JP2017037029A - Method of controlling biomolecule mobility and electrophoresis tank - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、脂質分子からなる支持膜に担持される生体分子の移動度を制御するための技術に関する。 The present invention relates to a technique for controlling the mobility of biomolecules carried on a support membrane made of lipid molecules.
微量の生体分子を効率よく検出するためには、マイクロアレイが一般的に使われる。現在、ほとんどのマイクロアレイの作製には、固体表面に直接生体分子（DNA、酵素、可水溶性タンパク質）を共有結合で固定化するという手法がとられている。DNAチップを代表とする、現在までに成功を収めている素子は、共有結合による固定化に際して、生体分子の機能を維持できるものに限られている。 In order to efficiently detect a minute amount of biomolecule, a microarray is generally used. Currently, most microarrays are produced by immobilizing biomolecules (DNA, enzymes, water-soluble proteins) directly on the solid surface by covalent bonds. Devices that have been successful so far, such as DNA chips, are limited to those that can maintain the function of biomolecules upon covalent bond immobilization.
近年、マイクロアレイを、膜タンパク質を代表とする膜関連生体分子へ拡張する試みが、精力的に行われている。このようなマイクロアレイにおいて、従来法である共有結合による固定化を行った場合、生体分子の機能が失われることが多く、これを回避する方法の開発が重要な課題となっている。解決法の一つとして、生体膜からなる支持膜をマイクロアレイの固体表面に支持させる手法が注目されている。自然界において効率よく特異的反応場として用いられている生体膜を、支持膜としてマイクロアレイの固体基板上に支持させることで、より自然に近い環境を素子上へ実現し、これまで機能を維持したままでの固定化が難しかった膜タンパク質に代表される生体分子を、その機能を失わせることなく固体表面に担持することが可能になると期待されている。 In recent years, vigorous attempts have been made to expand microarrays to membrane-related biomolecules typified by membrane proteins. When such a microarray is immobilized by a covalent bond, which is a conventional method, the function of the biomolecule is often lost, and the development of a method for avoiding this is an important issue. As one of the solutions, attention has been paid to a method of supporting a support membrane made of a biological membrane on a solid surface of a microarray. By supporting a biological membrane that is efficiently used as a specific reaction field in nature on a solid substrate of a microarray as a supporting membrane, a more natural environment can be realized on the device, while maintaining its functions so far It is expected that biomolecules typified by membrane proteins that are difficult to immobilize on the solid surface can be supported on a solid surface without losing their functions.
このような支持膜は固体表面に吸着しているが、生体膜が有する最も重要な性質である流動性を維持している。そのため、生体分子の機能する場として最適な環境を与える。図８は、支持膜を用いた生体分子検出チップの構成例である。この生体分子検出チップＣＰは、プラスチック、ガラス、シリコンなどの基板からなる固体ＳＵＢの表面に、脂質分子などからなる支持膜を配置し、これら支持膜を隔壁ＢＡＲで分離したものである。支持膜の流動性は、例えば図８に示す生体分子検出チップにおいて、基板表面の支持膜に平行な電場を印加することにより、ゲルに担持されたタンパク質の電気泳動と同様に、支持膜に担持した生体分子を動かすことで証明されている（非特許文献１）。 Such a support membrane is adsorbed on the solid surface, but maintains the fluidity, which is the most important property of the biological membrane. Therefore, it provides an optimal environment as a place where biomolecules function. FIG. 8 is a configuration example of a biomolecule detection chip using a support membrane. In this biomolecule detection chip CP, a support film made of lipid molecules or the like is disposed on the surface of a solid SUB made of a substrate such as plastic, glass, or silicon, and these support films are separated by a partition BAR. For example, in the biomolecule detection chip shown in FIG. 8, the fluidity of the support film is supported on the support film in the same manner as the electrophoresis of the protein supported on the gel by applying an electric field parallel to the support film on the substrate surface. This is proved by moving the biomolecules (Non-patent Document 1).
支持膜内で定常状態に達し、生体分子が一定速度で移動するとき、電気泳動、それとは逆向きの対イオンの逆流、支持膜から受ける摩擦力、および支持膜外の水相から受ける抵抗力という4つの力が相殺され、釣り合った状態になる（非特許文献２）。このとき、膜内の生体分子の濃度勾配や分離能は、外力と膜の流動性との競合となる。現在実現されている多くの支持膜実験系では、支持膜の流動性が外力に勝っており、外力がなくなった場合には速やかに均一な平衡状態へ移行する。 When a steady state is reached within the support membrane and the biomolecule moves at a constant speed, electrophoresis, counter-current counter-ion reverse flow, friction force received from the support membrane, and resistance force received from the aqueous phase outside the support membrane These four forces are canceled out and become balanced (Non-Patent Document 2). At this time, the concentration gradient and separation ability of the biomolecules in the membrane are competing between the external force and the fluidity of the membrane. In many support membrane experimental systems currently being realized, the fluidity of the support membrane is superior to the external force, and when the external force disappears, it quickly shifts to a uniform equilibrium state.
