JP2017023080A - Cheese and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、チーズ及びその製造方法に関する。詳しくは、ヤマブシタケ菌糸体を含有するナチュラルチーズ及びその製造方法に関する。 The present invention relates to cheese and a method for producing the cheese. Specifically, the present invention relates to natural cheese containing Yamabushitake mycelium and a method for producing the same.
乳製品の需要の高まりから、チーズの消費量は増加の傾向にある。昨今の乳の供給困難性の問題と同様に、乳からカードと称される固形物を形成させるために添加される凝乳酵素のレンネットの供給についても慢性的な供給不足から、代用凝乳酵素の研究、開発が進められてきた。その代表例として大腸菌を遺伝子操作して代用凝乳酵素を生産させる方法があるが、消費者の天然物由来や自然物由来志向の観点から遺伝子操作によらない方法が模索されてきた。 Due to increasing demand for dairy products, consumption of cheese is on the rise. Similar to the problem of milk supply difficulties in recent years, the supply of curdling enzyme rennet added to form solids called curd from milk is also a chronic shortage of supply, and substitute milk curd Enzyme research and development have been promoted. As a representative example, there is a method of genetically manipulating E. coli to produce a milk-clotting enzyme. However, methods that do not depend on genetic manipulation have been sought from the viewpoint of consumer natural product-derived or natural product-derived orientation.
そこで、レンネットに代わる凝乳酵素として、Paenibacillus sp.由来の凝乳酵素が提案されている（特許文献１）。 Therefore, a milk-clotting enzyme derived from Paenibacillus sp. Has been proposed as a milk-clotting enzyme that can replace rennet (Patent Document 1).
一般に食用とされている原材料から得られる凝乳酵素を用いてチーズを作製し、同時にチーズに良好な食感を与え、さらに添加物を添加せずに加工工程を増やすことなく、うま味成分であるアミノ酸の含有量を向上させる技術はこれまでになかった。 It is a umami ingredient that makes cheese using curdling enzymes obtained from raw materials that are generally considered edible, and at the same time gives a good texture to the cheese, and without adding processing steps without adding additives. There has never been a technique for improving the amino acid content.
従来技術における目的は凝乳させることであり、それによってカードの形成能は認められるものの、一般に食用とされている原料由来の凝乳酵素ではないため、チーズとしての安全性や、それを用いたことにより風味が損なわれるなどの問題がある。 The purpose in the prior art is to curd the curd, and although the ability to form curd is recognized, it is not a curdling enzyme derived from ingredients that are generally edible, so it is safe as cheese and it was used There is a problem that the flavor is impaired.
従って本発明は上記従来技術の問題点を解決したナチュラルチーズとその製造方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、従来よりも保存性に優れ、アミノ酸含有量の高いナチュラルチーズとその製造方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a natural cheese and a method for producing the same that have solved the above-mentioned problems of the prior art. Furthermore, an object of this invention is to provide the natural cheese which is excellent in preservability than before, and has high amino acid content, and its manufacturing method.
上記課題を解決するため、本発明によるナチュラルチーズは、
ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）を培養して得られた培養物を含有することを特徴とする。
また本発明によるナチュラルチーズの製造方法は、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）から培養して得られた培養物を添加する工程を備えたことを特徴とする。
In order to solve the above problems, the natural cheese according to the present invention is:
It contains a culture obtained by cultivating Yamabushitake (Hericium erinaceum).
Moreover, the manufacturing method of the natural cheese by this invention was equipped with the process of adding the culture obtained by cultivating from Yamabushitake (Hericium erinaceum).
以下に、本発明によるナチュラルチーズ及びその製造方法の実施例について詳細に説明する。 Below, the Example of the natural cheese by this invention and its manufacturing method is described in detail.
＜ヤマブシタケ由来凝乳酵素の製法＞
ヤマブシタケ由来凝乳酵素は次の方法により用意する。バイオシリコセンを有する100mL容三角フラスコにフスマ5ｇを入れ、水分含有量が60％となるように蒸留水を加え、オートクレーブ殺菌（115℃、20min）し、フスマ固体培地を作製する。フスマ固体培地上にヤマブシタケ菌糸体を接種する。これを25℃で2週間培養する。得られた培養物に0.05M McIlvaine buffer (pH 6.0)を50mL加え、塊を充分にほぐした後、4℃に一晩放置する。固体と液体を分離後、液体部分を遠心分離（7℃、10,000rpm, 15min）し、上澄みをヤマブシタケ由来凝乳酵素液とする。
<Manufacturing method of Yamabushitake-derived curdling enzyme>
Yamabushitake-derived curdling enzyme is prepared by the following method. Put 5 g of bran in a 100 mL Erlenmeyer flask containing biosilicosene, add distilled water to a water content of 60%, sterilize by autoclave (115 ° C., 20 min), and prepare a bran solid medium. Inoculate Yamabushitake mycelium on the bran solid medium. This is cultured at 25 ° C. for 2 weeks. After adding 50 mL of 0.05M McIlvaine buffer (pH 6.0) to the obtained culture and thoroughly loosening the mass, it is left at 4 ° C. overnight. After separating the solid and the liquid, the liquid part is centrifuged (7 ° C., 10,000 rpm, 15 min), and the supernatant is used as the Yamabushitake-derived milk coagulation enzyme solution.
