JP2017018011A - Detection kit and detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は，検出キット，及び検出方法に関する。より詳しく説明すると，本発明は，ヒト以外の実験動物において移植等したヒト細胞がどのように分布しているかを検出するための生体分布の検出キットや，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物において発現したヒト細胞の検出方法に関する。 The present invention relates to a detection kit and a detection method. More specifically, the present invention relates to a biodistribution detection kit for detecting how human cells transplanted in a non-human experimental animal are distributed, and a non-human experimental animal using the kit. The present invention relates to a method for detecting human cells expressed in 1.
国際公開ＷＯ２０１３−０６９６６１号パンフレットには，ｉＰＳ細胞を用いた細胞シートが開示されている。このようにｉＰＳ細胞など幹細胞を移植する試みがなされている。この場合，移植片の安全性を評価する必要が生ずる。このため，人体実験に先立って，動物実験が行われる。その場合，移植した細胞が，実験動物の生体内においてどのように分布したか評価することが望まれる。 International publication WO2013-069661 pamphlet discloses a cell sheet using iPS cells. Thus, attempts have been made to transplant stem cells such as iPS cells. In this case, it will be necessary to evaluate the safety of the graft. For this reason, animal experiments are performed prior to human experiments. In that case, it is desirable to evaluate how the transplanted cells were distributed in the living body of the experimental animal.
従来の技術では，ｉＰＳ細胞などヒト由来の移植片に由来して発現した細胞が，ヒト由来のものであるか実験動物由来のものであるかを判別することが困難であった。特に，マカク属に細胞を移植した場合，移植片に由来して発現した細胞が，ヒト由来のものであるか実験動物由来のものであるか判別することが困難であった。 In the prior art, it has been difficult to determine whether cells expressed from human-derived grafts such as iPS cells are derived from humans or experimental animals. In particular, when cells were transplanted into the macaque genus, it was difficult to determine whether the cells derived from the graft were derived from humans or experimental animals.
そこで，本発明は，ヒト細胞をヒト以外の実験動物において移植や発現等させた場合に，ヒト細胞の発現を検出するための検出キットや，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物において発現したヒト細胞の検出方法を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention was expressed in a detection kit for detecting the expression of a human cell when the human cell was transplanted or expressed in a non-human experimental animal, or in a non-human experimental animal using the kit. An object of the present invention is to provide a method for detecting human cells.
本発明の第１の側面は，フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットに関する。
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
一方，リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
The first aspect of the present invention relates to a detection kit including a forward primer and a reverse primer.
The forward primer is an oligonucleotide having 17 to 21 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
On the other hand, the reverse primer is an oligonucleotide having 18 to 22 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Sequence number 1: 5'-CCAGCCCTATGGGAAGTCTCTT-3 '
SEQ ID NO: 2: 5′-CGTCAAGAGAAAAGCCAACATG-3 ′
フォワードプライマーは，好ましくは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
リバースプライマーは，好ましくは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
The forward primer is preferably an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
The reverse primer is preferably an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
この検出キットは，更にプローブを有していてもよい。プローブは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
プローブは，好ましくは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
This detection kit may further have a probe. The probe is an oligonucleotide having 11 to 15 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 to which a fluorescent label is added at either or both of the 5 ′ end and the 3 ′ end.
The probe is preferably an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 to which a fluorescent label is added to either or both of the 5 ′ end and the 3 ′ end.
Sequence number 3: 5'-TGCATTGGAGGAAAA-3 '
プローブは，下記の配列を有するものが好ましい。
５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’
The probe preferably has the following sequence.
5'-FAM-TGCATTGGAGGAAAA-TAMRA-3 '
本発明の第２の側面は，上記したいずれかに記載の検出キットを用いたヒト以外の対象動物におけるヒト細胞の発現検出方法に関する。 The second aspect of the present invention relates to a method for detecting expression of human cells in a target animal other than humans using any of the detection kits described above.
