JP2017036925A - Optical measurement device and optical measurement method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポンプ光とプローブ光を用いて２以上の物理現象を同時に観測する同時多モードの光学測定に関する。 The present invention relates to simultaneous multimode optical measurement in which two or more physical phenomena are simultaneously observed using pump light and probe light.
ポンプ−プローブ法は、ポンプ光パルスの照射により励起された試料に生じた変化をプローブ光（測定光）で観測する手法である。ポンプ光とプローブ光を２次元的に走査することで、生体細胞等の顕微イメージングが可能である。 The pump-probe method is a method of observing a change generated in a sample excited by irradiation of a pump light pulse with probe light (measurement light). Microscopic imaging of living cells and the like is possible by two-dimensionally scanning the pump light and the probe light.
生体の生理過程や病理過程は、生体内の多種の関連分子がかかわる複雑で巧妙な機序に基づいて進行している。これらを顕微鏡検査で解明するには、生体内で互いに関連する分子の相関的な挙動を測定、観察することが望ましい。 Physiological processes and pathological processes in the body progress on the basis of complex and sophisticated mechanisms involving various related molecules in the body. In order to elucidate these by microscopic examination, it is desirable to measure and observe the relative behavior of molecules related to each other in a living body.
現行の光イメージングの手法で関連分子の相関的挙動を観察する場合、複数の波長の光で非同時または順次に試料を励起し、各励起によって得られた各データを解析することで多色イメージングを得ている。 When observing the relative behavior of related molecules using current optical imaging techniques, samples are excited non-simultaneously or sequentially with light of multiple wavelengths, and each color obtained by each excitation is analyzed to analyze multiple colors. Have gained.
レーザーを用いた生体試料の顕微イメージングには、通常、蛍光プローブが利用される。しかし、自然放出蛍光はスペクトル幅が広いため、複数の異なる蛍光プローブ光が存在する場合は、スペクトルの重なり（クロストーク）により複数情報の分離が困難である。 A fluorescent probe is usually used for microscopic imaging of a biological sample using a laser. However, since spontaneous emission fluorescence has a wide spectrum width, when there are a plurality of different fluorescent probe lights, it is difficult to separate a plurality of information due to spectrum overlap (crosstalk).
なお、レーザー走査にともなう信号光と参照光の強度比の変動を解消して測定精度を向上する方法が知られている（たとえば、特許文献１）。この手法は、ポンプ−プローブ法にオートバランス検出を適用して信号光と参照光の強度比を一定にし、光ノイズを効率的に除去するものである。 A method for improving measurement accuracy by eliminating fluctuations in the intensity ratio between signal light and reference light associated with laser scanning is known (for example, Patent Document 1). In this method, autobalance detection is applied to the pump-probe method to make the intensity ratio of the signal light and the reference light constant, thereby efficiently removing optical noise.
また、ポンプ光により励起された試料を透過したプローブ光を、プローブ光の径方向に沿って（ドーナツ状に）空間的に分離し、２つのセグメントの光成分の差分を検出する手法が提案されている（たとえば、非特許文献２参照）。 In addition, a method has been proposed in which the probe light transmitted through the sample excited by the pump light is spatially separated (in a donut shape) along the radial direction of the probe light and the difference between the light components of the two segments is detected. (For example, refer nonpatent literature 2).
従来の多色イメージングには、以下の問題がある。(i)波長切り替えやクロストークの問題により、リアルタイムの同時多色測定が困難である。(ii)何度も異なった波長で励起することから、試料が劣化するおそれがある（光毒による試料の劣化）。(iii)ほとんどの手法が蛍光性物質により標識されたシグナル分子やタンパク質をイメージングしており、標識できない場合には、それらを可視化することができない。 Conventional multicolor imaging has the following problems. (i) Real-time simultaneous multicolor measurement is difficult due to wavelength switching and crosstalk problems. (ii) Since the sample is excited many times at different wavelengths, the sample may be deteriorated (deterioration of the sample due to phototoxin). (iii) Most techniques image signal molecules and proteins labeled with a fluorescent substance, and if they cannot be labeled, they cannot be visualized.
そこで、標識の有無にかかわらず、ポンプ光の励起で生じる複数の物理現象を同時に観測できる構成と手法を提供することを課題とする。 Therefore, it is an object to provide a configuration and a method that can simultaneously observe a plurality of physical phenomena generated by excitation of pump light regardless of the presence or absence of a label.
上記課題を解決するために、光学測定装置は、
試料を励起するポンプ光を出力する第１光源と、
波長の異なる２以上のプローブ光を出力する第２光源と、
前記２以上のプローブ光を結合させるビームコンバイナと、
前記ポンプ光と、結合された前記２以上のプローブ光を試料に導く光学系と、
前記ポンプ光で励起された前記試料を透過した、または反射した前記２以上のプローブ光を前記波長ごとに検出する光検出器と、
前記光検出器から出力されるプローブ信号をロックイン検出して、前記試料に生じた２以上の物理現象を同時かつ各々弁別して検出するロックイン増幅器と、
を有する。
In order to solve the above problems, an optical measuring device
A first light source that outputs pump light for exciting the sample;
A second light source that outputs two or more probe lights having different wavelengths;
A beam combiner for combining the two or more probe lights;
An optical system for guiding the pump light and the combined two or more probe lights to a sample;
A photodetector that detects, for each wavelength, the two or more probe lights that are transmitted or reflected by the sample excited by the pump light;
A lock-in amplifier that detects a probe signal output from the photodetector in a lock-in manner, and simultaneously detects and discriminates two or more physical phenomena generated in the sample;
Have
標識の有無にかかわらず、ポンプ光の励起で生じる複数の物理現象を同時に観測することが可能になる。 Regardless of the presence or absence of the label, it becomes possible to simultaneously observe a plurality of physical phenomena caused by pump light excitation.
