JP2017043616A - 14-3-3 Protein activity regulator - Google Patents

14-3-3 Protein activity regulator Download PDF

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英志 杉原
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a 14-3-3 protein activity regulator for treating disease associated with 14-3-3 protein activity such as neurodegenerative disease.SOLUTION: A 14-3-3 protein activity regulator comprises a benzaldehyde compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof. A preferable benzaldehyde compound is a compound of the general formula (I) in the figure.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、ベンズアルデヒド化合物を含む１４−３−３タンパク質活性調節剤、その調節剤を含む１４−３−３タンパク質活性が関与する疾患（例えば、神経変性疾患など）を治療するための医薬組成物、その調節剤を含む抗がん剤組成物などに関する。   The present invention relates to a 14-3-3 protein activity regulator comprising a benzaldehyde compound, and a pharmaceutical composition for treating a disease involving a 14-3-3 protein activity comprising the regulator (eg, neurodegenerative disease). And an anticancer agent composition containing the regulator.

ベンズアルデヒド又はその誘導体は、東風睦之博士によってその抗がん活性が見いだされた物質である（例えば、特許文献１）。その後東風らの研究によって、種々のベンズアルデヒド化合物（例えば、ベンズアルデヒド、５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩、４，６−０−ベンジリデン−Ｄ−グルコピラノースなど）について、抗がん活性、抗ＨＩＶ活性、活性酸素種の消去活性、インフルエンザの治療活性などが見いだされている（特許文献２〜６及び非特許文献１〜３など）。
ベンズアルデヒドは最も単純な芳香族アルデヒドで安価でもあり、正常細胞に対する細胞障害性がほとんどなく化学療法による苦痛を軽減できる可能性の高い物質である。 Benzaldehyde or a derivative thereof is a substance whose anticancer activity was found by Dr. Tomoyuki Dongfeng (for example, Patent Document 1). Thereafter, various studies of benzaldehyde compounds (for example, benzaldehyde, 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid sodium salt, 4,6-0-benzylidene-D-glucopyranose etc.) Activity, anti-HIV activity, scavenging activity of reactive oxygen species, therapeutic activity of influenza, etc. have been found (Patent Documents 2-6 and Non-Patent Documents 1-3).
Benzaldehyde is the simplest aromatic aldehyde, is inexpensive, has little cytotoxicity against normal cells, and is likely to reduce the pain of chemotherapy.

一方、疾患に関与するタンパク質は膨大な数知られている。例えば、がんに関与するタンパク質としては、例えば、チロシンキナーゼ型受容体（例えば、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲなど）；細胞内チロシンキナーゼ (例えば、Ｓｒｃ-ファミリー, Ｓｙｋ−ＺＡＰ−７０ファミリー、ＢＴＫファミリ−など）：調節性ＧＴＰases（例えば、Ｒａｓタンパク質）；細胞内セリン/スレオニンキナーゼとそれらの調節サブユニット（例えば、Ｒａｆキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、ＡＫＴキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、ＲＳＫキナーゼ、ｐ−７０Ｓ６キナーゼ、ｍＴＯＲキナーゼ、Ｐｉｍキナーゼ）；シグナル伝達系のアダプタータンパク質（例えば、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ２７、１４−３−３）；各種転写因子、（例えば、ＳＴＡＴ３、ＮＦκＢ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、Ｅ２Ｆ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ）;Ｗｎｔシグナル関連タンパク質（例えば、Ｗｎｔ、β-Ｃａｔｅｎｉｎ）；Ｎｏｔｃｈシグナル関連タンパク質（例えばＮｏｔｃｈ）；Ｈｅｄｇｅｈｏｇ関連タンパク質（例えば、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２）；アポトーシス関連タンパク質（例えばＢｃｌ−２）、細胞骨格タンパク質（例えば、Ｒｈｏ、ＣＤＣ４２、Ｒａｃ、Ｃｏｆｉｌｉｎ）；癌免疫の異常に関連するタンパク質（例えばＩＬ−６、ＩＦＮ、ＴＮＦ、抗ＰＤ−１/ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ）などが挙げられる。抗がん剤の開発においては、これらの多くのタンパク質がターゲットとされて膨大な労力、時間、コストが投入されている。   On the other hand, a huge number of proteins involved in diseases are known. For example, proteins involved in cancer include, for example, tyrosine kinase type receptors (eg, EGFR, PDGFR, VEGFR, etc.); intracellular tyrosine kinases (eg, Src-family, Syk-ZAP-70 family, BTK family- Etc.): regulatory GTPases (eg Ras protein); intracellular serine / threonine kinases and their regulatory subunits (eg Raf kinase, PI3 kinase, AKT kinase, protein kinase C, RSK kinase, p-70S6 kinase, mTOR) Kinase, Pim kinase); adapter protein of signal transduction system (for example, HSP90, HSP70, HSP27, 14-3-3); various transcription factors (for example, STAT3, NFκB, c-Myc, c-Myb, E2F, c) -J n, c-Fos); Wnt signal-related protein (eg, Wnt, β-Catenin); Notch signal-related protein (eg, Notch); Hedgehog-related protein (eg, GLI1, GLI2); Apoptosis-related protein (eg, Bcl-2) Cytoskeletal proteins (eg, Rho, CDC42, Rac, Cofilin); proteins associated with abnormalities in cancer immunity (eg, IL-6, IFN, TNF, anti-PD-1 / PD-L1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, CXCR4, CCR) and the like. In the development of anticancer drugs, many of these proteins are targeted, and enormous effort, time and cost are invested.

これらのタンパク質の中で、１４−３−３−タンパク質（特に、１４−３−３ζタンパク質）は、がん化の初期、がんの転移、悪性化段階や抗がん剤や放射線治療後のがん細胞において多く発現が認められている（非特許文献４〜１３）。１４−３−３ζタンパク質はアルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症などの神経変性疾患の発症に関わるタウタンパク質の構成成分である（非特許文献１４〜１８）。このため、タウタンパク質をターゲットとした治療薬の研究も行われているが、未だ有効な治療薬の開発には至っていない。   Among these proteins, 14-3-3 protein (especially 14-3-3ζ protein) is an early stage of canceration, cancer metastasis, malignant stage, anticancer agent and after radiotherapy. Many expressions are recognized in cancer cells (Non-Patent Documents 4 to 13). 14-3-3ζ protein is a constituent component of tau protein involved in the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis (Non-Patent Documents 14 to 18). For this reason, research on therapeutic agents targeting tau protein has been conducted, but an effective therapeutic agent has not yet been developed.

特公昭54-962号Japanese Patent Publication No.54-962 特公昭63-10685号明細書Japanese Patent Publication No.63-10685 特開平7-242632JP 7-242632 A 特公平3-33127号明細書Japanese Patent Publication No.3-333127 特開平8-217675号明細書JP-A-8-217675 specification 特公昭44-12747号明細書（特許第560349号）Japanese Patent Publication No. 44-12747 (Patent No. 560349)

Takeuchi, S.ら, Agric Biol Chem 42: 1449-1451, 1978Takeuchi, S. et al., Agric Biol Chem 42: 1449-1451, 1978 Kochi, M.ら, The 13th International Cancer Congres, Seattle, 1982Kochi, M. et al., The 13th International Cancer Congres, Seattle, 1982 Kochi, M.ら, The 14th International Cancer Congress, Budapest, 1986Kochi, M. et al., The 14th International Cancer Congress, Budapest, 1986 Matta, A.ら, BMC Cancer 2007; 7: 169Matta, A. et al., BMC Cancer 2007; 7: 169 Li Z.ら, Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 162-167Li Z. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 162-167 Choi JEら, Cancer Lett 2011; 303: 99-107Choi JE et al., Cancer Lett 2011; 303: 99-107 Steve Aら, JBC. 2009; 284: 22379-22389Steve A et al., JBC. 2009; 284: 22379-22389 Young Ki Leeら, Experimental & Molecular Medicine 2014; 46; e77Young Ki Lee et al., Experimental & Molecular Medicine 2014; 46; e77 Qi Wら, Radiat Res 2003; 160: 217-223Qi W et al., Radiat Res 2003; 160: 217-223 Morrison DKら, Trends Cell Biol 2009; 19: 16-23Morrison DK et al., Trends Cell Biol 2009; 19: 16-23 Niemantsverdriet Mら, Oncogene 2008; 27: 1315-1319Niemantsverdriet M et al., Oncogene 2008; 27: 1315-1319 Neal CLら, Expert Opin Ther Targets 2010; 14: 1343-1354Neal CL et al., Expert Opin Ther Targets 2010; 14: 1343-1354 A. Mattaら, Expert Opin Ther Targets 2012; 16: 515-523A. Matta et al., Expert Opin Ther Targets 2012; 16: 515-523 Berg Dら, Nat Rev Neurosci. 2003; 4 (9): 752-62Berg D et al., Nat Rev Neurosci. 2003; 4 (9): 752-62 Hashiguchi Mら, J Biol Chem 2000; 275(33): 25247-54Hashiguchi M et al., J Biol Chem 2000; 275 (33): 25247-54 Layfield Rら, Neurosci Lett 1996; 209 (1): 57-60Layfield R et al., Neurosci Lett 1996; 209 (1): 57-60 Agarwal-Mawal Aら, J Biol Chem 2003; 278 (15): 12722-8Agarwal-Mawal A et al., J Biol Chem 2003; 278 (15): 12722-8 Shimada, T.ら, BioMed Res Inter. 2013; 10.1155-1165Shimada, T. et al., BioMed Res Inter. 2013; 10.1155-1165

上記したように、ベンズアルデヒド又はその誘導体（以下、「ベンズアルデヒド化合物」ともいう）は、種々の有用な活性を有しており有用な物質であると考えられる。しかしながら、その作用機序が解明されていないことから、未だ有効に利用されていないというのが現状である。本発明者らは、ベンズアルデヒド化合物の作用機序を解明して、この物質のさらなる有効利用を図ることを課題として研究を進めた。
また、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症などの神経変性疾患の治療剤は多く開発されているが、副作用が少なく適用範囲の広い治療剤の開発が望まれている。 As described above, benzaldehyde or a derivative thereof (hereinafter also referred to as “benzaldehyde compound”) has various useful activities and is considered to be a useful substance. However, since the mechanism of action has not yet been elucidated, it has not been used effectively yet. The inventors of the present invention have conducted research with the object of elucidating the mechanism of action of benzaldehyde compounds and further effective utilization of this substance.
Moreover, many therapeutic agents for neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis have been developed. However, there is a demand for the development of therapeutic agents with few side effects and a wide range of applications.

本発明者らは、上記課題を解決するためにベンズアルデヒド化合物の作用機序について鋭意研究した結果、ベンズアルデヒド化合物が１４−３−３タンパク質（特に、１４−３−３ζタンパク質）の活性を調節することを見いだし、本発明を完成させた。   As a result of intensive studies on the mechanism of action of benzaldehyde compounds in order to solve the above problems, the present inventors have found that benzaldehyde compounds regulate the activity of 14-3-3 proteins (particularly, 14-3-3ζ protein). And the present invention was completed.

すなわち、本発明は、以下の実施態様に係る、１４−３−３タンパク質活性調節剤、それを含む医薬組成物などを提供する。   That is, the present invention provides a 14-3-3 protein activity regulator, a pharmaceutical composition containing the same, and the like according to the following embodiments.

（１）ベンズアルデヒド化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、１４−３−３タンパク質活性調節剤。 (1) A 14-3-3 protein activity regulator comprising a benzaldehyde compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

（２）前記ベンズアルデヒド化合物が、下記一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ1は−ＣＨＯ、−ＣＸＯ（ここで、Ｘはハロゲン基）、ジオキソラニル基、ジオキサニル基、−ＣＮ−Ｒ3（Ｒ3は低級アルキル基）、
を；Ｒ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基又は低級アルコキシ基を；
そしてｎは１〜５の整数を表す）で示される、上記（１）に記載の調節剤。 (2) The benzaldehyde compound is represented by the following general formula (I):
(Wherein R 1 is —CHO, —CXO (where X is a halogen group), dioxolanyl group, dioxanyl group, —CN—R 3 (R 3 is a lower alkyl group),
Each R 2 independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkenyl group, a lower alkynyl group or a lower alkoxy group;
And n represents an integer of 1 to 5, and the regulator according to (1) above.