一方、支持膜内の特定の分子を、外場を利用して支持膜内で分離・分取するといった技術の要請が高まっている。この場合には、分子を分離しようとする外力と、分子を均一に分散させようとする流動性の競合を制御しなければならない。外場によって支持膜内に形成した生体分子の濃度勾配を維持できるように、支持膜の流動性を抑制・制御する技術が特に重要である。これによって、形成した濃度勾配が短時間で平衡状態へ移行するのを防ぎ、膜内で分離した生体分子を分取することが可能になる。 On the other hand, there is an increasing demand for a technique for separating / sorting specific molecules in a support membrane within the support membrane using an external field. In this case, it is necessary to control the competition between the external force for separating the molecules and the fluidity for uniformly dispersing the molecules. A technique for suppressing and controlling the fluidity of the support membrane is particularly important so that the concentration gradient of the biomolecule formed in the support membrane can be maintained by an external field. This prevents the formed concentration gradient from shifting to the equilibrium state in a short time, and enables the biomolecules separated in the membrane to be separated.
従来、マイクロアレイの固体基板上に支持されている支持膜の流動性を抑制・制御するための手法として、例えば支持膜の成分を変える、支持基板を変える、温度を変える、などが提案・実証されている。
しかしながら、このような従来技術にもそれぞれ課題が指摘されている。例えば、支持膜の成分を変えると、目的対象物に最適な成分支持膜を選択できない可能性がある。また、人工生体膜を利用する場合は、成分を変えることが困難であることが多い。一方、支持基板を変えた場合、支持膜内の生体分子との相互作用が生じ、生体分子の機能の維持を阻害する恐れがある。また、温度を変えた場合、支持膜成分の相転移を促すことがあり、支持膜内の異なる成分の相分離を生じる可能性がある。
Conventionally, as a method for suppressing and controlling the fluidity of the support film supported on the solid substrate of the microarray, for example, changing the components of the support film, changing the support substrate, changing the temperature, etc. have been proposed and verified. ing.
However, problems are also pointed out in each of these conventional techniques. For example, if the components of the support membrane are changed, there is a possibility that the optimum component support membrane for the target object cannot be selected. In addition, when using an artificial biological membrane, it is often difficult to change the components. On the other hand, when the support substrate is changed, an interaction with the biomolecule in the support film occurs, which may hinder the maintenance of the function of the biomolecule. Further, when the temperature is changed, the phase transition of the support membrane component may be promoted, and phase separation of different components in the support membrane may occur.
本発明はこのような課題を解決するためのものであり、生体分子の機能を損なうことなく、固体基板上に支持されている支持膜の流動性を容易に制御できる技術を提供することを目的としている。 The present invention is for solving such problems, and an object of the present invention is to provide a technique capable of easily controlling the fluidity of a supporting film supported on a solid substrate without impairing the function of a biomolecule. It is said.
このような目的を達成するために、本発明にかかる生体分子移動度制御方法は、電解質溶液中にある固体表面に支持した脂質分子および生体分子からなる支持膜に対し、当該支持膜の膜内および／または膜表面に担持した生体分子の移動度を、当該電解質溶液の粘度により制御するようにしたものである。 In order to achieve such an object, the biomolecule mobility control method according to the present invention is applied to a support membrane composed of lipid molecules and biomolecules supported on a solid surface in an electrolyte solution. In addition, the mobility of the biomolecule supported on the membrane surface is controlled by the viscosity of the electrolyte solution.
また、本発明にかかる上記生体分子移動度制御方法の一構成例は、前記電解質溶液に溶解している電解質の濃度により当該電解質溶液の粘度を制御するようにしたものである。 Moreover, one configuration example of the biomolecule mobility control method according to the present invention is to control the viscosity of the electrolyte solution by the concentration of the electrolyte dissolved in the electrolyte solution.
また、本発明にかかる上記生体分子移動度制御方法の一構成例は、前記電解質溶液がイオン液体からなるものである。 In one configuration example of the biomolecule mobility control method according to the present invention, the electrolyte solution is made of an ionic liquid.
また、本発明にかかる上記生体分子移動度制御方法の一構成例は、前記電解質溶液の電解質としてイオン液体を用い、当該イオン液体の種類および濃度により、当該電解質溶液の粘度を制御するようにしたものである。 Further, in one configuration example of the biomolecule mobility control method according to the present invention, an ionic liquid is used as the electrolyte of the electrolyte solution, and the viscosity of the electrolyte solution is controlled by the type and concentration of the ionic liquid. Is.
また、本発明にかかる電気泳動漕は、電解質溶液中で生体分子を電気泳動させる電気泳動槽であって、電解質溶液中にある固体表面に支持した脂質分子および生体分子からなる支持膜と、当該支持膜の膜内および／または膜表面を電気泳動する生体分子の移動度を、粘度に応じて制御する前記電解質溶液とを備えている。 Further, an electrophoretic kite according to the present invention is an electrophoretic tank for electrophoretic biomolecules in an electrolyte solution, and a support membrane composed of lipid molecules and biomolecules supported on a solid surface in the electrolyte solution; And an electrolyte solution for controlling the mobility of biomolecules that are electrophoresed in and / or on the surface of the support membrane according to the viscosity.
