JP2017012117A - Aerobic production methods for 3-hydroxybutyric acid or salt thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法に関し、さらに詳細には、特定のハロモナス属に属する微生物を用いた簡便で効率良く３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を高収量で得られる製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof, and more specifically, relates to a production method for obtaining 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof in a high yield simply and efficiently using a microorganism belonging to a specific genus Halomonas. .
３−ヒドロキシ酪酸はバイオプラスチックや医薬品等の原料となる物質であり、またポリヒドロキシアルカノエートは、生分解性のプラスチックとして利用可能な物質で、３−ヒドロキシ酪酸の原料とすることもできる。そのため、これらの物質を効率的に生産し得る方法の確立が期待されている。 3-hydroxybutyric acid is a material used as a raw material for bioplastics and pharmaceuticals, and polyhydroxyalkanoate is a material that can be used as a biodegradable plastic, and can also be used as a raw material for 3-hydroxybutyric acid. Therefore, establishment of a method capable of efficiently producing these substances is expected.
３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートは微生物による発酵生産が可能であり、いくつかの生産方法が検討されている。例えば、遺伝子組み換え大腸菌（特許文献１）や紫外線変異株カプリアビダス・ネカトー（Cupriavidus necator Cn31）（非特許文献１）を用いて３−ヒドロキシ酪酸を産生させる方法が報告されている。 3-Hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate can be fermented by microorganisms, and several production methods have been studied. For example, a method for producing 3-hydroxybutyric acid using a genetically modified Escherichia coli (Patent Document 1) and an ultraviolet mutant Capriavidus necator Cn31 (Non-Patent Document 1) has been reported.
またこのような遺伝子操作技術によることなく、種々の微生物を用いて３−ヒドロキシ酪酸を製造する方法も検討されている。例えば、アルカリゲネス属やラルストニア属等の微生物を培養した後、微生物を分解溶液と接触させて、菌体内に蓄積されたポリヒドロキシアルカノエートを自家分解させる方法（特許文献２）や、シュードモナス属などの微生物を培養した後、その培養液から菌体を分離してホウ酸緩衝液などに懸濁し、これをさらに好気的条件でインキュベートする方法（特許文献３）、ハロモナス属微生物を好気培養し、次いで微好気培養に変更して培養する方法（特許文献４）などが開示されている。 In addition, a method for producing 3-hydroxybutyric acid using various microorganisms without using such a gene manipulation technique has been studied. For example, after culturing microorganisms such as the genus Alkagenes or Ralstonia, the microorganism is brought into contact with a decomposition solution to self-decompose polyhydroxyalkanoate accumulated in the cells (Patent Document 2), Pseudomonas genus, etc. After culturing the microorganism, the cells are separated from the culture solution and suspended in a borate buffer solution, and this is further incubated under aerobic conditions (Patent Document 3). Subsequently, a method of changing to microaerobic culture and culturing (Patent Document 4) and the like are disclosed.
しかし、これらの方法はいずれも微生物を好気培養し、菌体内にポリヒドロキシアルカノエートを蓄積させた後、これを３−ヒドロキシ酪酸に変換するための処理が必要で工程が複雑になる上、３−ヒドロキシ酪酸の生産量が菌体内のポリヒドロキシアルカノエートの蓄積量に制限されるため、工業的生産に適したものとはいえなかった。また上述のとおり、ポリヒドロキシアルカノエート自体、生分解性プラスチックとして利用可能で有用性の高い物質であるが、上記方法はいずれも菌体内に蓄積したポリヒドロキシアルカノエートを原料として３−ヒドロキシ酪酸に変換するものであるため、実質的に両者の同時生産は困難であるのが実情であった。 However, both of these methods require a treatment for aerobically culturing microorganisms and accumulating polyhydroxyalkanoate in the microbial cells, and then converting them into 3-hydroxybutyric acid. Since the production amount of 3-hydroxybutyric acid is limited to the accumulation amount of polyhydroxyalkanoate in the microbial cells, it could not be said that it was suitable for industrial production. In addition, as described above, polyhydroxyalkanoate itself is a highly useful substance that can be used as a biodegradable plastic. However, all of the above methods use polyhydroxyalkanoate accumulated in the fungus body as a raw material to 3-hydroxybutyric acid. In reality, it is difficult to produce both of them at the same time.