（３）前記ベンズアルデヒド化合物が、一般式（Ｉ）の化合物であって、Ｒ1が−ＣＨＯ、１，３−ジオキソラニル基、１，３−ジオキサニル基、又は
であり；Ｒ2はそれぞれ独立して水素原子又はハロゲン原子である、上記（２）に記載の調節剤。 (3) The benzaldehyde compound is a compound of the general formula (I), and R 1 is —CHO, 1,3-dioxolanyl group, 1,3-dioxanyl group, or
The regulator according to (2) above, wherein each R 2 independently represents a hydrogen atom or a halogen atom.

（４）前記ベンズアルデヒド化合物が、ベンズアルデヒド又は５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸である、上記（３）に記載の調節剤。 (4) The regulator according to (3) above, wherein the benzaldehyde compound is benzaldehyde or 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid.

（５）１４−３−３ζタンパク質の活性を調節する（阻害する）、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の調節剤。 (5) The regulator according to any one of (1) to (4) above, which regulates (inhibits) the activity of 14-3-3ζ protein.

（６）１４−３−３ζタンパク質と１４−３−３ζタンパク質に結合するタンパク質との結合を抑制する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の調節剤。 (6) The regulator according to any one of (1) to (5), wherein the regulator suppresses binding between 14-3-3ζ protein and a protein that binds to 14-3-3ζ protein.

（７）前記１４−３−３ζタンパク質に結合するタンパク質が、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＴＳＣ２、ｃＲａｆ、ＳＴＡＴ３、ＦＯＸＯ１及びＦＯＸＯ３aから選択される１以上のタンパク質である、上記（６）に記載の調節剤。 (7) The regulation according to (6) above, wherein the protein that binds to the 14-3-3ζ protein is one or more proteins selected from mTOR, Raptor, Rictor, TSC2, cRaf, STAT3, FOXO1 and FOXO3a. Agent.

（８）Ｔａｕタンパク質のセリン（Ser262）のリン酸化を抑制する、上記（１）〜（７）に記載の調節剤。 (8) The regulator according to (1) to (7), which suppresses phosphorylation of serine (Ser262) of Tau protein.

（９）上記（１）〜（８）に記載の調節剤及び薬学的に許容し得る担体を含有する、１４−３−３タンパク質活性が関与する疾患の治療のための医薬組成物。 (9) A pharmaceutical composition for treating a disease associated with 14-3-3 protein activity, comprising the regulator according to (1) to (8) above and a pharmaceutically acceptable carrier.

（１０）前記１４−３−３タンパク質活性が関与する疾患が、神経変性疾患、がん、てんかん、神経障害性疼痛、自己免疫疾患、心疾患、又はウィルス感染疾患である、上記（９）に記載の医薬組成物。 (10) In the above (9), wherein the disease involving 14-3-3 protein activity is a neurodegenerative disease, cancer, epilepsy, neuropathic pain, autoimmune disease, heart disease, or viral infection disease The pharmaceutical composition as described.

（１１）前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、進行性多巣性白質脳症、レビー小体型認知症、皮質基底核変性症、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、パーキンソン症候群、脊髄小脳変性症、痙性対麻痺、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、進行性多巣性白質脳症、又は非ヘルペス性急性辺縁系脳炎である、上記（１０）に記載の医薬組成物。 (11) The neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, Creutzfeldt-Jakob disease, progressive multifocal leukoencephalopathy, Lewy body type Dementia, cortical basal ganglia, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, Parkinson's syndrome, spinocerebellar degeneration, spastic paraplegia, spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, progressive multifocal leukoencephalopathy, Or the pharmaceutical composition as described in said (10) which is nonherpetic acute limbic encephalitis.

（１２）上記（１）〜（８）に記載の１４−３−３タンパク質活性調節剤（第１抗がん剤成分）、及び１４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤（第２抗がん剤成分）を含む、抗がん剤組成物。 (12) The 14-3-3 protein activity regulator (first anticancer agent component) according to (1) to (8) above, and an anti-antibody having an action mechanism not involved in 14-3-3 protein activity An anticancer agent composition comprising a cancer agent (second anticancer agent component).

（１３）第１抗がん剤成分が、ベンズアルデヒド又は５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸であり；
第２抗がん剤成分が、ゲフィチニブ、塩酸イリノテカン、塩酸トポテカン、ドセタキソール、パクリタキセル、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、テニポシド、酒石酸ビノレルビン、ブスルファン、カルボコン、チオテパ、シクロホスファミド、メルファラン、リン酸エストラムスチンナトリウム、塩酸メクロレタミンオキシド、イホスファミド、ラニムスチン、塩酸ニムスチン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、ジノスタチンスチマラート、アクチノマイシンＤ、塩酸アクラルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、塩酸ダウノルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、マイトマイシン、バルルビシン、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、フルオロウラシル、テガフール、シタラビン、塩酸ゲムシタビン、シタラビンオクホスファート、カペシタビン、ドキシフルリジン、カルモフール、エノシタビン、ネダプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、ビカルタミド、フルタミド、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、トレチノイン、ペントスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、ソブゾキサン、トラスツズマブ、リツキシマブ、メシル酸イマチニブ、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、アスクレ、カルボクリン、キノレスパン、クレスチン、及びピシバニールから選択される一種以上の化合物である前記上記（１１）記載の抗がん剤組成物。 (13) the first anticancer drug component is benzaldehyde or 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid;
The second anticancer component is gefitinib, irinotecan hydrochloride, topotecan hydrochloride, docetaxol, paclitaxel, vinblastine sulfate, vincristine sulfate, vindesine sulfate, etoposide, teniposide, vinorelbine tartrate, busulfan, carbocon, thiotepa, cyclophosphamide, melphalan , Estramustine phosphate sodium, mechloretamine oxide hydrochloride, ifosfamide, ranimustine, nimustine hydrochloride, bleomycin hydrochloride, peplomycin sulfate, dinostatin stimalate, actinomycin D, aclarubicin hydrochloride, doxorubicin hydrochloride, idarubicin hydrochloride, amrubicin hydrochloride, daunorubicin hydrochloride , Pirarubicin, epirubicin hydrochloride, mitomycin, valrubicin, methotrexate, mercaptopurine, phosphate Darabine, cladribine, fluorouracil, tegafur, cytarabine, gemcitabine hydrochloride, cytarabine ocphosphate, capecitabine, doxyfluridine, carmofur, enocitabine, nedaplatin, carboplatin, cisplatin, fadrozol hydrochloride, anastrozole, exemestane, fenmetitamide, bicalutamide, bicalutamide Toremifene acid, tretinoin, pentostatin, L-asparaginase, dacarbazine, procarbazine hydrochloride, mitoxantrone hydrochloride, sobuzoxane, trastuzumab, rituximab, imatinib mesylate, 5-fluoro-2'-deoxyuridine, ascle, carbocrine, quinolespan, crestine, And the above-mentioned (1) which is one or more compounds selected from picibanil ) Anticancer agent composition.

（１４）１４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤による治療を受けた患者に投与する、上記（１）〜（８）に記載の１４−３−３タンパク質活性調節剤を含有する、抗がん剤組成物。 (14) The 14-3-3 protein activity described in the above (1) to (8), which is administered to a patient who has been treated with an anticancer agent having an action mechanism not involved in the 14-3-3 protein activity. An anticancer agent composition comprising a regulator.

本発明の１４−３−３タンパク質活性調節剤は、１４−３−３タンパク質活性（特に、１４−３−３ζタンパク質活性）を調節することによって、１４−３−３タンパク質活性が（特に、１４−３−３ζタンパク質活性）関与する種々の疾患の治療に用いることができる。１４−３−３タンパク質活性が関与する種々の疾患としては、神経変性疾患（アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、進行性多巣性白質脳症、レビー小体型認知症、皮質基底核変性症、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、パーキンソン症候群、脊髄小脳変性症、痙性対麻痺、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、進行性多巣性白質脳症、非ヘルペス性急性辺縁系脳炎など）、がん、てんかん、神経障害性疼痛、自己免疫疾患（関節リウマチ、橋本脳症など）、心疾患（心不全、糖尿病心筋症など）、ウィルス感染疾患（インフルエンザ脳症、ＨＩＶ脳症など）などが挙げられる。   The 14-3-3 protein activity regulator of the present invention regulates 14-3-3 protein activity (particularly 14-3-3ζ protein activity), thereby improving 14-3-3 protein activity (particularly 14 3-3ζ protein activity) It can be used to treat various diseases involved. Various diseases involving 14-3-3 protein activity include neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, Creutzfeldt-Jakob disease, Progressive multifocal leukoencephalopathy, Lewy body dementia, cortical basal ganglia degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, Parkinson's syndrome, spinocerebellar degeneration, spastic paraplegia, spinocerebellar degeneration, multiple Sclerosis, progressive multifocal leukoencephalopathy, non-herpetic acute limbic encephalitis, etc., cancer, epilepsy, neuropathic pain, autoimmune diseases (such as rheumatoid arthritis, Hashimoto encephalopathy), heart disease (heart failure, diabetes mellitus) Cardiomyopathy, etc.) and viral infection diseases (influenza encephalopathy, HIV encephalopathy, etc.).

本発明に係る調節剤は、１４−３−３タンパク質活性を調節することにより抗がん活性を奏するので、１４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤と併用することによって、抗腫瘍効果の増強、薬剤耐性の軽減、副作用の軽減などにおいて期待できる。また本発明に係る調節剤は、長期的にはがん化の予防薬としての効果も期待できる。   Since the regulator according to the present invention exhibits anticancer activity by regulating 14-3-3 protein activity, it is used in combination with an anticancer agent having a mechanism of action not involved in 14-3-3 protein activity. Therefore, it can be expected to enhance the antitumor effect, reduce drug resistance, reduce side effects, and the like. Further, the regulator according to the present invention can be expected to have an effect as a preventive agent for canceration in the long term.

また、本発明に係る調節剤は、１４−３−３タンパク質活性を調節することにより抗がん活性を奏するので、１４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤で治療を受けたが、治療効果が十分に得られなかった患者に対して有効な抗がん剤として用いることができる。   Moreover, since the regulator which concerns on this invention has anticancer activity by adjusting 14-3-3 protein activity, it is an anticancer agent which has an action mechanism which is not related to 14-3-3 protein activity. It can be used as an effective anticancer agent for patients who have received treatment but have not sufficiently obtained a therapeutic effect.

本発明の抗がん剤及び抗がん剤組成物は、副作用が少なく、有効な抗がん活性を有するので新規抗がん剤として好適に用いられる。本発明の抗がん剤及び抗がん剤組成物は、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、咽頭がん、喉頭がん、胃がん、カポジ肉腫、肝臓がん、筋肉腫、結腸がん、血管腫、骨髄腫、甲状腺がん、睾丸腫瘍、膵臓がん、消化器がん、食道がん、大腸がん、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、直腸がん、乳がん、尿管腫瘍、肉腫、骨肉腫、脳腫瘍、白血病、肺がん、神経芽腫、真性多血症、膀胱腫、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がんおよび皮膚黒色腫などの各種良性および悪性腫瘍の治療に用いることができる。   The anticancer agent and anticancer agent composition of the present invention are suitably used as a novel anticancer agent because they have few side effects and have effective anticancer activity. The anticancer agent and anticancer agent composition of the present invention include, for example, malignant melanoma, malignant lymphoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, gastric cancer, Kaposi's sarcoma, liver cancer, myoma, colon cancer, blood vessel Tumor, myeloma, thyroid cancer, testicular tumor, pancreatic cancer, digestive organ cancer, esophageal cancer, colon cancer, maxillary cancer, tongue cancer, lip cancer, oral cancer, gallbladder cancer, bile duct Cancer, biliary tract cancer, rectal cancer, breast cancer, ureteral tumor, sarcoma, osteosarcoma, brain tumor, leukemia, lung cancer, neuroblastoma, polycythemia vera, cystoma, ovarian cancer, uterine cancer, prostate It can be used to treat various benign and malignant tumors such as cancer, myoma, skin cancer, basal cell cancer, skin appendage cancer, skin metastasis cancer and cutaneous melanoma.