本発明によれば、生体分子の機能を損なうことなく、固体基板上に支持されている支持膜の流動性を容易に制御することが可能となり、支持膜内での生体分子の分離・分取技術に貢献する。その応用として、例えば、定常状態のタンパク質の移動度、すなわち濃度勾配のスロープやｐＨ勾配下での等電点電気泳動のバンド幅など、支持膜内・膜表面での生体分子のパターンを作製することができる。さらに本発明の技術は、これまで提案のあった手法と同時に適用可能な手法であることから、さらに広範囲な制御を可能とする。 According to the present invention, it is possible to easily control the fluidity of a support membrane supported on a solid substrate without impairing the function of the biomolecule, and separation / sorting of the biomolecule in the support membrane is possible. Contribute to technology. As its application, for example, the pattern of biomolecules in the support membrane and on the membrane surface such as steady-state protein mobility, ie, slope of concentration gradient and bandwidth of isoelectric focusing under pH gradient, etc. be able to. Furthermore, since the technique of the present invention is a technique that can be applied simultaneously with the previously proposed techniques, a wider range of control is possible.
次に、本発明の一実施の形態について図面を参照して説明する。
［生体分子移動度制御方法］
まず、図１を参照して、本発明にかかる生体分子移動度制御方法について説明する。図１は、本発明の生体分子移動度制御方法が適用される電気泳動槽を示す概略図である。
Next, an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings.
[Biomolecular mobility control method]
First, a biomolecule mobility control method according to the present invention will be described with reference to FIG. FIG. 1 is a schematic view showing an electrophoresis tank to which the biomolecule mobility control method of the present invention is applied.
本発明にかかる生体分子移動度制御方法は、電解質溶液の粘度により、支持膜の膜内および／または膜表面を電気泳動する生体分子の移動度を制御するようにしたものである。
電解質溶液中を電気泳動する生体分子を、電解質溶液に浸漬させた生体分子検出チップ（バイオチップ）の支持膜の膜内および／または膜表面に担持することにより、目的の生体分子を分離・分取する際、電気泳動するこれら生体分子の移動度を制御するために、本発明にかかる生体分子移動度制御方法が用いられる。
The biomolecule mobility control method according to the present invention controls the mobility of biomolecules that are electrophoresed in and / or on the surface of a support membrane according to the viscosity of an electrolyte solution.
Biomolecules that are electrophoresed in the electrolyte solution are supported on the membrane and / or on the membrane surface of the biomolecule detection chip (biochip) immersed in the electrolyte solution, thereby separating and separating the target biomolecules. In order to control the mobility of these biomolecules that undergo electrophoresis, the biomolecule mobility control method according to the present invention is used.
図１において、電気泳動漕１０は、主な構成として、槽１１、正電極１２、負電極１３、電源１４、電解質溶液１５、および生体分子検出チップＣＰを備えている。
槽１１に収容されている電解質溶液１５に生体分子検出チップＣＰを浸漬し、正電極１２と負電極１３との間に電源１４から電圧を印加することにより、生体分子検出チップＣＰの支持膜ＳＬＢに担持された生体分子２０が電気泳動によって支持膜ＳＬＢ内で分離・分取される。
In FIG. 1, an electrophoretic basket 10 includes a tank 11, a positive electrode 12, a negative electrode 13, a power source 14, an electrolyte solution 15, and a biomolecule detection chip CP as main components.
By immersing the biomolecule detection chip CP in the electrolyte solution 15 accommodated in the tank 11 and applying a voltage from the power source 14 between the positive electrode 12 and the negative electrode 13, the support film SLB of the biomolecule detection chip CP. The biomolecules 20 supported on the substrate are separated and sorted in the support membrane SLB by electrophoresis.
［生体分子検出チップＣＰ］
生体分子検出チップＣＰにおいて、固体ＳＵＢの表面には、親水表面と支持膜ＳＬＢが形成されない疎水表面とが設けられている。一般には疎水表面を持つ材料により隔壁ＢＡＲが形成されればよい。このうち、親水表面は、隔壁ＢＡＲでそれぞれ分離されて、脂質二分子膜などの脂質分子ＬＭからなる支持膜ＳＬＢが形成されている。図１の例では、正電極１２および負電極１３が生体分子検出チップＣＰとは別個に設けられているが、これら電極を固体ＳＵＢに形成してもよい。
[Biomolecule detection chip CP]
In the biomolecule detection chip CP, the surface of the solid SUB is provided with a hydrophilic surface and a hydrophobic surface on which the support film SLB is not formed. In general, the partition BAR may be formed of a material having a hydrophobic surface. Among these, the hydrophilic surfaces are separated by the partition walls BAR, and a support membrane SLB made of lipid molecules LM such as a lipid bilayer membrane is formed. In the example of FIG. 1, the positive electrode 12 and the negative electrode 13 are provided separately from the biomolecule detection chip CP, but these electrodes may be formed on a solid SUB.
脂質二分子膜は、一般的に、極性頭部と疎水性炭化水素鎖を併せ持つ両親媒性の脂質分子からなる単一膜が、疎水性炭化水素鎖が内側となるよう形成される構造体である。本発明では、脂質二分子膜を固体表面に支持した状態において、脂質二分子膜が電解質溶液と接する面を支持膜の膜表面と呼び、脂質二分子膜が存在する領域を支持膜の膜内と呼ぶ。 A lipid bilayer is generally a structure in which a single membrane consisting of amphiphilic lipid molecules with both a polar head and a hydrophobic hydrocarbon chain is formed with the hydrophobic hydrocarbon chain inside. is there. In the present invention, in the state where the lipid bilayer membrane is supported on the solid surface, the surface where the lipid bilayer membrane is in contact with the electrolyte solution is referred to as the membrane surface of the support membrane, and the region where the lipid bilayer membrane exists is within the membrane of the support membrane. Call it.