図１は実施形態の光学測定装置１の概略構成図である。実施形態では、異なる波長の複数のプローブ光及び／または異なる波長の複数のポンプ光を組み合わせて、２種類以上の現象をリアルタイムで同時に測定する。この明細書と特許請求の範囲で、「同時」に測定という場合は、複数のプローブ光または複数のポンプ光の試料への入射をほぼ同時に行うことを意味し、光路長の相違やばらつきによるわずかな誤差や遅延も含まれるものとする。この場合に、誤差・遅延の許容範囲は信号となる減少の持続時間に光が進む距離である。具体的には、蛍光現象の場合には、３０センチメートル、光熱の場合には、３００メートルである。従って、ほとんどその影響は問題にならない。 FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an optical measurement apparatus 1 according to an embodiment. In the embodiment, two or more kinds of phenomena are simultaneously measured in real time by combining a plurality of probe lights having different wavelengths and / or a plurality of pump lights having different wavelengths. In this specification and claims, the term “simultaneously” means that a plurality of probe lights or a plurality of pump lights are incident on the sample almost simultaneously, and it is slightly caused by a difference or variation in optical path length. Including errors and delays. In this case, the allowable range of error / delay is the distance traveled by light for the duration of the decrease that becomes a signal. Specifically, it is 30 centimeters in the case of fluorescence phenomenon and 300 meters in the case of photothermal. Therefore, the effect is hardly a problem.
光学測定装置１は、測定部２と制御部３を有する。制御部３は必ずしも光学測定装置１に設ける必要はなく、汎用ＰＣ等の外部の制御機器を接続して用いてもよい。 The optical measurement device 1 includes a measurement unit 2 and a control unit 3. The control unit 3 is not necessarily provided in the optical measuring device 1 and may be used by connecting an external control device such as a general-purpose PC.
光学測定装置１の測定部２は、光源１１−１〜１１−５を有する。光源１１−１〜１１−５は、ダイオードレーザーまたは半導体パルスレーザーであり、それぞれ異なる波長の光を出力する単色レーザーである。図１の例では、光源１１−１〜１１−４をプローブ光源として用い、光源１１−５をポンプ光源として用いている。光源１１−１〜１１−４から出力される各波長のプローブ光の強度は、それぞれ異なる変調周波数ｆｐｒ１、ｆｐｒ２、ｆｐｒ３、ｆｐｒ４で変調されている。光源１１−５から出力されるポンプ光の強度は変調周波数ｆｐｕで変調されている。変調手段は特に図示しないが、光源１１−１〜１１−５の内部にそれぞれの変調周波数に対応する信号生成器を組み込んでもよいし、外部から変調駆動信号を印加してもよい。光源１１−１〜１１−４から出力されるプローブ光と、光源１１−５から出力されるポンプ光は、ビームコンバイナ１５で合成され、光分離器１６によって走査光学系４０に導かれて試料１０上を走査する。 The measuring unit 2 of the optical measuring device 1 includes light sources 11-1 to 11-5. The light sources 11-1 to 11-5 are diode lasers or semiconductor pulse lasers, and are monochromatic lasers that output light of different wavelengths. In the example of FIG. 1, the light sources 11-1 to 11-4 are used as probe light sources, and the light source 11-5 is used as a pump light source. The intensity of the probe light of each wavelength output from the light sources 11-1 to 11-4 is modulated at different modulation frequencies fpr1, fpr2, fpr3, and fpr4. The intensity of the pump light output from the light source 11-5 is modulated at the modulation frequency fpu. Although the modulation means is not particularly shown, a signal generator corresponding to each modulation frequency may be incorporated in the light sources 11-1 to 11-5, or a modulation drive signal may be applied from the outside. The probe light output from the light sources 11-1 to 11-4 and the pump light output from the light source 11-5 are combined by the beam combiner 15 and guided to the scanning optical system 40 by the light separator 16, and the sample 10. Scan up.
ビームコンバイナ１５は、ビームカプラ１５１〜１５５で特定の色（波長）の光を反射する。自動制御のビームカプラ１５１〜１５５を用いることで、各々強度変調をかけたプローブ光と、ポンプ光を高精度かつ安定して接合する。ビームカプラ１５１〜１５５として、たとえば誘電体多層膜のダイクロイックミラーを用いてもよい。 The beam combiner 15 reflects light of a specific color (wavelength) with the beam couplers 151 to 155. By using the automatically controlled beam couplers 151 to 155, the probe light and the pump light, each of which is intensity-modulated, are joined with high accuracy and stability. As the beam couplers 151 to 155, for example, a dielectric multilayer dichroic mirror may be used.
光分離器１６には、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ：Polarization Beam Splitter）、音響光学波長可変フィルタ（ＡＯＴＦ：Acousto-Optics Tunable Filter）などを用いることができる。光分離器１６は、入射光を走査光学系４０に反射するとともに、試料１０から戻って来たプローブ光（戻りプローブ光）を透過する。なお、図示は省略するが、光分離器１６とダイクロイックミラー３５の間にフィルタが挿入されており、試料１０からの戻り光に含まれるポンプ光はカットされる。試料１０からの戻りプローブ光は、光電子倍増管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）３７で電気信号に変換され、モニタされる。 As the light separator 16, a polarization beam splitter (PBS), an acousto-optic tunable filter (AOTF), or the like can be used. The light separator 16 reflects incident light to the scanning optical system 40 and transmits probe light (returned probe light) returned from the sample 10. Although not shown, a filter is inserted between the light separator 16 and the dichroic mirror 35, and the pump light included in the return light from the sample 10 is cut. Return probe light from the sample 10 is converted into an electrical signal by a photomultiplier tube (PMT) 37 and monitored.