評価１
表１にはヤマブシタケ由来凝乳酵素液の菌株間における酵素活性の比較結果を示す。ヤマブシタケ菌糸体は、NBRC100328、MAFF420247、MAFF430233、MAFF430234、MAFF435060を比較対象とし活性測定及び蛋白質定量を行った。プロテアーゼ活性はカゼインが加水分解される反応速度を生成チロシン量で評価した。凝乳酵素活性はカゼインから酵素反応でカード粒子が形成し始める時間を測定しSoxhlet法で活性を評価した。(凝乳酵素活性/プロテアーゼ活性)比は凝乳酵素活性をプロテアーゼ活性で除したものである。タンパク質濃度は色素結合法により牛血清アルブミンを標準蛋白質とする検量線から求める。プロテアーゼ活性の比活性は蛋白質1ｍｇ当たりのプロテアーゼ活性である。凝乳酵素活性の比活性は蛋白質1ｍｇ当たりの凝乳酵素活性を意味する。
Evaluation 1
Table 1 shows a comparison result of enzyme activity between strains of Yamabushitake mushroom-derived milk-clotting enzyme solution. For the Yamabushitake mycelium, NBRC100328, MAFF420247, MAFF430233, MAFF430234, and MAFF435060 were compared for activity measurement and protein quantification. For the protease activity, the reaction rate at which casein was hydrolyzed was evaluated by the amount of tyrosine produced. The curdling enzyme activity was evaluated by the Soxhlet method after measuring the time when card particles started to form from casein by enzymatic reaction. The ratio (coagulant enzyme activity / protease activity) is the curdase enzyme activity divided by the protease activity. The protein concentration is determined from a calibration curve using bovine serum albumin as a standard protein by a dye binding method. The specific activity of protease activity is protease activity per 1 mg of protein. The specific activity of the curdling enzyme activity means the curdling enzyme activity per 1 mg of protein.
＜ヤマブシタケ菌糸体を含まないヤマブシタケ菌糸体由来酵素によるチーズ＞
ヤマブシタケ菌糸体を含まないヤマブシタケ由来凝乳酵素液によるチーズは図1（A01〜A13）の工程により次の方法で用意する。低温殺菌（生乳、高温殺菌乳、超高温殺菌乳であっても良い）牛乳（66℃、30分間殺菌）100mL（A01）を35℃で10分間保温（A02）する。これにヤマブシタケ菌糸体由来の酵素溶液10mLを加え（A03）ゆるやかに攪拌（A04）した後に静置（A05）する。乳全体が凝固（A06）した時点でカードを6ｍｍ角に切断（A07）する。切断後、カードの温度が50℃になるまで攪拌しながら加温（A08）する。50℃に達した時点でホエイ排出器具を用いて4℃でホエイを排出（A09）する。作製したカードをガーゼに包み（A10）、25％（w/v）の食塩水溶液に60分間4℃で浸漬（A11）する。その後、ガーゼを取り外してキムワイプで水気を取り（A12）、密閉容器に入れ、13℃で1か月間熟成（A13）させてチーズを得る。
<Cheese with Yamabushitake mycelium-derived enzyme that does not contain Yamabushitake mycelium>
The cheese by Yamabushitake mushroom-derived milk-clotting enzyme solution which does not contain Yamabushitake mycelium is prepared by the following method according to the steps of FIG. 1 (A01 to A13). Paste pasteurized (can be raw milk, pasteurized milk or ultra-high pasteurized milk) 100 ml (A01) of milk (66 ° C, pasteurized for 30 minutes) at 35 ° C for 10 minutes (A02). To this, 10 mL of an enzyme solution derived from Yamabushitake mycelium is added (A03), and the mixture is gently stirred (A04) and allowed to stand (A05). When the whole milk has solidified (A06), cut the card into 6 mm squares (A07). After cutting, heat (A08) with stirring until the temperature of the curd reaches 50 ° C. When the temperature reaches 50 ° C, the whey is discharged at 4 ° C using a whey discharge device (A09). The prepared card is wrapped in gauze (A10) and immersed in a 25% (w / v) saline solution at 4 ° C. for 60 minutes (A11). Then remove the gauze, drain with Kimwipe (A12), put in a sealed container, and age at 13 ° C for 1 month (A13) to obtain cheese.
＜ヤマブシタケ菌糸体の製法＞
チーズに含有させるためのヤマブシタケ菌糸体は次の方法により用意する。含有させるヤマブシタケ菌糸体の前培養培地として、 Glucose 30g/L、 Soluble starch 20g/L、 Yeast extract 10g/L、 KH2PO4 1g/L、 MgSO4・7H2O 0.6g/L、 D.W. 1L、 pH5.5からなる溶液100ｍLを300ｍL容三角フラスコに入れ、オートクレーブ殺菌（121℃、20min）し、液体培地を作製する。得られた液体培地にヤマブシタケ菌糸体を接種し、回転振盪培養（28℃、100rpm、7days）する。
含有させるヤマブシタケ菌糸体の本培養培地として、500mL容三角フラスコにGlucose 30g/L、 Soluble starch 20g/L、 Yeast extract 10g/L、 KH2PO4 1g/L、 MgSO4・7H2O 0.6g/L、 D.W. 1L、 pH5.5からなる液体培地200mLを用意する。ヤマブシタケ菌糸体前培養液を7％（v/v）接種し、28℃、100rpm、7days回転振盪培養する。培養して得た本培養培地の上清を除去し、滅菌水で菌糸体を洗浄し、菌糸体を得る。
<Production method of Yamabushitake mycelium>
Yamabushitake mycelium for inclusion in cheese is prepared by the following method. As a pre-culture medium of Yamabushitake mycelium to be contained, Glucose 30 g / L, Soluble starch 20 g / L, Yeast extract 10 g / L, KH 2 PO 4 1 g / L, MgSO 4 7H 2 O 0.6 g / L, DW 1 L, 100 mL of a solution consisting of pH 5.5 is placed in a 300 mL Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave (121 ° C., 20 min) to prepare a liquid medium. The obtained liquid medium is inoculated with Yamabushitake mycelium and subjected to rotary shaking culture (28 ° C., 100 rpm, 7 days).