図1〜図3は膵臓がん細胞株BxPC3細胞においてベンズアルデヒドが多くの14-3-3ζ蛋白と結合する蛋白のリン酸化抑制を示している。図1は低濃度のベンズアルデヒド（100μM）を用いた場合と高濃度のベンズアルデヒド（500μM）を用いた場合の比較を示している。FIGS. 1 to 3 show that phosphorylation of benzaldehyde is bound to many 14-3-3ζ proteins in pancreatic cancer cell line BxPC3 cells. FIG. 1 shows a comparison between the case of using a low concentration of benzaldehyde (100 μM) and the case of using a high concentration of benzaldehyde (500 μM). 図2は高濃度のベンズアルデヒド（500μM）を用いた場合の結果を示している。FIG. 2 shows the results when using a high concentration of benzaldehyde (500 μM). 図３も高濃度のベンズアルデヒド（500μM）を用いた場合の結果を示している。FIG. 3 also shows the results when a high concentration of benzaldehyde (500 μM) is used. 図4はBxPC3細胞において14-3-3 バインディング・モチーフ（binding motif）抗体（エピトープアミノ酸配列：(R/K)xx(S*)xP、S*はリン酸化セリン）を用いてベンズアルデヒド投与群と投与しない群について、24時間後の変化の比較を示している。ベンズアルデヒド投与により低分子から高分子まで幅広く14-3-3 バインディング・モチーフ（binding motif）が減少していることが示されている。ベンズアルデヒドはかなり数多くのタンパク質に作用していることが推測される。右端のレーンは分子量マーカーの泳動及びその分子量を示す。Fig. 4 shows benzaldehyde administration group using 14-3-3 binding motif antibody (epitope amino acid sequence: (R / K) xx (S *) xP, S * is phosphorylated serine) in BxPC3 cells. A comparison of changes after 24 hours is shown for the non-administered group. It has been shown that administration of benzaldehyde reduces the 14-3-3 binding motif from low to large molecules. It is speculated that benzaldehyde acts on a large number of proteins. The rightmost lane shows the migration of the molecular weight marker and its molecular weight. 図5はHEK293T細胞に14-3-3ζmyc標識のついたcDNAをトランスフェクションし、cMYC抗体で免疫沈降を行った結果を示している。mTOR、Raptor、Rictor、TSC2、cRaf、STAT3、FOXO1、FOXO3aなどにおいてベンズアルデヒド投与によって明らかに14-3-3ζと結合蛋白との蛋白蛋白間結合の抑制が確認された。FIG. 5 shows the results of transfection of HEK293T cells with cDNA labeled with 14-3-3ζ myc and immunoprecipitation with cMYC antibody. In mTOR, Raptor, Rictor, TSC2, cRaf, STAT3, FOXO1, FOXO3a, etc., suppression of protein-protein binding between 14-3-3ζ and the binding protein was clearly confirmed by benzaldehyde administration. 図6はHEK293T細胞に14-3-3θmyc標識のついたcDNAをトランスフェクションし、cMYC抗体で免疫沈降を行った結果を示している。mTOR、Raptor、Rictor、cRafにおいてベンズアルデヒド投与後も14-3-3θと結合蛋白との蛋白蛋白間結合に変化は見られなかった。FIG. 6 shows the result of transfection of HEK293T cells with cDNA labeled with 14-3-3θmyc and immunoprecipitation with cMYC antibody. In mTOR, Raptor, Rictor, and cRaf, there was no change in protein-protein binding between 14-3-3θ and the binding protein after benzaldehyde administration. 図7はHEK293T細胞に14-3-3σmyc標識のついたcDNAをトランスフェクションし、cMYC抗体で免疫沈降を行った結果を示している。mTOR、cRaf、FOXO1、Rictorにおいてベンズアルデヒド投与によって14-3-3σと結合蛋白との蛋白蛋白間結合の増加が軽度確認された。FIG. 7 shows the results of transfection of HEK293T cells with cDNA labeled with 14-3-3σmyc and immunoprecipitation with cMYC antibody. In mTOR, cRaf, FOXO1, and Rictor, the increase in protein-protein binding between 14-3-3σ and binding protein was confirmed by administration of benzaldehyde. 図8はHEK293T細胞に14-3-3ηmyc標識のついたcDNAをトランスフェクションし、cMYC抗体で免疫沈降を行った結果を示している。Rictor、cRafにおいてベンズアルデヒド投与によって14-3-3η結合蛋白との蛋白蛋白間結合はほぼ不変であった。FIG. 8 shows the results of transfecting HEK293T cells with cDNA labeled with 14-3-3ηmyc and immunoprecipitation with cMYC antibody. In Rictor and cRaf, protein-protein binding to 14-3-3 eta binding protein was almost unchanged by benzaldehyde administration. 図9はHEK293T細胞に14-3-3βmyc標識のついたcDNAをトランスフェクションし、cMYC抗体で免疫沈降を行った結果を示している。Rictor、cRafにおいてベンズアルデヒド投与によって14-3-3βとの結合はわずかな抑制が見られた。FIG. 9 shows the result of transfection of HEK293T cells with cDNA labeled with 14-3-3βmyc and immunoprecipitation with cMYC antibody. In Rictor and cRaf, binding to 14-3-3β was slightly inhibited by benzaldehyde administration. 図10はHEK293T細胞に14-3-3γmyc標識のついたcDNAをトランスフェクションし、cMYC抗体で免疫沈降を行った結果を示している。Rictorにおいてベンズアルデヒド投与によって14-3-3γとの結合はごくわずかな抑制が見られた。FIG. 10 shows the result of transfection of HEK293T cells with cDNA labeled with 14-3-3γmyc and immunoprecipitation with cMYC antibody. In Rictor, the binding to 14-3-3γ was slightly suppressed by benzaldehyde administration. 図11はHEK293T細胞に14-3-3εmyc標識のついたcDNAをトランスフェクションし、cMYC抗体で免疫沈降を行った結果を示している。Rictorにおいてベンズアルデヒド投与によって14-3-3εとの結合はごくわずかな抑制が見られた。FIG. 11 shows the results of transfection of HEK293T cells with cDNA labeled with 14-3-3εmyc and immunoprecipitation with cMYC antibody. In Rictor, binding to 14-3-3ε was found to be slightly suppressed by benzaldehyde administration. 図12はHEK293T細胞に14-3-3ζmyc標識のついたcDNAをトランスフェクションした細胞のTotalのライセートにおいて24時間ベンズアルデヒドを投与した群がタウ蛋白Ser262のリン酸化状態を抑制していることを示す。FIG. 12 shows that the group in which benzaldehyde was administered for 24 hours in the total lysate of cells transfected with cDNA labeled with 14-3-3ζ myc in HEK293T cells suppressed the phosphorylation state of tau protein Ser262. 図13は、短鎖ヘアピン RNAを用いたRNA干渉法により14-3-3ζ蛋白をノックダウンしたBxPC3細胞(14-3-3ζshRNA)におけるベンズアルデヒドの作用をコントロールと比較している。FIG. 13 compares the action of benzaldehyde with a control in BxPC3 cells (14-3-3ζ shRNA) in which 14-3-3ζ protein was knocked down by RNA interference using short hairpin RNA. 図14は、短鎖ヘアピン RNAを用いたRNA干渉法により14-3-3ζ蛋白をノックダウンしたA549細胞((14-3-3ζshRNA)におけるベンズアルデヒドの作用をコントロールと比較している。FIG. 14 compares the action of benzaldehyde with the control in A549 cells (14-3-3ζ shRNA) knocked down with 14-3-3ζ protein by RNA interference using short hairpin RNA.

１．本発明の１４−３−３タンパク質活性調節剤
本発明は、ベンズアルデヒド化合物（ベンズアルデヒド又はその誘導体）又はその薬学的に許容される塩を含む、１４−３−３タンパク質活性調節剤を提供する。 1. 14-3-3 protein activity regulator of the present invention The present invention provides a 14-3-3 protein activity regulator comprising a benzaldehyde compound (benzaldehyde or a derivative thereof) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

本明細書中、「１４−３−３タンパク質」とは１４−３−３タンパク質ファミリーのメンバーをいう。１４−３−３タンパク質は、独立した遺伝子でコードされた高度に相同なタンパク質のファミリーである。14-3-3蛋白はセリンまたはスレオニンによるリン酸化部分を含めた特定のアミノ酸配列に結合するアダプタータンパク質（adaptor protein）で7個のアイソフォーム（β、γ、ε、ζ、θ、η、σ）を有する（Ichimuraら, 1988, PNAS 85:7084-7088; Martinら, 1993, FEBS Lett. 331:296-303）。これら７個の各アイソフォームのアミノ酸配列のGenBank Accession Noとしては、例えば、β：P31946、γ：P61981、ε：P62258、ζ：P63104、θ：P27348、η：Q04917、およびσ：P31947が登録されている。特開２００７−５２３１９７号公報に記載のように、１４−３−３タンパク質は、主としておよそ30kDのモノマー分子量を有するダイマーとして存在する。１４−３−３ポリペプチドの一般特性は、さらにFuら（2000）Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40:617-647; Takahashi, 2003, Neurochem Res. 28:1265-73;ならびにTzivionおよびAvruch, 2002, J Biol Chem. 277:3061-4中に見い出すことができる。種々の１４−３−３タンパク質ファミリーメンバーの核酸配列およびアミノ酸配列は、例えばLefferら, (1993) J. Mol. Biol. 231:982-998に記載されている。
１４−３−３タンパク質のアイソフォームの中の1つである１４−３−３ζタンパク質はがん細胞での発現が多く、がん細胞において亢進している（Muslin, A.J.ら, Cell 1996; 84: 889-897、Yaffe, M.B.ら, Cell 1997; 91: 961-971）。１４−３−３ζタンパク質はPI3K−AKT-mTOR、cRaf、STAT3などの活性化に関与している（CL Nealら, Oncogene 2012; 31: 897-906、Tzivion G.ら, Nature 1998; 394(6688):88-92、Petosa, C.ら, J Biol Chem 1998; 273: 16305-16310、Jia Zら, Plos one 2012; 10: 1371）。またがん化の初期段階、がんの転移、悪性化などに関与しており、また抗がん剤投与後や放射線治療後に発現上昇を認めることから治療抵抗性と関連性のあるタンパク質であることなどが知られている。このため、１４−３−３ζタンパク質阻害剤は、抗がん剤として使用し得ると認識されている（Maxwellら(2009) J. Biol. Chem. 284:22379-22389、Leeら(2014)Exp. Mol.Med: 46: e77等参照）。
また、１４−３−３ζタンパクの過剰発現はタウ蛋白のSer262のリン酸化を促進させる。Ser262のリン酸化はβアミロイドの神経毒性を引き起こし、脳内に毒性も持ったタウ領域を引き起こし、シナプス前タンパクのシナプトフィシンを減少させる。１４−３−３ζ蛋白はアルツハイマー病の神経病理である(1)βアミロイドペプチドの蓄積、(2)タウタンパクの高リン酸化、(3)シナプスの欠失に影響を及ぼすと考えられる（非特許文献１４〜１８）。筋委縮性側索硬化症、ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）病であるハンチントン病や脊髄小脳変性症、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ＨＩＶ脳症、進行性多巣性白質脳症、パーキンソン病などの神経変性疾患やてんかんの責任病変の病態形成に１４−３−３ζを中心とした１４−３−３蛋白が深く関わっている。このため、本発明に係る１４−３−３タンパク質活性調節剤は、神経疾患治療薬として使用可能である（Qureshi, H.Y.ら, PLoS ONE 2013; 8(12): 1-14、Marie Curie Industry-Academia Partnerships and Pathways.2012）。
また、１４−３−３ζタンパク質は神経障害性疼痛に関わっており、１４−３−３ζを制御することで神経障害性による慢性疼痛の改善が動物モデルを用いた実験から報告されている（Laffray, S.ら, EMBO J. (2012) 31, 3239-3251）。 In this specification, “14-3-3 protein” refers to a member of the 14-3-3 protein family. 14-3-3 proteins are a family of highly homologous proteins encoded by independent genes. The 14-3-3 protein is an adapter protein that binds to a specific amino acid sequence including a phosphorylated moiety by serine or threonine, and is composed of seven isoforms (β, γ, ε, ζ, θ, η, σ (Ichimura et al., 1988, PNAS 85: 7084-7088; Martin et al., 1993, FEBS Lett. 331: 296-303). For example, β: P31946, γ: P61981, ε: P62258, ζ: P63104, θ: P27348, η: Q04917, and σ: P31947 are registered as GenBank Accession Nos of amino acid sequences of these seven isoforms. ing. As described in JP 2007-523197 A, the 14-3-3 protein exists mainly as a dimer having a monomer molecular weight of approximately 30 kD. General properties of 14-3-3 polypeptides are further described by Fu et al. (2000) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40: 617-647; Takahashi, 2003, Neurochem Res. 28: 1265-73; and Tzivion and Avruch, 2002, J Biol Chem. 277: 3061-4. Nucleic acid and amino acid sequences of various 14-3-3 protein family members are described, for example, in Leffer et al. (1993) J. Mol. Biol. 231: 982-998.
14-3-3ζ protein, which is one of the isoforms of 14-3-3 protein, is highly expressed in cancer cells and is enhanced in cancer cells (Muslin, AJ et al., Cell 1996; 84 : 889-897, Yaffe, MB et al., Cell 1997; 91: 961-971). 14-3-3ζ protein is involved in activation of PI3K-AKT-mTOR, cRaf, STAT3, etc. (CL Neal et al., Oncogene 2012; 31: 897-906, Tzivion G. et al., Nature 1998; 394 (6688 ): 88-92, Petosa, C. et al., J Biol Chem 1998; 273: 16305-16310, Jia Z et al., Plos one 2012; 10: 1371). It is also involved in the early stages of canceration, cancer metastasis, malignant transformation, etc., and is associated with resistance to treatment because of increased expression after administration of anticancer drugs and radiation therapy. That is known. For this reason, it has been recognized that 14-3-3ζ protein inhibitors can be used as anticancer agents (Maxwell et al. (2009) J. Biol. Chem. 284: 22379-22389, Lee et al. (2014) Exp. Mol. Med: 46: e77 etc.).
Moreover, overexpression of 14-3-3ζ protein promotes phosphorylation of Ser 262 of tau protein. Phosphorylation of Ser 262 causes β-amyloid neurotoxicity, a toxic tau region in the brain, and decreases the presynaptic protein synaptophysin. 14-3-3ζ protein is considered to affect the neuropathology of Alzheimer's disease (1) β-amyloid peptide accumulation, (2) tau protein hyperphosphorylation, and (3) synaptic deletion (non-patent literature) 14-18). Amyotrophic lateral sclerosis, polyglutamine (PolyQ) disease Huntington's disease and spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, Creutzfeldt-Jakob disease, HIV encephalopathy, progressive multifocal leukoencephalopathy, Parkinson's disease, etc. The 14-3-3 protein centered on 14-3-3ζ is deeply involved in the pathogenesis of neurodegenerative diseases and responsible lesions of epilepsy. Therefore, the 14-3-3 protein activity regulator according to the present invention can be used as a therapeutic agent for neurological diseases (Qureshi, HY et al., PLoS ONE 2013; 8 (12): 1-14, Marie Curie Industry- Academia Partnerships and Pathways. 2012).
In addition, 14-3-3ζ protein is involved in neuropathic pain, and by controlling 14-3-3ζ, improvement of chronic pain due to neuropathy has been reported from experiments using animal models (Laffray). S. et al., EMBO J. (2012) 31, 3239-3251).