支持膜の材料には、脂質分子およびその混合物、さらにここにスフィンゴミエリン、コレステロールなどを混合したものを用いることができる。さらにここにプロテオソームをベシクル融合させることで、膜タンパク質を担持させることができる。支持膜に担持するタンパク質としては、膜貫入型タンパク質（細胞接着レセプター、イオンチャネル）やグリセロフォスファチジルイノシトール脂質結合型タンパク質、またビオチンやヒスチジンオリゴマーでタグ付けされた人工再構成タンパク質などが挙げられる。また、人工膜だけでなく小胞体や筋小胞体、単離した細胞膜などの生体由来の膜を直接利用することもできる。 As the material for the support membrane, lipid molecules and a mixture thereof, and further a mixture of sphingomyelin, cholesterol and the like can be used. Furthermore, a membrane protein can be carried by fusing a proteosome with a vesicle. Examples of proteins carried on the support membrane include membrane-penetrating proteins (cell adhesion receptors, ion channels), glycerophosphatidylinositol lipid-binding proteins, and artificially reconstituted proteins tagged with biotin or histidine oligomers. . In addition to artificial membranes, membranes derived from living bodies such as endoplasmic reticulum, sarcoplasmic reticulum, and isolated cell membrane can also be directly used.
支持膜を形成する固体の基板材質としては、シリコンウエハ、石英ウエハ、ガラスウエハ、サファイア、マイカ等を用いることができる。さらにその表面を高分子薄膜でコーティングしたものも用いることができる。高分子薄膜材料としては再生セルロースのスピンコート膜、もしくはラングミュア−ブロジェット膜を用いる。これを用いることにより、人工生体膜だけでなく天然の生体膜をも固体基板に保持することができる（例えば、非特許文献３など参照）。 As a solid substrate material for forming the support film, a silicon wafer, a quartz wafer, a glass wafer, sapphire, mica, or the like can be used. Furthermore, what coated the surface with the polymer thin film can also be used. As the polymer thin film material, a regenerated cellulose spin coat film or a Langmuir-Blodgett film is used. By using this, not only an artificial biological membrane but also a natural biological membrane can be held on a solid substrate (see, for example, Non-Patent Document 3).
電気泳動で支持膜内の生体分子を濃縮させたり、濃度勾配を与えたりする際には、基板表面に予め金、ニッケル、クロムなどの金属を加熱蒸着やスパッタ蒸着等の方法で蒸着したパターンを作製する。これは支持膜の拡散を制限する拡散バリアとして機能する。電気泳動の電源は通常のゲル電気泳動と同じものを用いる。 When concentrating biomolecules in the support membrane or applying a concentration gradient by electrophoresis, a pattern in which a metal such as gold, nickel, or chromium is previously deposited on the substrate surface by a method such as heat deposition or sputter deposition is used. Make it. This functions as a diffusion barrier that limits the diffusion of the support membrane. The power source for electrophoresis is the same as that for normal gel electrophoresis.
図２は、支持膜内を定速移動する生体分子への力の作用を示す説明図である。支持膜内で定常状態に達し、生体分子が一定速度で移動するとき、電気泳動の力Ｆｅ、それとは逆向きの対イオンの逆流の力Ｆｒ、支持膜から受ける摩擦力Ｆｆ、および支持膜外の水相から受ける抵抗力Ｆｃという４つの力が相殺され、釣り合った状態になる。このとき、膜内の生体分子の濃度勾配や分離能は、外力と膜の流動性との競合となる。現在実現されている多くの支持膜実験系では、支持膜の流動性が外力に勝っており、外力がなくなった場合には速やかに均一な平衡状態へ移行する。 FIG. 2 is an explanatory view showing the action of force on a biomolecule moving at a constant speed in the support membrane. When a steady state is reached in the supporting membrane and the biomolecule moves at a constant speed, the electrophoresis force Fe, the counter-current counter-current force Fr, the friction force Ff received from the supporting membrane, and the outside of the supporting membrane The four forces of the resistance force Fc received from the water phase cancel each other out, and a balanced state is obtained. At this time, the concentration gradient and separation ability of the biomolecules in the membrane are competing between the external force and the fluidity of the membrane. In many support membrane experimental systems currently being realized, the fluidity of the support membrane is superior to the external force, and when the external force disappears, it quickly shifts to a uniform equilibrium state.
本発明は、このような生体分子への力の作用において、支持膜外の水相から受ける抵抗力Ｆｃが電解質溶液の粘度により制御可能であることに着目し、電解質溶液の粘度により支持膜の膜内および／または膜表面を移動する生体分子の移動度を制御するようにしたものである。 The present invention pays attention to the fact that the resistance force Fc received from the aqueous phase outside the support membrane can be controlled by the viscosity of the electrolyte solution in the action of the force on the biomolecule. The mobility of biomolecules moving within the membrane and / or the membrane surface is controlled.