As a main culture medium of Yamabushitake mycelium to be added, Glucose 30 g / L, Soluble starch 20 g / L, Yeast extract 10 g / L, KH 2 PO 4 1 g / L, MgSO 4 7H 2 O 0.6 g / Prepare 200 mL of liquid medium consisting of L, DW 1 L, pH 5.5. Inoculate 7% (v / v) Yamabushitake mycelium preculture and incubate with shaking at 28 ° C, 100rpm for 7days. The supernatant of the main culture medium obtained by culturing is removed, and the mycelium is washed with sterile water to obtain the mycelium.
＜ヤマブシタケ菌糸体を含むヤマブシタケ由来凝乳酵素液によるチーズ＞
ヤマブシタケ菌糸体を含むヤマブシタケ由来凝乳酵素液によるチーズは図2（B01〜B15）の工程により次の方法で用意する。まず、低温殺菌（生乳、高温殺菌乳、超高温殺菌乳であっても良い）牛乳（66℃、30分間殺菌）100mL（B01）に、実施例２に記載のヤマブシタケ菌糸体の製法により得た菌糸体を0.8ｇ（湿重量）加え（B02）混合（B03）した後、35℃で10分間保温（B04）する。ヤマブシタケ菌糸体由来凝乳酵素液10mLを加え（B05）、ゆるやかに攪拌（B06）した後に静置（B07）する。乳全体が凝固（B08）した時点でカードを6ｍｍ角に切断（B09）する。切断後、カードの温度が50℃になるまで攪拌しながら加温（B10）する。50℃に達した時点でホエイ排出器具を用いて4℃でホエイを排出（B11）する。作製したカードをガーゼに包み（B12）、25％（w/v）の食塩水溶液に60分間4℃で浸漬（B13）する。その後、ガーゼを取り外してキムワイプで水気を取り（B14）、密閉容器に入れ、13℃で1か月間熟成（B15）させてチーズを得る。
<Cheese with Yamabushitake mushroom-derived milk-clotting enzyme solution containing Yamabushitake mycelium>
The cheese by Yamabushitake-derived milk coagulation enzyme solution containing Yamabushitake mycelium is prepared by the following method according to the steps of FIG. 2 (B01 to B15). First, pasteurized (can be raw milk, high temperature pasteurized milk, ultra high temperature pasteurized milk) 100 ml (B01) of milk (66 ° C, pasteurized for 30 minutes) was obtained by the production method of Yamabushitake mycelium described in Example 2 Add 0.8g (wet weight) of mycelium (B02), mix (B03), and incubate (B04) at 35 ° C for 10 minutes. Add 10 mL of milk coagulation enzyme solution derived from Yamabushitake mycelium (B05), gently stir (B06), and then leave to stand (B07). When the whole milk has solidified (B08), cut the card into 6 mm squares (B09). After cutting, heat (B10) with stirring until the temperature of the curd reaches 50 ° C. When the temperature reaches 50 ° C, the whey is discharged at 4 ° C using a whey discharging device (B11). The prepared card is wrapped in gauze (B12) and immersed in a 25% (w / v) saline solution at 4 ° C. for 60 minutes (B13). Then remove the gauze, drain with Kimwipe (B14), put in a sealed container and age at 13 ° C for 1 month (B15) to obtain cheese.
＜ヤマブシタケ菌糸体を含むレンネットによるチーズ＞
ヤマブシタケ菌糸体を含むレンネットによるチーズは、図３（C01〜C15）の工程により次の方法で用意する。まず、低温殺菌牛乳（66℃、30分間殺菌）100mL（C01）に実施例２に記載のヤマブシタケ菌糸体の製法により得た菌糸体を0.8ｇ（湿重量）加え（C02）混合（C03）した後、35℃で10分間保温（C04）する。2mg/mLの市販レンネット（野澤組カルチャー、CHY-MAX）を1mL加え（C05）、ゆるやかに攪拌（C06）した後に静置（C07）する。乳全体が凝固（C08）した時点でカードを6ｍｍ角に切断（C09）する。切断後、カードの温度が50℃になるまで攪拌しながら加温（C10）する。50℃に達した時点でホエイ排出器具を用いて4℃でホエイを排出（C11）する。作製したカードをガーゼに包み（C12）、25％（w/v）の食塩水溶液に60分間4℃で浸漬（C13）する。その後、ガーゼを取り外してキムワイプで水気を取り（C14）、密閉容器に入れ、13℃で1か月間熟成（C15）させてチーズを得る。
<Rennet cheese containing Yamabushitake mycelium>
The rennet cheese containing Yamabushitake mycelium is prepared by the following method according to the process of FIG. 3 (C01 to C15). First, 0.8 g (wet weight) of mycelia obtained by the production method of Yamabushitake mycelium described in Example 2 was added to 100 mL (C01) of pasteurized milk (66 ° C., sterilized for 30 minutes) (C02) and mixed (C03). Then, incubate at 35 ° C for 10 minutes (C04). Add 1 mL of 2 mg / mL commercial rennet (Nozawa-gumi Culture, CHY-MAX) (C05), gently agitate (C06), and leave still (C07). When the whole milk has solidified (C08), cut the card into 6 mm squares (C09). After cutting, heat (C10) while stirring until the temperature of the curd reaches 50 ° C. When the temperature reaches 50 ° C, the whey is discharged at 4 ° C (C11) using a whey discharge device. The prepared card is wrapped in gauze (C12) and immersed in a 25% (w / v) saline solution at 4 ° C. for 60 minutes (C13). Then remove the gauze, drain with Kimwipe (C14), put in a sealed container, and age at 13 ° C for 1 month (C15) to obtain cheese.