本明細書中、「１４−３−３タンパク質活性」とは、例えば、１４−３−３タンパク質が１４−３−３結合性タンパク質に結合する活性、タンパク質をリン酸化する活性、タンパク質を構造的又は化学的に変異させる活性を意味する。本発明において特に着目しているのは、１４−３−３タンパク質が１４−３−３タンパク質に結合するタンパク質と結合する活性、タンパク質のリン酸化部分に結合することでそのタンパク質のリン酸化状態を維持させる活性などである。そのような活性としては、１４−３−３タンパク質とｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＴＳＣ２、ｃＲａｆ、ＳＴＡＴ３、ＦＯＸＯ１及びＦＯＸＯ３aから選択される１以上のタンパク質との結合活性、Ｔａｕタンパク質のセリン（Ser262）のリン酸化を調節する活性が挙げられる。   In this specification, “14-3-3 protein activity” refers to, for example, the activity of 14-3-3 protein binding to 14-3-3 binding protein, the activity of phosphorylating protein, and the structural of protein Or it means the activity of chemically mutating. Of particular interest in the present invention is that the 14-3-3 protein binds to the protein that binds to the 14-3-3 protein, and the phosphorylation state of the protein by binding to the phosphorylated part of the protein. Such as the activity to be maintained. Such activity includes binding activity between 14-3-3 protein and one or more proteins selected from mTOR, Raptor, Rictor, TSC2, cRaf, STAT3, FOXO1 and FOXO3a, and serine of Tau protein (Ser262). The activity which regulates phosphorylation is mentioned.

本明細書中、「活性調節」という用語は上記のような活性を抑制または促進することを意味し、「活性調節剤」という用語は上記のような活性の抑制剤（阻害剤）または促進剤を意味する。「活性を促進する」とは、活性調節剤を使用しない場合と比較して、その活性（例えば、結合活性）が、１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上増加することを意味する。「活性を抑制する」とは、活性調節剤を使用しない場合と比較して、その活性（例えば、結合活性）が、１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上低減することを意味する。   In the present specification, the term “activity modulation” means to suppress or promote the activity as described above, and the term “activity regulator” refers to an activity inhibitor (inhibitor) or promoter as described above. Means. “Promoting the activity” means that the activity (for example, binding activity) is 1% or more, preferably 5% or more, more preferably 10% or more, even more preferably, as compared with the case where no activity regulator is used. Means an increase of 20% or more, more preferably 30% or more. “Suppressing the activity” means that the activity (for example, binding activity) is 1% or more, preferably 5% or more, more preferably 10% or more, even more preferably, compared to the case where no activity regulator is used. Means 20% or more, more preferably 30% or more.

本明細書中、「抗がん剤」とは、腫瘍縮小、腫瘍細胞増殖抑制、がん転移防止、がん再発防止または発がん予防等の目的で使用されるものをいう。   In the present specification, the “anticancer agent” refers to those used for the purpose of tumor reduction, tumor cell growth inhibition, cancer metastasis prevention, cancer recurrence prevention or carcinogenesis prevention.

本発明で好ましく用いられるベンズアルデヒド化合物は、１４−３−３タンパク質活性を調節する機能を有する限り特に限定されることはないが、例えば、下記一般式（Ｉ）：   The benzaldehyde compound preferably used in the present invention is not particularly limited as long as it has a function of regulating 14-3-3 protein activity. For example, the following general formula (I):

（式中、Ｒ1は−ＣＨＯ、−ＣＸＯ（ここで、Ｘはハロゲン原子）、ジオキソラニル基、ジオキサニル基、−ＣＮ−Ｒ3（Ｒ3は低級アルキル基）、
を；Ｒ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基又は低級アルコキシ基を；そしてｎは１〜５の整数を表す）で示される化合物を含む。
ここで、「ジオキソラニル基」とは、ヘテロ原子として２個の酸素原子を有する５員複素環式基であり、好ましくは２位の炭素原子が式（Ｉ）のフェニル基と結合している１，３−ジオキソラニル基である。残りの４位及び５位の原子は、非置換であっても、１以上のハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アキニル基、アルコキシ基、水酸基などによって置換されてもよい。
ここで、「ジオキサニル基」とは、ヘテロ原子として２個の酸素原子を有する６員複素環式基であり、好ましくは２位の炭素原子が式（Ｉ）のフェニル基と結合している１，３−ジオキサニル基である。残りの４〜６位の原子は、非置換であっても、１以上のハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、水酸基などによって置換されてもよい。
ここで、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子由来の基を意味するものである。
また、「低級」とは炭素数１〜６個を有することをいう。 Wherein R 1 is —CHO, —CXO (where X is a halogen atom), a dioxolanyl group, a dioxanyl group, —CN—R 3 (R 3 is a lower alkyl group),
Each of R 2 independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkenyl group, a lower alkynyl group or a lower alkoxy group; and n represents an integer of 1 to 5.
Here, the “dioxolanyl group” is a 5-membered heterocyclic group having two oxygen atoms as heteroatoms, preferably a carbon atom at the 2-position is bonded to the phenyl group of the formula (I) , 3-dioxolanyl group. The remaining 4- and 5-position atoms may be unsubstituted or substituted with one or more halogen atoms, alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups, alkoxy groups, hydroxyl groups, and the like.
Here, the “dioxanyl group” is a 6-membered heterocyclic group having two oxygen atoms as heteroatoms, preferably a carbon atom at the 2-position is bonded to the phenyl group of the formula (I) , 3-dioxanyl group. The remaining 4-6 position atoms may be unsubstituted or substituted with one or more halogen atoms, alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups, alkoxy groups, hydroxyl groups, and the like.
Here, the “halogen atom” means a group derived from a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
“Lower” means having 1 to 6 carbon atoms.

本明細書中、「アルキル基」は、一価の直鎖状炭化水素、または分枝鎖状炭化水素の基を意味するもので、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。   In the present specification, the “alkyl group” means a monovalent linear hydrocarbon group or a branched hydrocarbon group, and is methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl. , S-butyl, t-butyl and the like, but are not limited thereto.

本明細書中、「アルケニル基」は、二重結合を持つ一価の直鎖状炭化水素及び分枝鎖状炭化水素の基を表す用語として用いられており、エテニル、１−及び２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−及び２−ブテニル等を包含するが、これらに限定されるものではない。
本明細書中、「アルキニル基」は、三重結合を持つ一価の直鎖状炭化水素及び分枝鎖状炭化水素の基を表す用語として用いられており、エチニル、プロピニル、ブチニル等を包含するが、これらに限定されるものではない。 In the present specification, the “alkenyl group” is used as a term representing a monovalent straight-chain hydrocarbon or branched-chain hydrocarbon group having a double bond, and includes ethenyl, 1- and 2-propenyl. , 2-methyl-1-propenyl, 1- and 2-butenyl and the like, but are not limited thereto.
In the present specification, the “alkynyl group” is used as a term representing a monovalent straight-chain hydrocarbon or branched-chain hydrocarbon group having a triple bond, and includes ethynyl, propynyl, butynyl and the like. However, it is not limited to these.

本明細書中、「アルコキシ基」は−Ｏ−アルキルを表す用語として用いられており、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ等を包含するが、これらに限定されるものではない。   In the present specification, the “alkoxy group” is used as a term representing —O-alkyl, and includes methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, s-butoxy, t-butoxy and the like. However, it is not limited to these.

一般式（Ｉ）の化合物は、物質としては公知であるか、公知の出発物質から種々の公知の反応を利用して合成することができる。
例えば、一般式（Ｉ）の化合物で、Ｒ1が−ＣＨＯであり、Ｒ2が全て水素原子である化合物はベンズアルデヒドであり、この化合物は公知である。ベンズアルデヒドの抗がん活性については、例えば、特公昭５４−９６２号公報に記載されている。一般式（Ｉ）の化合物で、Ｒ1が
であり；Ｒ2が全て水素原子の化合物は５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸であり、この化合物も公知である。5,6−Ｏ−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸の製造法は「Steroids」12巻， 309頁(1968)等に記載され、また別の製造法は、特公平３− 33127号公報及び米国特許第 5,036,103号明細書に示される。更に、5,6−Ｏ−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸又はこれのナトリウム塩、カリウム塩及びカルシウム塩が有する抗がん活性と、これらの塩を製造する方法とは特公平３− 33127号公報及び米国特許第 5,036,103号明細書に記載されている。
一般式（Ｉ）の化合物で、Ｒ1が
であり、Ｒ2が全て水素原子である化合物は４，６−ベンジリデンーＤ−グルコピラノースであり、やはり公知化合物である。この化合物の構造、抗がん活性などについては、例えば、特公昭６３−１０６８５号公報などに記載されている。
一般式（Ｉ）の化合物で、Ｒ1が−ＣＮ−Ｒ3（Ｒ3がエチル基）であり、Ｒ2が全て水素原子である化合物はＮ−ベンジリデンエチルアミンである。この化合物の抗がん活性などについては、例えば、特公昭５４−７０４２８号公報などに記載されている。
一般式（Ｉ）の化合物で、上記化合物以外の化合物については、上記文献に記載のベンズアルデヒド化合物の合成法に、合成化学者の一般常識などを参酌して合成可能である。 The compound of the general formula (I) is known as a substance or can be synthesized from a known starting material by utilizing various known reactions.
For example, a compound of the general formula (I) in which R 1 is —CHO and all R 2 are hydrogen atoms is benzaldehyde, and this compound is known. The anticancer activity of benzaldehyde is described in, for example, Japanese Patent Publication No. 54-962. A compound of general formula (I) wherein R 1 is
The compound in which R 2 is all hydrogen atoms is 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid, and this compound is also known. A method for producing 5,6-O-benzylidene-L-ascorbic acid is described in “Steroids”, Vol. 12, p. 309 (1968), and other production methods are described in Japanese Patent Publication No. 3-33127 and US Pat. It is shown in the specification of 5,036,103. Furthermore, the anticancer activity of 5,6-O-benzylidene-L-ascorbic acid or a sodium salt, potassium salt and calcium salt thereof and a method for producing these salts are disclosed in Japanese Patent Publication No. 3-33127 and This is described in US Pat. No. 5,036,103.
A compound of general formula (I) wherein R 1 is
The compound in which R 2 is all hydrogen atoms is 4,6-benzylidene-D-glucopyranose, which is also a known compound. The structure and anticancer activity of this compound are described in, for example, Japanese Patent Publication No. 63-10585.
A compound of the general formula (I) in which R 1 is —CN—R 3 (R 3 is an ethyl group) and R 2 is all hydrogen atoms is N-benzylideneethylamine. The anticancer activity and the like of this compound are described in, for example, Japanese Patent Publication No. 54-70428.
The compounds of the general formula (I) other than the above compounds can be synthesized by taking into account the general knowledge of synthetic chemists in the synthesis method of benzaldehyde compounds described in the above literature.