走査光学系４０は、走査速度を上げるために２組のガルバノミラー１８，１９を用いている。光分離器１６からの合波をミラー１７でガルバノミラー１８と１９に導き、Ｘ方向とＹ方向に走査する。ガルバノミラー１８，１９は、たとえば１ｋＨｚの速度でレーザー光（合波）を掃引する。走査光はレンズ２０で集光され、対物レンズ２１を介して試料１０に入射する。ポンプ−プローブ光の二次元走査で、試料１０の２次元像を観測することができる。さらに、試料１０を保持するステージ（不図示）を光軸方向（Ｚ方向）に沿って移動することで試料１０の３次元像を観測できる。 The scanning optical system 40 uses two sets of galvanometer mirrors 18 and 19 in order to increase the scanning speed. The combined light from the light separator 16 is guided to galvanometer mirrors 18 and 19 by a mirror 17 and scanned in the X direction and the Y direction. Galvano mirrors 18 and 19 sweep laser light (combined) at a speed of 1 kHz, for example. The scanning light is collected by the lens 20 and enters the sample 10 through the objective lens 21. A two-dimensional image of the sample 10 can be observed by two-dimensional scanning with pump-probe light. Furthermore, a three-dimensional image of the sample 10 can be observed by moving a stage (not shown) holding the sample 10 along the optical axis direction (Z direction).
試料１０の中の分子は、ポンプ光の照射によって励起される。４色のプローブ光は、励起光の吸収により生じる異なる物理現象や変化を測定する。観測される物理現象については後述する。試料１０を透過した光は、コンデンサレンズ２２で集光され、コリメートされる。透過光のうち、ポンプ光は図示しないフィルタでカットされ、試料１０の変化情報をのせた４色のプローブ光がビームカプラ２５に導かれる。ビームカプラ２５は、特定の波長の光だけを反射させるダイクロイックミラー２５１〜２５４で各波長のプローブ光を分離する。分離された各色の光は対応する光検出器（ＰＤ：Photo Detector）２７−１〜２７−４で検出され、電気信号が対応する自動バランス検出器３０−１〜３０−４の第１入力端子に接続される。 Molecules in the sample 10 are excited by irradiation with pump light. The four colors of probe light measure different physical phenomena and changes caused by absorption of excitation light. The observed physical phenomenon will be described later. The light transmitted through the sample 10 is collected by the condenser lens 22 and collimated. Of the transmitted light, the pump light is cut by a filter (not shown), and the four-color probe light carrying the change information of the sample 10 is guided to the beam coupler 25. The beam coupler 25 separates probe light of each wavelength by dichroic mirrors 251 to 254 that reflect only light of a specific wavelength. The separated light of each color is detected by corresponding photo detectors (PD: Photo Detector) 27-1 to 27-4, and first input terminals of automatic balance detectors 30-1 to 30-4 to which the electric signals correspond. Connected to.
光源１１−１〜１１−４の出力光の一部は、ビームスプリッタ１３−１〜１３−４で分岐され、参照光として用いられる。各波長の参照光は対応する光検出器（ＰＤ）２９−１〜２９−４で検出され、電気信号が自動バランス検出器３０−１〜３０−４の第２入力端子に接続される。自動バランス検出器３０−１〜３０−４は、参照信号とプローブ信号に位相をわずかにずらして強度比を一定にし、参照信号とプローブ信号の符号を反転して差分をとることで、参照信号とプローブ信号に含まれるノイズをキャンセルする。このオートバランス処理は、単純に参照信号とプローブ信号の差分をとる一般的なバランス処理とは異なる。自動バランス検出器３０−１〜３０−４のオートバランス処理により、プローブ信号に含まれる試料情報が高精度に抽出できる。各波長のプローブ信号は、対応するロックイン増幅器３２−１〜３２−４でロックイン検出される。 Part of the output light from the light sources 11-1 to 11-4 is branched by beam splitters 13-1 to 13-4 and used as reference light. The reference light of each wavelength is detected by the corresponding photodetectors (PD) 29-1 to 29-4, and the electric signal is connected to the second input terminals of the automatic balance detectors 30-1 to 30-4. The automatic balance detectors 30-1 to 30-4 slightly shift the phase between the reference signal and the probe signal to make the intensity ratio constant, reverse the sign of the reference signal and the probe signal, and take the difference, thereby obtaining the reference signal. And cancel the noise contained in the probe signal. This auto balance processing is different from general balance processing that simply takes the difference between the reference signal and the probe signal. By the automatic balance processing of the automatic balance detectors 30-1 to 30-4, the sample information included in the probe signal can be extracted with high accuracy. The probe signals of the respective wavelengths are lock-in detected by the corresponding lock-in amplifiers 32-1 to 32-4.
実施例では、試料１０で生じた異なる現象を同時検出するために、試料１０で反射され光分離器１６を透過した戻りプローブ光のうち、所望の波長のプローブ光をダイクロイックミラー３５で取り出して、光検出器（ＰＤ）３８で検出する。光検出器３８で検出されたプローブ信号は、たとえば、光熱屈折率変化の測定に用いることができる。光源１１−１から出力されたプローブ光の戻り光を光検出器３８で検出する場合は、この検出信号を自動バランス検出器３０−１の第３入力端子に接続し、検出信号と参照信号との間でオートバランス処理を行う。 In the embodiment, in order to simultaneously detect different phenomena occurring in the sample 10, out of the return probe light reflected by the sample 10 and transmitted through the optical separator 16, the probe light having a desired wavelength is extracted by the dichroic mirror 35. Detection is performed by a photodetector (PD) 38. The probe signal detected by the photodetector 38 can be used, for example, for measuring the photothermal refractive index change. When the return light of the probe light output from the light source 11-1 is detected by the photodetector 38, this detection signal is connected to the third input terminal of the automatic balance detector 30-1, and the detection signal, the reference signal, Auto balance processing is performed between.
なお、図示の複雑化を避けるため結線は省略するが、誘導放出の際に生じる蛍光強度の減少を観測する場合は、試料１０で反射されＰＭＴ３７で検出された蛍光を、自動バランス検出器３０を通さずに、直接ロックイン増幅器３２で検出する。 Although connection is omitted in order to avoid complication of illustration, when observing a decrease in fluorescence intensity that occurs during stimulated emission, the fluorescence reflected by the sample 10 and detected by the PMT 37 is detected by the automatic balance detector 30. Instead, it is detected by the lock-in amplifier 32 directly.