＜レンネットによるチーズ＞
レンネットによるチーズは次の方法で用意する。低温殺菌牛乳（66℃、30分間殺菌）100mL、または低温殺菌牛乳（66℃、30分間殺菌）100mLに菌糸体を0.8ｇ（湿重量）加え（A04〜A12のいずれかの工程）混合したものを、35℃で10分間保温する。2mg/mLの市販レンネット（野澤組カルチャー、CHY-MAX）を1mL加え、ゆるやかに攪拌し、50℃に達した時点でホエイ排出器具を用いて4℃でホエイを排出し、カードを作製する。作製したカードをガーゼに包み、25％（w/v）の食塩水溶液に60分間4℃で浸漬する。その後、ガーゼを取り外してキムワイプで水気を取り、密閉容器に入れ、13℃で1か月間熟成させてチーズを得る。
<Rennet cheese>
Rennet cheese is prepared by the following method. Pasteurized milk (66 ° C, sterilized for 30 minutes) 100mL, or pasteurized milk (66 ° C, sterilized for 30 minutes) 100mL, mixed with 0.8g (wet weight) of mycelium (any step of A04 to A12) and mixed Incubate at 35 ° C. for 10 minutes. Add 1mL of 2mg / mL commercial rennet (Nozawa-gumi Culture, CHY-MAX), gently stir, and when it reaches 50 ° C, discharge whey at 4 ° C using a whey discharge device to make a card . The prepared card is wrapped in gauze and immersed in a 25% (w / v) saline solution for 60 minutes at 4 ° C. Then, remove the gauze, drain with Kimwipe, put in a sealed container, and age at 13 ° C for 1 month to obtain cheese.
評価２
ヤマブシタケMAFF435060株由来凝乳酵素で作製したチーズにおいて、ヤマブシタケ菌糸体NBRC100328、ヤマブシタケ菌糸体MAFF 420242、ヤマブシタケ菌糸体MAFF 435037、ヤマブシタケ菌糸体MAFF 435063、ヤマブシタケ菌糸体MAFF 420247、ヤマブシタケ菌糸体MAFF 430233、ヤマブシタケ菌糸体MAFF 430234、ヤマブシタケ菌糸体MAFF 435060のそれぞれを含むチーズの官能評価結果を表２に示す。ヤマブシタケ菌糸体由来凝乳酵素で作製したチーズは白色で外観は良好であった。菌糸体を含むチーズは薄い褐色を呈していた。レンネットで作製したチーズに比べて香りはヤマブシタケ菌糸体由来酵素で作製したチーズのほうが強かった。レンネットで作製したチーズの食感はボソボソしており、ヤマブシタケ菌糸体由来酵素で作製したチーズは滑らかであった。ヤマブシタケ菌糸体由来酵素と菌糸体を用いたチーズは表面及び内部が滑らかで最も食感に優れていた。菌糸体を含むチーズの味はヤマブシタケの菌糸体の種類によって風味、味覚、及び食感が異なり、ヤマブシタケを用いたチーズは多様な食味のチーズの作製の可能性を示した。
Evaluation 2
In cheese made with milk coagulation enzyme from Yamabushitake MAFF435060 strain, Yamabushitake mycelium NBRC100328, Yamabushitake mycelium MAFF 420242, Yamabushitake mycelium MAFF 435037, Yamabushitake mycelium MAFF 435063, Yamabushitake mycelium MAFF 420247 Table 2 shows the sensory evaluation results of cheese containing each of the body MAFF 430234 and the Yamabushitake mycelium MAFF 435060. The cheese prepared with the Yamabushitake mycelium-derived curdling enzyme was white and had a good appearance. The cheese containing mycelium had a light brown color. Compared with the cheese produced with Rennet, the cheese produced with the enzyme derived from Yamabushitake mycelium was stronger. The texture of the cheese produced with rennet was sober, and the cheese produced with the enzyme derived from Yamabushitake mycelium was smooth. The cheese using Yamabushitake mycelium-derived enzyme and mycelium had the smoothest surface and interior and the best texture. The taste, taste and texture of cheese containing mycelium differed depending on the type of mycelium of Yamabushitake, and the cheese using Yamabushitake showed the possibility of producing cheeses with various tastes.