本発明において用いる好ましいベンズアルデヒド化合物は、ベンズアルデヒド、５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸、４，６−０−ベンジリデン−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−ベンジリデンエチルアミン、２−フェニル−１，３−ジオキソラン、２−フェニル−４−メチル−１，３−ジオキソラン、２−フェニル−１，３−ジオキサンを含む。本発明において用いるより好ましいベンズアルデヒド化合物は、ベンズアルデヒドまたは５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸である。なお、２−フェニル−１，３−ジオキソラン、２−フェニル−４−メチル−１，３−ジオキソラン、２−フェニル−１，３−ジオキサンの構造式は次のとおりである。
Preferred benzaldehyde compounds used in the present invention are benzaldehyde, 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid, 4,6-0-benzylidene-D-glucopyranose, N-benzylideneethylamine, 2-phenyl-1,3- Dioxolane, 2-phenyl-4-methyl-1,3-dioxolane, 2-phenyl-1,3-dioxane. A more preferred benzaldehyde compound used in the present invention is benzaldehyde or 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid. The structural formulas of 2-phenyl-1,3-dioxolane, 2-phenyl-4-methyl-1,3-dioxolane, and 2-phenyl-1,3-dioxane are as follows.

なお、本発明の医薬組成物の有効成分である化合物が少なくとも１個の不斉中心を持っている場合は、種々の光学異性体または配置のものが存在し得る。したがって、本発明の化合物は、（＋）および（−）の別々の光学活性体として、およびラセミ体または（±）混合物として存在し得る。また、不斉中心を２個以上持つ化合物の場合には、さらにそれぞれの光学異性によるジアステレオマーも存在し得る。本発明はこれらすべての型をその範囲に包含するものである。たとえば、ジアステレオマーは当業者によく知られた方法、たとえば分別結晶法等によって分離することができ、また、光学活性体はこの目的のためによく知られた有機化学的手法によって得ることができる。   In addition, when the compound which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention has at least one asymmetric center, various optical isomers or arrangements may exist. Thus, the compounds of the present invention can exist as separate optically active forms of (+) and (−) and as racemates or (±) mixtures. In addition, in the case of a compound having two or more asymmetric centers, diastereomers by respective optical isomerism may also exist. The present invention includes all these types within its scope. For example, diastereomers can be separated by methods well known to those skilled in the art, such as fractional crystallization, and optically active forms can be obtained by organic chemistry techniques well known for this purpose. it can.

また、本発明の有効成分であるベンズアルデヒド化合物は必要に応じて、「薬学上許容され得る塩」にすることができる。「薬学上許容され得る塩」は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩のような鉱酸塩；メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなスルホン酸塩；シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、アスコルビン酸塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム塩、アスコルビン酸カリウム塩など）、乳酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩のような有機酸塩等の酸付加塩、好適には塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩である。本発明において、５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩またはカリウム塩は好ましい塩形態である。   Moreover, the benzaldehyde compound which is an active ingredient of this invention can be made into a "pharmaceutically acceptable salt" as needed. “Pharmaceutically acceptable salt” refers to, for example, mineral salts such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, sulfate, nitrate; methanesulfonate, ethanesulfonic acid Sulfonates such as salts, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate; oxalate, tartrate, citrate, maleate, succinate, acetate, benzoate, mandelate, Acid addition salts such as ascorbate (eg, sodium ascorbate, potassium ascorbate, etc.), lactate, gluconate, malate, etc., preferably hydrochloride, hydrobromic acid Salt, phosphate, sulfate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, oxalate, tartrate, citrate, acetate, lactate. In the present invention, 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid sodium salt or potassium salt is a preferred salt form.

また、本発明の有効成分であるベンズアルデヒド化合物は、水溶液から凍結乾燥したり、又は、再結晶をすることにより、水分を吸収し、あるいは吸着水がついて水和物となる場合があり、そのような塩も本発明の有効成分に包含される。   Further, the benzaldehyde compound that is an active ingredient of the present invention may absorb moisture or become adsorbed water to form a hydrate by lyophilization from an aqueous solution or by recrystallization. Such salts are also included in the active ingredient of the present invention.

２．抗がん剤組成物
本発明に係る調節剤は、１４−３−３タンパク質活性を調節することにより抗がん活性を奏するので、１４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤と併用することによって、抗がん活性を増強した抗がん剤を提供することができる。
したがって、本発明の他の実施態様によれば、本発明の抗がん剤組成物は、（ａ）本発明の１４−３−３タンパク質活性調節剤（第１抗がん剤成分）、及び（ｂ）１４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤（第２抗がん剤成分）を含む。 2. Anti-cancer agent composition Since the regulator according to the present invention exhibits anti-cancer activity by regulating 14-3-3 protein activity, the regulator has an action mechanism not involved in 14-3-3 protein activity. By using in combination with a cancer agent, an anticancer agent with enhanced anticancer activity can be provided.
Therefore, according to another embodiment of the present invention, the anticancer agent composition of the present invention comprises (a) a 14-3-3 protein activity regulator (first anticancer agent component) of the present invention, and (B) an anticancer agent (second anticancer agent component) having an action mechanism not involved in 14-3-3 protein activity.

本発明の好ましい態様によれば、第１抗がん剤成分が、ベンズアルデヒド又は５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸であり；
第２抗がん剤成分が、ゲフィチニブ、塩酸イリノテカン、塩酸トポテカン、ドセタキソール、パクリタキセル、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、テニポシド、酒石酸ビノレルビン、ブスルファン、カルボコン、チオテパ、シクロホスファミド、メルファラン、リン酸エストラムスチンナトリウム、塩酸メクロレタミンオキシド、イホスファミド、ラニムスチン、塩酸ニムスチン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、ジノスタチンスチマラート、アクチノマイシンＤ、塩酸アクラルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、塩酸ダウノルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、マイトマイシン、バルルビシン、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、フルオロウラシル、テガフール、シタラビン、塩酸ゲムシタビン、シタラビンオクホスファート、カペシタビン、ドキシフルリジン、カルモフール、エノシタビン、ネダプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、ビカルタミド、フルタミド、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、トレチノイン、ペントスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、ソブゾキサン、トラスツズマブ、リツキシマブ、メシル酸イマチニブ、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、アスクレ、カルボクリン、キノレスパン、クレスチン、及びピシバニールから選択される一種以上の化合物である。 According to a preferred embodiment of the present invention, the first anticancer agent component is benzaldehyde or 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid;
The second anticancer component is gefitinib, irinotecan hydrochloride, topotecan hydrochloride, docetaxol, paclitaxel, vinblastine sulfate, vincristine sulfate, vindesine sulfate, etoposide, teniposide, vinorelbine tartrate, busulfan, carbocon, thiotepa, cyclophosphamide, melphalan , Estramustine phosphate sodium, mechloretamine oxide hydrochloride, ifosfamide, ranimustine, nimustine hydrochloride, bleomycin hydrochloride, peplomycin sulfate, dinostatin stimalate, actinomycin D, aclarubicin hydrochloride, doxorubicin hydrochloride, idarubicin hydrochloride, amrubicin hydrochloride, daunorubicin hydrochloride , Pirarubicin, epirubicin hydrochloride, mitomycin, valrubicin, methotrexate, mercaptopurine, phosphate Darabine, cladribine, fluorouracil, tegafur, cytarabine, gemcitabine hydrochloride, cytarabine ocphosphate, capecitabine, doxyfluridine, carmofur, enocitabine, nedaplatin, carboplatin, cisplatin, fadrozol hydrochloride, anastrozole, exemestane, fenmetitamide, bicalutamide, bicalutamide Toremifene acid, tretinoin, pentostatin, L-asparaginase, dacarbazine, procarbazine hydrochloride, mitoxantrone hydrochloride, sobuzoxane, trastuzumab, rituximab, imatinib mesylate, 5-fluoro-2'-deoxyuridine, ascle, carbocrine, quinolespan, crestine, And one or more compounds selected from picibanil.

また、抗がん剤の作用機序は多様であり、このため、ある患者に対し、ある作用機序の抗がん剤は有効であるが、その作用機序と異なる作用機序を有する抗がん剤が有効でないという場合もある。使用した抗がん剤の作用機序がその患者の遺伝的背景等を考慮してがん細胞に対して有効に作用しない場合があるからである。
このため、本発明の別の実施態様は、１４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤による治療を受けた患者に投与する、本発明に係る１４−３−３タンパク質活性調節剤を含有する、抗がん剤組成物を提供する。 In addition, the mechanism of action of anticancer agents is diverse, and for this reason, anticancer agents with a certain mechanism of action are effective against certain patients, but have anti-cancer agents with a mechanism of action different from that. In some cases, cancer drugs are not effective. This is because the action mechanism of the used anticancer drug may not act effectively on cancer cells in consideration of the genetic background of the patient.
For this reason, another embodiment of the present invention provides 14-3-3 according to the present invention, which is administered to a patient who has been treated with an anticancer agent having a mechanism of action that does not involve 14-3-3 protein activity. An anticancer agent composition containing a protein activity regulator is provided.

３．本発明の医薬組成物
本発明に係る１４−３−３タンパク質活性調節剤、医薬組成物又は抗がん剤組成物の投与形態は特に制限は無く、経口的あるいは非経口的に投与することが出来る。本発明で用いられるベンズアルデヒド化合物は単独で配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明で用いるベンズアルデヒド化合物は、例えば、製剤中、０．１〜９９．９重量％含有することができる。
本発明においては、このような製剤にさらに、上記他の抗がん剤を配合することもできる。この場合、前記ベンズアルデヒド化合物と他の抗がん剤との配合比は、がんの種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的などによって適宜選択されるが、例えば、１：９９〜９９：１の範囲で選択することができる。本願発明の医薬組成物においては、２種以上の他の抗がん剤を配合することもできる。その場合の配合比も、がんの種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的などによって適宜選択される。 3. Pharmaceutical Composition of the Present Invention The administration form of the 14-3-3 protein activity regulator, pharmaceutical composition or anticancer composition according to the present invention is not particularly limited and can be administered orally or parenterally. I can do it. Although the benzaldehyde compound used in the present invention may be blended alone, it may be provided in the form of a formulation by blending a pharmaceutically acceptable carrier or a pharmaceutical additive thereto. In this case, the benzaldehyde compound used in the present invention can be contained, for example, in an amount of 0.1 to 99.9% by weight in the preparation.
In the present invention, the above-mentioned other anticancer agent can be further added to such a preparation. In this case, the compounding ratio of the benzaldehyde compound and the other anticancer agent is appropriately selected depending on the type of cancer, the age and symptoms of the patient, the administration route, the purpose of treatment, and the like. A range of 99: 1 can be selected. In the pharmaceutical composition of the present invention, two or more kinds of other anticancer agents can be blended. The mixing ratio in that case is also appropriately selected depending on the type of cancer, the age and symptoms of the patient, the administration route, the purpose of treatment, and the like.

製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐH調整剤、安定化剤等を用いることが出来る。   Examples of pharmaceutically acceptable carriers or additives include excipients, disintegrants, disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, solubilizers, solubilizers, isotonic agents. Agents, pH adjusters, stabilizers and the like can be used.