ロックイン増幅器３２−１〜３２−４の出力は、制御部３の画像処理部４に入力され、座標（画素）ごとに画像変換され、任意の表示装置で表示される。制御部３はまた、モード選択部５を有し、２以上の異なる物理現象の同時観測を可能にする。 Outputs of the lock-in amplifiers 32-1 to 32-4 are input to the image processing unit 4 of the control unit 3, and are converted into images for each coordinate (pixel) and displayed on an arbitrary display device. The control unit 3 also has a mode selection unit 5 that enables simultaneous observation of two or more different physical phenomena.
複数の物理現象によるイメージングとして、以下の手法が挙げられる。
（１）誘導放出利得（ＳＥＩＧ：Stimulated Emission Induced Gain）によるイメージンング：この方法は、誘導放出によるプローブ光の増幅を検出するイメージング法である。後述するように、誘導放出はポンプ光とプローブ光の強度の積に比例するので、ポンプ光の空間パターンを工夫することにより、従来の蛍光顕微鏡と比べて解像度を約２倍向上させて、高解像を実現することができる。（ポンプ波長１つ、プローブ波長１以上）
（２）誘導放出誘起蛍光強度減少（ＳＥＩＦＩＲ：Stimulated Emission Induced Fluorescence Intensity Reduction）によるイメージング：この方法は、誘導放出による蛍光強度の減少（蛍光消失）をロックイン増幅器を使って検出するイメージング法である。通常のレーザー走査共焦点蛍光顕微鏡と同様の配置で蛍光を検出するが、ポンプ光の空間パターンを工夫することで、従来の蛍光イメージングと比べて解像度を約２倍向上することができる。また、試料１０上の焦点以外の背景信号を除去することで高コントラスト象を得ることができる。（ポンプ波長１つ、プローブ波長１つ以上）
（３）光熱屈折率変化測定（ＰＴＭ：Photo Thermal Microscopy）によるイメージング：この方法は、ポンプ光で励起された分子近傍の温度上昇などに伴う微小な屈折率変化をプローブ光の透過率変化として検出するイメージング法である。分子に吸収されたポンプ光が熱に変換されるフォトサーマル効果を利用した手法である。ＳＥＩＧと同じ光学系で検出することができる。この場合、ＳＥＩＧとは異なる変調周波数を用い、試料１０の透過後のプローブ光を集めるコンデンサレンズ２２のアイリス径を変えて開口数を調整するだけでよい。ＳＥＩＧと同様の高解像度を達成することができ、かつ金属ナノ粒子やカーボン材料のような無蛍光、弱蛍光性の物質や、メラニン、ヘモグロビン等の光吸収係数が大きくて発光効率の低い生体分子も検出することができる。（ポンプ波長１以上、プローブ波長１つ）
（４）誘導放出寿命（ＳＬＩＭ：Stimulated emission Lifetime Imaging Microscopy）によるイメージング：この方法は、上述した（１）〜（３）の方法のいずれかにおいて、プローブ光の変調周波数を変えながら検出信号の振幅応答、または位相応答を測定することで、光励起状態寿命や熱拡散定数などの時間分解情報を得る方法である。信号の変調周波数応答から光励起ダイナミクスの情報を得ることができる。励起状態寿命をτ、変調周波数をω、位相応答をΔφ、振幅応答をＡとすると、
Δφ＝ｔａｎ−１（ωτ）
Ａ＝１／［（１＋（ωτ）２）］１／２
で表すことができる。利得変調によるダイオードレーザーの最大変調周波数は数ＧＨｚであるため、位相シフト法による実効的時間分解能は、１００ピコ秒以下となる。ポンプ光の変調周波数を変えることで、異なる寿命の複数の蛍光色素を同時検出して、顕微イメージを得ることができる（ポンプ波長１以上、プローブ波長１つ）。
The following methods are exemplified as imaging by a plurality of physical phenomena.
(1) Imaging by stimulated emission gain (SEIG): This method is an imaging method for detecting amplification of probe light by stimulated emission. As will be described later, stimulated emission is proportional to the product of the intensity of the pump light and the probe light. Therefore, by devising the spatial pattern of the pump light, the resolution can be improved by a factor of about 2 compared to the conventional fluorescence microscope. Resolution can be realized. (One pump wavelength, one probe wavelength or more)
(2) Imaging by Stimulated Emission-induced Fluorescence Intensity Reduction (SEIFIR): This method is an imaging method that uses a lock-in amplifier to detect a decrease in fluorescence intensity (fluorescence loss) due to stimulated emission. . Fluorescence is detected in the same arrangement as that of a normal laser scanning confocal fluorescence microscope, but the resolution can be improved about twice compared with conventional fluorescence imaging by devising the spatial pattern of pump light. Further, a high contrast elephant can be obtained by removing background signals other than the focal point on the sample 10. (One pump wavelength, one probe wavelength or more)
(3) Imaging by photothermal refractive index measurement (PTM: Photo Thermal Microscopy): This method detects minute refractive index changes as the temperature rises in the vicinity of molecules excited by pump light as changes in probe light transmittance. This is an imaging method. This is a technique using a photothermal effect in which pump light absorbed by molecules is converted into heat. It can be detected by the same optical system as SEIG. In this case, it is only necessary to adjust the numerical aperture by using a modulation frequency different from that of SEIG and changing the iris diameter of the condenser lens 22 that collects the probe light after passing through the sample 10. Biomolecules that can achieve the same high resolution as SEIG, and have a high light absorption coefficient such as melanin and hemoglobin, and non-fluorescent and weakly fluorescent substances such as metal nanoparticles and carbon materials. Can also be detected. (Pump wavelength 1 or more, probe wavelength 1)
(4) Imaging by stimulated emission lifetime (SLIM): In this method, in any of the methods (1) to (3) described above, the amplitude of the detection signal is changed while changing the modulation frequency of the probe light. This is a method for obtaining time-resolved information such as photoexcited lifetime and thermal diffusion constant by measuring response or phase response. Information on the optical excitation dynamics can be obtained from the modulation frequency response of the signal. When the excited state lifetime is τ, the modulation frequency is ω, the phase response is Δφ, and the amplitude response is A,
Δφ = tan −1 (ωτ)
A = 1 / [(1+ (ωτ) 2 )] 1/2
Can be expressed as Since the maximum modulation frequency of the diode laser by gain modulation is several GHz, the effective time resolution by the phase shift method is 100 picoseconds or less. By changing the modulation frequency of the pump light, a plurality of fluorescent dyes having different lifetimes can be simultaneously detected to obtain a microscopic image (pump wavelength 1 or more, probe wavelength 1).