評価３
ヤマブシタケMAFF435060株由来の凝乳酵素を用いて作製するチーズの抗菌性試験は次の方法により行った。PDA（Potato-Dextrose-Agar）培地に生育したPenicillium caseicolum NBRC 5849株またはPenicillium roqueforti NBRC 5459株の分生子を接種した。接種は分生子を0.1％（w/v）Tween 80を含む0.1Mリン酸Buffer(pH7.0)に懸濁した懸濁液を用いて、PDAプレートに0.2mL滴下し塗布した。PDAプレートにコルクボーラーで7mmの穴をあけ、ヤマブシタケ由来凝乳酵素液を用いて作製したチーズ0.1ｇをその場所に埋め込み、プレートをパラフィルムで密閉し、25℃でカビが生育するまで培養した。Nutrient寒天培地に生育したBacillus subtilis及びEschericia coli、YEPD寒天培地に生育したSaccharomyces cerevisiae、 YM寒天培地に生育したCandida albicans、 MYS寒天培地に生育したAspergillus niger及びAspergillus oryzaeを、それぞれの微生物が生育した培地と同様の寒天培地（20mL）が入った試験管に細菌及び酵母菌体、またはカビの分生子を懸濁し、プレートに流し込み固化させる。コルクボーラーで7mmの穴をあけ、ヤマブシタケ由来凝乳酵素を用いて作製したチーズを0.1ｇ、穴に埋め込んだ。プレートをパラフィルムで密閉し、30℃（細菌）、あるいは25℃（酵母、カビ）で生育するまで培養する。抗菌活性はチーズサンプルの周囲のハロの大きさを測定することで評価した。
Evaluation 3
The antibacterial property test of cheese produced using the milk-clotting enzyme derived from Yamabushitake MAFF435060 strain was carried out by the following method. Conidia of Penicillium caseicolum NBRC 5849 strain or Penicillium roqueforti NBRC 5459 strain grown on PDA (Potato-Dextrose-Agar) medium was inoculated. Inoculation was performed by dropping 0.2 mL of conidia on a PDA plate using a suspension of 0.1 M (w / v) Tween 80 in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0). A 7 mm hole was made in a PDA plate with a cork borer, 0.1 g of cheese made using a Yamabushitake mushroom-derived milk-clotting enzyme solution was embedded in the place, the plate was sealed with parafilm, and cultured at 25 ° C. until mold grew. . Bacillus subtilis and Eschericia coli grown on Nutrient agar, Saccharomyces cerevisiae grown on YEPD agar, Candida albicans grown on YM agar, Aspergillus niger and Aspergillus oryzae grown on MYS agar Suspend bacteria and yeast cells or mold conidia in a test tube containing the same agar medium (20 mL), and pour onto a plate to solidify. A 7 mm hole was made with a cork borer, and 0.1 g of cheese made using a Yamabushitake-derived milk-clotting enzyme was embedded in the hole. Seal the plate with parafilm and incubate at 30 ° C (bacteria) or 25 ° C (yeast, mold) until grown. Antibacterial activity was evaluated by measuring the size of the halo around the cheese sample.
表３にヤマブシタケ菌糸体由来酵素で作製したチーズの抗菌性の検討結果を示す。抗菌性はAspergillus niger、Penicillium caseicolum、Eschericia coli及びCandida albicansには強く、Bacillus subtilis、Aspergillus oryzae、Penicillium roqueforti及びSaccharomyces cerevisiaeには弱い。凝乳酵素自体には抗菌性は認められなかった。 Table 3 shows the results of examination of the antibacterial properties of cheese made with the enzyme derived from Yamabushitake mycelium. Antibacterial activity is strong against Aspergillus niger, Penicillium caseicolum, Escherichia coli and Candida albicans, and weak against Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, Penicillium roqueforti and Saccharomyces cerevisiae. Antibacterial activity was not observed in the curdling enzyme itself.
ヤマブシタケMAFF435060株由来の凝乳酵素を用いて作製したチーズには熟成中雑菌繁殖が全く認められない一方、MAFF435060株以外のヤマブシタケの凝乳酵素及びレンネットを用いて作製されるチーズは熟成中雑菌繁殖が認められた。Penicillium caseicolum NBRC5849株及びPenicillium roqueforti NBRC5459株に対して、ヤマブシタケMAFF435060株由来の凝乳酵素を用いたチーズには抗菌性が認められた。しかし凝乳酵素自体には抗菌性は認められなかった。 Cheese prepared using the curdling enzyme derived from Yamabushitake MAFF435060 strain does not show any breeding of germs during ripening, while cheese made using the curdling enzyme of Yamabushitake and rennet other than MAFF435060 Breeding was observed. Antibacterial activity was observed in cheese using the curdling enzyme derived from Yamabushitake MAFF435060 strain against Penicillium caseicolum NBRC5849 strain and Penicillium roqueforti NBRC5459 strain. However, the curdling enzyme itself did not show antibacterial activity.
チーズ熟成開始から0、15、30、45、60日後にチーズサンプルを採取し抗菌活性を測定した。抗菌活性はチーズサンプルの周囲のハロの大きさを測定することで評価した。 Cheese samples were collected 0, 15, 30, 45, and 60 days after the start of cheese ripening to measure antibacterial activity. Antibacterial activity was evaluated by measuring the size of the halo around the cheese sample.
MAFF435060株由来の凝乳酵素を用いて作製したチーズにおける熟成時間が抗菌性に及ぼす影響を検討すると、0日目のチーズには抗菌性がなかったため、カード自体には抗菌性はなかった。一方、熟成15日後からチーズに抗菌性が見いだされ、それ以後も抗菌性が維持された。ハロの大きさには30日以後は変化がなかった。 Examination of the effect of ripening time on antibacterial properties in cheese made using the milk-clotting enzyme derived from MAFF435060 strain showed that the curd itself was not antibacterial because the cheese on day 0 had no antibacterial properties. On the other hand, the antibacterial property was found in cheese after 15 days of ripening, and the antibacterial property was maintained thereafter. The size of the halo did not change after 30 days.