経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトースまたは乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。   Examples of preparations suitable for oral administration include powders, tablets, capsules, fine granules, granules, liquids or syrups. For oral administration, various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, dipotassium phosphate, glycine are added to starch, preferably corn, potato or tapioca starch, and alginic acid and certain species. It can be used with various disintegrants such as silicate double salts and granulating binders such as polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, gum arabic. In addition, lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, and talc are often very effective for tablet formation. The same kind of solid composition can also be used by filling gelatin capsules. Suitable substances in this connection include lactose or lactose as well as high molecular weight polyethylene glycols. When an aqueous suspension and / or elixir is desired for oral administration, the active ingredient is used in combination with various sweeteners or flavors, colorants or dyes, and if necessary, an emulsifier and / or suspending agent is also used. And can be used with water, ethanol, propylene glycol, glycerin, and the like, and diluents that combine them.

非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような水溶液は静脈内注射に適し、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。   Examples of preparations suitable for parenteral administration include injections and suppositories. In the case of parenteral administration, a solution in which the active ingredient of the present invention is dissolved in either sesame oil or peanut oil or dissolved in an aqueous propylene glycol solution can be used. The aqueous solution should be appropriately buffered as necessary (preferably pH 8 or more), and the liquid diluent must first be made isotonic. Such aqueous solutions are suitable for intravenous injection and oily solutions are suitable for intra-articular, intramuscular and subcutaneous injection. All these solutions can be prepared aseptically by standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art. Furthermore, the active ingredient of the present invention can also be administered locally such as on the skin. In this case, topical administration in the form of creams, jellies, pastes, ointments is desirable according to standard pharmaceutical practice.

本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、がんの種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。例えば、経口投与の場合には成人（例えば、体重６０ｋｇ）１日当たり100mgから10g程度、好ましくは150mgから5gである。これらの１日投与量は２から４回に分けて投与されても良い。   The dose of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dose is selected according to various conditions such as the type of cancer, the age and symptoms of the patient, the route of administration, the purpose of treatment, and the presence or absence of a concomitant drug. It is possible to select. For example, in the case of oral administration, it is about 100 mg to 10 g, preferably 150 mg to 5 g per day for an adult (for example, body weight 60 kg). These daily doses may be administered in 2 to 4 divided doses.

実施例及び参考例
以下、本発明を実施例と参考例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 Examples and Reference Examples Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on Examples and Reference Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

（１）免疫抗体法による14-3-3ζ結合蛋白のリン酸化状態の測定
14-3-3結合蛋白は数百ほど存在することが確認されている。14-3-3は特定のセリン/スレオニンのリン酸化を含む配列部分に結合し、リン酸化状態を維持させる。14-3-3との結合が抑制されると、結合蛋白のリン酸化低下が起こる。
がん細胞において活性されているいくつかの経路の中で、14-3-3ζの結合蛋白であることが報告されているmTOR、TSC2、PRAS40とmTORC1の下流であるp70S6Kα、4EBP1、FOXO1 ,FOXO3a上流のPI3K(p85)さらにcRaf、NF-κB、STAT3、βcatenin、Cofilinなどのリン酸化がベンズアルデヒドの投与によって低下するか否かを免疫抗体法にて確認した。 (1) Measurement of phosphorylation state of 14-3-3ζ binding protein by immuno-antibody method
Several hundred 14-3-3 binding proteins have been identified. 14-3-3 binds to a sequence portion containing specific serine / threonine phosphorylation and maintains the phosphorylated state. When binding to 14-3-3 is suppressed, phosphorylation of the binding protein is reduced.
Among several pathways active in cancer cells, p70S6Kα, 4EBP1, FOXO1 and FOXO3a are downstream of mTOR, TSC2, PRAS40 and mTORC1, which are reported to be 14-3-3ζ binding proteins. Whether or not phosphorylation of upstream PI3K (p85) and cRaf, NF-κB, STAT3, βcatenin, Cofilin, etc. was reduced by administration of benzaldehyde was confirmed by an immunoantibody method.

6ウェルプレートの各ウェルにヒト膵臓がん細胞株BxPC-3細胞を 1.5×10５ずつ播種。RPMI培地（5%牛胎児血清、1%ペニシリン、ストレプトマイシンを含む）は各ウェル2ml投与し24時間培養後、ベンズアルデヒド（SIGMA）0μM、100μM、500μM添加の培養液に交換する。ベンズアルデヒドは水への溶解度が0.6w/w%（20℃）と非常に低いためにRPMI溶液に添加後1分以上ボルテックスにて混和する。また、揮発性が非常に高く培地内からの気化を抑えるために、ベンズアルデヒドを含むRPMI培地は約8mlずつと多めに各ウェルに充填し、表面をシールで密閉してから培養器に入れた。細胞は0時間、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間に回収。回収は培養液を1×PBSにて置換後各ウェル100μlのライシスバッファー（2% SDS、10% glycerol、50mM Tris(pH6.8)）で溶解した細胞液を27Gの注射針にてホモジネート後、95度で5分加熱。比色法にて蛋白量を測定し、パジェルゲル各ウェルに15μgずつのタンパクを注入し、SDS-PAGE溶液中で電気泳動を行う。ニトロセルロース膜に蛋白を移行させて、ミルクでブロッキング後一次抗体を反応させる。 Seeded human pancreatic cancer cell line BxPC-3 cells by 1.5 × 10 5 per well of 6-well plates. RPMI medium (containing 5% fetal bovine serum, 1% penicillin, streptomycin) is administered in 2 ml of each well, cultured for 24 hours, and then replaced with a culture solution supplemented with benzaldehyde (SIGMA) 0 μM, 100 μM, and 500 μM. Since benzaldehyde has a very low solubility in water of 0.6 w / w% (20 ° C), add it to the RPMI solution and mix by vortexing for at least 1 minute. In addition, in order to suppress vaporization from the inside of the medium because of its extremely high volatility, RPMI medium containing benzaldehyde was filled into each well in a large amount of about 8 ml, and the surface was sealed with a seal and then placed in an incubator. Cells were collected at 0, 2, 4, 8, 12, and 24 hours. After the culture medium was replaced with 1 × PBS, the cell solution dissolved in 100 μl of lysis buffer (2% SDS, 10% glycerol, 50 mM Tris (pH 6.8)) was homogenized with a 27G injection needle. Heat at 95 degrees for 5 minutes. The amount of protein is measured by a colorimetric method, 15 μg of protein is injected into each well of the pagel gel, and electrophoresis is performed in an SDS-PAGE solution. The protein is transferred to the nitrocellulose membrane, and after blocking with milk, the primary antibody is reacted.

１次抗体はp70S6Kα（Cell signaling technology；CST）、p-p70S6Kα（CST）、4EBP1（CST）、p-4EBP1（CST）、mTOR（CST）、p-mTOR（CST）、TSC2(CST)、p-TSC2(CST)、PRAS40、p-PRAS40、p85（CST）、p-p85（CST）、FOXO1(CST)、p-FOXO1/FOXO3a(CST)、FOXO3a（CST）、p-FOXO3a（CST）、IκB(CST)、p- IκB(CST)、p65（Santa Cruz）、cRaf（CST）、STAT3（CST）、p- STAT3（CST）、βcatenin（Santa Cruz）、p-βcatenin（CST）、Cofilin(CST)、p- Cofilin(CST)、14-3-3ζ（Santa Cruz）、βactin(SIGMA)を用いた。βactinは10000倍、それ以外の抗体は500〜1000倍に希釈して反応させた。二次抗体を反応させた後LAS3000（富士フィルム)で検出を行った。
p-14-3-3 binding antibody(CST)はBA投与群と投与しない群を24時間後の変化で比較した。
実験結果を図１〜５に示す。 Primary antibodies are p70S6Kα (Cell signaling technology; CST), p-p70S6Kα (CST), 4EBP1 (CST), p-4EBP1 (CST), mTOR (CST), p-mTOR (CST), TSC2 (CST), p -TSC2 (CST), PRAS40, p-PRAS40, p85 (CST), p-p85 (CST), FOXO1 (CST), p-FOXO1 / FOXO3a (CST), FOXO3a (CST), p-FOXO3a (CST), IκB (CST), p-IκB (CST), p65 (Santa Cruz), cRaf (CST), STAT3 (CST), p-STAT3 (CST), βcatenin (Santa Cruz), p-βcatenin (CST), Cofilin ( CST), p-Cofilin (CST), 14-3-3ζ (Santa Cruz), and βactin (SIGMA) were used. βactin was diluted 10,000 times, and other antibodies were diluted 500-1000 times. After reacting with the secondary antibody, detection was performed with LAS3000 (Fuji Film).
p-14-3-3 binding antibody (CST) was compared between the BA administration group and the non-administration group after 24 hours.
Experimental results are shown in FIGS.

（２）免疫沈降抗体法を用いた14-3-3ζと結合蛋白の蛋白蛋白間結合の測定、及び14-3-3ζ以外のアイソフォーム14-3-3θ、η、β、ε、γ、σにおけるベンズアルデヒドの効果の比較
14-3-3ζとの結合が報告されている蛋白の中でmTORC1の構成因子であるmTOR、Raptor、Rictor、AKTによってリン酸化される基質であるPRAS40、TSC2、FOXO1、FOXO3a、βcatenin、がんの進行において重要であるSTAT3、cRaf、 p65などについてベンズアルデヒドの投与によって蛋白間蛋白間結合に変化がもたらされるかを調べた。 (2) Measurement of protein-protein binding between 14-3-3ζ and binding protein using immunoprecipitation antibody method, and isoforms 14-3-3θ other than 14-3-3ζ, η, β, ε, γ, Comparison of the effects of benzaldehyde on σ
PTOR40, TSC2, FOXO1, FOXO3a, βcatenin, a substrate that is phosphorylated by mTOR, Raptor, Rictor, and AKT among the proteins that have been reported to bind to 14-3-3ζ, cancer STAT3, cRaf, p65, etc., which are important in the progression of this, were examined to determine whether administration of benzaldehyde caused changes in protein-protein protein-protein binding.

6ウェルプレートにDMEM培地を添加し、HEK293T細胞を4×10５個/各ウェルに播種する。24時間経過後14-3-3ζにcMyc標識のついたcDNAベクターと空のベクターを6ウェルにつき9〜18μgトランスフェクションさせた細胞を24時間培養する。ベンズアルデヒド500μMとベンズアルデヒド未添加のDMEM培地に交換する。ベンズアルデヒドは揮発性を考え、前述と同様各ウェルには約8mlの培養液を充填し、シールで密閉後に培養器に入れる。24時間経過後、PBS置換後にトリプシンで細胞をはがして細胞浮遊液を作る。細胞浮遊液の細胞数を測定し、1×10７個になるよう細胞数を調節する。 DMEM medium is added to a 6-well plate, and HEK293T cells are seeded at 4 × 10 5 cells / well. After 24 hours, cells transfected with 9-18 μg of a cDNA vector labeled with cMyc on 14-3-3ζ and an empty vector per 6 wells are cultured for 24 hours. Replace with 500 μM benzaldehyde and DMEM medium without benzaldehyde. Considering volatility of benzaldehyde, each well is filled with about 8 ml of culture solution as described above, sealed with a seal, and placed in an incubator. After 24 hours, remove the cells with trypsin after replacement with PBS to make a cell suspension. Measuring the number of cells in the cell suspension, adjusting the cell number so as to be 1 × 10 7 cells.

免疫沈降用のライシスバッファー(100mM Tris、300mM NaCl、10mM EDTA、2% Nonidet P-40)1ml)を30分反応させて、細胞を溶解し、遠心後の上清の50μlを免疫沈降前の検体として採取する。残りの900μlは免疫沈降用でcMYC抗体5〜8μlとBSAにてブロッキング済のプロテインAビーズを添加し、冷蔵室のターンテーブルにて2時間以上反応させる。14-3-3ζと結合した蛋白をcMYC標識部分に反応する抗体の働きでビーズに吸着させることができる。ビーズ洗浄後蛋白間結合を切断するライシスバッファー（2% SDS、10% glycerol、50mM Tris(pH6.8)）を添加し、切断されて溶出した蛋白成分を免疫電気泳動にて検出行う。一次抗体として（１）にて使用した抗体の他にRaptor（CST）、Rictor(CST)、cRaf（CST）、cMYC（Santa Cruz）を使用した。二次抗体反応後LAS3000にて検出を行った。   Lysis buffer for immunoprecipitation (100 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2% Nonidet P-40) 1 ml) was reacted for 30 minutes to lyse the cells, and 50 μl of the supernatant after centrifugation was sampled before immunoprecipitation Collect as The remaining 900 μl is used for immunoprecipitation, 5 to 8 μl of cMYC antibody and protein A beads blocked with BSA are added, and reacted for 2 hours or longer on a turntable in a refrigerator. The protein bound to 14-3-3ζ can be adsorbed to the beads by the action of an antibody that reacts with the cMYC labeling moiety. After washing the beads, a lysis buffer (2% SDS, 10% glycerol, 50 mM Tris (pH 6.8)) that cleaves protein-protein bonds is added, and the cleaved and eluted protein components are detected by immunoelectrophoresis. In addition to the antibody used in (1), Raptor (CST), Rictor (CST), cRaf (CST), and cMYC (Santa Cruz) were used as primary antibodies. After the secondary antibody reaction, detection was performed with LAS3000.