ここで、電解質溶液の粘度を変える副作用として、生体分子の機能を損なうことがあってならない。電解質溶液の粘度を変えるためには、電解質濃度を変える方法と、電解質の種類を変える方法がある。前者は、例えば一般的な電解質である無機塩の濃度を変えればよいが、その範囲は溶解度以下の範囲であり、粘度もそれに応じた変化を示す。 Here, as a side effect of changing the viscosity of the electrolyte solution, the function of the biomolecule should not be impaired. In order to change the viscosity of the electrolyte solution, there are a method of changing the electrolyte concentration and a method of changing the type of the electrolyte. In the former, for example, the concentration of an inorganic salt, which is a general electrolyte, may be changed, but the range is a range below the solubility, and the viscosity also changes accordingly.
電解質濃度を変える場合、電解質としては、一般的な無機塩の他に、生体分子の機能を損なわず粘度を変化させられる電解質として、イオン液体が挙げられる。イオン液体は無機塩に変わる電解質であり、ある種のイオン液体は室温付近で液体である。これらのイオン液体は水溶液とせずに電解質溶液の代わりに用いることができる。また、ある種のイオン液体は水と無限大に混じり、得られたイオン液体水溶液を電解質溶液に用いることができる。このため、無機塩に比べ濃度範囲を広く変えることができ、したがって粘度を広範に変化させることが可能である。 In the case of changing the electrolyte concentration, examples of the electrolyte include an ionic liquid as an electrolyte that can change the viscosity without impairing the function of a biomolecule, in addition to a general inorganic salt. An ionic liquid is an electrolyte that is converted into an inorganic salt, and some ionic liquids are liquids near room temperature. These ionic liquids can be used in place of the electrolyte solution without forming an aqueous solution. Moreover, a certain kind of ionic liquid mixes infinitely with water, and the obtained ionic liquid aqueous solution can be used for electrolyte solution. For this reason, the concentration range can be changed widely compared to the inorganic salt, and thus the viscosity can be changed widely.
一方、電解質の種類を変える場合、イオン液体の具体例な種類としては、コリン二水素リン酸、コリンビストリフルオロメチルメチルスルフォニルイミド、１−ブチルイミダゾリウムジシアナイド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムトリフルオロメチルスルホン酸、１−ブチル−１−メチルピペリジニウムテトラフルオロボレート、他が挙げられる。 On the other hand, when changing the type of electrolyte, specific types of ionic liquids include choline dihydrogen phosphate, choline bistrifluoromethylmethylsulfonylimide, 1-butylimidazolium dicyanide, 1-butyl-3-methylimidazole. Examples include lithium tetrafluoroborate, 1-butyl-3-methylimidazolium trifluoromethylsulfonic acid, 1-butyl-1-methylpiperidinium tetrafluoroborate, and the like.
なお、本発明を支持膜という観点から見れば、本発明にかかる支持膜は、電解質溶液中におかれた固体表面に支持した脂質分子および生体分子からなる支持膜の膜内および／または膜表面に生体分子を担持する支持膜であって、前記電解質溶液の粘度に応じて、当該支持膜の膜内および／または膜表面に置かれた生体分子の移動度が制御されるものである。 When the present invention is viewed from the viewpoint of a support membrane, the support membrane according to the present invention is an intramembrane and / or membrane surface of a support membrane composed of lipid molecules and biomolecules supported on a solid surface placed in an electrolyte solution. The support membrane for supporting the biomolecules, the mobility of the biomolecules placed in and / or on the surface of the support membrane is controlled according to the viscosity of the electrolyte solution.
また、本発明を生体分子検出チップという観点から見れば、本発明にかかる生体分子検出チップは、本発明にかかる電解質溶液中におかれた固体表面に支持した脂質分子および生体分子からなる支持膜において、当該支持膜の膜内および／または膜表面に担持する生体分子が、前記電解質溶液の粘度に応じて、当該支持膜の膜内および／または膜表面を電気泳動する生体分子の移動度が制御された検出チップである。 Further, when the present invention is viewed from the viewpoint of a biomolecule detection chip, the biomolecule detection chip according to the present invention is a support film comprising lipid molecules and biomolecules supported on a solid surface placed in the electrolyte solution according to the present invention. In this case, the mobility of the biomolecules that electrophores in the membrane and / or the membrane surface of the support membrane depends on the viscosity of the electrolyte solution. Controlled detection chip.
［実施例］
次に、本発明の実施例について説明する。
それぞれのクロロホルム溶液を用いて、卵黄由来脂質分子Ｌ−α−ＰＣと、１６：０ ｂｉｏｔｉｎｙｌ ＤＰＰＥと、１６：０ ＮＢＤ−ＤＰＰＥとを、９７：２：１のモル比の割合で含む混合物を、クロロホルム溶液として調製した。得られたクロロホルム溶液は、はじめに窒素気流下においてクロロホルムを蒸発させ、次に真空下に１晩おいてクロロホルムをさらに除去した。ここに混合物濃度が１ｇ／Ｌになるようにコリン二水素リン酸水溶液（１００ｍＭ）を加えた。これに超音波照射を５分間行い、混合物のベシクルを含む黄色透明水溶液を得た。これをさらに遠心（毎分１５００００回転、１５分間）することで不溶物を沈殿させ、均一な黄色透明水溶液を得た。
[Example]
Next, examples of the present invention will be described.