評価４
レオメーターAnton paar 社製MCR 302を用い、G’貯蔵弾性率（弾性項）、G’’損失弾性率（粘性項）を測定した。サンプルは薄くスライスし、2枚の表面が平らな円盤（半径25 mm）に隙間を2 mmあけて挟み、サンプル表面は水分の蒸発を防ぐために、シリコンオイルでコーティングした。サンプルをレオメーターにセットし、50℃から5℃まで徐々に温度を下げ（2℃/min）、その間にG’貯蔵弾性率（弾性項）とG’’損失弾性率（粘性項）を測定した。サンプルの角振動数は1秒間に一回とし、ひずみ量は0.1%とした。
Evaluation 4
G 'storage elastic modulus (elastic term) and G''loss elastic modulus (viscous term) were measured using MCR 302 made by Rheometer Anton paar. The sample was sliced thinly and sandwiched between two flat disks (radius 25 mm) with a gap of 2 mm, and the sample surface was coated with silicone oil to prevent moisture evaporation. Set the sample in the rheometer, gradually decrease the temperature from 50 ℃ to 5 ℃ (2 ℃ / min), and measure G 'storage elastic modulus (elastic term) and G''loss elastic modulus (viscous term) during that time did. The angular frequency of the sample was once per second, and the strain amount was 0.1%.
市販レンネットでのチーズカード（コントロール）とヤマブシタケ酵素でのチーズカードの物性比較は以下のサンプルにより行った。酵素と溶媒との組合わせが弾性率に影響しないよう、ヤマブシタケから凝乳酵素を抽出した際と同じバッファー0.05M McIlvaine buffer (ｐＨ 6.0) を用意し、以下の４種類の比較サンプルにより評価した。
（比較サンプル 4種類）
市販レンネット（蒸留水に溶解）によるカード
市販レンネット（バッファーに溶解）によるカード
ヤマブシタケ酵素（蒸留水に溶解）でのチーズカード
ヤマブシタケ酵素（バッファーに溶解）でのチーズカード
Comparison of physical properties of cheese curd with commercially available rennet (control) and cheese curd with Yamabushitake enzyme was performed by the following samples. In order to prevent the combination of the enzyme and the solvent from affecting the elastic modulus, 0.05M McIlvaine buffer (pH 6.0) was prepared in the same manner as when milk-clotting enzyme was extracted from Yamabushitake, and the following four types of comparative samples were evaluated.
(4 types of comparison samples)
Cheese curd with curd Yamabushitake enzyme (dissolved in distilled water) with cheese curd Yamabushitake enzyme (dissolved in buffer) with curd commercial rennet (dissolved in buffer) with commercially available rennet (dissolved in distilled water)
図４、図５に示されているように、市販レンネットとヤマブシタケ酵素ではヤマブシタケカードの粘弾性が低く（G’、 G’’が低い）柔らかいカードとなった。なお、抽出溶媒の差は無かった。損失弾性率/貯蔵弾性率比（G’’/G’）はヤマブシタケカードが市販レンネットカードに比べて高く、損失弾性率の寄与が高い結果となった。カードは、市販レンネットカードと比べ、柔らかく、よりなめらかな食感を呈した。これは抽出溶媒の影響を受けたものではなく、酵素液によるものであると考えられる。 As shown in FIGS. 4 and 5, the commercial rennet and the Yamabushitake enzyme were soft cards with low viscoelasticity (G ′ and G ″ were low). There was no difference in the extraction solvent. The loss elastic modulus / storage elastic modulus ratio (G ″ / G ′) was higher for Yamabushitake cards than commercial rennet cards, and the loss elastic modulus contributed greatly. The card was softer and smoother than the commercial rennet card. This is not influenced by the extraction solvent, but is considered to be due to the enzyme solution.
市販レンネットによるチーズカードとヤマブシタケ酵素でのチーズカード、及び菌糸体入りカードの物性比較は以下の４種類の比較サンプルにより行った。
（比較サンプル 4種類）
市販レンネットによるカード
菌糸体入り市販レンネットによるカード
ヤマブシタケ酵素でのチーズカード
菌糸体入りヤマブシタケ酵素でのチーズカード
Comparison of physical properties of cheese curd with commercially available rennet, cheese curd with Yamabushitake enzyme, and card with mycelia was performed by the following four types of comparative samples.
(4 types of comparison samples)
Cheese curd with Yamabushitake enzyme with curd Yamabushitake enzyme with curd mycelia with commercial rennet with curd mycelium with commercial rennet
図６、図７に示されているとおり、市販レンネットのみで作製したものが最も固く、G’、 G’’ともに最も高くなった。ヤマブシタケ酵素で作製したカードは市販レンネットを用いたカードよりもG’、 G’’粘弾性が低いため、より柔らかいカードであることが明らかになった。損失弾性率/貯蔵弾性率比（G’’/G’）はヤマブシタケカードが市販レンネットカードと比べて高く、損失弾性率の寄与が高いことが明らかとなった。ヤマブシタケカードは、市販レンネットカードと比べ、柔らかく、よりなめらかな食感を呈した。 As shown in FIG. 6 and FIG. 7, the one made only with the commercial rennet was the hardest, and both G ′ and G ″ were the highest. The card made with Yamabushitake enzyme was found to be a softer card because it has lower G 'and G "viscoelasticity than a card using a commercial rennet. The loss elastic modulus / storage elastic modulus ratio (G ″ / G ′) was higher for Yamabushitake cards than commercial rennet cards, and it was revealed that the contribution of loss elastic modulus was high. The Yamabushitake card was softer and smoother than the commercial rennet card.