14-3-3ζ以外のアイソフォーム14-3-3θ、η、β、ε、γ、σにおいても14-3-3ζと同様の過程を経てcMYC標識のついたcDNAベクターをトランスフェクションさせ、免疫沈降抗体法を用いてベンズアルデヒド投与による結合蛋白との結合状態を確認した。結合蛋白はすべての14-3-3アイソフォームとの結合が報告されているcRafの他にRictor、Raptor、FOXO1などを用いた。免疫電気泳動の一次抗体として14-3-3θ（Santa Cruz）、η(IBL 免疫生物研究所)、β（Santa Cruz）、ε（Santa Cruz）、γ（Santa Cruz）、σ(IBL 免疫生物研究所)を使用した。
実験結果を図６〜１１に示す。 In the isoforms 14-3-3θ, η, β, ε, γ, and σ other than 14-3-3ζ, a cDNA vector labeled with cMYC was transfected through the same process as 14-3-3ζ for immunization. The binding state with the binding protein by benzaldehyde administration was confirmed using the precipitation antibody method. Rictor, Raptor, FOXO1, etc. were used as the binding protein in addition to cRaf, which has been reported to bind to all 14-3-3 isoforms. 14-3-3θ (Santa Cruz), η (IBL Institute for Immunobiology), β (Santa Cruz), ε (Santa Cruz), γ (Santa Cruz), σ (IBL Immunobiology Research) as primary antibodies for immunoelectrophoresis ) Was used.
Experimental results are shown in FIGS.

（３）Tau蛋白リン酸化に対するベンズアルデヒドの作用の確認
14-3-3ζはアルツハイマー病において発現が増加し、ラット海馬において14-3-3ζ蛋白はタウ蛋白262番目のセリン（Ser262）のリン酸化を増加させ、多くのタウと結合する微小管と、シナプス前蛋白質のシナプトフィシンを減量させる。Ser262のリン酸化はβアミロイドの神経毒性を引き起こし、脳内に毒性を持ったタウ領域を形成させる。 (3) Confirmation of the action of benzaldehyde on Tau protein phosphorylation
14-3-3ζ is up-regulated in Alzheimer's disease, and in the rat hippocampus 14-3-3ζ protein increases phosphorylation of the tau protein 262th serine (Ser 262 ), and microtubules that bind to many tau Reduce the amount of presynaptic protein synaptophysin. Phosphorylation of Ser 262 causes β-amyloid neurotoxicity and forms a toxic tau region in the brain.

病態形成の鍵となるタウ蛋白Ser262のリン酸化の変化を確認するために（２）にて採取したHEK293T細胞に14-3-3ζcDNAをトランスフェクションした細胞のライシスを用いて、ベンズアルデヒドを24時間反応させたものと、未治療の群との発現の差を免疫電気泳動法にて比較した。一次抗体はp-Tau/Ser262(life technology)を使用した。
実験結果を図１２に示す。 To confirm the phosphorylation of tau protein Ser 262 , which is the key to pathogenesis, benzaldehyde was treated for 24 hours using the lysis of 14-3-3ζ cDNA transfected into HEK293T cells collected in (2). The difference in expression between the reacted group and the untreated group was compared by immunoelectrophoresis. As the primary antibody, p-Tau / Ser 262 (life technology) was used.
The experimental results are shown in FIG.

（４）短鎖ヘアピンRNAを用いたRNA干渉法により14-3-3ζ蛋白の発現を抑制させた細胞におけるベンズアルデヒドの作用を確認する実験。
ベンズアルデヒドが14-3-3ζ蛋白に作用することを示すために、RNA干渉法によって14-3-3ζ蛋白をノックダウンさせた細胞において、従来の癌細胞と比較してベンズアルデヒドの活性経路の抑制が低下するかを比較検討した。すでに論文報告のある14-3-3z： Sigma-Aldrich社 TRCN0000029405のレンチウィルスベクター(Oncogene 33, 589-598, 30 January 2014)を用いてLenti-X293細胞にトランスフェクションを行い、回収した上清をBxPC3細胞およびA549細胞にインフェクションさせ、ピューロマイシン処置後、shRNAを発現する細胞を選別して実験に使用した。６ウェルプレートに選別したBxPC3細胞を2.3×10５個/各ウェル、選別したA549細胞を2.5×10５個/各ウェル播種し、翌日ベンズアルデヒド(BA) 500μMを添加し、添加後0時間、0.5時間、2時間で細胞を回収し、各回収細胞のライセートを作り、免疫抗体法にて14-3-3ζ、pan14-3-3(Santa Cruz)、pS6（CST）、S6（CST）、pERK（CST）、ERK（CST）、pTSC2、TSC2、pRictor、Rictorの抗体を反応させて発現を比較した。
BxPC3細胞およびA549細胞の実験結果をそれぞれ図13および図14に示す。 (4) An experiment for confirming the action of benzaldehyde in cells in which the expression of 14-3-3ζ protein is suppressed by RNA interference using short hairpin RNA.
In order to show that benzaldehyde acts on 14-3-3ζ protein, in the cells in which 14-3-3ζ protein was knocked down by RNA interference method, the benzaldehyde active pathway was suppressed compared to conventional cancer cells. A comparison was made to see if it decreases. Previously reported 14-3-3z: Lenti-X293 cells were transfected using lentiviral vector (Oncogene 33, 589-598, 30 January 2014) of TRCN0000029405 from Sigma-Aldrich. BxPC3 cells and A549 cells were infected, and after puromycin treatment, cells expressing shRNA were selected and used for experiments. BxPC3 cells sorted into a 6-well plate were seeded at 2.3 × 10 5 cells / well, the sorted A549 cells were seeded at 2.5 × 10 5 cells / well, and the next day, 500 μM benzaldehyde (BA) was added. Cells are collected in 2 hours, and lysates of each collected cell are prepared. 14-3-3ζ, pan14-3-3 (Santa Cruz), pS6 (CST), S6 (CST), pERK are prepared by immuno-antibody method. (CST), ERK (CST), pTSC2, TSC2, pRictor and Rictor antibodies were reacted to compare expression.
The experimental results of BxPC3 cells and A549 cells are shown in FIGS. 13 and 14, respectively.

（５）実験結果及び考察
膵臓がん細胞株BxPC3細胞、肺がん細胞株A549細胞などにおいてベンズアルデヒドの抑制するPathwayを調べると、がん細胞において亢進しているPI3K-AKT-mTOR pathway、RAF-ERK pathway、STAT3 pathwayなど多系統に抑制することを見出した（齋藤 潤ら、第71回日本癌学会学術総会(2012) P-2073、第72回日本癌学会学術総会(2013) P-3399、第73回日本癌学会学術総会(2014) J-2017）。そこで多くのタンパク質のリン酸化部分に結合する１４−３−３タンパク質に注目し、特にがん細胞で発現が亢進している１４−３−３タンパク質のアイソフォームである１４−３−３ζについて検討を行った。１４−３−３ζとの結合が報告されている各タンパク質のリン酸化はベンズアルデヒド投与によってPI3K(p85)、mTOR、PRAS40、TSC2、p70S6Kα、FOXO3a、cRaf、STAT3、NFκB(p65)、βCatenin、Cofilinの抑制が確認された。14-3-3ζのタンパク質発現量の抑制は確認されない事から、蛋白蛋白間結合が作用部分と考えられる。ヒト胎児腎細胞由来のHEK293T細胞に１４−３−３ζのｐｃDNAをトランスフェクションした細胞を用いて免疫沈降を行い１４−３−３ζと各タンパク質の結合の変化を比較した結果、ベンズアルデヒドは１４−３−３ζとmTOR、TSC2、Raptor、Rictor、cRaf、FOXO1、FOXO3a、及びSTAT3の各タンパク質との結合を抑制することを見出した（図１〜５）。 (5) Experimental results and discussion When investigating the pathway of benzaldehyde inhibition in pancreatic cancer cell line BxPC3 cell, lung cancer cell line A549 cell, etc., PI3K-AKT-mTOR pathway and RAF-ERK pathway are enhanced in cancer cells. And STAT3 pathway were found to be suppressed in multiple systems (Jun Saito et al., 71st Annual Meeting of the Japanese Cancer Society (2012) P-2073, 72nd Annual Meeting of the Japanese Cancer Society (2013) P-3399, 73) Annual Scientific Meeting of the Japanese Cancer Association (2014) J-2017). Therefore, focusing on the 14-3-3 protein that binds to the phosphorylated portion of many proteins, especially 14-3-3ζ, an isoform of the 14-3-3 protein whose expression is enhanced in cancer cells. Went. Phosphorylation of each protein that has been reported to bind to 14-3-3ζ was induced by PI3K (p85), mTOR, PRAS40, TSC2, p70S6Kα, FOXO3a, cRaf, STAT3, NFκB (p65), βCatenin, Cofilin by benzaldehyde administration. Inhibition was confirmed. Since suppression of the protein expression level of 14-3-3ζ has not been confirmed, protein-protein binding is considered to be the action part. As a result of immunoprecipitation using human fetal kidney cell-derived HEK293T cells transfected with 14-3-3ζ pcDNA and comparing changes in binding between 14-3-3ζ and each protein, benzaldehyde was 14-3 It was found that the binding of -3ζ to mTOR, TSC2, Raptor, Rictor, cRaf, FOXO1, FOXO3a, and STAT3 was suppressed (FIGS. 1 to 5).

なお、14-3-3タンパク質の7個のアイソフォームの中でζ以外のβ、γ、ε、θ、η、σについてHEK293T細胞にそれぞれのｐｃDNAのtransfectionを行いcRaf、Rictorなどについてベンズアルデヒド投与の効果を比較すると、１４−３−３θは変化を示さず、１４−３−３β、γ、ε、ηでは軽度結合の抑制を示し、１４−３−３σとは軽度の結合増加を示した（図６〜１１）。
これらの実験結果から、既知の抗がん剤であるベンズアルデヒドまたはその誘導体の作用機序は、１４−３−３タンパク質（特に、１４−３−３ζタンパク質）の結合蛋白との結合阻害であることが確認された。 Of the seven isoforms of 14-3-3 protein, β, γ, ε, θ, η, and σ other than ζ were transfected with each pcDNA into HEK293T cells, and cRaf, Rictor, etc. were treated with benzaldehyde. Comparing the effects, 14-3-3θ showed no change, 14-3-3β, γ, ε, and η showed mild binding inhibition, and 14-3-3σ showed mild binding increase ( 6-11).
From these experimental results, the action mechanism of benzaldehyde or its derivative, which is a known anticancer agent, is the inhibition of binding of 14-3-3 protein (especially 14-3-3ζ protein) to the binding protein. Was confirmed.

一方、アルツハイマー病の病理変化は脳の海馬におけるβアミロイドペプチドの蓄積、タウ蛋白の高リン酸化、シナプスの欠失などである。１４−３−３ζはアルツハイマー病において発現が増加し、ラット海馬において１４−３−３ζ蛋白はタウ蛋白262番目のセリン（Ser262）のリン酸化を増加させ、多くのタウと結合する微小管と、シナプス前蛋白質のシナプトフィシンを減量させる。Ser262のリン酸化はβアミロイドの神経毒性を引き起こし、脳内に毒性を持ったタウ領域を形成させる（Qureshi, H.Yら、PLoS ONE 2013; 8(12): 1-14）。
上記実験によって、HEK293T細胞において、ベンズアルデヒドはSer262のリン酸化を抑制することを見いだした（図12）。したがって、本発明に係る１４−３−３タンパク質活性調節剤は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療に有用であることが示された。 On the other hand, pathological changes in Alzheimer's disease include accumulation of β-amyloid peptide, hyperphosphorylation of tau protein, synapse loss in the hippocampus of the brain. 14-3-3ζ is increased in Alzheimer's disease, and in the rat hippocampus 14-3-3ζ protein increases phosphorylation of the tau protein 262th serine (Ser 262 ), and microtubules that bind to many tau Reduce the amount of presynaptic protein synaptophysin. Phosphorylation of Ser 262 causes β-amyloid neurotoxicity and forms a toxic tau region in the brain (Qureshi, HY et al., PLoS ONE 2013; 8 (12): 1-14).
From the above experiment, it was found that benzaldehyde suppresses phosphorylation of Ser 262 in HEK293T cells (FIG. 12). Therefore, it was shown that the 14-3-3 protein activity regulator according to the present invention is useful for the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease.