Using each chloroform solution, a mixture containing egg yolk-derived lipid molecule L-α-PC, 16: 0 biotinyl DPPE, and 16: 0 NBD-DPPE in a molar ratio of 97: 2: 1, Prepared as a chloroform solution. The resulting chloroform solution was first evaporated under a nitrogen stream and then further removed overnight under vacuum overnight. An aqueous choline dihydrogen phosphate solution (100 mM) was added thereto so that the mixture concentration was 1 g / L. This was subjected to ultrasonic irradiation for 5 minutes to obtain a yellow transparent aqueous solution containing vesicles of the mixture. This was further centrifuged (150,000 revolutions per minute, 15 minutes) to precipitate insoluble matter, and a uniform yellow transparent aqueous solution was obtained.
ＳｉＯ２酸化膜（３００ｎｍ）を有するＳｉウエハ（ＳｉＯ２／Ｓｉ）を５ｍｍ×１５ｍｍに切断し、これに対して水洗（５分間）、濃硫酸：過酸化水素水＝４：１（体積比）混酸（ピラニア）処理（５分間）、水洗（５分間）、フッ化アンモニウム水溶液（５分間）処理、水洗（５分間）、の順で洗浄した。 A Si wafer (SiO 2 / Si) having a SiO 2 oxide film (300 nm) is cut into 5 mm × 15 mm, washed with water (5 minutes), concentrated sulfuric acid: hydrogen peroxide solution = 4: 1 (volume ratio) mixed acid ( It was washed in the order of piranha) treatment (5 minutes), water washing (5 minutes), ammonium fluoride aqueous solution (5 minutes) treatment, and water washing (5 minutes).
コリン二水素リン酸（分子量２０１．１６）２グラムを純水に溶解して１００ｍＬとし、１００ｍＭコリン二水素リン酸水溶液を調製した。またコリン二水素リン酸６０グラムを純水３０グラムに溶解して、コリン二水素リン酸濃厚水溶液を調製した。逆流形キャノン−フェンスケ不透明液用粘度計を用いて測定した室温（２５℃）における動粘度は、それぞれ０．９３６、３０．８（ｍｍ2／ｓ）であった。 2 g of choline dihydrogen phosphate (molecular weight 201.16) was dissolved in pure water to 100 mL to prepare a 100 mM choline dihydrogen phosphate aqueous solution. Also, 60 g of choline dihydrogen phosphate was dissolved in 30 g of pure water to prepare a concentrated aqueous solution of choline dihydrogen phosphate. The kinematic viscosities at room temperature (25 ° C.) measured using a reverse flow Canon-Fenske opaque liquid viscometer were 0.936 and 30.8 (mm 2 / s), respectively.
図３は、支持膜の顕微鏡観察結果を示す画像である。ＳｉＯ２／Ｓｉ基板表面に黄色透明水溶液５０μＬを滴下して５分間静置した後、コリン二水素リン酸水溶液（１００ｍＭ）で洗浄した。洗浄後のＳｉＯ２／Ｓｉ基板は、常にコリン二水素リン酸水溶液（１００ｍＭ）に浸漬した状態に保ち、蛍光顕微鏡で観察した。これにより、Ｂ励起で緑色に光る一様な支持膜を確認した。 FIG. 3 is an image showing the result of microscopic observation of the support film. After dropping 50 μL of a yellow transparent aqueous solution onto the SiO 2 / Si substrate surface and allowing to stand for 5 minutes, it was washed with an aqueous choline dihydrogen phosphate solution (100 mM). The cleaned SiO 2 / Si substrate was always kept immersed in an aqueous choline dihydrogen phosphate solution (100 mM) and observed with a fluorescence microscope. Thereby, the uniform support film which shines green by B excitation was confirmed.
次に、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いてこの支持膜を時間発展観察しながら、赤色蛍光色素であるＴｅｘａｓ Ｒｅｄが結合したストレプトアビジン（ＴＲ−ｓＡｖ）のコリン二水素リン酸水溶液（１００ｍＭ）を途中で添加した。添加時のＴＲ−ｓＡｖ濃度は２μｇ／１００μＬとした。 Next, while observing the development of the support film with time using a confocal laser scanning microscope, an aqueous choline dihydrogen phosphate solution (100 mM) of streptavidin (TR-sAv) bound to Texas Red, which is a red fluorescent dye, was added. Added halfway. The TR-sAv concentration at the time of addition was 2 μg / 100 μL.
ＴＲ−ｓＡｖ添加前においては、支持膜のある領域からは、図３（ａ）に示すように、緑色蛍光（４８８ｎｍ励起、５０５−５２５ｎｍ発光、ＮＢＤ由来）が観察された。また、図３（ｂ）に示すように、赤色蛍光（５４３ｎｍ励起、＞５８０ｎｍ発光、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ由来）は観察されなかった。
一方、ＴＲ−ｓＡｖ添加後においては、図３（ｃ）に示すように、緑色蛍光は添加前と同様に確認された。また、図３（ｄ）に示すように、膜部分は速やかに赤色発光を示すことを確認し、ＴＲ−ｓＡｖが膜に含まれるビオチンと結合したことを確認した。
Before the addition of TR-sAv, green fluorescence (488 nm excitation, 505-525 nm emission, NBD-derived) was observed from a certain region of the support membrane as shown in FIG. In addition, as shown in FIG. 3B, red fluorescence (excitation at 543 nm, emission at> 580 nm, derived from Texas Red) was not observed.