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたヒト以外の動物である。 The target animal is preferably a non-human animal transplanted with human stem cells.
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたマカク属に分類される動物である。 The target animal is preferably an animal classified into the genus Macaque transplanted with human stem cells.
この発現検出方法は，好ましくは，移植されたヒト細胞の対象動物における発現分布を検出する方法である。 This expression detection method is preferably a method for detecting the expression distribution of the transplanted human cells in the target animal.
本発明は，ヒト細胞をヒト以外の実験動物において移植や発現等させた場合に，ヒト細胞の発現を検出するための検出キットを提供できる。
また，本発明は，そのキットを用いる，ヒト以外の実験動物において発現したヒト細胞の検出方法を提供することができる。
The present invention can provide a detection kit for detecting the expression of a human cell when the human cell is transplanted or expressed in a laboratory animal other than a human.
The present invention can also provide a method for detecting human cells expressed in laboratory animals other than humans, using the kit.
本発明の第１の側面は，フォワードプライマーとリバースプライマーとを含む検出キットに関する。この検出キットは，ヒト細胞が発現したか否か，すなわちヒト細胞の分布を検出することに好ましく用いることができる。また，後述する実施例により実証されたとおり，本発明の検出キットは，マカク属に属するヒト以外の動物において，ヒト細胞を移植等した際に，ヒト細胞が発現したか否かを適切に評価できる。本発明の検出キットは，プライマーを含むため，例えば，ＰＣＲなど公知の核酸増幅法を用いて発現を分析できる。ＰＣＲ自体やＰＣＲを行うための装置は，公知であるから，公知のＰＣＲ法などの核酸増幅法において，本発明の検出キットを用いることができる。 The first aspect of the present invention relates to a detection kit including a forward primer and a reverse primer. This detection kit can be preferably used to detect whether or not human cells are expressed, that is, the distribution of human cells. Further, as demonstrated by the examples described later, the detection kit of the present invention appropriately evaluates whether or not human cells are expressed when transplanting human cells in a non-human animal belonging to the genus Macaque. it can. Since the detection kit of the present invention includes primers, expression can be analyzed using a known nucleic acid amplification method such as PCR. Since PCR itself and apparatuses for performing PCR are known, the detection kit of the present invention can be used in a nucleic acid amplification method such as a known PCR method.
各プライマーセットを用いた増幅反応の結果を確認するには，公知の様々な検出方法を利用することができる。増幅反応を確認する方法の例は，アガロースゲル電気泳動法，ポリアクリルアミド電気泳動法，フラグメント解析法及び蛍光物質による検出方法である。 In order to confirm the result of the amplification reaction using each primer set, various known detection methods can be used. Examples of methods for confirming the amplification reaction are agarose gel electrophoresis, polyacrylamide electrophoresis, fragment analysis, and detection using a fluorescent substance.
核酸増幅方法の例は，ＰＣＲの他，ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻，第９１頁（１９９１）），ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報，及び特開平２−２９３４号公報），ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ 第２０巻，第１６９１頁（１９９２）），ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報），ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第３１巻，第３２７０頁（１９９３））である。 Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature, Vol. 350, page 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, and JP-A-2-2934). No. Gazette), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research Vol. 20, p. 1691 (1992)), RCR (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcribion mediated amplification method. 31, page 3270 (1993)).
ＰＣＲ法は，試料核酸，４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸，一対のオリゴヌクレオチド，及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で，変性，アニーリング，伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより，上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。変性工程で試料の核酸を変性し，続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと，それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ，続く伸長工程で，各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ，二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより，１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って，このサイクルをｎ回繰り返せば，理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので，電気泳動等の方法により容易に検出できる。 The PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a thermostable DNA polymerase. This is a method of exponentially amplifying a region of a sample nucleic acid sandwiched between oligonucleotides. In the denaturation step, the sample nucleic acid is denatured, in the subsequent annealing step, each oligonucleotide is hybridized with a region on the complementary single-stranded sample nucleic acid, and in the subsequent extension step, DNA is derived from each oligonucleotide as a starting point. A DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of the polymerase to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of oligonucleotides is theoretically amplified 2n times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis.