菌糸体を加えたカードは市販レンネットカード、ヤマブシタケカードともに、菌糸体を加えないカードと比べてG’、 G’’ともに低く、菌糸体により、柔らかくなった。ヤマブシタケカード、市販レンネットカードの両方で、菌糸体を加える事によりG’’/G’が低くなり、貯蔵弾性率の寄与は高まった。菌糸体は細かい繊維であるため、カード中で抵抗となりコンクリートに鉄筋を入れる様な剛性上昇効果の働きをしていると考えられる。ヤマブシタケ酵素と菌糸体は、それぞれカードに対して、カードを柔らかくする方向に働くことが明らかになった。さらに、菌糸体は弾性の寄与を高める働きがあることが明らかになった。これらの使用量を調節することにより、自由に食感を調製でき、多様な食感を持つチーズの生産が可能である。 Both the commercially available Rennet card and Yamabushitake card were low in both G ′ and G ″, and softened with the mycelium. In both Yamabushitake cards and commercial rennet cards, the addition of mycelia lowered G ″ / G ′, and the contribution of storage modulus increased. Since the mycelium is a fine fiber, it is considered that it works as an effect of increasing rigidity, such as resistance in the card and insertion of rebar into the concrete. It became clear that Yamabushitake enzyme and mycelium act to soften the card, respectively. Furthermore, it was revealed that the mycelium has a function to increase the contribution of elasticity. By adjusting the amount used, the texture can be freely adjusted, and cheeses with various textures can be produced.
このことから、ヤマブシタケ酵素カードは市販レンネットカードと比べ、柔らかくなり（G’、 G’’が低くなる）、損失弾性率G’’の寄与が大きい（柔らかく滑らかな食感）。さらに、菌糸体を入れることで、柔らかくなる（G’、 G’’が低くなる）が貯蔵弾性率の寄与は高まる（柔らかくしっかりとした食感）ことがわかる。 Therefore, the Yamabushitake enzyme card becomes softer (G ′ and G ″ are lower) and the contribution of loss elastic modulus G ″ is larger (soft and smooth texture) than commercial rennet cards. Furthermore, it can be seen that the mycelium is softened (G ′ and G ″ are lowered), but the contribution of the storage elastic modulus is increased (soft and firm texture).
評価５
ヤマブシタケ酵素は、低温殺菌牛乳のみならず、高温殺菌牛乳でも凝乳することや、チーズの食味の違いなどから凝乳機構が市販レンネットとは違う独特のものである可能性が考えられた。それを明らかにするため、ホエイのHPLC分析を行った。牛乳中にはカゼインはミセルとして存在している。レンネットの凝乳機構はそのミセルの表面に存在するカッパーカゼインの一部を切断することにより親水部を遊離させ、ミセル表面を疎水性にさせることによる疎水結合で凝乳させるとされている。その際に遊離するグリコマクロペプチド（GMP）がホエイに存在するか否かでヤマブシタケ酵素と市販レンネットで差があるかを確認する。
Evaluation 5
Yamabushitake enzyme may be unique not only in pasteurized milk but also in pasteurized milk, and the curdling mechanism is different from commercial rennets due to differences in cheese taste. In order to clarify it, HPLC analysis of whey was conducted. Casein exists as micelles in milk. Rennet's curding mechanism is said to cleave part of the kappa casein present on the surface of the micelle to release the hydrophilic part and to curd up with a hydrophobic bond by making the micelle surface hydrophobic. Whether there is a difference between the Yamabushitake enzyme and the commercial rennet based on whether or not the glycomacropeptide (GMP) released at that time is present in the whey.
市販レンネットのホエイにはGMPが存在していたが、ヤマブシタケ酵素のホエイにはGMPが存在していないことが明らかになった。このことからヤマブシタケ酵素は市販レンネットと違う凝乳機構を持っている、もしくはヤマブシタケ酵素によって遊離したGMPがヤマブシタケの別の酵素によって分解されてしまっているかのどちらかであると推測される。 GMP was present in commercial wrennet whey, but GMP was not present in Yamabushitake enzyme whey. From this, it is speculated that the Yamabushitake enzyme has a different curdling mechanism from the commercial rennet, or that GMP released by the Yamabushitake enzyme has been degraded by another enzyme of Yamabushitake.