On the other hand, after TR-sAv addition, as shown in FIG. 3C, green fluorescence was confirmed in the same manner as before addition. Moreover, as shown in FIG.3 (d), it confirmed that the film | membrane part showed red light emission rapidly, and confirmed that TR-sAv couple | bonded with the biotin contained in a film | membrane.
次に、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて、ＦＲＡＰ（Fluorescence Recovery After Photobleaching）実験を行った。直径５０μｍの円領域にレーザを高強度で照射し、この領域の色素分子を退色させた。その前後で、２０秒毎に、赤色蛍光および緑色蛍光を、共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて観察した。色素退色させた領域の蛍光強度（任意単位）の時間変化をプロットし、拡散係数を求めた。実験はＴＲ−ｓＡｖ添加後の支持膜を用いて行い、脂質分子の移動度はＮＢＤ−ＤＰＰＥ由来の緑色蛍光から、ストレプトアビジンの移動度はＴＲ−ｓＡｖ由来の赤色蛍光から、それぞれ評価した。 Next, FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) experiments were performed using a confocal laser scanning microscope. A circular region having a diameter of 50 μm was irradiated with high intensity laser, and the dye molecules in this region were faded. Before and after that, every 20 seconds, red fluorescence and green fluorescence were observed using a confocal laser scanning microscope. The time course of the fluorescence intensity (arbitrary unit) of the dye-discolored area was plotted to obtain the diffusion coefficient. The experiment was performed using the support membrane after the addition of TR-sAv, and the mobility of lipid molecules was evaluated from the green fluorescence derived from NBD-DPPE, and the mobility of streptavidin was evaluated from the red fluorescence derived from TR-sAv.
図４は、コリン二水素リン酸水溶液中（100mM）における緑色蛍光強度変化を示すグラフである。緑色蛍光はＮＢＤ由来であり、ＮＢＤが結合した脂質の拡散係数を与える。緑色蛍光強度が初期蛍光強度の１／２に回復する時間から求めた拡散係数は３．１μｍ2／ｓであった。 FIG. 4 is a graph showing changes in green fluorescence intensity in an aqueous choline dihydrogen phosphate solution (100 mM). Green fluorescence is derived from NBD and gives the diffusion coefficient of lipids bound by NBD. The diffusion coefficient determined from the time for the green fluorescence intensity to recover to 1/2 of the initial fluorescence intensity was 3.1 μm 2 / s.
図５は、コリン二水素リン酸水溶液中（100mM）における赤色蛍光強度変化を示すグラフである。赤色蛍光はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ由来であり、ストレプトアビジンが結合したビオチン脂質の移動度を与える。赤色蛍光強度が初期蛍光強度の１／２に回復する時間から求めた拡散係数は１．０μｍ2／ｓであった。 FIG. 5 is a graph showing changes in red fluorescence intensity in an aqueous choline dihydrogen phosphate solution (100 mM). Red fluorescence is derived from Texas Red and gives the mobility of biotin lipid bound to streptavidin. The diffusion coefficient obtained from the time required for the red fluorescence intensity to recover to 1/2 of the initial fluorescence intensity was 1.0 μm 2 / s.
次に、コリン二水素リン酸水溶液（１００ｍＭ）をコリン二水素リン酸濃厚水溶液に置換した。その後、蛍光顕微鏡で観察すると、Ｂ励起で緑色に光る一様な膜を確認し、この溶液の置換によって支持膜が維持されていることを確認した。この後、引き続き、上記と同様に共焦点レーザ走査型顕微鏡を用いて、ＦＲＡＰ実験を行った。 Next, the choline dihydrogen phosphate aqueous solution (100 mM) was replaced with a choline dihydrogen phosphate concentrated aqueous solution. Thereafter, when observed with a fluorescence microscope, a uniform film that glowed green by B excitation was confirmed, and it was confirmed that the support film was maintained by substitution of this solution. Thereafter, the FRAP experiment was subsequently performed using a confocal laser scanning microscope in the same manner as described above.
図６は、コリン二水素リン酸水溶液中における緑色蛍光強度変化を示すグラフである。緑色蛍光の回復からＮＢＤが結合した脂質の拡散係数を求めると、１．４μｍ2／ｓであった。このことから、電解質溶液の粘度を増大させることによって、ＮＢＤ結合脂質の移動度を制御できることが示された。 FIG. 6 is a graph showing changes in green fluorescence intensity in an aqueous choline dihydrogen phosphate solution. The diffusion coefficient of NBD-bound lipid was determined from the recovery of green fluorescence and found to be 1.4 μm 2 / s. This indicates that the mobility of NBD-binding lipid can be controlled by increasing the viscosity of the electrolyte solution.
図７は、コリン二水素リン酸水溶液中における赤色蛍光強度変化を示すグラフである。緑色蛍光の回復が見られた一方、赤色蛍光は、ほとんど回復が見られなかった。電解質溶液の粘度により、ストレプトアビジン結合したビオチン脂質の移動度は、ＮＢＤ結合脂質の移動度に比べて、大幅に低下した。これはストレプトアビジンがＮＢＤに比べて体積が大きく、粘度の高い電解質溶液から受ける抵抗が大きいためであることが示された。 FIG. 7 is a graph showing changes in red fluorescence intensity in an aqueous choline dihydrogen phosphate solution. While green fluorescence was recovered, red fluorescence was hardly recovered. Due to the viscosity of the electrolyte solution, the mobility of streptavidin-linked biotin lipid was greatly reduced compared to the mobility of NBD-bound lipid. This is because streptavidin is larger in volume than NBD and has a higher resistance from a highly viscous electrolyte solution.