上記（１）〜（４）の測定モードの２つ以上を組み合わせて、多モードの同時測定を実現する。例えば、（１）と（２）と（３）の同時測定、（１）と（３）の同時測定、（１）と（４）の同時測定、（２）と（３）の同時測定、（２）と（４）の同時側などである。光熱屈折率変化測定（ＰＴＭ）法や誘導放出寿命（ＳＬＩＭ）法では、ポンプ光の波長を２以上用いることで、異なる屈折率変化や、異なる寿命を同時に観測できる。この場合は、光源１１−１〜１１−５のうち２つ以上をポンプ光源として用いてもよい。 Multi-mode simultaneous measurement is realized by combining two or more of the measurement modes (1) to (4). For example, simultaneous measurement of (1), (2) and (3), simultaneous measurement of (1) and (3), simultaneous measurement of (1) and (4), simultaneous measurement of (2) and (3), (2) and (4) at the same time. In the photothermal refractive index change measurement (PTM) method and the stimulated emission lifetime (SLIM) method, by using two or more wavelengths of pump light, different refractive index changes and different lifetimes can be observed simultaneously. In this case, two or more of the light sources 11-1 to 11-5 may be used as pump light sources.
図１の光学測定装置１のうち、試料１０の透過プローブ光は、誘導放出利得（ＳＥＩＧ）と、光熱屈折率変化と、誘導放出寿命（ＳＬＩＭ）の観測に用いることができる。試料１０からの戻りプローブ光は、蛍光強度減少（ＳＥＩＦＩＲ）と、光熱屈折率変化の観測に用いることができる。戻りプローブ光をＰＴＭに用いるときは、光電変換された電気信号を、自動バランス検出器３０経由でロックイン検出する。戻りプローブ光をＳＥＩＦＩＲに用いるときは、ＰＭＴ３７で検出され光電変換された信号を、自動バランス検出器３０を介さずに、ロックイン検出する。 In the optical measurement apparatus 1 of FIG. 1, the transmitted probe light of the sample 10 can be used for observation of stimulated emission gain (SEIG), photothermal refractive index change, and stimulated emission lifetime (SLIM). The return probe light from the sample 10 can be used to observe fluorescence intensity reduction (SEIFIR) and photothermal refractive index change. When the return probe light is used for PTM, the photoelectrically converted electrical signal is detected by lock-in via the automatic balance detector 30. When the return probe light is used for SEIFIR, the signal detected by the PMT 37 and subjected to photoelectric conversion is detected by lock-in without using the automatic balance detector 30.
上記（１）、（３）、（４）の場合も、ポンプ光と、各波長のプローブ光を掛け合わせた信号がロックイン増幅器３２で検出される。ポンプ光と各プローブ光は、それぞれ異なる変調周波数で強度変調されているので、検出されるのはポンプ光と各プローブ光のビート周波数である。ポンプ光の変調周波数ｆｐｕ、各プローブ光の変調周波数ｆｐｒ１、ｆｐｒ２、ｆｐｒ３、ｆｐｒ４を用いる場合、たとえば、ロックイン増幅器３２−１では（ｆｐｕ−ｆｐｒ１）のビート周波数（差周波数）が検出される。ロックイン増幅器３２−２では（ｆｐｕ−ｆｐｒ２）のビート周波数が、ロックイン増幅器３２−３では（ｆｐｕ−ｆｐｒ３）のビート周波数が、ロックイン増幅器３２−４では（ｆｐｕ−ｆｐｒ４）のビート周波数が検出される。それぞれ異なるビート周波数が位相検波されるので、クロストークをノイズ以下に低減することができる。 In the cases (1), (3), and (4), the lock-in amplifier 32 detects a signal obtained by multiplying the pump light and the probe light of each wavelength. Since the pump light and each probe light are intensity-modulated at different modulation frequencies, it is the beat frequency of the pump light and each probe light that is detected. When using the modulation frequency fpu of the pump light and the modulation frequencies fpr1, fpr2, fpr3, and fpr4 of each probe light, for example, the beat frequency (difference frequency) of (fpu−fpr1) is detected in the lock-in amplifier 32-1. The lock-in amplifier 32-2 has a beat frequency of (fpu-fpr2), the lock-in amplifier 32-3 has a beat frequency of (fpu-fpr3), and the lock-in amplifier 32-4 has a beat frequency of (fpu-fpr4). Detected. Since different beat frequencies are phase-detected, crosstalk can be reduced below noise.
図２は、誘導放出に伴う物理現象を説明する図である。試料１０の分子は、ポンプ光の照射によって基底状態Ｓ０から励起一重項状態Ｓ１に励起される。励起された分子は、時間とともに状態が変化する。振動緩和による状態Ｓ１から状態Ｓ１ ＊への遷移（光分解反応）や、自然放出後の状態Ｓ０ ＊からＳ０への遷移（熱分解）、光の放出なしに励起状態Ｓ１から基底状態Ｓ０へ戻る非輻射失活（熱発生）が起きる。試料１０に生じるこれらの分解反応や非輻射失活は従来技術の問題点であったが、実施形態では、ポンプ光と同時または直後にプローブ光を入射することで、光反応が生じる時間を与えずに、励起エネルギーを光として放出させる。 FIG. 2 is a diagram for explaining a physical phenomenon associated with stimulated emission. The molecules of the sample 10 are excited from the ground state S 0 to the excited singlet state S 1 by irradiation with pump light. Excited molecules change state over time. Transition from state S 1 to state S 1 * due to vibration relaxation (photolysis reaction), transition from state S 0 * to S 0 after spontaneous emission (thermal decomposition), and excitation state S 1 without light emission Non-radiative deactivation (heat generation) that returns to the ground state S 0 occurs. These decomposition reactions and non-radiation deactivation that occur in the sample 10 are problems of the prior art, but in the embodiment, the probe light is incident at the same time as or immediately after the pump light, thereby giving a time for the photoreaction to occur. Without releasing the excitation energy as light.