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
一方，リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
The forward primer is an oligonucleotide having 17 to 21 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
On the other hand, the reverse primer is an oligonucleotide having 18 to 22 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Sequence number 1: 5'-CCAGCCCTATGGGAAGTCTCTT-3 '
SEQ ID NO: 2: 5′-CGTCAAGAGAAAAGCCAACATG-3 ′
フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１８〜２１塩基（１９〜２１塩基又は２０〜２１塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。フォワードプライマーは，好ましくは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。 The forward primer may be an oligonucleotide having 18 to 21 bases (19 to 21 bases or 20 to 21 bases) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The forward primer is preferably an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１９〜２２塩基（２０〜２２塩基又は２１〜２２塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。リバースプライマーは，好ましくは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。 The reverse primer may be an oligonucleotide having 19 to 22 bases (20 to 22 bases or 21 to 22 bases) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. The reverse primer is preferably an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
本発明のフォワードプライマー及びリバースプライマーは，ヒト由来のあるＤＮＡと特異的にハイブリダイズするものと考えられる。「特異的にハイブリダイズする」とは，通常のハイブリダイゼーション条件下，好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば，サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ， 第２版，１９８９に記載の条件）において，他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。 The forward primer and reverse primer of the present invention are considered to specifically hybridize with certain human-derived DNA. “Specifically hybridize” means normal hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Laboratory Press, New York, USA, 2nd. Plate, conditions described in 1989) means that cross-hybridization with other DNA does not occur significantly.
この検出キットは，上記のフォワードプライマー及びリバースプライマーに加え，ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むものであってもよい。 This detection kit may contain a DNA polymerase and four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) in addition to the forward primer and the reverse primer described above.
この検出キットは，更にプローブを有していてもよい。プローブは，配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドである。プローブは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に標識が付加されてもよい。配列番号３で示される塩基配列中の連続する１２〜１５塩基（１３〜１５塩基又は１４〜１５塩基）を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。プローブは，好ましくは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
This detection kit may further have a probe. The probe is an oligonucleotide having 11 to 15 consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. The probe may be labeled at either or both of the 5 ′ end and 3 ′ end. It may be an oligonucleotide having 12 to 15 bases (13 to 15 bases or 14 to 15 bases) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. The probe is preferably an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 to which a fluorescent label is added to either or both of the 5 ′ end and the 3 ′ end.
Sequence number 3: 5'-TGCATTGGAGGAAAA-3 '
標識の例は，蛍光化学物質による蛍光標識，発光団，酵素，蛍光蛋白質，発光蛋白質，磁性体，導電性物質，ビオチン，ハプテン，抗原及び抗体である。蛍光化学物質の例は，ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド，Ｃｙ３，及びＣｙ５である。発光団の例は，ルテニウムである。酵素の例は，アルカリフォスファターゼ及びペルオキシダーゼである。プローブのみならず，上記したフォワードプライマー及びリバースプライマーにも適宜標識が付されていてもよい。 Examples of labels are fluorescent labels with fluorescent chemicals, luminophores, enzymes, fluorescent proteins, photoproteins, magnetic substances, conductive substances, biotin, haptens, antigens and antibodies. Examples of fluorescent chemicals are FITC, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Texas Red, Cy3, and Cy5. An example of a luminophore is ruthenium. Examples of enzymes are alkaline phosphatase and peroxidase. Not only the probe but also the above-mentioned forward primer and reverse primer may be appropriately labeled.
プローブは，下記の配列を有するものが好ましい。
５’−ＦＡＭ−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’
５’末端及び３’末端のＦＡＭ及びＴＡＭＲＡは蛍光標識である。
The probe preferably has the following sequence.