［本実施の形態の効果］
このように、本実施の形態は、電解質溶液中にある固体表面に支持した脂質分子および生体分子からなる支持膜に対し、当該支持膜の膜内および／または膜表面に担持した生体分子の移動度を、当該電解質溶液の粘度により制御するようにしたものである。
より具体的には、電解質溶液に溶解している電解質の濃度により当該電解質溶液の粘度を制御してもよく、電解質溶液としてイオン液体を用いてもよく、また電解質溶液に電解質として溶解しているイオン液体の種類により、当該電解質溶液の粘度を制御してもよい。
[Effects of the present embodiment]
As described above, in the present embodiment, the movement of the biomolecules supported in the membrane and / or on the membrane surface of the lipid membrane and the biomolecule supported on the solid surface in the electrolyte solution is performed. The degree is controlled by the viscosity of the electrolyte solution.
More specifically, the viscosity of the electrolyte solution may be controlled by the concentration of the electrolyte dissolved in the electrolyte solution, an ionic liquid may be used as the electrolyte solution, and the electrolyte solution is dissolved in the electrolyte solution. The viscosity of the electrolyte solution may be controlled by the type of ionic liquid.
これにより、生体分子の機能を損なうことなく、固体基板上に支持されている支持膜の流動性を容易に制御することが可能となり、支持膜内での生体分子の分離・分取技術に貢献する。その応用として、例えば、定常状態のタンパク質の移動度、すなわち濃度勾配のスロープやｐＨ勾配下での等電点電気泳動のバンド幅など、支持膜内・膜表面での生体分子のパターンを作製することができる。さらに本発明の技術は、これまで提案のあった手法と同時に適用可能な手法であることから、さらに広範囲な制御を可能とする。 This makes it possible to easily control the fluidity of the support membrane supported on the solid substrate without impairing the functions of the biomolecules, contributing to the technology for separating and sorting biomolecules within the support membrane. To do. As its application, for example, the pattern of biomolecules in the support membrane and on the membrane surface such as steady-state protein mobility, ie, slope of concentration gradient and bandwidth of isoelectric focusing under pH gradient, etc. be able to. Furthermore, since the technique of the present invention is a technique that can be applied simultaneously with the previously proposed techniques, a wider range of control is possible.
［実施の形態の拡張］
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。また、各実施形態については、矛盾しない範囲で任意に組み合わせて実施することができる。
[Extended embodiment]
The present invention has been described above with reference to the embodiments, but the present invention is not limited to the above embodiments. Various changes that can be understood by those skilled in the art can be made to the configuration and details of the present invention within the scope of the present invention. In addition, each embodiment can be implemented in any combination within a consistent range.
１０…電気泳動漕、１１…槽、１２…正電極、１３…負電極、１４…電源、１５…電解質溶液、２０…生体分子、ＣＰ…生体分子検出チップ、ＳＬＢ…支持膜、ＳＵＢ…固体（基板）。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Electrophoresis basket, 11 ... Tank, 12 ... Positive electrode, 13 ... Negative electrode, 14 ... Power supply, 15 ... Electrolyte solution, 20 ... Biomolecule, CP ... Biomolecule detection chip, SLB ... Support film, SUB ... Solid ( substrate).
Claims (5)
前記電解質溶液に溶解している電解質の濃度により当該電解質溶液の粘度を制御することを特徴とする生体分子移動度制御方法。 The biomolecule mobility control method according to claim 1,
A biomolecule mobility control method, wherein the viscosity of the electrolyte solution is controlled by the concentration of the electrolyte dissolved in the electrolyte solution.
前記電解質溶液がイオン液体からなることを特徴とする生体分子移動度制御方法。 The biomolecule mobility control method according to claim 1,
A biomolecule mobility control method, wherein the electrolyte solution comprises an ionic liquid.
前記電解質溶液の電解質としてイオン液体を用い、当該イオン液体の種類および濃度により、当該電解質溶液の粘度を制御することを特徴とする生体分子移動度制御方法。 The biomolecule mobility control method according to claim 1,
A biomolecule mobility control method, wherein an ionic liquid is used as an electrolyte of the electrolyte solution, and the viscosity of the electrolyte solution is controlled by the type and concentration of the ionic liquid.
電解質溶液中にある固体表面に支持した脂質分子および生体分子からなる支持膜と、
当該支持膜の膜内および／または膜表面を電気泳動する生体分子の移動度を、粘度に応じて制御する前記電解質溶液と
を備えることを特徴とする電気泳動槽。 An electrophoresis tank for electrophoresis of biomolecules in an electrolyte solution,
A support membrane composed of lipid molecules and biomolecules supported on a solid surface in an electrolyte solution;
An electrophoretic tank comprising: the electrolyte solution that controls the mobility of biomolecules that electrophorese in and / or on the surface of the support membrane according to viscosity.
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