ポンプ光で励起された分子がプローブ光による刺激で光を放出する場合が誘導放出である。この誘導放出により、測定モード（１）の誘導放出利得（ＳＥＩＧ）や、測定モード（４）の誘導放出寿命（ＳＬＩＭ）が観測される。励起された分子はまた、外部刺激なしに自然に低準位へと遷移して光を放出する。これが自然放出であり、測定モード（２）の蛍光強度減少（ＳＥＩＦＩＲ）の観測に用いられる。 Stimulated emission is when the molecules excited by pump light emit light upon stimulation with probe light. By this stimulated emission, the stimulated emission gain (SEIG) in the measurement mode (1) and the stimulated emission lifetime (SLIM) in the measurement mode (4) are observed. Excited molecules also spontaneously transition to low levels without external stimuli and emit light. This is spontaneous emission and is used for observation of fluorescence intensity decrease (SEIFIR) in the measurement mode (2).
他方、フォトサーマル効果は、光エネルギーを効率よく熱に変換する過程であり、ポンプ光を吸収した分子が発する熱による屈折率変化を、プローブ光の透過率変化として測定する。 On the other hand, the photothermal effect is a process in which light energy is efficiently converted into heat, and a change in refractive index due to heat generated by molecules that have absorbed pump light is measured as a change in transmittance of probe light.
図３は、実施形態の解像特性を従来の光学顕微鏡と比較して示す図である。実施形態のポンプ−プローブ誘導放出では、ポンプ光とプローブ光の強度の積により、シャープな強度分布を得ることができる。強度の積を取ることで、ピーク領域が支配的になりサイドローブは抑制される。ガウス関数とすると、その空間的広がりの幅は、１／√２に狭めることができる。半値全幅でいうと、約０．６倍に低減でき、解像度は１，６倍に向上する。このようなポンプ−プローブ光の結像する１点で蛍光を得る共焦点ＳＥＩＦＩＲにより、光ビームの回折限界値０．５１λ／ＮＡ＝３４４ｎｍと比較して、１／２．１倍に小さくできる。規格化空間周波数［ＮＡ／λ］でいうと約２．１倍に空間周波数幅を広げることができる。 FIG. 3 is a diagram showing the resolution characteristics of the embodiment in comparison with a conventional optical microscope. In the pump-probe stimulated emission of the embodiment, a sharp intensity distribution can be obtained by the product of the intensity of the pump light and the probe light. By taking the product of intensity, the peak region becomes dominant and side lobes are suppressed. In the case of a Gaussian function, the width of the spatial extension can be reduced to 1 / √2. In terms of the full width at half maximum, it can be reduced to about 0.6 times, and the resolution is improved to 1.6 times. The confocal SEIFIR that obtains fluorescence at one point where the pump-probe light forms an image can be reduced by a factor of 1 / 2.1 compared to the diffraction limit value of 0.51λ / NA = 344 nm. In terms of the normalized spatial frequency [NA / λ], the spatial frequency width can be expanded to about 2.1 times.
図４は、二色プローブによるアンミクシング（蛍光分離）を示す。実施形態の光学測定装置１の光源１１−１〜１１−５は単色レーザーを用いるので、各プローブ光のスペクトル幅は非常に小さい（２ｎｍ未満）。異なる蛍光スペクトルＦ１、Ｆ２の分離にバンドパスフィルタを用いる場合（フィルタ帯域を破線で示す）、短波長側と長波長側で２つの蛍光の強度比（Ｐ１／Ｐ２）が異なり、誤差や不確定性が含まれる。これに対し、スペクトル幅の非常に小さい単色レーザー光では、２つの蛍光の強度比をほぼ一定として検出することができる。したがって、誤差や不確定性の少ない状態で、異なる蛍光を正確に分離することができる。 FIG. 4 shows unmixing (fluorescence separation) with a two-color probe. Since the light sources 11-1 to 11-5 of the optical measurement apparatus 1 of the embodiment use a monochromatic laser, the spectral width of each probe light is very small (less than 2 nm). When a bandpass filter is used to separate the different fluorescence spectra F1 and F2 (the filter band is indicated by a broken line), the intensity ratio (P1 / P2) of the two fluorescences is different between the short wavelength side and the long wavelength side, and errors and uncertainties Includes sex. On the other hand, with a monochromatic laser beam having a very small spectral width, the intensity ratio of the two fluorescences can be detected as being substantially constant. Therefore, it is possible to accurately separate different fluorescences with less error and uncertainty.
図５は、図１の光学測定装置１の誘導放出顕微イメージである。左側が誘導放出利得（ＳＥＩＧ）により得られたマウス神経細胞の画像、右側が光熱屈折率変化測定（ＰＴＭ）により得られた脳スライスの光熱イメージである。観察領域はともに２５０μｍ×２５０μｍ、ピクセル当たりの滞在時間は１ｍｓ、ロックイン増幅器３２の時定数は０．５ｍｓである。 FIG. 5 is a stimulated emission microscopic image of the optical measurement apparatus 1 of FIG. The left side is an image of a mouse neuron obtained by stimulated emission gain (SEIG), and the right side is a photothermal image of a brain slice obtained by photothermal refractive index change measurement (PTM). Both observation areas are 250 μm × 250 μm, the residence time per pixel is 1 ms, and the time constant of the lock-in amplifier 32 is 0.5 ms.
図６は、図１の光学測定装置１の蛍光強度減少測定（ＳＥＩＦＩＲ）による顕微イメージ（Ａ）を、従来の蛍光イメージ（Ｂ）と比較して示す図である。２つの画像の破線で示す位置での断面強度をグラフ（Ｃ）に示す。ＳＥＩＦＩＲ法によると、各位置での分子の存在を明確に捉えることができる。 FIG. 6 is a view showing a microscopic image (A) by fluorescence intensity reduction measurement (SEIFIR) of the optical measuring device 1 of FIG. 1 in comparison with a conventional fluorescent image (B). Graph (C) shows the cross-sectional strength at the positions indicated by the broken lines in the two images. According to the SEIFIR method, the presence of molecules at each position can be clearly captured.