5'-FAM-TGCATTGGAGGAAAA-TAMRA-3 '
FAM and TAMRA at the 5 ′ and 3 ′ ends are fluorescent labels.
本発明の検出キットを用いた検出方法は，標識の種類に応じて選択されればよい。例えば，プライマーとプローブが異なる蛍光化学物質で標識されている場合は，蛍光検出器，又はフローサイトメーターを用いることにより目的とする増幅核酸を検出することができる。さらに，ＦＲＥＴを利用することで，目的とする増幅核酸を検出してもよい。例えば，一方がビオチン，他方が蛍光化学物質や発光団により標識されている場合は，例えば，ビオチン標識を利用してハイブリッドの捕捉を行い，捕捉されたハイブリッドの標識を測定する方法などが考えられる。またビオチンと抗原等の両方が捕捉可能な物質の場合は，例えばアビジンを固定した通液フィルターでハイブリッドを捕捉し，次に酵素標識抗体を反応させ，当該酵素による発色もしくは発光基質を添加することによる発光を利用して検出することができる。 The detection method using the detection kit of the present invention may be selected according to the type of label. For example, when the primer and the probe are labeled with different fluorescent chemical substances, the target amplified nucleic acid can be detected by using a fluorescence detector or a flow cytometer. Furthermore, the target amplified nucleic acid may be detected by using FRET. For example, when one is labeled with biotin and the other is labeled with a fluorescent chemical or a luminophore, for example, a method of capturing a hybrid using a biotin label and measuring the label of the captured hybrid can be considered. . In the case of a substance that can capture both biotin and antigen, for example, capture the hybrid with a flow-through filter to which avidin is immobilized, then react with the enzyme-labeled antibody, and add a color or luminescent substrate with the enzyme. It is possible to detect by utilizing the light emission by.
本発明の第２の側面は，上記したいずれかに記載の検出キットを用いたヒト以外の対象動物におけるヒト細胞の発現検出方法に関する。ヒト細胞の発現を検出するためには，上記において説明した各種の方法を適宜用いればよい。 The second aspect of the present invention relates to a method for detecting expression of human cells in a target animal other than humans using any of the detection kits described above. In order to detect the expression of human cells, various methods described above may be used as appropriate.
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたヒト以外の動物である。ヒトの幹細胞の例は，ヒトのｉＰＳ細胞であり，ヒトのｉＰＳ細胞シートであってもよい。対象動物は，形質転換されたヒト以外の動物であってもよい。さらに，対象動物は，ヒト細胞が投与されたヒト以外の動物であってもよい。 The target animal is preferably a non-human animal transplanted with human stem cells. An example of a human stem cell is a human iPS cell, which may be a human iPS cell sheet. The target animal may be a transformed non-human animal. Furthermore, the target animal may be a non-human animal to which human cells are administered.
対象動物は，好ましくは，ヒトの幹細胞を移植されたマカク属に分類される動物である。マカク属に分類される動物の例は，カニクイザルである。 The target animal is preferably an animal classified into the genus Macaque transplanted with human stem cells. An example of an animal classified as genus Macaque is cynomolgus monkey.
この発現検出方法は，好ましくは，移植されたヒト細胞の対象動物における発現分布を検出する方法である。この場合，対象動物の各部位から細胞を取り出して，本発明の検出キットを用いて，各部位においてヒト細胞が発現しているかを分析（例えば定量分析）すればよい。具体的に説明すると，移植片が移植された部位のみならず，その周辺や各種の器官から細胞を採取し，ヒト細胞が発現等しているか否か分析すればよい。 This expression detection method is preferably a method for detecting the expression distribution of the transplanted human cells in the target animal. In this case, it is only necessary to take out cells from each part of the target animal and analyze (for example, quantitative analysis) whether human cells are expressed in each part using the detection kit of the present invention. More specifically, cells may be collected not only from the site where the graft is transplanted, but also from its surroundings and various organs to analyze whether or not human cells are expressed.
以下実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は，上記した説明や，実施例に限定されるものではなく，当業者に公知な方法や条件を適宜採用することができる。 The present invention will be specifically described below with reference to examples. The present invention is not limited to the above description and examples, and methods and conditions known to those skilled in the art can be appropriately employed.
カニクイザルまたはラットのゲノムＤＮＡ由来の増幅は起こらず，ヒトのゲノムＤＮＡを特異的に増幅できることを確認するため，ヒト，カニクイザル及びラットそれぞれのゲノムＤＮＡを５〜５００００コピー（１６．５ｐｇ〜１６５ｎｇ，ゲノムＤＮＡ １コピー ＝ ３．３ｐｇ換算）含む希釈系列を作製し，これらを鋳型としてｑＰＣＲ定量を行った。
この際，フォワードプライマー及びリバースプライマーとして，それぞれ，配列番号１及び配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’
また，プローブとして，５’−ＦＡＭ−（配列番号３）−ＴＡＭＲＡ−３’で示されるものを用いた。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’
In order to confirm that human genomic DNA can be specifically amplified without amplification from cynomolgus monkey or rat genomic DNA, 5 to 50000 copies (16.5 pg to 165 ng, genomic DNA of human, cynomolgus monkey and rat) A dilution series containing 1 copy of DNA = 3.3 pg was prepared, and qPCR quantification was performed using these as templates.
At this time, oligonucleotides having base sequences represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were used as the forward primer and the reverse primer, respectively.
Sequence number 1: 5'-CCAGCCCTATGGGAAGTCTCTT-3 '
SEQ ID NO: 2: 5′-CGTCAAGAGAAAAGCCAACATG-3 ′
Moreover, what was shown by 5'-FAM- (sequence number 3) -TAMRA-3 'was used as a probe.
Sequence number 3: 5'-TGCATTGGAGGAAAA-3 '
ｑＰＣＲは，公知の装置を用いて行った。ｑＰＣＲ条件は，５０℃２分／９５℃１０分／（９５℃１５秒及び６０℃１分）を１サイクルとし，４０サイクル行うことを基本とした。 qPCR was performed using a known apparatus. The qPCR conditions were basically 50 cycles of 50 ° C. 2 minutes / 95 ° C. 10 minutes / (95 ° C. 15 seconds and 60 ° C. 1 minute) and 40 cycles.
ラット及びカニクイザルのゲノムＤＮＡに市販のヒトゲノムＤＮＡを規定量（５〜５００００コピー）添加した希釈系列を作成し，これらを鋳型としてｑＰＣＲ定量を行うことで，ヒトゲノムＤＮＡを特異的に検出できるか否かを評価した。バックグラウンド試料として，代表的な臓器である肝臓を使用した。具体的には，ラットやカニクイザルのゲノムＤＮＡをそれらの肝臓から抽出し，ｑＰＣＲ定量のバックグラウンド試料として用いた。
検量線を作成する際には，バックグラウンド試料を含まないヒトゲノムＤＮＡを使用し，ＰＣＲ増幅に対する影響の有無を確認した。その結果を図１〜図６に示す。
Whether or not human genomic DNA can be specifically detected by preparing a dilution series in which a specified amount (5 to 50000 copies) of commercially available human genomic DNA is added to the genomic DNA of rat and cynomolgus monkey, and performing qPCR quantification using these as templates Evaluated. The liver, which is a representative organ, was used as a background sample. Specifically, rat and cynomolgus monkey genomic DNA was extracted from their livers and used as a background sample for qPCR quantification.
When preparing a calibration curve, human genomic DNA not containing a background sample was used, and the presence or absence of influence on PCR amplification was confirmed. The results are shown in FIGS.
図１Ａは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図１Ｂは，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図２は，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図３Ａは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図３Ｂは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図４は，実施例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図５Ａは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す。
図５Ｂは，実施例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す。
図６Ａは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における増幅曲線を示す。
図６Ｂは，実施例１におけるラットゲノムＤＮＡ中のヒトゲノムＤＮＡ検出における検量線を示す。
FIG. 1A shows an amplification curve when human genomic DNA in Example 1 is used.
FIG. 1B shows a calibration curve when the human genomic DNA in Example 1 is used.
FIG. 2 shows an amplification curve when rat genomic DNA in Example 1 is used.
FIG. 3A shows an amplification curve when using cynomolgus monkey genomic DNA in Example 1.
FIG. 3B shows a calibration curve when using cynomolgus monkey genomic DNA in Example 1.
FIG. 4 shows an amplification curve when using human genomic DNA in Example 1.
FIG. 5A shows an amplification curve in human genomic DNA detection in cynomolgus monkey genomic DNA in Example 1.
FIG. 5B shows a calibration curve for detecting human genomic DNA in cynomolgus monkey genomic DNA in Example 1.
FIG. 6A shows an amplification curve in human genomic DNA detection in rat genomic DNA in Example 1.
FIG. 6B shows a calibration curve for detection of human genomic DNA in rat genomic DNA in Example 1.
増幅曲線において，縦軸（Ｄｅｌｔａ Ｒｎ）は，反応生産物量を示す。数値は蛍光量の対数で記載されたものである。理論上，（テンプレートの初期濃度×２のｎ乗）で増幅する。増幅曲線において，横軸（Ｃｙｃｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ）は，ＰＣＲ反応のサイクル数を示す。増幅曲線において，補助線（Ｔｒａｓｈｈｏｌｄ Ｌｉｎｅ（図中の横線））は，指数関数的に増幅されている領域に引かれたベースラインである。補助線は，ユーザーが任意の場所に変更できるものである。増幅曲線において，Ｃｔ値は，補助線と増幅曲線との交点のサイクル数を示す。Ｃｔ値は，検量線作成や，サンプルの濃度推定に使用する数値である。
検量線において，縦軸（Ｃｔ値）はサイクル数を示す。Ｃｔ値は，増幅曲線のＣｔ値が使用される。検量線において，横軸（Ｌｏｇ Ｃ０）は，検量（濃度）を対数表記したものである。既知濃度サンプルを検量線試料とすることで，未知のサンプル濃度を推定できる。
In the amplification curve, the vertical axis (Delta Rn) indicates the amount of reaction product. The numerical value is described by the logarithm of the fluorescence amount. Theoretically, amplification is performed at (initial template concentration × 2 to the nth power). In the amplification curve, the horizontal axis (Cycle Number) indicates the number of cycles of the PCR reaction. In the amplification curve, an auxiliary line (Trashhold Line (horizontal line in the figure)) is a baseline drawn in the region amplified exponentially. The auxiliary line can be changed by the user to any place. In the amplification curve, the Ct value indicates the number of cycles at the intersection of the auxiliary line and the amplification curve. The Ct value is a numerical value used for preparing a calibration curve or estimating the concentration of a sample.
In the calibration curve, the vertical axis (Ct value) indicates the number of cycles. As the Ct value, the Ct value of the amplification curve is used. In the calibration curve, the horizontal axis (Log C0) is a logarithmic representation of the calibration (concentration). An unknown sample concentration can be estimated by using a known concentration sample as a calibration curve sample.
検量線試料より，５００００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝１６．３±０．０６であり，５０００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝１９．３±０．０７であり，５００コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝２２．７±０．０６であり，５０コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝２６．４±０．１４であり，５コピーに応じたサイクル数はＣｔ＝３０．１±０．１１であった。バックグラウンド試料中の各コピー数に応じたサイクル数は，カニクイザルでは，Ｃｔ＝１６．３±０．０２，１９．３±０．１３，２２．８±０．１０，及び３０．１±０．１１であった。ラットでは，Ｃｔ＝１６．３±０．０４，１９．４±０．０８，２２．８±０．１６，及び３０．２±０．１７であった。この結果，バックグラウンド試料存在下でもＰＣＲ増幅に影響なく，ヒトゲノムＤＮＡを定量できることが明らかとなった。 From the calibration curve sample, the number of cycles corresponding to 50000 copies was Ct = 16.3 ± 0.06, and the number of cycles corresponding to 5000 copies was Ct = 19.3 ± 0.07, corresponding to 500 copies. The number of cycles is Ct = 22.7 ± 0.06, the number of cycles according to 50 copies is Ct = 26.4 ± 0.14, and the number of cycles according to 5 copies is Ct = 30.1 ± 0. .11. The number of cycles for each copy number in the background sample is Ct = 16.3 ± 0.02, 19.3 ± 0.13, 22.8 ± 0.10, and 30.1 ± 0 for cynomolgus monkeys. .11. In rats, Ct = 16.3 ± 0.04, 19.4 ± 0.08, 22.8 ± 0.16, and 30.2 ± 0.17. As a result, it was revealed that human genomic DNA can be quantified without affecting PCR amplification even in the presence of a background sample.
［比較例１］
フォワードプライマー及びリバースプライマーとして，それぞれ，配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これは，ヒトではマルチに存在し，マカク属には１００％一致する配列が存在しない領域であるＱ８ＩＸ６２＿１７−８３を選択的に増幅するプライマーセットである。この領域は，ヒト特異的な配列であり，ＤＵＦ１２２０配列とよばれるものである。また，プローブとして，５’末端及び３’末端がそれぞれＶＩＣ，及びＴＡＭＲＡで蛍光修飾された配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ｑＰＣＲの条件は，実施例１と同様とした。その結果を図７〜図９に示す。
[Comparative Example 1]
As the forward primer and the reverse primer, oligonucleotides having base sequences represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 were used, respectively. This is a primer set that selectively amplifies Q8IX62_17-83, which is a region that exists in mulch in humans and does not have a 100% identical sequence in Macaque genus. This region is a human-specific sequence and is called the DUF1220 sequence. Further, as the probe, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which the 5 ′ end and 3 ′ end were fluorescently modified with VIC and TAMRA, respectively, was used. The qPCR conditions were the same as in Example 1. The results are shown in FIGS.
配列番号４：５’−ＧＣＴＧＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣ−３’
配列番号５：５’−ＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡ−３’
配列番号６：５’−ＴＧＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴＣＡＡＣＴＣＣ−３’
Sequence number 4: 5'-GCTGGAGGTAGTAGAGCCCTGAAGTC-3 '
Sequence number 5: 5'-GGAGTCAGGCTGTTCAAGACAA-3 '
Sequence number 6: 5'-TGCAGGACTCACTGGATAGATAGTTATTCAACTCC-3 '
図７Ａは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図７Ｂは，比較例１におけるヒトゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
図８は，比較例１におけるラットゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図９Ａは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の増幅曲線を示す。
図９Ｂは，比較例１におけるカニクイザルゲノムＤＮＡを用いた場合の検量線を示す。
FIG. 7A shows an amplification curve when human genomic DNA in Comparative Example 1 is used.
FIG. 7B shows a calibration curve when the human genomic DNA in Comparative Example 1 is used.
FIG. 8 shows an amplification curve when rat genomic DNA in Comparative Example 1 is used.
FIG. 9A shows an amplification curve when using cynomolgus monkey genomic DNA in Comparative Example 1.
FIG. 9B shows a calibration curve when using cynomolgus monkey genomic DNA in Comparative Example 1.
図７から，ヒトＤＮＡを鋳型として用いた場合，全ての希釈系で指数関数的増幅を示すことが確認された。
図８から，ラットＤＮＡを鋳型として用いた場合，全ての希釈系で増幅がみられないことが分かった。
図９から，カニクイザルＤＮＡを鋳型として用いた場合には，５００００コピー（１６５ｎｇ）の濃度において，２８サイクル目（Ｃｔ＝２７．７±０．０５）から，増幅が検出された。ヒトＤＮＡを鋳型として用いた場合には，Ｃｔ＝１７．７±０．０４であり，これと比べると２×１０２の差が生じているものの，ヒトＤＮＡと同様に指数関数的な増幅が確認でき，定量分析を行うことができることがわかる。比較例では，ヒト及びカニクイザルといった霊長類特異性を確認することができたものの，ヒト特異的ではなく，マカク属を対象動物とした移植片等の分布評価には，適していないことがわかった。
From FIG. 7, it was confirmed that when human DNA was used as a template, exponential amplification was exhibited in all dilution systems.
From FIG. 8, it was found that no amplification was observed in all dilution systems when rat DNA was used as a template.
From FIG. 9, when cynomolgus monkey DNA was used as a template, amplification was detected from the 28th cycle (Ct = 27.7 ± 0.05) at a concentration of 50000 copies (165 ng). When human DNA is used as a template, Ct = 17.7 ± 0.04, and although a difference of 2 × 10 2 occurs compared to this, exponential amplification is similar to human DNA. It can be confirmed that quantitative analysis can be performed. In the comparative example, primates such as humans and cynomolgus monkeys could be confirmed, but it was not human-specific and was not suitable for evaluating the distribution of grafts etc. for macaques. .
本発明の検出キットを用いることで，ヒトＤＮＡのみを測定することができた。バックグラウンドに動物ＤＮＡが存在してもその特異性は変化することなく安定して測定することができた。 By using the detection kit of the present invention, only human DNA could be measured. Even if animal DNA was present in the background, its specificity could be measured stably without any change.
本発明は，製薬産業，医療機器産業，及び医療診断産業において利用されうる。 The present invention can be used in the pharmaceutical industry, the medical device industry, and the medical diagnosis industry.
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プローブ
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プローブ
Sequence number 1: Primer Sequence number 2: Primer Sequence number 3: Probe Sequence number 4: Primer Sequence number 5: Primer Sequence number 6: Probe
Claims (8)
前記フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列中の連続する１７〜２１塩基を有するオリゴヌクレオチドであり，
前記リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列中の連続する１８〜２２塩基を有するオリゴヌクレオチドである，
検出キット。
配列番号１：５’−ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’ A detection kit comprising a forward primer and a reverse primer,
The forward primer is an oligonucleotide having 17 to 21 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
The reverse primer is an oligonucleotide having 18 to 22 consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Detection kit.
Sequence number 1: 5'-CCAGCCCTATGGGAAGTCTCTT-3 '
SEQ ID NO: 2: 5′-CGTCAAGAGAAAAGCCAACATG-3 ′
前記フォワードプライマーは，配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり，
前記リバースプライマーは，配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである，
検出キット。 The detection kit according to claim 1,
The forward primer is an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
The reverse primer is an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Detection kit.
配列番号３で示される塩基配列中の連続する１１〜１５塩基を有するオリゴヌクレオチドであるプローブを，更に有する
検出キット。
配列番号３：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’ The detection kit according to claim 1 or 2,
A detection kit further comprising a probe which is an oligonucleotide having 11 to 15 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
Sequence number 3: 5'-TGCATTGGAGGAAAA-3 '
前記プローブは，５’末端及び３’末端のいずれか又は両方に蛍光標識が付加された，配列番号３で示される塩基配列を有する検出キット。
５’−ＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’ The detection kit according to claim 3, wherein
The probe is a detection kit having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3, wherein a fluorescent label is added to either or both of the 5 ′ end and the 3 ′ end.
5'-TGCATTGGAGGAAAA-3 '
The expression detection method according to claim 5, wherein the expression distribution of the transplanted human cells in the target animal is detected.
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