この推論を明らかにするため、ヤマブシタケ酵素と標準試薬のGMPとを反応させ、サンプルを経時変化で回収しHPLCを行った。反応液は0、1、2、5、10、20、30、60分で回収しHPLC分析した。図８にはその結果を示す。これによると、反応0分、60分後の分析結果のいずれにおいてもGMPを示すピークは現れた。GMP濃度を0〜60分のピーク面積から求める。GMPのリテンションタイム(RT)はRT4.553〜6.045に検出されるピークと考えられるが、ヤマブシタケ酵素はRT6.0付近に分解物と思われるピークが一部重なることから、RT4.55でのピークをGMPとして濃度を求めた。GMPの濃度は減少しておらず、HPLCで分かる範囲ではGMPを分解していないことがわかった。 To clarify this reasoning, Yamabushitake enzyme was reacted with GMP, which is a standard reagent, and samples were collected over time and subjected to HPLC. The reaction solutions were collected at 0, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 60 minutes and analyzed by HPLC. FIG. 8 shows the result. According to this, a peak indicating GMP appeared in both the analysis results after 0 minutes and 60 minutes after the reaction. The GMP concentration is determined from the peak area of 0-60 minutes. The retention time (RT) of GMP is considered to be a peak detected at RT4.553 to 6.045, but the Yamabushitake enzyme has a peak at RT4.55 because a peak that seems to be a degradation product overlaps around RT6.0. The concentration was determined as GMP. The concentration of GMP did not decrease, and it was found that GMP was not degraded within the range known by HPLC.
ヤマブシタケ酵素はカッパーカゼインからGMPを遊離しない凝乳機構であり、レンネットとは異なった凝乳機構であると考えられた。今までに発見されている凝乳酵素である微生物レンネットはウシ由来のレンネットと同様の機構で凝乳させているため、ヤマブシタケ酵素は凝乳酵素として新規の凝乳機構を持つ酵素であることが明らかである。凝乳機構はカゼインミセル表面におけるカッパーカゼインのGMPの糖鎖部分だけを切断し、GMPのペプチド部分は切断せずにカゼインミセルのほとんどを疎水性にする機構ではないかと推察される。この凝乳機構の場合、ペプチド部分がホエイに流れ出ないため、よりタンパク量が多いチーズ等の作製が期待できる。 Yamabushitake enzyme is a curdling mechanism that does not release GMP from kappa casein and is considered to be a curdling mechanism different from rennet. The microbial rennet, a curdling enzyme that has been discovered so far, is coagulated by a mechanism similar to that of bovine rennet, so the Yamabushitake enzyme is an enzyme with a novel curdling mechanism as a curdling enzyme. It is clear. It is inferred that the curdling mechanism is a mechanism that cleaves only the GMP sugar chain part of kappa casein on the surface of casein micelles and makes most of the casein micelles hydrophobic without cleaving the peptide part of GMP. In the case of this curdling mechanism, since the peptide portion does not flow out into the whey, production of cheese or the like having a higher protein content can be expected.
評価６
チーズ中の遊離アミノ酸含有量の測定は以下のようにする。チーズ1ｇに60℃の蒸留水を加え、ホモジナイズした。ホモジネートを10ml容メスフラスコに入れ定容した。0.5mlをマイクロチューブにとり、5％TCA溶液を加え、混合する。混合液を遠心分離した後、上清にn-ヘキサンを加え混合した。水層を回収し0.2μmのフィルターでろ過し、測定試料とした。サンプル溶液に0.02M HCl溶液で2倍に希釈し、アミノ酸分析機により測定した。
Evaluation 6
Measurement of free amino acid content in cheese is as follows. Distilled water at 60 ° C. was added to 1 g of cheese and homogenized. The homogenate was placed in a 10 ml volumetric flask and the volume was adjusted. Take 0.5 ml in a microtube, add 5% TCA solution and mix. After centrifuging the mixture, n-hexane was added to the supernatant and mixed. The aqueous layer was collected and filtered through a 0.2 μm filter to obtain a measurement sample. The sample solution was diluted 2-fold with 0.02M HCl solution and measured with an amino acid analyzer.
ヤマブシタケMAFF435060株由来の酵素と菌糸体を用いたチーズに含まれるアミノ酸含有量を分析した結果を表４に示す。測定試料はレンネットのみ、レンネットとヤマブシタケMAFF435060株菌糸体、ヤマブシタケMAFF435060株由来の酵素のみ、及びヤマブシタケMAFF435060株由来酵素とヤマブシタケMAFF435060株菌糸体を用いて製造したカードを加塩後、13℃で一か月間熟成したナチュラルチーズの4種類について検討した。 Table 4 shows the results of analyzing the amino acid content contained in cheese using the enzyme and mycelium derived from Yamabushitake MAFF435060 strain. The sample to be measured was Rennet only, Rennet and Yamabushitake MAFF435060 strain mycelium, Yamabushitake MAFF435060 strain-only enzyme, and Yamabushitake MAFF435060 strain-derived enzyme and Yamabushitake MAFF435060 strain mycelium were salted and mixed at 13 ° C. Four types of natural cheese ripened for months were examined.
レンネットのみ及びヤマブシタケ菌糸体由来酵素のみで作製したチーズはアミノ酸量が少なく、レンネットのみのものが最も低かった。酵素のみのチーズに比べて、菌糸体を含むチーズはアミノ酸量が増加し、ヤマブシタケ菌糸体由来酵素と菌糸体を用いたチーズが最も高かった。菌糸体を含むチーズはGlu、 Thr、 Val、 Met、 Ile、 Leu、 Phe、 Lysが多かった。 Cheese prepared with only rennet and Yamabushitake mycelium-derived enzymes had low amino acid content, and rennet-only cheese was the lowest. Compared with enzyme-only cheese, cheese containing mycelium had an increased amino acid content, and cheese using Yamabushitake mycelium-derived enzyme and mycelium was the highest. Many cheeses containing mycelium were Glu, Thr, Val, Met, Ile, Leu, Phe, and Lys.
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