図13では、短鎖ヘアピン RNAを用いたRNA干渉法により14-3-3ζ蛋白をノックダウンしたBxPC3細胞におけるベンズアルデヒドの作用をコントロールベクターと比較している。14-3-3ζノックダウン細胞BxPC3において、mTORシグナルの活性を示すS6のリン酸化(p-S6)、Rictorのリン酸化(p-Rictor)、ERKシグナルの活性を示すpERKのリン酸化(p-ERK)のベンズアルデヒド投与による顕著な低下が14-3-3ζ蛋白ノックダウンによって抑えられた。さらに、各リン酸化の発現自体もノックダウンによって抑制された。
図14では、図13と同様に、14-3-3ζをノックダウンしたA549細胞において、mTORシグナルの活性を示すS6、TSC2、Rictorのリン酸化(それぞれp-S6、p-TSC2、p-Rictor)のベンズアルデヒド投与による顕著な低下が、14-3-3ζ蛋白ノックダウンによって抑制された。また、各リン酸化の発現自体もノックダウンによって抑制されていることが確認された。
図13および図14の結果から、14-3-3ζ蛋白の発現が高く、mTORシグナル、ERKシグナルの活性の高い細胞がベンズアルデヒド高感受性細胞であること、よってベンズアルデヒド化合物を含む組成物が14-3-3タンパク質（特に14-3-3ζタンパク質）の活性調節剤として、mTORシグナル活性、ERKシグナル活性の調節等に有用であることを見い出した。 In FIG. 13, the action of benzaldehyde in BxPC3 cells in which 14-3-3ζ protein was knocked down by RNA interference method using short hairpin RNA was compared with the control vector. In BxPC3 14-3-3ζ knockdown cell, phosphorylation of S6 (p-S6) indicating mTOR signal activity, phosphorylation of Rictor (p-Rictor), phosphorylation of pERK indicating activity of ERK signal (p- ERK) was significantly reduced by benzaldehyde administration by 14-3-3ζ protein knockdown. Furthermore, the expression of each phosphorylation itself was also suppressed by knockdown.
In FIG. 14, as in FIG. 13, phosphorylation of S6, TSC2, and Rictor showing the activity of mTOR signal (p-S6, p-TSC2, and p-Rictor respectively) in A549 cells knocked down 14-3-3ζ. ) Was significantly suppressed by 14-3-3ζ protein knockdown. It was also confirmed that the expression of each phosphorylation itself was suppressed by knockdown.
From the results of FIG. 13 and FIG. 14, the expression of 14-3-3ζ protein is high, and the cells having high mTOR signal and ERK signal activity are benzaldehyde-sensitive cells, and thus the composition containing a benzaldehyde compound is 14-3. As an activity regulator of -3 protein (especially 14-3-3ζ protein), it was found useful for the regulation of mTOR signal activity and ERK signal activity.

（参考文献）
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本発明の１４−３−３タンパク質活性調節剤は、１４−３−３タンパク質活性が関与する疾患の治療のための医薬として用いることができる。特に、本発明の調節剤又は医薬組成物は、アルツハイマーなどの神経変性疾患の治療剤、抗がん剤などとして有効に用いることができる。
また、本発明の調節剤は、作用機序の異なる公知の抗がん剤と組み合わせて用いることもでき、異なる作用機序の抗がん剤を併用することによって、相加的または相乗的な治療効果を期待することができる。 The 14-3-3 protein activity regulator of the present invention can be used as a medicament for the treatment of diseases involving 14-3-3 protein activity. In particular, the regulator or pharmaceutical composition of the present invention can be effectively used as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, an anticancer agent and the like.
In addition, the regulator of the present invention can be used in combination with known anticancer agents having different action mechanisms, and can be additively or synergistically used in combination with anticancer agents having different action mechanisms. A therapeutic effect can be expected.

Claims (14)

ベンズアルデヒド化合物又はその薬学的に許容される塩を含む、１４−３−３タンパク質活性調節剤。   A 14-3-3 protein activity regulator comprising a benzaldehyde compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 前記ベンズアルデヒド化合物が、下記一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ1は−ＣＨＯ、−ＣＸＯ（ここで、Ｘはハロゲン基）、ジオキソラニル基、ジオキサニル基、−ＣＮ−Ｒ3（Ｒ3は低級アルキル基）、
を；Ｒ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基又は低級アルコキシ基を；
そしてｎは１〜５の整数を表す）で示される、請求項１に記載の調節剤。 The benzaldehyde compound is represented by the following general formula (I):
(Wherein R 1 is —CHO, —CXO (where X is a halogen group), dioxolanyl group, dioxanyl group, —CN—R 3 (R 3 is a lower alkyl group),
Each R 2 independently represents a hydrogen atom, a halogen group, a lower alkyl group, a lower alkenyl group, a lower alkynyl group or a lower alkoxy group;
And n represents an integer of 1 to 5). 前記ベンズアルデヒド化合物が、一般式（Ｉ）の化合物であって、Ｒ1が−ＣＨＯ、１，３−ジオキソラニル基、１，３−ジオキサニル基、又は
であり；Ｒ2はそれぞれ独立して水素原子又はハロゲン基である、請求項２に記載の調節剤。 The benzaldehyde compound is a compound of the general formula (I), and R 1 is —CHO, 1,3-dioxolanyl group, 1,3-dioxanyl group, or
The regulator according to claim 2, wherein each R 2 is independently a hydrogen atom or a halogen group. 前記ベンズアルデヒド化合物が、ベンズアルデヒド、５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸、４，６−０−ベンジリデン−Ｄ−グルコピラノースまたはＮ−ベンジリデンエチルアミンである、請求項３に記載の調節剤。   The regulator according to claim 3, wherein the benzaldehyde compound is benzaldehyde, 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid, 4,6-0-benzylidene-D-glucopyranose or N-benzylideneethylamine. １４−３−３ζタンパク質の活性を調節する、請求項１〜４のいずれかに記載の調節剤。   The regulator according to any one of claims 1 to 4, which regulates the activity of 14-3-3ζ protein. １４−３−３ζタンパク質と１４−３−３ζタンパク質に結合するタンパク質との結合を抑制する、請求項１〜５のいずれかに記載の調節剤。   The regulator in any one of Claims 1-5 which suppresses the coupling | bonding of 14-3-3ζ protein and the protein couple | bonded with 14-3-3ζ protein. 前記１４−３−３ζタンパク質に結合するタンパク質が、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＴＳＣ２、ｃＲａｆ、ＳＴＡＴ３、ＦＯＸＯ１及びＦＯＸＯ３aから選択される１以上のタンパク質である、請求項６に記載の調節剤。   The regulator according to claim 6, wherein the protein that binds to the 14-3-3ζ protein is one or more proteins selected from mTOR, Raptor, Rictor, TSC2, cRaf, STAT3, FOXO1 and FOXO3a. Ｔａｕタンパク質のセリン（Ser262）のリン酸化を抑制する、請求項１〜７に記載の調節剤。   The regulator of Claims 1-7 which suppresses phosphorylation of serine (Ser262) of Tau protein. 請求項１〜８に記載の調節剤及び薬学的に許容し得る担体を含有する、１４−３−３タンパク質活性が関与する疾患の治療のための医薬組成物。   A pharmaceutical composition for the treatment of a disease involving 14-3-3 protein activity, comprising the modulator according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 前記１４−３−３タンパク質活性が関与する疾患が、神経変性疾患、がん、てんかん、神経障害性疼痛、心疾患、糖尿病性疾患、自己免疫疾患、又はウィルス感染疾患である、請求項９に記載の医薬組成物。   The disease in which the 14-3-3 protein activity is involved is a neurodegenerative disease, cancer, epilepsy, neuropathic pain, heart disease, diabetic disease, autoimmune disease, or viral infection disease. The pharmaceutical composition as described. 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、進行性多巣性白質脳症、レビー小体型認知症、皮質基底核変性症、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、パーキンソン症候群、脊髄小脳変性症、痙性対麻痺、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、進行性多巣性白質脳症、又は非ヘルペス性急性辺縁系脳炎である、請求項１０に記載の医薬組成物。   The neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, Creutzfeldt-Jakob disease, progressive multifocal leukoencephalopathy, Lewy body dementia, Corticobasal degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, Parkinson's syndrome, spinocerebellar degeneration, spastic paraparesis, spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, progressive multifocal leukoencephalopathy, or non-herpes The pharmaceutical composition according to claim 10, which is sexual acute limbic encephalitis. 請求項１〜８に記載の１４−３−３タンパク質活性調節剤（第１抗がん剤成分）、及び１４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤（第２抗がん剤成分）を含む、抗がん剤組成物。   The 14-3-3 protein activity regulator (first anticancer agent component) according to claim 1, and an anticancer agent having a mechanism of action not involved in 14-3-3 protein activity (second An anticancer agent composition comprising an anticancer agent component). 第１抗がん剤成分が、ベンズアルデヒド又は５，６−０−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸であり；
第２抗がん剤成分が、ゲフィチニブ、塩酸イリノテカン、塩酸トポテカン、ドセタキソール、パクリタキセル、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、テニポシド、酒石酸ビノレルビン、ブスルファン、カルボコン、チオテパ、シクロホスファミド、メルファラン、リン酸エストラムスチンナトリウム、塩酸メクロレタミンオキシド、イホスファミド、ラニムスチン、塩酸ニムスチン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、ジノスタチンスチマラート、アクチノマイシンＤ、塩酸アクラルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸アムルビシン、塩酸ダウノルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、マイトマイシン、バルルビシン、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、フルオロウラシル、テガフール、シタラビン、塩酸ゲムシタビン、シタラビンオクホスファート、カペシタビン、ドキシフルリジン、カルモフール、エノシタビン、ネダプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、ビカルタミド、フルタミド、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、トレチノイン、ペントスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、ソブゾキサン、トラスツズマブ、リツキシマブ、メシル酸イマチニブ、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、アスクレ、カルボクリン、キノレスパン、クレスチン、及びピシバニールから選択される一種以上の化合物である前記請求項１１記載の抗がん剤組成物。 The first anticancer component is benzaldehyde or 5,6-0-benzylidene-L-ascorbic acid;
The second anticancer component is gefitinib, irinotecan hydrochloride, topotecan hydrochloride, docetaxol, paclitaxel, vinblastine sulfate, vincristine sulfate, vindesine sulfate, etoposide, teniposide, vinorelbine tartrate, busulfan, carbocon, thiotepa, cyclophosphamide, melphalan , Estramustine phosphate sodium, mechloretamine oxide hydrochloride, ifosfamide, ranimustine, nimustine hydrochloride, bleomycin hydrochloride, peplomycin sulfate, dinostatin stimalate, actinomycin D, aclarubicin hydrochloride, doxorubicin hydrochloride, idarubicin hydrochloride, amrubicin hydrochloride, daunorubicin hydrochloride , Pirarubicin, epirubicin hydrochloride, mitomycin, valrubicin, methotrexate, mercaptopurine, phosphate Darabine, cladribine, fluorouracil, tegafur, cytarabine, gemcitabine hydrochloride, cytarabine ocphosphate, capecitabine, doxyfluridine, carmofur, enocitabine, nedaplatin, carboplatin, cisplatin, fadrozol hydrochloride, anastrozole, exemestane, fenmetitamide, bicalutamide, bicalutamide Toremifene acid, tretinoin, pentostatin, L-asparaginase, dacarbazine, procarbazine hydrochloride, mitoxantrone hydrochloride, sobuzoxane, trastuzumab, rituximab, imatinib mesylate, 5-fluoro-2'-deoxyuridine, ascle, carbocrine, quinolespan, crestine, And one or more compounds selected from Pichibanil. Anticancer agent composition. １４−３−３タンパク質活性に関与しない作用機序を有する抗がん剤による治療を受けた患者に投与する、請求項１〜８に記載の１４−３−３タンパク質活性調節剤を含有する、抗がん剤組成物。   The 14-3-3 protein activity regulator according to claim 1, which is administered to a patient who has been treated with an anticancer drug having a mechanism of action not involved in 14-3-3 protein activity. Anticancer agent composition.
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