図７は、図１の光学測定装置１の熱屈折率変化測定（ＰＴＭ）法による三次元イメージである。試料を光軸に沿って（Ｚ方向に）少しずつずらしてポンプ−プローブ光の２次元走査を繰り返すことで、厚さのある試料の三次元イメージングが可能である。画像（Ａ）はミトコンドリアの三次元イメージ、画像（Ｂ）はウサギ腎臓の三次元イメージである。 FIG. 7 is a three-dimensional image obtained by the thermal refractive index change measurement (PTM) method of the optical measurement apparatus 1 of FIG. By repeating the two-dimensional scanning of the pump-probe light while shifting the sample little by little along the optical axis (in the Z direction), three-dimensional imaging of a thick sample is possible. Image (A) is a three-dimensional image of mitochondria, and image (B) is a three-dimensional image of rabbit kidney.
図８は、光熱屈折率変化測定（ＰＴＭ）法による同時多色イメージング画像（Ａ）を、従来の顕微鏡による明視野像（Ｂ）と比較して示す。両画像ともに、ヘマトキシリンとエオジンで染色（Ｈ＆Ｅ染色）されたウサギ卵巣の同一部位を示す。ヘマトキシリンで細胞核を青紫色で染色し、エオジンでその他の部位を異なる濃さの紅色に染める。複数波長のポンプ光で異なる熱屈折変化を起こすことで、左図のように鮮明なイメージを得ることができる。 FIG. 8 shows a simultaneous multicolor imaging image (A) by a photothermal refractive index change measurement (PTM) method compared with a bright field image (B) by a conventional microscope. Both images show the same part of the rabbit ovary stained with hematoxylin and eosin (H & E staining). The cell nucleus is stained blue-purple with hematoxylin, and the other parts are stained red with a different intensity with eosin. By causing different thermorefractive changes with pump light of a plurality of wavelengths, a clear image can be obtained as shown in the left figure.
このように、実施形態の光学測定装置１は、ポンプ−プローブ法による光劣化を最小限に抑え、クロストークが低減されたリアルタイムの同時多色測定を可能にする。複数の単色レーザーを光源１１−１〜１１−５に用いて多モード化することで、蛍光ラベルされた部位、自家蛍光の部位、無蛍光の部位など、様々な部位を同時にイメージングできる。複数のシグナル分子やタンパク質の挙動を同時に分析することができる。また、波長の近い蛍光信号を分離することができる。 As described above, the optical measurement apparatus 1 according to the embodiment enables real-time simultaneous multicolor measurement in which light degradation due to the pump-probe method is minimized and crosstalk is reduced. By using a plurality of monochromatic lasers for the light sources 11-1 to 11-5 to be multimoded, various sites such as fluorescently labeled sites, autofluorescent sites, and non-fluorescent sites can be imaged simultaneously. The behavior of multiple signal molecules and proteins can be analyzed simultaneously. In addition, fluorescent signals with close wavelengths can be separated.
図９は、光学測定装置１により測定される対象物と、使用モード（ＳＥＩＧモード（１）、ＳＥＩＦＩＲモード（２）、ＰＴＭモード（３）、及びＳＬＩＭモード（４））を示す。モード（１）、（２）及び（４）では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Green Fluorescent Protein）などの蛍光タンパク質、量子ドット・蛍光色素標識タンパク質、蛍光標識代謝産物、抗体などの蛍光性物質を観測することができる。 FIG. 9 shows an object to be measured by the optical measuring device 1 and use modes (SEIG mode (1), SEIFIR mode (2), PTM mode (3), and SLIM mode (4)). In modes (1), (2), and (4), fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP), fluorescent materials such as quantum dots / fluorescent dye-labeled proteins, fluorescently labeled metabolites, and antibodies are observed. can do.
ＰＴＭモード（３）では、ヘム蛋白、メラニン、血管、赤血球、ミトコンドリアなどの非蛍光性物質や、種々の染色性細胞を測定することができる。 In PTM mode (3), non-fluorescent substances such as heme protein, melanin, blood vessels, erythrocytes, mitochondria, and various staining cells can be measured.
光学測定装置１のマルチモード測定で、例えば、がん細胞（発光）の増殖と、血管（非発光）の新生を同時観測することができる。具体的には、ＧＦＰ等で蛍光標識されたがん細胞をＳＥＩＦＩＲモード（２）でイメージングし、同時に、このがん細胞の近辺の新生血管をＰＴＭモード（３）によるヘモグロビンの酸素飽和度分布測定でイメージングすることができる。これにより、がん細胞と、がん細胞へ血流を供給するために増勢する血管の空間分布形状を同時に計測、観測できる。 In the multi-mode measurement of the optical measuring device 1, for example, the proliferation of cancer cells (luminescence) and the formation of blood vessels (non-luminescence) can be observed simultaneously. Specifically, cancer cells fluorescently labeled with GFP or the like are imaged in the SEIFIR mode (2), and at the same time, neovascularization in the vicinity of the cancer cells is measured in the oxygen saturation distribution of hemoglobin by the PTM mode (3) Can be imaged. Thereby, it is possible to simultaneously measure and observe cancer cells and the spatial distribution shape of blood vessels that increase to supply blood flow to the cancer cells.
ＰＴＭ法では、蛍光を発しない物質も観察可能であり、標識なしにイメージングを行うことができる。たとえば、皮膚のメラノーマ（非発光性）転移を引き起こす生検を避けて非侵襲の診断用観察が可能となる。無蛍光性分子や弱蛍光性分子は科学的にも安定で、蛍光色素のような褪色の問題が少ないため、長時間測定に有利である。 In the PTM method, a substance that does not emit fluorescence can be observed, and imaging can be performed without labeling. For example, non-invasive diagnostic observations are possible avoiding biopsies that cause skin melanoma (non-luminescent) metastases. Non-fluorescent molecules and weakly fluorescent molecules are scientifically stable and have few problems of fading like fluorescent dyes, which is advantageous for long-time measurement.