このように従来の方法では、（１）３−ヒドロキシ酪酸を得るために２段階以上の工程が必要になる、（２）生産される３−ヒドロキシ酪酸は原料となるポリヒドロキシアルカノエートの量に制限される、（３）３−ヒドロキシ酪酸とポリヒドロキシアルカノエートを同時に生産することは困難である、という課題があった。そこで本発明は、簡便かつ効率的で生産性の高い３−ヒドロキシ酪酸の製造方法を提供すること、さらに、３−ヒドロキシ酪酸とともに、ポリヒドロキシアルカノエートも同時に製造し得る方法を提供することを課題とする。 As described above, in the conventional method, (1) two or more steps are required to obtain 3-hydroxybutyric acid. (2) The amount of 3-hydroxybutyric acid produced is the amount of polyhydroxyalkanoate used as a raw material. There is a problem that (3) it is difficult to simultaneously produce 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate. Therefore, the present invention provides a simple, efficient and highly productive method for producing 3-hydroxybutyric acid, and further provides a method capable of simultaneously producing polyhydroxyalkanoate together with 3-hydroxybutyric acid. And
本発明者は、上記課題を解決すべく非常に多くの微生物を検索した結果、好気培養条件下で、菌体内にポリヒドロキシアルカノエートを蓄積するとともに、３−ヒドロキシ酪酸を菌体外に分泌するハロモナス属微生物が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of searching for an extremely large number of microorganisms to solve the above-mentioned problems, the present inventor accumulated polyhydroxyalkanoate in the cells and secreted 3-hydroxybutyric acid outside the cells under aerobic culture conditions. As a result, the present invention has been completed.
すなわち本発明は、ハロモナス・コーリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、ハロモナス・サリフォディナエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｆｏｄｉｎａｅ）、ハロモナス・ハロフィラ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ハロモナス・パシフィカ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｐａｃｉｆｉｃａ）及びハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＯＩＴＣ１２６１株よりなる群から選ばれるハロモナス属に属する微生物を栄養培地中で好気的に培養して得られる培養液から３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収することを特徴とする３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法である。 That is, the present invention relates to Halomonas korenosis, Halomonas salifodiae, Halomonas halophila (Halomonas halospia) and Halomonas halospia (Halomonas halosp. Production of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof, comprising recovering 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof from a culture solution obtained by aerobically culturing a microorganism belonging to the genus Halomonas selected from the group in a nutrient medium Is the method.
また本発明は、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＯＩＴＣ１２６１株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２０２７）である。 Moreover, this invention is a Halomonas sp (Halomonas sp.) OITC1261 strain | stump | stock (NITE P-02027).
本発明方法に用いるハロモナス属に属する微生物は、好気培養することにより、菌体内にポリヒドロキシアルカノエートを蓄積するとともに、菌体外へ３−ヒドロキシ酪酸を産生する。このため、ポリヒドロキシアルカノエートの生産量が定常状態に達した後であっても、好気培養を継続することで３−ヒドロキシ酪酸の生産量を増加させることができる。またポリヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシ酪酸に変換するための処理が不要であり、培養液から３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収するだけで３−ヒドロキシ酪酸を得ることが可能である。さらに、３−ヒドロキシ酪酸の産生にあたってポリヒドロキシアルカノエートは消費されないため、両者の同時生産が可能となる。そして、培養後の微生物を培養液から回収して繰り返し３−ヒドロキシ酪酸の産生に利用できるため、微生物増殖の工程が省略でき、大幅な生産コストの低減と生産時間の短縮を実現し得る。 The microorganism belonging to the genus Halomonas used in the method of the present invention accumulates polyhydroxyalkanoate in the microbial cells by aerobic culture and produces 3-hydroxybutyric acid outside the microbial cells. For this reason, even after the production amount of polyhydroxyalkanoate reaches a steady state, the production amount of 3-hydroxybutyric acid can be increased by continuing the aerobic culture. Moreover, the process for converting polyhydroxyalkanoate into 3-hydroxybutyric acid is unnecessary, and it is possible to obtain 3-hydroxybutyric acid only by recovering 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof from the culture solution. Furthermore, since polyhydroxyalkanoate is not consumed in the production of 3-hydroxybutyric acid, both can be produced simultaneously. And since the microorganisms after culture | cultivation can be collect | recovered from a culture solution and can be repeatedly used for production of 3-hydroxybutyric acid, the process of microbial growth can be omitted, and the reduction of production cost and the shortening of production time can be realized.
本発明では、ハロモナス・コーリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、ハロモナス・サリフォディナエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｆｏｄｉｎａｅ）、ハロモナス・ハロフィラ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ハロモナス・パシフィカ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｐａｃｉｆｉｃａ）及びハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＯＩＴＣ１２６１株よりなる群から選ばれるハロモナス属に属する微生物（以下、「ハロモナス属微生物」ということがある）を用いる。 In the present invention, Halomonas korenosis, Halomonas salifodinae, Halomonas halophya (Halomonas halophya), Halomonas halophya (Halomonas halopiae). A microorganism belonging to the genus Halomonas selected from the following (hereinafter also referred to as “halomonas microorganism”) is used.
上記ハロモナス属微生物のうち、ハロモナス・コーリエンシス、ハロモナス・サリフォディナエ、ハロモナス・ハロフィラ、ハロモナス・パシフィカは、これらの種に属する菌株であれば特に制限なく使用することができるが、例えば、基準株であるハロモナス・コーリエンシス ＪＣＭ １２２３７株、ハロモナス・サリフォディナエ ＪＣＭ １４８０３株、ハロモナス・ハロフィラ ＪＣＭ ２０７９１株、ハロモナス・パシフィカ ＪＣＭ ２０６３３株などが３−ヒドロキシ酪酸又はその塩及びポリヒドロキシアルカノエートの生産性に優れるため好適である。 Among the above-mentioned microorganisms of the genus Halomonas, Halomonas coriensis, Halomonas salifodinae, Halomonas halophylla, Halomonas pacifica can be used without particular limitation as long as they belong to these species. Halomonas choriensis JCM 12237 strain, Halomonas salifodinae JCM 14803 strain, Halomonas halophylla JCM 20791 strain, Halomonas pacifica JCM 20633 strain, etc. are preferable because of their excellent productivity of 3-hydroxybutyric acid or its salt and polyhydroxyalkanoate. is there.
またハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩及びポリヒドロキシアルカノエート産生能が特に高いため本発明において好適に用いられる。 Halomonas sp. OITC1261 strain is suitably used in the present invention because it has particularly high ability to produce 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof and polyhydroxyalkanoate.
このハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は海岸堆積物から分離した微生物である。その１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を配列表の配列番号１に示す。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列について、既知の菌種との相同性検索を行ったところ、ハロモナス・サリフォディナエやハロモナス・パシフィカと比較的相同性が高いことから、ハロモナス属微生物に分類された。ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は、平成２７年３月１９日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０２７として寄託されている。 This Halomonas sp. OITC1261 strain is a microorganism isolated from coastal sediment. The 16S rRNA gene sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The 16S rRNA gene sequence was subjected to a homology search with known bacterial species. As a result, it was classified as a genus microorganism of the genus Halomonas due to its relatively high homology with Halomonas salifodinae and Halomonas pacifica. Halomonas sp. OITC1261 strain was registered with NITE P-02027 on March 19, 2015 at the National Institute of Technology and Evaluation of Microorganisms (2-5-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture). Has been deposited.
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株の菌学的性質は以下のとおりである。
（１） コロニー：クリーム色
（２） 運動性：有
（３） グルコース資化性：有
（４） スクロース資化性：有
（５） キシロース資化性：無
（６） マルトース資化性：有
（７） グルコン酸資化性：有
（８） グリセリン資化性：有
（９） エタノール資化性：有
（１０） 乳酸資化性：有
（１１） クエン酸資化性：有
（１２） 酢酸資化性：有
（１３） 酪酸資化性：有
（１４） 澱粉加水分解物資化性：有
（１５） 硝酸ナトリウムのみを窒素源とする培地での生育：可能
（１６） 尿素のみを窒素源とする培地での生育：可能
（１７） 生育可能な塩化ナトリウム濃度：０．５〜１５％（ｗ／ｖ）
（１８） 生育可能なｐＨ範囲：６〜１０
The bacteriological properties of Halomonas sp. OITC1261 strain are as follows.
(1) Colony: Cream color (2) Motility: Yes (3) Glucose utilization: Yes (4) Sucrose utilization: Yes (5) Xylose utilization: No (6) Maltose utilization: Yes (7) Gluconic acid assimilation: Yes (8) Glycerin assimilation: Yes (9) Ethanol assimilation: Yes (10) Lactic acid assimilation: Yes (11) Citric acid assimilation: Yes (12) Acetic acid assimilation: Yes (13) Butyric acid assimilation: Yes (14) Starch hydrolyzate assimilation: Yes (15) Growth in medium using only sodium nitrate as a nitrogen source: Possible (16) Urea only as nitrogen Growth in medium as source: Possible (17) Concentrated sodium chloride concentration capable of growth: 0.5 to 15% (w / v)
(18) pH range in which growth is possible: 6 to 10
本発明の微生物には、配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上で含み、下記菌学的性質を示すハロモナス属に属する微生物も包含される。
（１） コロニー：クリーム色
（２） エタノール資化性：有
（３） 酪酸資化性：有
（４） 尿素を窒素源とする培地での生育：可能
（５） 生育可能な塩化ナトリウム濃度：０．５〜１５％（ｗ／ｖ）
（６） 生育可能なｐＨ範囲：６〜１０
The microorganism of the present invention contains a 16S rRNA gene base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing with a homology of 97% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and exhibiting the following mycological properties: Also included are microorganisms belonging to the genus.
(1) Colony: Cream color (2) Ethanol assimilation: Existence (3) Butyric acid assimilation: Existence (4) Growth in medium using urea as nitrogen source: Possible (5) Concentration of viable sodium chloride: 0.5-15% (w / v)
(6) pH range in which growth is possible: 6 to 10
上記ハロモナス属微生物を培養する栄養培地は特に限定されるものではないが、有機炭素源を含有するものが好ましく、さらに無機塩類及び窒素源を含有するものが好ましい。 The nutrient medium for culturing the above genus Halomonas microorganisms is not particularly limited, but preferably contains an organic carbon source, and more preferably contains an inorganic salt and a nitrogen source.
有機炭素源としては、グルコース、スクロース、マルトース、グルコン酸、グリセリン、エタノール、乳酸、クエン酸、酢酸、酪酸、リンゴ酸、コハク酸、α−ケトグルタル酸、ギ酸、ピルビン酸、糖蜜、サトウキビ搾汁液、テンサイ搾汁液、水飴、焼酎蒸留残液等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を用いることができる。これらのうち、グルコース、スクロース、グリセリン等が３−ヒドロキシ酪酸又はその塩及びポリヒドロキシアルカノエートの生産量の点で好適である。さらに、これらの有機炭素源を含有する安価な材料として、糖蜜やサトウキビ、テンサイなどの砂糖作物の搾汁液、水飴等の澱粉加水分解物、泡盛蒸留残液、米焼酎蒸留残液、麦焼酎残液、芋焼酎残液、黒糖焼酎残液等の焼酎蒸留残液等が挙げられ、好適に用いられる。糖蜜や焼酎蒸留残液等は後述する窒素源を含有する点でも好ましい。有機炭素源の栄養培地中の濃度は、合計で通常５〜４５ｗ／ｖ％、好ましくは１０〜４０ｗ／ｖ％、より好ましくは１５〜３５ｗ／ｖ％である。有機炭素源は、栄養培地中に予め全量を添加してもよく、一部のみ予め添加し、残部は培養中に追加供給してもよい。 Organic carbon sources include glucose, sucrose, maltose, gluconic acid, glycerin, ethanol, lactic acid, citric acid, acetic acid, butyric acid, malic acid, succinic acid, α-ketoglutaric acid, formic acid, pyruvic acid, molasses, sugarcane juice, Examples include sugar beet juice, starch syrup, shochu distillation residue, and the like. One or more of these can be used. Among these, glucose, sucrose, glycerin and the like are preferable in terms of the production amount of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof and polyhydroxyalkanoate. In addition, inexpensive materials containing these organic carbon sources include sugar juices such as molasses, sugarcane and sugar beet, starch hydrolysates such as starch syrup, awamori distillation residue, rice shochu distillation residue, and barley shochu residue. Liquid, shochu-distilled liquid, shochu-distilled liquid such as brown sugar shochu-residue, and the like are preferably used. Molasses, shochu distillation residue and the like are also preferable in that they contain a nitrogen source described later. The concentration of the organic carbon source in the nutrient medium is generally 5 to 45 w / v%, preferably 10 to 40 w / v%, more preferably 15 to 35 w / v% in total. The whole amount of the organic carbon source may be added to the nutrient medium in advance, or only a part thereof may be added in advance, and the remainder may be additionally supplied during the culture.
無機塩類としては、特に限定されるものではないが、例えば、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、銅等の金属塩、硫酸塩等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を用いることができる。これらのうち好ましい具体例として、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＦｅＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｕＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４等を例示でき、特にＮａＣｌ等が微生物の生育に望ましいナトリウム源としても優れているため好適である。無機塩類の栄養培地中の濃度は、合計で通常２〜８ｗ／ｖ％、好ましくは４〜６ｗ／ｖ％である。 Examples of inorganic salts include, but are not limited to, metal salts such as sodium, magnesium, potassium, calcium, iron, manganese, cobalt, zinc, and copper, and sulfates. Two or more kinds can be used. Among these, preferable specific examples include NaCl, NaHCO 3, Na 2 CO 3 , K 2 SO 4 , MgSO 4 , CaCl 2 , FeSO 4 , MnSO 4 , ZnSO 4 , CuSO 4 , Na 2 MoO 4, and the like. In particular, NaCl is preferable because it is excellent as a desirable sodium source for the growth of microorganisms. The total concentration of inorganic salts in the nutrient medium is usually 2 to 8 w / v%, preferably 4 to 6 w / v%.
窒素源としては、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、有機態窒素等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を添加することができる。好適な具体例としては、ＮａＮＯ３、ＮａＮＯ２、ＮＨ４Ｃｌ、尿素、Ｃｏ（ＮＯ３）２等を例示することができ、これらのうち、ＮａＮＯ３や尿素等が微生物の生育を阻害することなく３−ヒドロキシ酪酸又はその塩及びポリヒドロキシアルカノエートの生産量を増大させられるため特に好ましく用いられる。窒素源の栄養培地中の濃度は、合計で通常０．１〜５ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜５ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜３ｗ／ｖ％である。 Nitrogen sources include nitrates, nitrites, ammonium salts, organic nitrogen, and the like, and one or more of these can be added. Preferable specific examples include NaNO 3 , NaNO 2 , NH 4 Cl, urea, Co (NO 3 ) 2 and the like. Among these, NaNO 3 , urea and the like inhibit the growth of microorganisms. It is particularly preferably used because the production amount of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof and polyhydroxyalkanoate can be increased. The concentration of the nitrogen source in the nutrient medium is generally 0.1 to 5 w / v%, preferably 0.5 to 5 w / v%, more preferably 1 to 3 w / v% in total.
栄養培地には、さらにリン源を添加することが好ましい。リン源としては、リン酸塩、重合リン酸、有機態リン等が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を添加することができる。好適な具体例としては、Ｋ３ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｍｇ３（ＰＯ４）２、ＭｇＨＰＯ４、Ｃａ３（ＰＯ４）２、ＣａＨＰＯ４、Ｈ４Ｐ２Ｏ７、Ｈ５Ｐ３Ｏ１０、ＡＴＰ、ＡＤＰ、レシチン、ホスファチジルグリセロール等を例示することができ、これらのうち、Ｋ２ＨＰＯ４やＮａ２ＨＰＯ４等は微生物の生育に望ましいｐＨ調整剤としても優れているため好適である。リン源の栄養培地中の濃度は、合計で通常０．０１〜２ｗ／ｖ％、好ましくは０．１〜１ｗ／ｖ％、より好ましくは０．２〜１ｗ／ｖ％である。 It is preferable to further add a phosphorus source to the nutrient medium. Examples of the phosphorus source include phosphate, polymerized phosphoric acid, organic phosphorus, and the like, and one or more of these can be added. Preferable specific examples include K 3 PO 4 , K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , Na 3 PO 4 , Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , Mg 3 (PO 4 ) 2 , MgHPO 4 and Ca 3. (PO 4 ) 2 , CaHPO 4 , H 4 P 2 O 7 , H 5 P 3 O 10 , ATP, ADP, lecithin, phosphatidylglycerol and the like can be exemplified, and among these, K 2 HPO 4 and Na 2 HPO 4 and the like are preferable because they are excellent as a pH adjusting agent desirable for the growth of microorganisms. The concentration of the phosphorus source in the nutrient medium is generally 0.01 to 2 w / v%, preferably 0.1 to 1 w / v%, more preferably 0.2 to 1 w / v% in total.
栄養培地のｐＨは、通常５〜１０であり、８．５〜９．５が好ましい。ｐＨをアルカリ条件とすることによって雑菌汚染に基づく生産性の低下を防止して安定的な生産が可能となる。 The pH of the nutrient medium is usually 5 to 10, and preferably 8.5 to 9.5. By adjusting the pH to an alkaline condition, it is possible to prevent a decrease in productivity due to contamination with various bacteria and to perform stable production.
このような栄養培地中で、上記ハロモナス属微生物を好気培養する。本明細書において、好気培養（好気条件）とは、酸素存在下にて培養することであり、例えば、栄養培地中の溶存酸素濃度が、２ｍｇ／Ｌ（ｍｇ−Ｏ／Ｌ）以上、好ましくは４ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ以上である。具体的には、酸素を含む気体と培地表面が接触する環境で撹拌しながら培養すればよく、例えば、空気と培地表面が接触した状態で、通常１００〜１，０００ｒｐｍ、好ましくは２００〜９００ｒｐｍ、より好ましくは５００〜８００ｒｐｍの撹拌速度にて撹拌すればよい。 The above-mentioned genus Halomonas is aerobically cultured in such a nutrient medium. In the present specification, aerobic culture (aerobic conditions) means culturing in the presence of oxygen, for example, the dissolved oxygen concentration in the nutrient medium is 2 mg / L (mg-O / L) or more, Preferably it is 4 mg / L or more, more preferably 6 mg / L or more. Specifically, the culture may be performed while stirring in an environment where the oxygen-containing gas and the surface of the medium are in contact with each other. For example, in a state where the air and the surface of the medium are in contact with each other, usually 100 to 1,000 rpm, preferably 200 to 900 rpm, More preferably, stirring may be performed at a stirring speed of 500 to 800 rpm.
ハロモナス属微生物を培養するにあたっては、上記栄養培地にハロモナス属微生物を接種し、温度３０〜３７℃で１８〜２４時間程度好気条件で前培養した後、前培養して得られた菌体を、上記栄養培地中に２０〜５０倍程度に希釈して好気条件で本培養すればよい。本培養は通常３０〜３７℃程度、好ましくは３３〜３７℃であり、時間は通常２０〜１００時間、好ましくは６０〜７０時間である。上記有機炭素源を追加供給する場合は、例えば、有機炭素源の全添加量のうち、１０〜５０質量％を予め栄養培地中に添加し、培養１５〜２４時間後に２５〜４５質量％を添加し、培養３０〜５０時間後に２５〜４５質量％を添加すると、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産量が増加するため好ましい。 In culturing a genus Halomonas, the above-mentioned nutrient medium is inoculated with the microorganism of the genus Halomonas, pre-cultured at a temperature of 30 to 37 ° C. for about 18 to 24 hours under aerobic conditions, and then the cells obtained by pre-culture are used. The main culture may be carried out under aerobic conditions after being diluted 20 to 50 times in the nutrient medium. The main culture is usually about 30 to 37 ° C, preferably 33 to 37 ° C, and the time is usually 20 to 100 hours, preferably 60 to 70 hours. In the case of additionally supplying the organic carbon source, for example, 10 to 50% by mass of the total amount of the organic carbon source added is previously added to the nutrient medium, and 25 to 45% by mass is added after 15 to 24 hours of culture. In addition, it is preferable to add 25 to 45 mass% after 30 to 50 hours of culturing because the production amount of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof increases.
培養方法は特に限定されず、回分培養、流加培養、連続培養等のいずれの培養方法も採用し得るが、高濃度の基質による生育阻害を回避し、かつ収率を向上できる点で流加培養が好適である。 The culture method is not particularly limited, and any culture method such as batch culture, fed-batch culture, or continuous culture can be adopted, but fed-batch is avoided in that it prevents growth inhibition due to a high concentration of substrate and improves the yield. Culture is preferred.
以上のようにして培養することにより、ハロモナス属微生物は菌体外に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を分泌する。培養液に分泌された３−ヒドロキシ酪酸は、培養液中に存在するナトリウムイオンなどの陽イオンと反応し、３−ヒドロキシ酪酸の塩を形成するため、培養後の培養液には、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれる。 By culturing as described above, the microorganisms of the genus Halomonas secrete 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof outside the cells. Since 3-hydroxybutyric acid secreted into the culture solution reacts with a cation such as sodium ion present in the culture solution to form a salt of 3-hydroxybutyric acid, the culture solution after culture contains 3-hydroxybutyric acid. Butyric acid or its salts are included.
この培養液から３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する。回収にあたっては、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む培養液と、ハロモナス属微生物とを公知の固液分離手段を用いて分離すればよい。固液分離手段としては、例えば、遠心分離、ろ過、膜分離等が例示される。固液分離処理後の培養液を、必要に応じて公知の分離精製手段を用いて処理することにより、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を得ることができる。 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof is recovered from this culture solution. In the recovery, a culture solution containing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof and a microorganism of the genus Halomonas may be separated using a known solid-liquid separation means. Examples of the solid-liquid separation means include centrifugation, filtration, membrane separation, and the like. 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof can be obtained by treating the culture solution after the solid-liquid separation treatment, if necessary, using a known separation and purification means.
本発明方法では、栄養培地１Ｌに対して通常０．１ｇ以上、好ましくは２０ｇ以上、より好ましくは３５ｇ以上の量の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を得ることができる。 In the method of the present invention, 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof can be obtained in an amount of usually 0.1 g or more, preferably 20 g or more, more preferably 35 g or more with respect to 1 L of the nutrient medium.
一方、分離したハロモナス属微生物は、その菌体内にポリヒドロキシアルカノエートを蓄積している。このため、菌体を破砕してトリクロロエチレンで抽出するなど公知の方法により、菌体内からポリヒドロキシアルカノエートを回収することができる。必要に応じて公知の分離精製手段を用いて処理してもよい。 On the other hand, the isolated genus Halomonas microorganisms accumulate polyhydroxyalkanoate in the cells. For this reason, polyhydroxyalkanoate can be collect | recovered from a microbial cell by well-known methods, such as crushing a microbial cell and extracting with trichloroethylene. You may process using a well-known separation refinement means as needed.
ポリヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸等のヒドロキシアルカノエート単位から構成されるポリマーであり、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸等が含まれる。本発明方法において、栄養培地１Ｌに対して通常１ｇ以上、好ましくは１５ｇ以上、より好ましくは２０ｇ以上のポリヒドロキシアルカノエートを得ることができる。 The polyhydroxyalkanoate is a polymer composed of hydroxyalkanoate units such as 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvaleric acid, and includes polyhydroxybutyric acid, polyhydroxyvaleric acid and the like. In the method of the present invention, 1 g or more, preferably 15 g or more, more preferably 20 g or more of polyhydroxyalkanoate can be obtained with respect to 1 L of the nutrient medium.
本発明方法においては、培養後の培養液から分離したハロモナス属微生物を再度３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産に使用することもできる。分離したハロモナス属微生物を培地に添加して好気培養することにより、菌体内にポリヒドロキシアルカノエートを蓄積するとともに、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を培地中に分泌する。培養を繰り返しても、その生産量は低下しない。このように、ハロモナス属微生物の好気培養にあたって、培養液から分離回収した菌体を繰り返し利用することで、ハロモナス属微生物の前培養が不要となり、工程の簡略化、生産時間の短縮及び生産コストの低減が可能となる。 In the method of the present invention, the genus Halomonas microorganisms separated from the culture solution after culturing can be used again for the production of 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof. By adding the separated microorganism of the genus Halomonas to the medium and aerobic culture, polyhydroxyalkanoate is accumulated in the cells and 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof is secreted into the medium. