JP2017016665A - Method for selecting variation information from sequence data, system, and computer program - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コンピュータを用いる生物の変異情報の選択方法、当該方法を行うためのシステム、及びコンピュータプログラムに関する。 The present invention relates to an organism mutation information selection method using a computer, a system for performing the method, and a computer program.
いわゆる次世代シーケンサー(NGS)が導入される前は、マイクロアレイが、総合的ゲノム解析に主に用いられていた。しかしながら、マイクロアレイを用いる場合、未知のゲノム変異情報を完全に検出することは困難である。なぜならば、プローブを予め設計しなければならないからである。 Prior to the introduction of so-called next-generation sequencers (NGS), microarrays were mainly used for comprehensive genome analysis. However, when microarrays are used, it is difficult to completely detect unknown genomic mutation information. This is because the probe must be designed in advance.
従って、NGSを用いることによるゲノム変異情報を検出するための手段の確立が、当該産業において期待されている。 Therefore, establishment of means for detecting genomic mutation information by using NGS is expected in the industry.
しかし、NGSによって提供されるリード情報に関しては、マッピングにおけるエラー等のリスクがある。 However, with respect to the lead information provided by NGS, there is a risk such as an error in mapping.
従って、リード情報から、このようなリスクを排除して、信頼性の高いゲノム変異情報を見出すことが課題であった。 Therefore, it has been a problem to find highly reliable genome mutation information by eliminating such risks from the read information.
本発明者は、NGS等から得たリード情報に基づくゲノム変異情報と、SNPアレイ等の他の手段によって得られたゲノム変異情報との間の一致度が、リード情報の深度(リード深度)に密接に関連していることを見出した。そして、本発明者は、当該一致度を指標として用いることによってリード深度の閾値を決定し、当該リード情報に基づいてゲノム変異情報をフィルタリングすることにより、高い信頼性のゲノム変異情報を得ることができることを見出し、本発明を完成した。さらに、本発明者は、当該リード情報からのゲノム変異情報の信頼性を、上記基本的フィルタリング手段に加えて他のフィルタリング手段を用いることによって高めることができることを見出した。 The present inventor found that the degree of coincidence between genome mutation information based on read information obtained from NGS or the like and genome mutation information obtained by other means such as a SNP array is the depth of the read information (read depth). I found it closely related. Then, the inventor determines a read depth threshold by using the degree of coincidence as an index, and obtains genome mutation information with high reliability by filtering genome mutation information based on the read information. The present invention has been completed by finding out what can be done. Furthermore, the present inventor has found that the reliability of genome mutation information from the read information can be improved by using other filtering means in addition to the basic filtering means.
本発明は、コンピュータによる、遺伝子変異情報を選択する方法であって、以下の工程(1)〜(3)を実行することを特徴とする、遺伝子変異情報の選択方法(以下、本発明の選択方法ともいう)を提供する。
(1)各DNAサンプルについて以下を行う工程。
(1−1)マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けし、
(1−2)当該各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、マッピング以外の手段によって各DNAサンプルから得られる二次変異セット情報、との間の変異情報の遺伝子型を比較することによって計算する、
(1−3)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットのリード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲を決定する;
(2)各DNAサンプルについて、工程(1−1)における一次変異セット情報から、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報を除いて、各DNAサンプルについて残っている変異情報を得る工程。
(3)全てのDNAサンプルの中の少なくとも1つのDNAサンプルについて、上記の工程(1)及び(2)を行った結果、残っている変異情報を、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出して、目的の変異情報として選択する工程。
The present invention relates to a method for selecting gene mutation information by a computer, wherein the following steps (1) to (3) are performed. Method).
(1) A step of performing the following for each DNA sample.
(1-1) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism is grouped into a subset having a predetermined range of the read depth. Divided,
(1-2) Mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information obtained from each DNA sample by means other than mapping, based on the measured value of the genotype coincidence of the mutation information of each subset. By comparing genotypes of
(1-3) determining an appropriate range of read depths by combining the range of read depths of subsets having a genotype match measurement value higher than a predetermined threshold;
(2) For each DNA sample, from the primary mutation set information in step (1-1), removing mutation information having a read depth outside the appropriate range of read depth to obtain remaining mutation information for each DNA sample .
(3) As a result of performing the above steps (1) and (2) for at least one DNA sample among all DNA samples, the remaining mutation information is extracted together with the locus to which the mutation information belongs. And selecting as target mutation information.
本発明において、「DNAサンプル」は、試験対象(標的生物)のDNAを含むサンプルであり、当該DNAには、ゲノムDNA、cDNA等が含まれる。DNAサンプルの供給源である生物は、当該生物がゲノムを有する限り特に限定されず、ヒトのような哺乳類、爬虫類、昆虫、植物、バクテリア、及びウイルスを含む。これらのうち、ヒトが好ましい。 In the present invention, a “DNA sample” is a sample containing DNA of a test subject (target organism), and the DNA includes genomic DNA, cDNA and the like. The organism that is the source of the DNA sample is not particularly limited as long as the organism has a genome, and includes mammals such as humans, reptiles, insects, plants, bacteria, and viruses. Of these, humans are preferred.
「変異」という用語は、ゲノムのヌクレオチド配列の変異を意味し、具体的には、単一ヌクレオチド変異(SNV)、挿入、又は欠失を含む。また、「変異情報」とは、これらを表すデジタル情報である。 The term “mutation” means a variation in the nucleotide sequence of a genome, and specifically includes a single nucleotide variation (SNV), insertion, or deletion. “Mutation information” is digital information representing these.
「リード情報」という用語は、ゲノムをシーケンサーで処理することにより得られるヌクレオチド配列に関するデジタル情報である。リード情報は、2つのタイプの情報に分けられる。当該一方は、単一の配列情報からなるシングルリード情報であり、他方は、ゲノム上で隣接した2領域の配列情報を含むペアエンドリード情報である。本発明において、リード情報は、両方のタイプのリード情報を含む。リード情報を提供するシーケンサーは、大量の情報を比較的短時間で提供できる、いわゆる「次世代シーケンサー」を含む「高性能シーケンサー」である。本発明を行った時点での次世代シーケンサーの例としては、Genome Sequence FLX(Roche(454)社);Genome Analyzer IIx、HiSeq2000、HiSeq2500、及びMiSeq(Illumina社);SOLiD(Applied Biosystem社);並びにPacBio RS II(Pacific Biosciences社)が挙げられるが、これらに限定されず、現時点及び将来提供される全てのシーケンサーが含まれる。 The term “read information” is digital information about a nucleotide sequence obtained by processing a genome with a sequencer. The lead information is divided into two types of information. The one is single read information composed of single sequence information, and the other is paired end read information including sequence information of two adjacent regions on the genome. In the present invention, the lead information includes both types of lead information. Sequencers that provide read information are “high-performance sequencers” including a so-called “next-generation sequencer” that can provide a large amount of information in a relatively short time. Examples of next-generation sequencers at the time of the present invention include Genome Sequence FLX (Roche (454)); Genome Analyzer IIx, HiSeq2000, HiSeq2500, and MiSeq (Illumina); SOLiD (Applied Biosystem); Examples include, but are not limited to, PacBio RS II (Pacific Biosciences) and include all sequencers provided at the present time and in the future.
一次変異セット情報を生成する際に用いられる、「マッピングアルゴリズム」という用語は、リファレンス配列中の位置―そこからリード配列が読まれる―を特定するためのアルゴリズムであり、例えば、BWA−MEM、及びBowtie2が含まれる。本明細書、請求の範囲、及び図面においては、「マッピング」は、「アラインメント」と同義である。「変異コールアルゴリズム」は、マッピングを行ったリード情報から、さらに変異情報が見つかったリード情報を、抽出するためのアルゴリズムであり、例えば、Bcftools、及びGenome Analysis Toolkit(GATK)が含まれる。この変異コールアルゴリズムを、マッピングを行ったリード情報に対して施すことにより、変異情報が抽出され、「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」の区分けが行われる。「リファレンスホモ」とは、所定の部位で標準ゲノム配列(又は参照ゲノム配列)と同じ塩基がホモ接合の遺伝子型で存在する形態であり、「非リファレンスホモ」とは、標準ゲノム配列とは異なる塩基がホモ接合の遺伝子型で存在する形態である。「ヘテロ」とは、標準ゲノム配列と同じ塩基と異なる塩基がヘテロ接合の遺伝子型で存在する形態である。 The term “mapping algorithm” used in generating primary mutation set information is an algorithm for specifying a position in a reference sequence—from which a read sequence is read—for example, BWA-MEM, and Bowtie2 is included. In the present specification, claims, and drawings, “mapping” is synonymous with “alignment”. The “mutation call algorithm” is an algorithm for extracting lead information in which mutation information is found from the mapped lead information, and includes, for example, Bcftools and Genome Analysis Toolkit (GATK). By applying this mutation call algorithm to the mapped read information, the mutation information is extracted, and “reference homo”, “hetero”, and “non-reference homo” are classified. “Reference homo” is a form in which the same base as the standard genomic sequence (or reference genomic sequence) exists in a predetermined site in a homozygous genotype, and “non-reference homo” is different from the standard genomic sequence. In this form, the base exists in a homozygous genotype. “Hetero” is a form in which bases different from the same base as the standard genome sequence exist in a heterozygous genotype.
「リード深度」という用語は、coverageと同義であり、DNAサンプルのマッピングの際に計算される、各変異部位(遺伝子座)に関する対応するリードの数を意味し、重複する部位の読み取りが、試験対象の変異部位についてどの程度行われたかを示す指標である。本明細書中、単に「深度」と記載することもある。 The term “read depth” is synonymous with coverage, meaning the number of corresponding reads for each mutation site (locus), calculated during mapping of the DNA sample, where duplicate site readings are tested This is an index indicating how much the target mutation site has been performed. In this specification, it may be simply described as “depth”.
「二次変異セット情報」を得るための「マッピング以外の手段」は、特に限定されず、例えば、サンガーシーケンス、マスアレイ(登録商標)、及びSNPアレイが含まれ、一次変異セット情報を得るために使用したシーケンサーと少なくとも同等の精度、好ましくはより高い精度を有している。これらの手段のなかで、SNPアレイが、安価でかつ、一度に高精度で多数の変異部位を決定できるために、好ましい。この場合、「一度に高精度で多数」は、好ましくは、約300,000〜約3,000,000SNPに対応している。 “Means other than mapping” for obtaining “secondary mutation set information” are not particularly limited, and include, for example, Sanger sequence, mass array (registered trademark), and SNP array, and to obtain primary mutation set information. It has at least the same accuracy as the sequencer used, preferably higher accuracy. Among these means, the SNP array is preferable because it is inexpensive and can determine a large number of mutation sites with high accuracy at a time. In this case, “many with high accuracy at one time” preferably corresponds to about 300,000 to about 3,000,000 SNPs.
「二次変異セット情報」には、上記の「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」の区分けが、具体的な「マッピング以外の手段」に応じた手法により割り付けられている。例えば、SNPアレイの場合は、プローブ色素の色彩や蛍光色素の蛍光を基に、「ジェノタイプコール」というクラスタリングアルゴリズムが施されることにより、上記の「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」の区分けがなされる。また、サンガーシーケンスの場合は、プローブ色素の色彩や蛍光色素の蛍光を基にしたチャートの波形を解析することにより、上記の「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」の区分けがなされることが知られている。 In the “secondary mutation set information”, the above-mentioned classification of “reference homo”, “hetero”, and “non-reference homo” is assigned by a method according to a specific “means other than mapping”. . For example, in the case of an SNP array, a clustering algorithm called “genotype call” is applied based on the color of the probe dye or the fluorescence of the fluorescent dye, so that the above “reference homo”, “hetero”, and “ “Non-reference homo” is classified. In the case of the Sanger sequence, the “reference homo”, “hetero”, and “non-reference homo” classifications are analyzed by analyzing the waveform of the chart based on the color of the probe dye and the fluorescence of the fluorescent dye. Is known to be made.
上記工程(2−2)における「遺伝子型一致度の測定値」は、(1)適合率(precision)、及び/又は、(2)検出率(power)であることが好適である。すなわち、適合率と検出率の双方、又は、いずれか一方を測定値として用いることができる。具体的には、これらの測定指標値に対して所定の閾値を設定して、測定値が、当該適合率又は検出率の閾値以上である場合、あるいは、当該適合率及び検出率の双方の閾値以上のである場合を、「遺伝子型一致度が所定の閾値より高い」として認定することができる。好ましい態様としては、適合率と検出率いずれか一方であれば、適合率を優先させて閾値指標とすることが好適であり、適合率と検出率の双方を閾値の指標とすることがさらに好適である。ここで、これらの測定指標値について説明する。 The “measured value of genotype coincidence” in the step (2-2) is preferably (1) precision and / or (2) detection rate (power). That is, both the precision and the detection rate, or one of them can be used as the measurement value. Specifically, a predetermined threshold value is set for these measurement index values, and the measured value is equal to or higher than the threshold value of the accuracy rate or the detection rate, or the threshold values of both the accuracy rate and the detection rate. The above case can be recognized as “the genotype matching degree is higher than a predetermined threshold”. As a preferred aspect, if either the precision ratio or the detection ratio is used, it is preferable to prioritize the precision ratio as a threshold index, and it is more preferable that both the precision ratio and the detection ratio be threshold indices. It is. Here, these measurement index values will be described.
<指標値(適合率と検出率について)>
これらの指標値は、工程(1)で行われる「変異コール」によって算出可能な値である。変異コールアルゴリズムの実行により、先行して行われるリード情報のマッピングやSNPアレイの使用、に際して認められる、「リード情報が参照配列情報とマッチしない『非マッチング情報』」に対して、当該非マッチング情報が、エラーによるミスマッチなのか、又は、DNAサンプルが真に有する変異によるミスマッチなのか、についての判別が行われる。ここで、非マッチング情報が「エラーによるミスマッチ」ではないと変異コールアルゴリズムの実行により判定がなされる場合に、非マッチングが起こった部位には変異が存在すると判定される。さらに、ヒトのような2倍体生物においては、変異が同定された部位のリード情報がすべて非リファレンス型である場合は「非リファレンスホモ」であり、これは父母双方由来のDNAに変異が存在したものとみなされる。また、変異が同定された部位のリード情報にリファレンス型と非リファレンス型が混在する場合「ヘテロ」であり、父母のいずれかにおいて変異が存在したものとみなされる。さらに変異コールアルゴリズムが変異と判定しない場合においても、全てのリード情報がリファレンス型である部位はリファレンスホモの状態にあるとみなすことができる。
<Indicator values (about precision and detection rate)>
These index values are values that can be calculated by the “mutation call” performed in step (1). By executing the mutation call algorithm, the non-matching information corresponding to the “non-matching information whose lead information does not match the reference sequence information”, which is recognized when mapping the lead information or using the SNP array performed in advance, is performed. Is a mismatch due to an error or a mismatch due to a mutation that the DNA sample truly has. Here, if the non-matching information is not “mismatch due to an error” and it is determined by executing the mutation call algorithm, it is determined that there is a mutation in the portion where the non-matching has occurred. Furthermore, in diploid organisms such as humans, when all the read information of the site where the mutation is identified is non-reference type, it is “non-reference homozygous”, which means that there is a mutation in DNA from both parents It is regarded as having done. In addition, when the reference type and the non-reference type are mixed in the read information of the site where the mutation is identified, it is “hetero”, and it is considered that the mutation exists in one of the parents. Further, even when the mutation call algorithm does not determine that the mutation is present, it is possible to regard the site where all the read information is of the reference type as being in the reference homo state.
これらのことをまとめると、例えば、標的生物がヒトの場合において、変異コールアルゴリズムを実行した場合の非マッチング情報としては、(ア)リファレンスホモ、(イ)ヘテロ、(ウ)非リファレンスホモの3通りの分類が可能であり、一次変異セット情報の場合と、二次変異セット情報の場合を組み合わせると、併せて9通りの場合が認められる。 In summary, for example, when the target organism is a human, the non-matching information when the mutation call algorithm is executed includes (a) reference homo, (b) hetero, and (c) non-reference homo. Classification is possible, and when the primary mutation set information is combined with the secondary mutation set information, nine cases are recognized.
下記表1において、これらの9通りについて図示し、かつ、これらを基に算出される適合率と検出率について説明する。NGSに基づく変異コールの結果が一次変異セット情報を生成し、SNPアレイに基づく変異コールの結果が二次変異セット情報を生成する。表中のアルファベット(a〜i)は、各サブセットの中で変異情報として検出された遺伝子型の数である。例えば、下記表1中の「d」は、NGSで「ヘテロ」と判定され、SNPアレイで「リファレンスホモ」と判定された遺伝子型の数である。 In Table 1 below, these nine patterns are illustrated, and the precision and detection rate calculated based on these are described. The result of the mutation call based on NGS generates primary mutation set information, and the result of the mutation call based on SNP array generates secondary mutation set information. The alphabets (ai) in the table are the number of genotypes detected as mutation information in each subset. For example, “d” in Table 1 below is the number of genotypes determined to be “hetero” by NGS and “reference homo” by the SNP array.
ここで、適合率は、「一次変異セット情報(本例ではNSG)で、「ヘテロ又は非リファレンスホモ」と判定された内、二次変異セット情報(本例ではSNPアレイ)においても同じ判定がなされた割合」であり、上記表1においては、「(e+i)/(d+e+f+h+i)」で表される値である。検出率は、「二次変異セット情報(本例ではSNPアレイ)で、「ヘテロ又は非リファレンスホモ」と判定された内、一次変異セット情報(本例ではNSG)においても同じ判定がなされた割合」であり、上記表1においては、「(e+i)/(b+c+e+f+h+i)」で表される値である。適合率と検出率共に、表示形式は限定されず、例えば、直接比率値表示であっても、百分率表示であってもよい。 Here, the relevance rate is “primary mutation set information (NSG in this example) and determined as“ hetero or non-reference homo ”, and the same determination is also made in secondary mutation set information (SNP array in this example). Is a ratio represented by “(e + i) / (d + e + f + h + i)” in Table 1. The detection rate is the ratio of “secondary mutation set information (SNP array in this example) determined as“ hetero or non-reference homo ”, and the same determination was made in primary mutation set information (NSG in this example)” In Table 1, the value is represented by “(e + i) / (b + c + e + f + h + i)”. The display format of both the precision rate and the detection rate is not limited, and for example, direct ratio value display or percentage display may be used.
上記工程(2−3)における適合率の閾値は、0.995以上であることが好適であり、さらに好適には0.998以上である。同じく検出率の閾値は、0.93以上であることが好適であり、さらに好適には0.95以上である。 The threshold value of the precision in the step (2-3) is preferably 0.995 or more, and more preferably 0.998 or more. Similarly, the threshold of the detection rate is preferably 0.93 or more, and more preferably 0.95 or more.
さらに本発明の選択方法は、上記工程(1)〜(4)が行われて第一の特定変異情報を得て、下記(A)〜(D)から選ばれる1以上の工程において、除かれるべき変異情報として定義された1以上の変異情報が、第一の特定変異情報から除かれて第二の特定変異情報を得、当該第二の特定変異情報を、目的の変異情報として選択される態様とすることも可能である。
(A)第一の特定変異情報が、2以上のDNAサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、工程(3)中の変異部位中の5%〜20%を超える場合、当該特定の変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される;
(B)低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報が、一次変異セット情報から選択され、遺伝子型一致度の測定値が、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で計算され、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される;
(C)工程(1)、又は、工程(1)〜(4)が、最初の工程(1)とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって行われて、各DNAサンプルについて、異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を得、そして、最初の変異情報に含まれるが、異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される;
(D)ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムが行われて、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される。
Further, in the selection method of the present invention, the above-mentioned steps (1) to (4) are carried out to obtain the first specific mutation information, which is excluded in one or more steps selected from the following (A) to (D). One or more mutation information defined as power mutation information is removed from the first specific mutation information to obtain the second specific mutation information, and the second specific mutation information is selected as the target mutation information. It is also possible to adopt an aspect.
(A) When the first specific mutation information is obtained by using two or more DNA samples, the ratio of the specific mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth is the step (3). If more than 5% to 20% in the mutation site in the, the specific mutation information is defined as the mutation information to be excluded above;
(B) All the mutation information existing in the area assigned to the low complexity area is selected from the primary mutation set information, and the measured value of the genotype coincidence is the all mutation information and each low complexity area. All mutation information in the low-complexity region that is calculated between the mutation information in the second mutation set information and has a genotype-matched measurement value below a predetermined threshold is defined as the mutation information to be excluded. ;
(C) Step (1) or steps (1) to (4) are performed by using a different mapping algorithm and different mutation call algorithm from the first step (1), and are different for each DNA sample. Mutation information to obtain primary mutation set information or different mutation information and is included in the first mutation information but not in different primary mutation set information or different mutation information is defined as mutation information to be excluded;
(D) An algorithm related to the Hardy-Weinberg equilibrium test is performed, and mutation information deviating from the Hardy-Weinberg equilibrium is defined as mutation information to be removed.
これらの追加工程(A)〜(D)は、上述の本発明の選択方法が行われることを前提として、工程(A)、(B)、(C)及び(D)として示される4つのタイプの他のフィルタリング手段の一つがさらに行われるか、それらの二つから四つが組み合わせて行われる場合を規定している。これらの追加工程(A)〜(D)を、本発明の選択方法に加味することにより、リード情報由来の、より高い信頼性を有する変異情報の入手が可能となる。なお、上記の追加工程(A)における「特定の変異情報」とは、例えば、個別のSNV等の変異情報を意味するものである。 These additional steps (A) to (D) are four types shown as steps (A), (B), (C) and (D) on the premise that the selection method of the present invention described above is performed. One of the other filtering means is further performed, or two to four of them are combined and performed. By adding these additional steps (A) to (D) to the selection method of the present invention, it is possible to obtain mutation information having higher reliability derived from lead information. The “specific mutation information” in the additional step (A) means, for example, mutation information such as individual SNV.
さらに本発明は、上記の本発明の選択方法を行うためのコンピュータシステムを提供し、コンピュータに本発明の選択方法を実行させるためのアルゴリズムを含むコンピュータプログラム、本発明のコンピュータプログラムを、コンピュータが読み取り可能な状態で保存されている、デジタルメディアを提供する。 Furthermore, the present invention provides a computer system for performing the above-described selection method of the present invention, a computer program including an algorithm for causing a computer to execute the selection method of the present invention, and a computer reading the computer program of the present invention. Provide digital media, stored as possible.
また、本発明は、本発明の選択方法により得られた変異情報を提供する。 The present invention also provides mutation information obtained by the selection method of the present invention.
さらに本発明は、コンピュータによりリード深度の適正範囲を決定する方法であって、以下の工程(1)〜(3)を含む方法(以下、本発明の深度決定方法ともいう)を提供する。
(1)マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報を、当該一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けし、
(2)当該各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、マッピング以外の手段によって各DNAサンプルから得られる二次変異セット情報、との間の変異情報の遺伝子型を比較することによって計算する、
(3)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットのリード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲を決定する。
Furthermore, the present invention provides a method for determining an appropriate range of the lead depth by a computer, which includes the following steps (1) to (3) (hereinafter also referred to as the depth determination method of the present invention).
(1) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, the primary mutation set information, and the predetermined range of the read depth Group into subsets with
(2) The gene of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information obtained from each DNA sample by means other than mapping, using the measured value of the genotype coincidence of the mutation information of each subset. Calculate by comparing types,
(3) The appropriate range of the read depth is determined by combining the read depth ranges of the subsets having the genotype matching degree higher than the predetermined threshold.
本発明の深度決定方法の個々の定義は、本発明の選択方法において述べた通りである。例えば、「遺伝子型一致度の測定値」は、上述した、「適合率(precision)及び/又は検出率(power)」であることが好適である。 The individual definitions of the depth determination method of the present invention are as described in the selection method of the present invention. For example, the “measured value of genotype coincidence” is preferably the above-described “precision and / or detection rate (power)”.
さらに本発明は、本発明の深度決定方法を行うためのコンピュータシステム又はコンピュータ装置を提供し、コンピュータに本発明の深度決定方法を実行させるためのアルゴリズムを含むコンピュータプログラムを提供し、当該コンピュータプログラムが、コンピュータ読み取り可能状態で保存されている、デジタルメディアを提供する。 Furthermore, the present invention provides a computer system or a computer apparatus for performing the depth determination method of the present invention, and provides a computer program including an algorithm for causing a computer to execute the depth determination method of the present invention. Provide digital media stored in a computer readable state.
本発明によれば、高信頼性の変異情報を、DNAサンプル由来のリード情報から得ることができる。 According to the present invention, highly reliable mutation information can be obtained from lead information derived from a DNA sample.
上記した本発明の選択方法と深度決定方法は、具体的には、本発明のコンピュータシステムにおいて実行され、かつ、本発明のコンピュータプログラムのアルゴリズムを、コンピュータにおいて実現させることにより実行される。これらの形態により、高信頼性の変異情報を、DNAサンプル由来のリード情報から容易に得ることができる。 Specifically, the above-described selection method and depth determination method of the present invention are executed in the computer system of the present invention, and are executed by causing the computer program algorithm of the present invention to be realized in a computer. With these forms, highly reliable mutation information can be easily obtained from lead information derived from a DNA sample.
[本発明のコンピュータシステム]
コンピュータプシステムまたはコンピュータ装置は、主要には、本発明の選択方法の各工程を、コンピュータにおいて行うためのコンピュータシステムである。なお、コンピュータシステムは、コンピュータ装置と実質的に同義である。コンピュータシステムまたは装置は通常、記録部(HD)、演算処理部(CPU)、操作部(キーボード)、及び表示部(ディスプレイ)を有している。記録部において、本発明の選択方法を行うための基礎を形成する電子情報が記録され、演算処理部によって必要な工程の処理が、一時記録部(メモリ)に読み出された電子情報に対して行われ、そして結果がまた記録部に記録される。演算処理部において、操作部の操作を促進するためのまたは処理結果を表示するための画像データが作成され、当該画像データがビデオRAMを介して、表示部に表示される。このようにして、各工程を前進させる処理が行われ、そして、最後に、必要な変異情報が導き出される。本発明の深度決定方法を行うためのコンピュータシステム又は装置においても同様であり、適正リード深度を決定するための各工程の処理がコンピュータにおいて行われることにより、所望の適正リード深度が導き出される。
[Computer System of the Present Invention]
The computer system or computer apparatus is mainly a computer system for performing each step of the selection method of the present invention in a computer. A computer system is substantially synonymous with a computer device. A computer system or apparatus usually includes a recording unit (HD), an arithmetic processing unit (CPU), an operation unit (keyboard), and a display unit (display). In the recording unit, electronic information forming a basis for performing the selection method of the present invention is recorded, and the processing of the necessary steps by the arithmetic processing unit is performed on the electronic information read out to the temporary recording unit (memory). Done, and the result is also recorded in the recorder. In the arithmetic processing unit, image data for promoting the operation of the operation unit or displaying the processing result is created, and the image data is displayed on the display unit via the video RAM. In this way, the process of advancing each process is performed, and finally necessary mutation information is derived. The same applies to the computer system or apparatus for performing the depth determination method of the present invention, and the processing of each step for determining the appropriate lead depth is performed in the computer, whereby a desired appropriate lead depth is derived.
本発明のコンピュータシステム又は装置の主要な態様は、塩基配列のデータから特定変異情報を選択するコンピュータシステムであって、少なくとも記録部と演算処理部を備え、下記の処理(a)〜(f)が実行されることを特徴とするコンピュータシステム又は装置である。
(a)当該記録部には、マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各DNAサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されており、
(b)当該演算処理部では、前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理が実行され、
(c)各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理が実行されることによって算出され、
(d)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理が実行され、
(e)各DNAサンプルについて一次変異セット情報から、前記(d)により決定されたリード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理が実行され、各DNAサンプルについて残っている変異情報が抽出され、
(f)全てのDNAサンプルの中の少なくとも1つのDNAサンプルについて、上記の処理(a)〜(e)を行った結果、残っている変異情報が、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出されて、当該遺伝情報を目的の特定変異情報として特定される処理。
A main aspect of the computer system or apparatus of the present invention is a computer system that selects specific mutation information from base sequence data, and includes at least a recording unit and an arithmetic processing unit, and includes the following processes (a) to (f): Is executed by a computer system or apparatus.
(A) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the recording unit maps the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, and mapping from each DNA sample Secondary mutation set information obtained by means other than is recorded,
(B) In the arithmetic processing unit, a process of grouping primary mutation set information read from the recording unit into a subset having a predetermined range of read depth is executed,
(C) A genotype comparison process of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information read from the recording unit as the measured value of the genotype matching degree of the mutation information of each subset Is calculated by executing
(D) The determination process of the appropriate range of the read depth is performed by combining the range of the read depth of the subset having the genotype matching degree higher than the predetermined threshold into one,
(E) From the primary mutation set information for each DNA sample, mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth determined in (d) above is executed, and the remaining mutation information for each DNA sample Is extracted,
(F) As a result of performing the above processing (a) to (e) for at least one DNA sample among all DNA samples, the remaining mutation information is extracted together with the gene locus to which the mutation information belongs. , A process for identifying the genetic information as target specific mutation information.
上記処理(a)〜(f)は、本発明の選択方法における各工程(1)〜(3)に対応する処理である。すなわち、処理(a)(b)は、工程(1−1)に該当し、処理(c)は工程(1−2)に該当し、処理(d)は工程(1−3)に該当し、処理(e)は工程(2)に該当し、処理(f)は工程(3)に該当する。 The said process (a)-(f) is a process corresponding to each process (1)-(3) in the selection method of this invention. That is, process (a) and (b) correspond to process (1-1), process (c) corresponds to process (1-2), and process (d) corresponds to process (1-3). The process (e) corresponds to the process (2), and the process (f) corresponds to the process (3).
処理(a)における「一次変異セット情報」は、上記のように、マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた変異情報である。「マッピングアルゴリズム」と「変異コールアルゴリズム」については、上述した通りである。当該「一次変異セット情報」の確保手段は限定されず、例えば、同一のコンピュータ端末において、リード情報から、「マッピングアルゴリズム」と「変異コールアルゴリズム」に基づいて生成したものを用いても良いし、別途他所で生成された「一次変異セット情報」を本発明のコンピュータシステムに対して用いても良い。さらに、SNPアレイ等のマッピング以外の手段によって得られた「二次変異セット情報」についても、確保手段は全く限定されない。 As described above, the “primary mutation set information” in the process (a) is mutation information to which a read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm. is there. The “mapping algorithm” and the “mutation call algorithm” are as described above. The means for securing the “primary mutation set information” is not limited. For example, in the same computer terminal, from the lead information, those generated based on the “mapping algorithm” and the “mutation call algorithm” may be used, “Primary mutation set information” separately generated elsewhere may be used for the computer system of the present invention. Furthermore, as for “secondary mutation set information” obtained by means other than mapping such as an SNP array, the securing means is not limited at all.
処理(a)は、後述する実施例の「選択手順1」に該当する処理である。
The process (a) is a process corresponding to “
リード深度範囲毎のサブセットへのグループ分け処理(処理(b))、及び、一次変異セット情報と二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理(処理(c))は、後述する実施例の「選択手順2(図1の「手順2」の真ん中のグラフ)」に該当する処理である。上述のように処理(c)の「各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値」は、好適には適合率(precision)、及び/又は、検出率(power)として、さらに好適には適合率として、最も好適には適合率及び検出率として用いられる。適合率の閾値は、0.995以上であることが好適であり、さらに好適には0.998以上である。検出率の閾値は、0.93以上であることが好適であり、さらに好適には0.95以上である。
The grouping process (process (b)) into subsets for each read depth range, and the genotype comparison process (process (c)) of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information, This is processing corresponding to “selection procedure 2 (the middle graph of“
次いで、リード深度の適正範囲の決定処理(処理(d))、及び、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理(処理(e))は、後述する実施例の「選択手順2(図1の「手順2」)」に該当する処理である。
Next, the determination process of the appropriate range of the read depth (process (d)) and the exclusion process of the mutation information having the read depth outside the appropriate range of the read depth (process (e)) are performed in the “selection” example described later. This is a process corresponding to the procedure 2 ("
さらに、目的の特定変異情報の特定処理(処理(f))の結果の一例が、後述する実施例の表2の「手順2」に示されている。
Furthermore, an example of the result of the target specific mutation information specifying process (process (f)) is shown in “
本発明のコンピュータシステムは、上記コンピュータシステムの実行により得られた特定変異情報を第一の特定変異情報として、さらに、下記(α)〜(δ)から選ばれる1以上の処理より、除かれるべき変異情報として定義された1以上の変異情報が、第一の特定変異情報から除かれて第二の特定変異情報を得る処理が実行され、当該第二の特定変異情報が、目的の変異情報として抽出される処理が実行されるコンピュータシステムであることが好適である。
(α)第一の特定変異情報が、2以上のDNAサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、上記処理(f)によって得られた変異情報の5%〜20%を超える場合、当該特定の変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理。
(β)低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報が、一次変異セット情報から抽出され、遺伝子型一致度の測定値が、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で算出処理され、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理。
(γ)最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各DNAサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を、処理(f)により最初に抽出された変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理。
(δ)ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムが行われて、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される処理。
In the computer system of the present invention, the specific mutation information obtained by the execution of the computer system should be excluded from one or more processes selected from the following (α) to (δ) as the first specific mutation information. One or more mutation information defined as mutation information is removed from the first specific mutation information to obtain second specific mutation information, and the second specific mutation information is used as target mutation information. It is preferable that the computer system executes the extracted process.
(Α) When the first specific mutation information is obtained by using two or more DNA samples, the ratio of the specific mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth is determined by the above processing (f The processing in which the specific mutation information is defined as the mutation information to be excluded when it exceeds 5% to 20% of the mutation information obtained by (1).
(Β) All the mutation information existing in the area assigned to the low complexity area is extracted from the primary mutation set information, and the measured value of the genotype coincidence is the all mutation information and each low complexity area. All mutation information in the low-complexity region that is calculated and processed with the mutation information in the second mutation set information regarding and has a genotype-matched measurement value below a predetermined threshold is defined as the mutation information to be excluded. Processing.
(Γ) processing different primary mutation set information or different mutation information for each DNA sample generated by using a different mapping algorithm and different mutation call algorithm from the generation of the first used primary mutation set information ( The process in which the mutation information that is included in the mutation information extracted first by f) but not included in the different primary mutation set information or the different mutation information is defined as the mutation information to be removed.
(Δ) A process in which an algorithm related to the Hardy-Weinberg equilibrium test is performed, and mutation information deviating from the Hardy-Weinberg equilibrium is defined as mutation information to be removed.
「変異部位毎のリード深度に基づく変異情報の除去」に関する追加処理αは、本発明の選択方法の追加工程(a)に相当する処理であり、後述する実施例の「選択手順3」(図1の「手順3」の、特に真ん中)に相当し、その結果の一例は、表2の「手順3」に記載されている。 The additional process α relating to “removal of mutation information based on the read depth for each mutation site” is a process corresponding to the additional step (a) of the selection method of the present invention, and “selection procedure 3” (see FIG. 1 corresponds to “Procedure 3”, particularly in the middle), and an example of the result is described in “Procedure 3” in Table 2.
「ゲノムの複雑性に基づく変異情報の除去」に関する追加処理βは、本発明の選択方法の追加工程(b)に相当する処理であり、後述する実施例の「選択手順4」(図1の「手順4」の、特に左側の表と、右図)に相当し、その結果の一例は、表2の「手順4」に記載されている。 The additional process β related to “removal of mutation information based on genome complexity” is a process corresponding to the additional step (b) of the selection method of the present invention, and “selection procedure 4” (see FIG. This corresponds to “Procedure 4”, in particular, the table on the left side and the right figure.
「解析手法の偏りに関する変異情報の除去」に関する追加処理γは、本発明の選択方法の追加工程(c)に相当する処理であり、後述する実施例の「選択手順5」(図1の「手順5」の特に上図)に相当し、その結果の一例は、表2の「手順5」に記載されている。 The additional process γ related to “removal of mutation information related to bias of analysis method” is a process corresponding to the additional step (c) of the selection method of the present invention, and “selection procedure 5” (see “ An example of the result is described in “Procedure 5” in Table 2.
「集団遺伝学的な変異情報の除去」に関する追加処理(δ)は、本発明の選択方法の追加工程(d)に相当する処理であり、具体的には、ハーディ・ワインベルグ平衡検定を行い、当該平衡から逸脱した変異情報の除去が行われている。本追加処理(δ)は、後述する実施例の「選択手順6」(図1の「手順6」)に相当し、その結果の一例は、表2の「手順6」に記載されている。 The additional process (δ) relating to “removal of population genetic variation information” is a process corresponding to the additional step (d) of the selection method of the present invention. Specifically, a Hardy-Weinberg equilibrium test is performed. The mutation information deviating from the equilibrium is removed. This additional processing (δ) corresponds to “selection procedure 6” (“procedure 6” in FIG. 1) of an embodiment described later, and an example of the result is described in “procedure 6” of Table 2.
本発明のコンピュータシステム又は装置は、本発明の選択方法のみならず、本発明の深度決定方法を実行するための態様とすることができる。具体的には、塩基配列のデータから特定リード深度の範囲を選択するコンピュータシステムであって、少なくとも記録部と演算処理部を備え、下記の処理(a)〜(d)が実行されることを特徴とするコンピュータシステム又は装置である。
(a)当該記録部には、マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各DNAサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されており、
(b)当該演算処理部では、前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理が実行され、
(c)各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理が実行されることによって算出され、
(d)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理が実行される。
The computer system or apparatus of the present invention can be an embodiment for executing not only the selection method of the present invention but also the depth determination method of the present invention. Specifically, the computer system selects a specific read depth range from base sequence data, and includes at least a recording unit and an arithmetic processing unit, and performs the following processes (a) to (d). A featured computer system or apparatus.
(A) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the recording unit maps the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, and mapping from each DNA sample Secondary mutation set information obtained by means other than is recorded,
(B) In the arithmetic processing unit, a process of grouping primary mutation set information read from the recording unit into a subset having a predetermined range of read depth is executed,
(C) A genotype comparison process of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information read from the recording unit as the measured value of the genotype matching degree of the mutation information of each subset Is calculated by executing
(D) The process of determining the appropriate range of the read depth is executed by combining the range of the read depth of the subset having the genotype matching degree higher than the predetermined threshold.
上記処理(a)〜(d)は、本発明の選択方法を実行するためのコンピュータシステム又は装置における処理(a)〜(f)のうちの(a)〜(d)と実質的に同じである。
[本発明のコンピュータプログラム]
本発明のコンピュータプログラムの第1の態様は、本発明の選択方法を実行するためのアルゴリズムが含まれるコンピュータプログラムであり、具体的には、塩基配列のデータから特定変異情報を選択するコンピュータプログラムであって、コンピュータに下記の機能(a)〜(f)を実現させるアルゴリズムが含まれていることを特徴とするコンピュータプログラムである。
(a)マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各DNAサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されている記録部から、これらの情報を読み出す機能。
(b)前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理を実行する機能。
(c)各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理を実行することによって算出する機能。
(d)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理を実行する機能、
(e)各DNAサンプルについて一次変異セット情報から、前記(d)により決定されたリード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理が実行し、各DNAサンプルについて残っている変異情報を抽出する機能。
(f)全てのDNAサンプルの中の少なくとも1つのDNAサンプルについて、上記の処理(a)〜(e)を実行した結果、残っている変異情報を、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出して、当該遺伝情報を目的の特定変異情報として特定する機能。
The processes (a) to (d) are substantially the same as (a) to (d) among the processes (a) to (f) in the computer system or apparatus for executing the selection method of the present invention. is there.
[Computer program of the present invention]
A first aspect of the computer program of the present invention is a computer program including an algorithm for executing the selection method of the present invention. Specifically, the computer program selects specific mutation information from base sequence data. The computer program includes an algorithm for causing a computer to realize the following functions (a) to (f).
(A) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, and obtained by means other than mapping from each DNA sample A function to read out the information from the recording section where the secondary mutation set information is recorded.
(B) A function of performing a process of grouping primary mutation set information read from the recording unit into subsets having a predetermined range of read depth.
(C) A process for comparing genotypes of mutation information between primary mutation set information and the secondary mutation set information read from the recording unit, based on a measurement value of the genotype matching degree of mutation information of each subset A function that calculates by executing
(D) a function of executing a process of determining an appropriate range of read depth by combining the range of read depths of a subset having a measurement value of genotype matching higher than a predetermined threshold;
(E) From the primary mutation set information for each DNA sample, mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth determined in (d) above is executed, and the remaining mutation information for each DNA sample The function to extract.
(F) As a result of executing the above processes (a) to (e) for at least one DNA sample among all DNA samples, the remaining mutation information is extracted together with the locus to which the mutation information belongs. The function of identifying the genetic information as the specific mutation information of interest.
上記機能(a)〜(f)は、本発明のコンピュータシステム又は装置における、「処理(a)〜(f)」にそのまま対応する。すなわち、本発明のコンピュータプログラムは、上記機能(a)〜(f)を、コンピュータにおいて実現させることにより、コンピュータに上記処理(a)〜(f)を行わせることができるアルゴリズムが含まれている。 The functions (a) to (f) correspond directly to the “processing (a) to (f)” in the computer system or apparatus of the present invention. That is, the computer program of the present invention includes an algorithm that allows the computer to perform the processes (a) to (f) by realizing the functions (a) to (f) in the computer. .
機能(a)を実現させるためのアルゴリズムは、上記機能(a)として記載された通りである。 The algorithm for realizing the function (a) is as described as the function (a).
機能(b)を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、一次変異セット情報に割り当てられたリード深度の値毎に区分けするアルゴリズムが挙げられ、当該区分けの程度は特に限定されず、「1」毎に行うことも可能であり、それより多くの値で行うことも可能である。後述する実施例では「1」毎に区分けが行われた。 As an algorithm for realizing the function (b), for example, an algorithm for classifying each read depth value assigned to the primary mutation set information can be cited, and the degree of the classification is not particularly limited, and for each “1”. It is possible to do this, and it is also possible to do it with more values. In the example described later, the classification was performed for each “1”.
機能(c)を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、前記機能(b)によって得られる、一次変異セット情報に基づく、リード深度別に区分けされた変異情報のサブセット毎に、個々の変異情報について、上述した、「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」に分類処理し、さらに、二次変異セット情報についても、「リファレンスホモ」、「ヘテロ」、及び、「非リファレンスホモ」に分類処理し、上記の「適合率」及び/又は「検出率」を算出・合算(平均化)処理するアルゴリズムが挙げられる。 The algorithm for realizing the function (c) is, for example, the above-described individual mutation information for each subset of the mutation information classified by read depth based on the primary mutation set information obtained by the function (b). Classification processing into “reference homo”, “hetero”, and “non-reference homo”, and secondary mutation set information also into “reference homo”, “hetero”, and “non-reference homo” An algorithm for performing classification processing and calculating / summing (averaging) the above-mentioned “adaptation rate” and / or “detection rate” is given.
機能(d)を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、「適合率」及び/又は「検出率」についての所定の閾値(上記の通り)と、リード深度別に区分けされた変異情報のサブセットについて算出・合算(平均化)処理された「適合率」及び/又は「検出率」の値を比較して、当該閾値を超える値を有するリード深度毎のサブセットを抽出して、当該サブセットのリード深度を統合して、リード深度の適正範囲を生成するアルゴリズムが挙げられる。 The algorithm for realizing the function (d) is, for example, calculated with respect to a predetermined threshold (as described above) for “accuracy rate” and / or “detection rate” and a subset of variation information classified by read depth. Comparing the summed (averaged) values of “Precision rate” and / or “Detection rate”, extracting a subset for each lead depth that has a value exceeding the threshold, and integrating the read depth of the subset Then, an algorithm for generating an appropriate range of the lead depth can be mentioned.
機能(e)を実現させるためのアルゴリズムは、上記機能(e)として記載された通りである。 The algorithm for realizing the function (e) is as described as the function (e).
機能(f)を実現させるためのアルゴリズムは、上記機能(f)として記載された通りである。 The algorithm for realizing the function (f) is as described as the function (f).
本発明のコンピュータプログラムには、コンピュータプログラムにおける(a)〜(f)の機能を実現させるアルゴリズムに加えて、さらに、下記(α)〜(δ)から選ばれる1以上の機能の実現により、除かれるべき変異情報として定義された1以上の変異情報を、既存の第一の特定変異情報から除いて、新たな第二の特定変異情報を得る機能を実現させるアルゴリズムを含ませることができる。
(α)第一の特定変異情報が、2以上のDNAサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、上記機能(f)によって得られる変異情報の5%〜20%を超える場合、当該特定の変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能。
(β)低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報を、一次変異セット情報から抽出し、遺伝子型一致度の測定値を、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で算出し、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能。
(γ)最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各DNAサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を、上記機能(f)により最初に抽出した変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能。
(δ)ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムを行って、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報を、除かれるべき変異情報として定義する機能。
In addition to the algorithm for realizing the functions (a) to (f) in the computer program, the computer program of the present invention further includes one or more functions selected from the following (α) to (δ). An algorithm that realizes a function of obtaining new second specific mutation information by removing one or more pieces of mutation information defined as the mutation information to be added from the existing first specific mutation information can be included.
(Α) When the first specific mutation information is obtained by using two or more DNA samples, the ratio of specific mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth is the function (f The function of defining the specific mutation information as the above-described mutation information to be excluded when exceeding 5% to 20% of the mutation information obtained by (1).
(Β) All the mutation information existing in the area assigned to the low complexity area is extracted from the primary mutation set information, and the genotype match value is measured as the all mutation information and each low complexity area. All mutation information in the low-complexity region having a genotype-matched measurement value below a predetermined threshold is defined as the mutation information to be excluded. function.
(Γ) Different primary mutation set information or different mutation information for each DNA sample generated by using a different mapping algorithm and different mutation call algorithm from the generation of the first used primary mutation set information. A function of defining, as the mutation information to be excluded, the mutation information that is included in the mutation information extracted first in (f) but is not included in the different primary mutation set information or the different mutation information.
(Δ) A function for defining the mutation information deviating from the Hardy-Weinberg equilibrium as the mutation information to be removed by performing an algorithm related to the Hardy-Weinberg equilibrium test.
上記追加機能(α)〜(δ)は、本発明のコンピュータシステム又は装置における、「追加処理(α)〜(δ)」にそのまま対応する。すなわち、本発明のコンピュータプログラムは、上記追加機能(α)〜(δ)を、コンピュータにおいて実現させることにより、コンピュータに上記処理(α)〜(δ)を行わせることができるアルゴリズムが含まれている。 The additional functions (α) to (δ) correspond to “addition processing (α) to (δ)” as they are in the computer system or apparatus of the present invention. That is, the computer program of the present invention includes an algorithm that allows the computer to perform the processes (α) to (δ) by realizing the additional functions (α) to (δ) in the computer. Yes.
追加機能(α)を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、第一の特定変異情報における特定の変異情報(SNVの情報等)のリード深度をDNAサンプル毎に抽出して、当該リード深度が上記適正範囲外のDNAサンプル数の、全体のDNAサンプル数に対する比率を算出して、当該算出値が、特定の閾値(下限値として5〜20%のいずれか)を超えるか否かを判断して、超える場合には、当該特定の変異情報を「除かれるべき変異情報」として抽出するアルゴリズムが挙げられる。 The algorithm for realizing the additional function (α) is, for example, extracting the read depth of specific mutation information (such as SNV information) in the first specific mutation information for each DNA sample, and the read depth is the above appropriate Calculate the ratio of the number of DNA samples outside the range to the total number of DNA samples, and determine whether the calculated value exceeds a specific threshold (any of 5 to 20% as a lower limit), In the case of exceeding, there is an algorithm for extracting the specific mutation information as “mutation information to be removed”.
追加機能(β)を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、所定の低複雑度領域における変異情報を、一次変異セットと二次変異セットにおいて抽出し、「適合率」及び/又は「検出率」についての所定の閾値(上記の通り)と、リード深度別に区分けされた変異情報のサブセットについて算出・合算(平均化)処理された「適合率」及び/又は「検出率」の値を比較して、当該閾値以下の「適合率」及び/又は「検出率」の変異情報を、リード深度に係わらず「除かれるべき変異情報」として抽出するアルゴリズムが挙げられる。 As an algorithm for realizing the additional function (β), for example, mutation information in a predetermined low complexity region is extracted in a primary mutation set and a secondary mutation set, and “matching rate” and / or “detection rate” is determined. Compared with the predetermined threshold (as described above) and the value of the “compliance rate” and / or “detection rate” calculated and summed (averaged) for the subset of mutation information divided by read depth, There is an algorithm for extracting variation information of “matching rate” and / or “detection rate” below the threshold as “mutation information to be removed” regardless of the read depth.
追加機能(γ)を実現させるためのアルゴリズムは、例えば、「最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各DNAサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報」と、「上記機能(f)により最初に抽出した変異情報」の一致又は不一致を抽出し、当該不一致の変異情報を「上記機能(f)により最初に抽出した変異情報から除かれるべき変異情報」として抽出するアルゴリズムが挙げられる。 The algorithm for realizing the additional function (γ) is, for example, “for each DNA sample generated by using a different mapping algorithm and a different mutation call algorithm from the generation of the first used primary mutation set information. Match or mismatch between “different primary mutation set information or different mutation information” and “mutation information first extracted by the function (f)” is extracted, and the mismatch mutation information is first extracted by the above function (f). Algorithm to extract “mutation information to be removed from the mutation information that has been performed”.
追加機能(δ)を実現させるためのアルゴリズムは、上記追加機能(δ)として記載された通りである。 The algorithm for realizing the additional function (δ) is as described as the additional function (δ).
本発明のコンピュータプログラムは、本発明の選択方法のみならず、本発明の深度決定方法をコンピュータにおいて実現するためのアルゴリズムとすることができる。具体的には、塩基配列のデータからリード深度の適正範囲を算出するためのコンピュータプログラムであって、コンピュータに下記の機能(a)〜(d)を実現させるアルゴリズムが含まれていることを特徴とするコンピュータプログラムである。
(a)マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各DNAサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されている記録部から、これらの情報を読み出す機能、
(b)前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理を実行する機能、
(c)各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理を実行することによって算出する機能、
(d)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理を実行する機能;
The computer program of the present invention can be an algorithm for realizing not only the selection method of the present invention but also the depth determination method of the present invention in a computer. Specifically, it is a computer program for calculating an appropriate range of read depth from base sequence data, and includes an algorithm that causes the computer to realize the following functions (a) to (d): Is a computer program.
(A) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, and obtained by means other than mapping from each DNA sample A function to read out the information from the recording section where the secondary mutation set information is recorded,
(B) a function of performing a process of grouping primary mutation set information read from the recording unit into a subset having a predetermined range of read depths;
(C) A genotype comparison process of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information read from the recording unit as the measured value of the genotype matching degree of the mutation information of each subset Function to calculate by executing
(D) a function of executing a process of determining an appropriate range of read depths by combining the range of read depths of a subset having a genotype matching degree measurement value higher than a predetermined threshold;
上記機能(a)〜(d)は、本発明の選択方法を実行するためのコンピュータプログラムにおける機能(a)〜(f)のうちの(a)〜(d)と実質的に同じである。 The functions (a) to (d) are substantially the same as the functions (a) to (d) among the functions (a) to (f) in the computer program for executing the selection method of the present invention.
本発明のコンピュータプログラムは、C言語、Java(登録商標)、Perl、もしくはPythonのような高級コンピュータ言語でのみならず、2進数によってもしくはアセンブリ言語でも記載されることが可能である。コンピュータプログラムは、必要に応じてもしくは前もって記録部に、又は、外部ハードウェアに、記録されており、記録されたアルゴリズムに従った演算処理は、必要に応じて演算処理部において行われる。 The computer program of the present invention can be written not only in a high-level computer language such as C language, Java (registered trademark), Perl, or Python, but also in binary numbers or in assembly language. The computer program is recorded in the recording unit as needed or in advance or in external hardware, and arithmetic processing according to the recorded algorithm is performed in the arithmetic processing unit as necessary.
以下、本発明の実施例を説明する。
[全ゲノムのシークエンシング]
サンプル同士の混合を防ぐために、ライブラリ構築にはゲノムDNA検体を、96穴プレートを使って取り扱った。ゲノムDNAはラボラトリ自動化システム(Biomek NXP,Beckman社)を使って濃度20ng/μLになりように調製され、96穴プレートDNA超音波破砕装置(Covaris LE220,Covaris社)を使って平均550bpになるように断片化をした。このようにして得られたDNAはBravoリキッドハンドリング装置(Agilent Technologies社)を使ってTruSeq DNA PCR−Free HT sample prep kit(Illumina社)でライブラリ化を行った。最終的に、調製されたライブラリはバーコードラベルで識別された1.5mLの試験管に移され、ライブラリ品質管理用に変性処理を行った。
Examples of the present invention will be described below.
[ Sequencing of whole genome ]
In order to prevent mixing of samples, genomic DNA specimens were handled using a 96-well plate for library construction. Genomic DNA was prepared to a concentration of 20 ng / μL using a laboratory automation system (Biomek NXP, Beckman) and averaged to 550 bp using a 96-well plate DNA sonicator (Covaris LE220, Covaris). Fragmented. The DNA thus obtained was converted into a library using a TruSeq DNA PCR-Free HT sample prep kit (Illumina) using a Bravo liquid handling apparatus (Agilent Technologies). Finally, the prepared library was transferred to a 1.5 mL test tube identified by a barcode label and subjected to denaturation treatment for library quality control.
ライブラリの定量化および品質管理は新規に開発した定量MiSeq法(qMiSeq)で実施した。この手法ではまず、8μLまたは10μLの調整済みライブラリを等量の0.1N NaOHと一緒に5分間変性させた後、49倍の体積の氷冷した「Illumina HT1緩衝液」で希釈を行う。次に、予めHiSeqで解析済みの3つの対象サンプルを含む96個の50μL希釈済みライブラリを混合する。このうち60μLを、540μLの氷冷したIllumina HT1緩衝液で希釈し、MiSeqの25bpペアエンドプロトコルで解析を行う。MiSeqシークエンサーの解析で決められたインデックス比はHiSeqの実行にあたり実行条件を決めるための相対濃度として利用する。qMiSeq法の詳細は手法論文として既に公知である[Katsuoka F, et al. An efficient quantitation method of next-generation sequencing libraries by using MiSeq sequencer. Anal. Biochem. 466c, 27-29 (2014)]。また、DNAライブラリの品質管理を行うに際して、MiSeq QCに加えてFragment Analyzer ソフトウェア(Advanced Analytical社)も利用した。
Library quantification and quality control were performed with the newly developed quantitative MiSeq method (qMiSeq). In this procedure, 8 μL or 10 μL of the prepared library is first denatured with an equal amount of 0.1N NaOH for 5 minutes and then diluted with 49 times volume of ice-cooled “Illumina HT1 buffer”. Next, 96 50 μL diluted libraries containing 3 target samples previously analyzed with HiSeq are mixed. Of this, 60 μL is diluted with 540 μL of ice-cold Illumina HT1 buffer and analyzed using the
前述のDNAライブラリは製造者の手順書に従ってHiSeq2500シークエンサーで解析に使った。解析はTruSeq Rapid PE Cluster Kit (Illumina社)とone−and−a−half TruSeq Rapid SBS Kit(200 cycles, Illumina社)を使って162bpペアエンドのRapid−Run Modeで実行した。qMiSeqの結果に基づきライブラリを適切な濃度に調整し、on−boardクラスタ形成(Illumina社)が行われた。最初に報告されるクラスタ密度を確認し、その密度(約550から650K/mm2)によって解析を継続するかの判断を行う作業を反復的に行った。 The aforementioned DNA library was used for analysis with a HiSeq 2500 sequencer according to the manufacturer's protocol. The analysis was performed with a Rapid-Run Mode of 162 bp pair end using TruSeq Rapid PE Cluster Kit (Illumina) and one-and-a-half TruSeq Rapid SBS Kit (200 cycles, Illumina). Based on the result of qMiSeq, the library was adjusted to an appropriate concentration, and on-board cluster formation (Illumina) was performed. The cluster density reported first was confirmed, and the operation of determining whether to continue the analysis depending on the density (about 550 to 650 K / mm 2 ) was repeated.
[選択手順1] 各DNAサンプルのアライメントと変異コール
HiSeqシークエンサーから出力された各ゲノムDNAサンプル(以下、DNAサンプルとも記載する)のシークエンスリードを、参照ゲノム配列(GRCh37/hg19)にデコイ配列(hs37d5)とともにアライメントした。アライメントは“−X 2000”オプションを使ったBowtie2(version 2.1.0)と、標準オプションを使ったBWA−MEM(ver.0.7.5a−r405)で行った。変異コールは、これらのアライメント結果を使って「Bcftools software」(ver. 0.1.17−dev)と「the Genome Analysis Toolkit」(GATK version 2.5−2)で行った(図1の「手順1」)。以後のフィルタリングで使うために、各DNAサンプルの全SNV部位のリード深度を計算した(図1の「手順1」の中の最下行)。ここでリード深度は、各SNVポジションにおいて、マッピングクオリティ5以上でアラインメントが行われたシークエンスリードの数であることを確認する。
[ Selection Procedure 1 ] Alignment and Mutation Call of Each DNA Sample The sequence read of each genomic DNA sample (hereinafter also referred to as a DNA sample) output from the HiSeq sequencer is used as a decoy sequence (hs37d5) as a reference genomic sequence (GRCh37 / hg19). ). Alignment was performed with Bowtie 2 (version 2.1.0) using the “-X 2000” option and BWA-MEM (ver. 0.7.5a-r405) using the standard option. Mutation calls were made using “Bcftools software” (ver. 0.1.17-dev) and “the Genome Analysis Toolkit” (GATK version 2.5-2) using these alignment results (“FIG. 1“ GATK version 2.5-2 ”).
次にSNPアレイで設計されている部位の適合率(precision)と検出率(pewer)(=再現率(recall))を評価するために、SNVコールと同一サンプルの解析を行った「HumanOmni2.5−8 BeadChip」のジェノタイプコールとの比較を行った。Bowtie2のアライメントに対してBcftoolsの変異コーラーを使って得られたSNV(Bowtie2+Bcftools)の適合率は、常にBWA−MEMのアライメントに対してGATKの変異コーラーを適合して得られたSNV(BWA−MEM+GATK)より高かった。一方、検出率はBWA−MEM+GATKの方が、Bowtie2+Bcftoolsよりも高かった。この結果は先行研究の報告と一致している[Li H. Toward better understanding of artifacts in variant calling from high-coverage samples. Bioinformatics 30, 2843-2851 (2014)]。これらの結果から、「BWA−MEM+GATK」で得られたSNVは高感度、つまり可能な限り多くのSNV候補を発見することを目指した結果であると考えることができる。一方、「Bowtie2+Bcftools」で得られたSNVは信頼度が高く、以下のフィルタリングステップにおける、高信頼のSNV候補として使うことにする。以下断りがない限り、「SNV」は、「Bowtie2+Bcftools」で変異コールされたバリアントを指すこととする。 Next, in order to evaluate the precision and detection rate (= recall) of the sites designed in the SNP array, the same sample as the SNV call was analyzed, “HumanOmni2.5 A comparison was made with the genotype call of “-8 BeadChip”. The SNV (Bowtie2 + Bcftools) match rate obtained using the Bcftools mutation caller for the Bowtie2 alignment is always SNV (BWA-MEM + GATK) obtained by fitting the GATK mutation caller to the BWA-MEM alignment. ) Was higher. On the other hand, the detection rate of BWA-MEM + GATK was higher than that of Bowtie2 + Bcftools. This result is consistent with previous studies [Li H. Toward better understanding of artifacts in variant calling from high-coverage samples. Bioinformatics 30, 2843-2851 (2014)]. From these results, it can be considered that the SNV obtained by “BWA-MEM + GATK” is a result aimed at high sensitivity, that is, finding as many SNV candidates as possible. On the other hand, the SNV obtained by “Bowtie2 + Bcftools” has high reliability, and is used as a highly reliable SNV candidate in the following filtering step. Unless otherwise specified, “SNV” refers to a variant that has been mutated and called by “Bowtie2 + Bcftools”.
[選択手順2] DNAサンプル毎のリード深度に基づくSNVのフィルタリング
極端にリード深度が高いまたは低い遺伝型をDNAサンプル毎にフィルタリングした。DNAサンプル毎に、「HumanOmni2.5−8 BeadChip」のジェノタイピング結果との比較から計算された、適合率と検出率に基づき、遺伝型を残すリード深度の範囲を決定した。NGSのリード深度によってSNVをグループ分けし、グループごとに適合率と検出率を計算した(図1の「手順2」の真ん中のグラフ)。その際、複数の染色体にアラインメントされたリードの影響を排除するために、マッピングクオリティ5以上のリードのみを考慮した。その結果、適合度が0.998よりも大きく、かつ検出率が0.95よりも大きなグループに属するSNVのリード深度の範囲にある遺伝型を信頼できるSNVとして残した(図1の「手順2」)。この選択手順2において、2%の分離サイトが取り除かれた(表2の「手順2」)。
[ Selection Procedure 2 ] SNV Filtering Based on Read Depth for Each DNA Sample Genotypes with extremely high or low read depth were filtered for each DNA sample. For each DNA sample, the range of the read depth that leaves the genotype was determined based on the precision and detection rate calculated from the comparison with the genotyping results of “HumanOmni2.5-8 BeadChip”. SNVs were grouped according to the lead depth of NGS, and the precision and detection rate were calculated for each group (middle graph of “
表2における「既知変異」は、「dbSNP build 138」において報告されているSNVである。 The “known mutation” in Table 2 is the SNV reported in “dbSNP build 138”.
[選択手順3] SNV部位毎のリード深度に基づくSNVのフィルタリング
前記選択手順2で、リード深度に基づくフィルタリングが適用された結果、全DNAサンプルの10%以上の遺伝型が存在しないSNVは、部位全体を取り除いた。例えば、反復配列へのリードのアラインメントの結果、極端に高いまたは低いリード深度になるような部位はこのフィルタリングの対象になりうる。このフィルタリングによって残るSNV部位の割合を計算した(図1の「手順3」の真ん中)。この選択手順3において、4.99%のSNV部位が取り除かれた(上記表2の「手順3」)。
[ Selection Procedure 3 ] SNV Filtering Based on Read Depth for Each SNV Site As a result of applying the filtering based on the read depth in the
[選択手順4] ゲノムの複雑性に基づくフィルター
縦列型反復配列等の配列の複雑度が低い領域の正確な変異コールは、一般的に困難である。RepeatMaskerプログラム[Smit, AFA, Hubley, R & Green, P. RepeatMasker Open-4.0. 2013-2015 <http://www.repeatmasker.org>.]は56%のゲノム領域がこのような低複雑性の領域だと判定している。RepeatMaskerで判定されたリピートのグループ毎に、同一サンプルのSNPアレイジェノタイピングとの間の遺伝型の適合度の計算を行った(図1の「手順4」の左側の表)。各ゲノム領域のSNVコールの適合度は、「HumanOmni2.5−8 BeadChip」の解析で得られた遺伝型コールの結果に基づいて算出し、適合度が0.997以下になったゲノム領域(図1の「手順4」の右図)のSNVは取り除いた。低複雑性のゲノム領域には、Alu、ERVK、Low_complexity、Satellite、Simple_repeat、TcMar−Mariner、CR1、DNA、Deu、Dong−R4,ERV、ERV1、ERVK、ERVL,ERVL−MaLR、GENCODE、Gypsy、Helitron、L1、L2,LTR、MIR、Merlin,MuDR,Penelope、PiggyBac、RNA、RTE、RTE−BovB、SINE、TcMar、TcMar−Tc2、TcMar−Tigger、acro、centr、hAT、hAT−Blackjack、hAT−Chalie、hAT−Tip100、intergenic、rRNA、scRNA、snRNA、srpRNA、tRNA、telo等が含まれる。この手順で14.22%のSNVが取り除かれた(上記表2の「手順4」)。
[ Selection Procedure 4 ] Filter based on genome complexity It is generally difficult to accurately call mutations in regions with low sequence complexity such as tandem repeats. The RepeatMasker program [Smit, AFA, Hubley, R & Green, P. RepeatMasker Open-4.0. 2013-2015 <http://www.repeatmasker.org>.] Has 56% of the genomic region with such low complexity. Judged to be an area. For each group of repeats determined by Repeat Masker, genotypic fitness with SNP array genotyping of the same sample was calculated (the table on the left side of “Procedure 4” in FIG. 1). The SNV call fitness of each genomic region was calculated based on the result of genotype call obtained in the analysis of “HumanOmni2.5-8 BeadChip”. 1) (the right figure of “Procedure 4”) was removed. Low complexity genomic regions include Alu, ERVK, Low_complexity, Satelite, Simple_repeat, TcMar-Mariner, CR1, DNA, Deu, Dong-R4, ERV, ERV1, ERVK, ERVL, ERVL-MaLR, GENCODEHel, Gyps, Elps , L1, L2, LTR, MIR, Merlin, MuDR, Penelope, PiggyBac, RNA, RTE, RTE-BovB, SINE, TcMar, TcMar-Tc2, TcMar-Tigger, acro, centr, hAT, hAT-BlackAThack HAT-Tip100, intelligent, rRNA, scRNA, snRNA, srpRNA, tRNA, elo and the like. This procedure removed 14.22% of the SNV (“Procedure 4” in Table 2 above).
[選択手順5] 解析手法の偏りに対するフィルター
上記選択手順1の解析手法の偏りを制御するために、異なる解析手法においても発見されたSNV部位のみを残した。具体的には、上述したように、高感度の検出が行われる「BWA−MEM+GATK」を「他の手法」として用い、当該「他の手法」では発見されなかったSNVを、追加除外した。例えば、図1の「手順5」の上図において、最も左のSNVは他の手法(「BWA−MEM+GATK」)では発見されなかったので、このSNVは以後の解析から除外した。この手順で、0.57%のSNVが除去された(上記表2の「手順5」)。
[ Selection procedure 5 ] Filter against bias in analysis method In order to control the bias in the analysis method in the
[選択手順6] 集団遺伝学的なフィルタリング
上記選択手順5で得られたSNVの遺伝型頻度から計算される、ハーディーワインバーグ平衡検定でp値が10-5を下回るSNVを除去した。このフィルターは遺伝型頻度が、ハーディーワインバーグ平衡から逸脱したSNVの除去を意図している。ここで除去される多くの場合は、参照配列自体が不完全であったり、系統的なアラインメントエラーによるアーティファクトであることが想定される。この手順で1.03%のSNVが取り除かれ、最終的に当初のSNVの内77.20%がフィルタリング後に残った(図1の「手順6」と上記表2の「手順6」)。
[ Selection Procedure 6 ] Population Genetic Filtering SNVs having a p value of less than 10 −5 were removed by Hardy-Weinberg equilibrium test, which was calculated from the SNV genotype frequency obtained in the above selection procedure 5. This filter is intended to remove SNVs whose genotype frequencies deviate from Hardy Weinberg equilibrium. In many cases removed here, it is assumed that the reference sequence itself is incomplete or is an artifact due to a systematic alignment error. This procedure removed 1.03% of the SNV, and finally 77.20% of the original SNV remained after filtering (“Procedure 6” in FIG. 1 and “Procedure 6” in Table 2 above).
Claims (23)
(1)各DNAサンプルについて以下を行う工程:
(1−1)マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けし、
(1−2)当該各サブセットの変異の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、マッピング以外の手段によって各DNAサンプルから得られる二次変異セット情報、との間の変異の遺伝子型を比較することによって計算する、
(1−3)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットのリード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲を決定する;
(2)各DNAサンプルについて、工程(1−1)における一次変異セット情報から、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異を除いて、各DNAサンプルについて残っている変異情報を得る工程;
(3)全てのDNAサンプルの中の少なくとも1つのDNAサンプルについて、上記の工程(1)及び(2)を行った結果、残っている変異情報を、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出して、目的の変異情報として選択する工程。 A method for selecting gene mutation information by a computer, wherein the following steps (1) to (3) are executed.
(1) The following steps for each DNA sample:
(1-1) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism is grouped into a subset having a predetermined range of the read depth. Divided,
(1-2) Genes of mutations between the primary mutation set information and the secondary mutation set information obtained from each DNA sample by means other than mapping, based on the measured value of the genotype coincidence of each subset of mutations Calculate by comparing types,
(1-3) determining an appropriate range of read depths by combining the range of read depths of subsets having a genotype match measurement value higher than a predetermined threshold;
(2) For each DNA sample, from the primary mutation set information in step (1-1), removing mutations having a read depth outside the appropriate range of read depths to obtain remaining mutation information for each DNA sample;
(3) As a result of performing the above steps (1) and (2) for at least one DNA sample among all DNA samples, the remaining mutation information is extracted together with the locus to which the mutation information belongs. And selecting as target mutation information.
(A)第一の特定変異情報が、2以上のDNAサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、工程(3)中の変異部位中の5%〜20%を超える場合、当該特定の変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される;
(B)低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報が、一次変異セット情報から選択され、遺伝子型一致度の測定値が、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で計算され、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される;
(C)工程(1)、又は、工程(1)〜(3)が、最初の工程(1)で用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を各DNAサンプルについて得、そして、最初の変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される;
(D)ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムが行われて、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される。 1 defined as mutation information to be removed in one or more steps selected from the following (A) to (D) by performing the above steps (1) to (3) to obtain first specific mutation information. The above mutation information is removed from the first specific mutation information to obtain second specific mutation information, and the second specific mutation information is selected as target mutation information. The method in any one of 1-7.
(A) When the first specific mutation information is obtained by using two or more DNA samples, the ratio of the specific mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth is the step (3). If more than 5% to 20% in the mutation site in the, the specific mutation information is defined as the mutation information to be excluded above;
(B) All the mutation information existing in the area assigned to the low complexity area is selected from the primary mutation set information, and the measured value of the genotype coincidence is the all mutation information and each low complexity area. All mutation information in the low-complexity region that is calculated between the mutation information in the second mutation set information and has a genotype-matched measurement value below a predetermined threshold is defined as the mutation information to be excluded. ;
(C) By using a different mapping algorithm and different mutation call algorithm from the generation of the primary mutation set information used in the first step (1), step (1) or steps (1) to (3) Different primary mutation set information or different mutation information generated is obtained for each DNA sample, and mutation information that is included in the first mutation information but not in the different primary mutation set information or different mutation information is excluded. Defined as power variation information;
(D) An algorithm related to the Hardy-Weinberg equilibrium test is performed, and mutation information deviating from the Hardy-Weinberg equilibrium is defined as mutation information to be removed.
(a)当該記録部には、マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各DNAサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されており、
(b)当該演算処理部では、前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理が実行され、
(c)各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理が実行されることによって算出され、
(d)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理が実行され、
(e)各DNAサンプルについて一次変異セット情報から、前記(d)により決定されたリード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理が実行され、各DNAサンプルについて残っている変異情報が抽出され、
(f)全てのDNAサンプルの中の少なくとも1つのDNAサンプルについて、上記の処理(a)〜(e)を行った結果、残っている変異情報が、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出されて、当該遺伝情報を目的の特定変異情報として特定される処理;
が実行されることを特徴とするコンピュータシステム。 A computer system for selecting specific mutation information from base sequence data, comprising at least a recording unit and an arithmetic processing unit, and the following processes (a) to (f):
(A) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the recording unit maps the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, and mapping from each DNA sample Secondary mutation set information obtained by means other than is recorded,
(B) In the arithmetic processing unit, a process of grouping primary mutation set information read from the recording unit into a subset having a predetermined range of read depth is executed,
(C) A genotype comparison process of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information read from the recording unit as the measured value of the genotype matching degree of the mutation information of each subset Is calculated by executing
(D) The determination process of the appropriate range of the read depth is performed by combining the range of the read depth of the subset having the genotype matching degree higher than the predetermined threshold into one,
(E) From the primary mutation set information for each DNA sample, mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth determined in (d) above is executed, and the remaining mutation information for each DNA sample Is extracted,
(F) As a result of performing the above processing (a) to (e) for at least one DNA sample among all DNA samples, the remaining mutation information is extracted together with the gene locus to which the mutation information belongs. , A process for identifying the genetic information as target specific mutation information;
A computer system characterized in that is executed.
(α)第一の特定変異情報が、2以上のDNAサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、請求項14の処理(f)によって得られた変異情報の5%〜20%を超える場合、当該特定の変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理;
(β)低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報が、一次変異セット情報から抽出され、遺伝子型一致度の測定値が、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で算出処理され、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理;
(γ)最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各DNAサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を、請求項14の処理(f)により最初に抽出された変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報が、上記の除かれるべき変異情報として定義される処理;
(δ)ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムが行われて、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報が、除かれるべき変異情報として定義される処理。 The specific mutation information obtained by the execution of the computer system is defined as the first specific mutation information, and is further defined as mutation information to be removed from one or more processes selected from the following (α) to (δ) The above-described mutation information is removed from the first specific mutation information to obtain the second specific mutation information, and the second specific mutation information is extracted as target mutation information. The computer system according to claim 14, wherein:
(Α) When the first specific mutation information is obtained by using two or more DNA samples, the ratio of the specific mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth is When 5% to 20% of the mutation information obtained by the process (f) is exceeded, the specific mutation information is defined as the mutation information to be removed;
(Β) All the mutation information existing in the area assigned to the low complexity area is extracted from the primary mutation set information, and the measured value of the genotype coincidence is the all mutation information and each low complexity area. All mutation information in the low-complexity region that is calculated and processed with the mutation information in the second mutation set information regarding and has a genotype-matched measurement value below a predetermined threshold is defined as the mutation information to be excluded. Processing;
(Γ) different primary mutation set information or different mutation information for each DNA sample generated by using a different mapping algorithm and different mutation call algorithm from the generation of the first used primary mutation set information. A process in which the mutation information that is included in the mutation information extracted first by the process (f) of 14 but is not included in the different primary mutation set information or the different mutation information is defined as the mutation information to be removed;
(Δ) A process in which an algorithm related to the Hardy-Weinberg equilibrium test is performed, and mutation information deviating from the Hardy-Weinberg equilibrium is defined as mutation information to be removed.
(a)マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各DNAサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されている記録部から、これらの情報を読み出す機能、
(b)前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理を実行する機能、
(c)各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理を実行することによって算出する機能、
(d)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理を実行する機能、
(e)各DNAサンプルについて一次変異セット情報から、前記(d)により決定されたリード深度の適正範囲外のリード深度を有する変異情報の除外処理が実行し、各DNAサンプルについて残っている変異情報を抽出する機能、
(f)全てのDNAサンプルの中の少なくとも1つのDNAサンプルについて、上記の処理(a)〜(e)を実行した結果、残っている変異情報を、当該変異情報が属する遺伝子座と共に抽出して、当該遺伝情報を目的の特定変異情報として特定する機能;
を実現させるアルゴリズムが含まれていることを特徴とするコンピュータプログラム。 A computer program for selecting specific mutation information from base sequence data, and the following functions (a) to (f):
(A) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, and obtained by means other than mapping from each DNA sample A function to read out the information from the recording section where the secondary mutation set information is recorded,
(B) a function of performing a process of grouping primary mutation set information read from the recording unit into a subset having a predetermined range of read depths;
(C) A genotype comparison process of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information read from the recording unit as the measured value of the genotype matching degree of the mutation information of each subset Function to calculate by executing
(D) a function of executing a process of determining an appropriate range of read depth by combining the range of read depths of a subset having a measurement value of genotype matching higher than a predetermined threshold;
(E) From the primary mutation set information for each DNA sample, mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth determined in (d) above is executed, and the remaining mutation information for each DNA sample The ability to extract,
(F) As a result of executing the above processes (a) to (e) for at least one DNA sample among all DNA samples, the remaining mutation information is extracted together with the locus to which the mutation information belongs. , The function of identifying the genetic information as the specific mutation information of interest;
The computer program characterized by including the algorithm which implement | achieves.
(α)第一の特定変異情報が、2以上のDNAサンプルを用いることによって得られる場合であって、リード深度の適正範囲外のリード深度を有する特定の変異情報の比率が、機能(f)によって得られる変異情報の5%〜20%を超える場合、当該特定の変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能;
(β)低複雑度領域に割り当てられた領域中に存在する全ての変異情報を、一次変異セット情報から抽出し、遺伝子型一致度の測定値を、当該全ての変異情報と各低複雑度領域に関する第二変異セット情報の変異情報との間で算出し、所定の閾値以下の遺伝子型一致の測定値を有する低複雑度領域の全ての変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能;
(γ)最初に用いられた一次変異セット情報の生成とは異なるマッピングアルゴリズム及び異なる変異コールアルゴリズムを用いることによって生成された、各DNAサンプルについての異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報を、機能(f)により最初に抽出した変異情報に含まれるが、当該異なる一次変異セット情報又は異なる変異情報に含まれない変異情報を、上記の除かれるべき変異情報として定義する機能;
(δ)ハーディ・ワインベルグ平衡テストに関するアルゴリズムを行って、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱する変異情報を、除かれるべき変異情報として定義する機能。 In addition to the algorithm for realizing the functions (a) to (f) in the computer program, it is further defined as mutation information to be removed by realizing one or more functions selected from the following (α) to (δ). The one or more mutation information is removed from the existing first specific mutation information, and an algorithm for realizing a function of obtaining new second specific mutation information is included. Computer program.
(Α) When the first specific mutation information is obtained by using two or more DNA samples, the ratio of the specific mutation information having a read depth outside the appropriate range of the read depth is the function (f) A function that defines the specific mutation information as the above-described mutation information to be excluded when exceeding 5% to 20% of the mutation information obtained by
(Β) All the mutation information existing in the area assigned to the low complexity area is extracted from the primary mutation set information, and the genotype match value is measured as the all mutation information and each low complexity area. All mutation information in the low-complexity region having a genotype-matched measurement value below a predetermined threshold is defined as the mutation information to be excluded. function;
(Γ) Different primary mutation set information or different mutation information for each DNA sample generated by using a different mapping algorithm and different mutation call algorithm from the generation of the first used primary mutation set information. a function of defining, as the above-described mutation information to be excluded, the mutation information that is included in the mutation information extracted first by f) but not included in the different primary mutation set information or the different mutation information;
(Δ) A function for defining the mutation information deviating from the Hardy-Weinberg equilibrium as the mutation information to be removed by performing an algorithm related to the Hardy-Weinberg equilibrium test.
(1)マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報を、当該一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けし、
(2)当該各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値を、一次変異セット情報と、マッピング以外の手段によって各DNAサンプルから得られる二次変異セット情報、との間の変異情報の遺伝子型を比較することによって計算する、
(3)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットのリード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲を決定する。 A method for determining an appropriate range of lead depth by a computer, comprising the following steps (1) to (3).
(1) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, the primary mutation set information, and the predetermined range of the read depth Group into subsets with
(2) The gene of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information obtained from each DNA sample by means other than mapping, using the measured value of the genotype coincidence of the mutation information of each subset. Calculate by comparing types,
(3) The appropriate range of the read depth is determined by combining the read depth ranges of the subsets having the genotype matching degree higher than the predetermined threshold.
(a)マッピングアルゴリズム及び変異コールアルゴリズムに基づいて、標的生物の1以上の個体の各DNAサンプルに関する、リード深度が割り当てられた一次変異セット情報、及び、各DNAサンプルからマッピング以外の手段によって得られた二次変異セット情報が記録されている記録部から、これらの情報を読み出す機能、
(b)前記記録部から読み出された一次変異セット情報を、リード深度の所定範囲を有するサブセットにグループ分けする処理を実行する機能、
(c)各サブセットの変異情報の遺伝子型一致度の測定値が、一次変異セット情報と、前記記録部から読み出された上記二次変異セット情報との間の変異情報の遺伝子型の比較処理を実行することによって算出する機能、
(d)所定の閾値より高い遺伝子型一致度の測定値を有するサブセットの、リード深度の範囲を一つにまとめることによって、リード深度の適正範囲の決定処理を実行する機能;
を実現させるアルゴリズムが含まれていることを特徴とするコンピュータプログラム。 A computer program for calculating an appropriate range of read depth from base sequence data, and the following functions (a) to (d):
(A) Based on the mapping algorithm and the mutation call algorithm, the primary mutation set information to which the read depth is assigned for each DNA sample of one or more individuals of the target organism, and obtained by means other than mapping from each DNA sample A function to read out the information from the recording section where the secondary mutation set information is recorded,
(B) a function of performing a process of grouping primary mutation set information read from the recording unit into a subset having a predetermined range of read depths;
(C) A genotype comparison process of the mutation information between the primary mutation set information and the secondary mutation set information read from the recording unit as the measured value of the genotype matching degree of the mutation information of each subset Function to calculate by executing
(D) a function of executing a process of determining an appropriate range of read depths by combining the range of read depths of a subset having a genotype matching degree measurement value higher than a predetermined threshold;
The computer program characterized by including the algorithm which implement | achieves.
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