実施形態の光学測定装置１によると、同一の顕微光学系で、ポンプ光照射により励起された試料分子等に誘起される複数の物理現象の組み合わせを同時測定することができ、測定の高速化、相関的挙動の同時観測が実現する。 According to the optical measurement apparatus 1 of the embodiment, the same microscopic optical system can simultaneously measure a combination of a plurality of physical phenomena induced by sample molecules or the like excited by pump light irradiation. Simultaneous observation of correlated behavior is realized.
１ 光学測定装置
２ 測定部
３ 制御部
４ 画像処理部
５ モード選択部
１０ 試料
１１−１〜１１−５ 光源
１５ ビームコンバイナ
２５ ビームカプラ
３０−１〜３０−４ 自動バランス検出器
３２−１〜３２−４ ロックイン増幅器
４０ 走査光学系
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Optical measuring device 2 Measuring part 3 Control part 4 Image processing part 5 Mode selection part 10 Sample 11-1 to 11-5 Light source 15 Beam combiner 25 Beam coupler 30-1 to 30-4 Automatic balance detector 32-1 to 32 -4 Lock-in amplifier 40 Scanning optical system
Claims (10)
波長の異なる２以上のプローブ光を出力する第２光源と、
前記２以上のプローブ光を結合させるビームコンバイナと、
前記ポンプ光と、結合された前記２以上のプローブ光を試料に導く光学系と、
前記ポンプ光で励起された前記試料を透過した、または反射した前記２以上のプローブ光を前記波長ごとに検出する光検出器と、
前記光検出器から出力されるプローブ信号をロックイン検出して、前記試料に生じた２以上の物理現象を同時かつ個別に検出するロックイン増幅器と、
を有することを特徴とする光学測定装置。 A first light source that outputs pump light for exciting the sample;
A second light source that outputs two or more probe lights having different wavelengths;
A beam combiner for combining the two or more probe lights;
An optical system for guiding the pump light and the combined two or more probe lights to a sample;
A photodetector that detects, for each wavelength, the two or more probe lights that are transmitted or reflected by the sample excited by the pump light;
A lock-in amplifier that locks in a probe signal output from the photodetector and detects two or more physical phenomena generated in the sample simultaneously and individually;
An optical measuring device comprising:
をさらに有し、
前記モード選択部は、前記ポンプ光の入射により前記試料に生じる誘導放出利得、誘導放出蛍光強度減少、光熱屈折率変化、または誘導放出寿命を測定するモードを有することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。 A mode selection unit for selecting a measurement mode of the two or more physical phenomena;
Further comprising
2. The mode selection unit according to claim 1, wherein the mode selection unit has a mode for measuring a stimulated emission gain, a stimulated emission fluorescence intensity decrease, a photothermal refractive index change, or a stimulated emission lifetime that is generated in the sample by the incidence of the pump light. The optical measuring device described.
前記ビームコンバイナは、前記２以上のポンプ光を結合し、
前記２以上のプローブ光のうちの１のプローブ光で、前記２以上のポンプ光の照射により生じる異なる光熱屈折率変化または異なる誘導放出寿命を同時かつ個別に測定することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。 The first light source outputs two or more pump lights having different wavelengths,
The beam combiner combines the two or more pump lights,
2. A different photothermal refractive index change or a different stimulated emission lifetime caused by irradiation of the two or more pump lights is simultaneously and individually measured with one of the two or more probe lights. The optical measuring device described in 1.
前記ロックイン増幅器は、前記２以上のポンプ光の各々と、前記１のプローブ光とのビート周波数を検出することを特徴とする請求項３に記載の光学測定装置。 The two or more probe lights and the two or more pump lights are intensity-modulated at different modulation frequencies, respectively.
The optical measurement apparatus according to claim 3, wherein the lock-in amplifier detects a beat frequency between each of the two or more pump lights and the one probe light.
前記ロックイン増幅器は、前記２以上のプローブ光の各々と、前記ポンプ光とのビート周波数を検出することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。 The two or more probe lights and the pump light are intensity-modulated at different modulation frequencies, respectively.
The optical measurement apparatus according to claim 1, wherein the lock-in amplifier detects a beat frequency between each of the two or more probe lights and the pump light.
をさらに有し、前記ロックイン増幅器は、前記バランス検出器の出力をロックイン検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の光学測定装置。 A balance detector that detects a difference with a constant intensity ratio between a probe signal output from the photodetector and a reference light signal branched from the corresponding probe light;
The optical measurement apparatus according to claim 1, further comprising: the lock-in amplifier that locks in an output of the balance detector.
第２光源から波長の異なる２以上のプローブ光を出力し、
前記２以上のプローブ光を結合させ、
前記ポンプ光と、結合された前記２以上のプローブ光を試料上に走査し、
前記ポンプ光で励起された前記試料を透過した、または反射された前記２以上のプローブ光を前記波長ごとに検出し、
検出されたプローブ信号をロックイン検出して、前記２以上のプローブ光で、前記ポンプ光の入射により前記試料に生じた２以上の物理現象を、同時かつ個別に測定する、
ことを特徴とする光学測定方法。 Output pump light to excite the sample from the first light source;
Output two or more probe lights with different wavelengths from the second light source,
Combining the two or more probe lights;
Scan the sample with the pump light and the two or more probe lights combined,
Detecting the two or more probe lights transmitted through or reflected by the sample excited by the pump light for each wavelength;
Lock-in detection of the detected probe signal, and simultaneously measure two or more physical phenomena generated in the sample by the incident of the pump light with the two or more probe lights simultaneously,
An optical measurement method.
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|---|---|---|---|---|
| KR102005832B1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-01 | 주식회사 올리브헬스케어 | Signal processing device for bio-signal analysing and bio-signal analysing apparatus using the same |
| KR102229881B1 (en) * | 2019-09-27 | 2021-03-19 | 한국기초과학지원연구원 | Apparatus of measuring photothermal reflectance spectrum and operating method thereof |
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- 2015-08-06 JP JP2015156262A patent/JP2017036925A/en active Pending
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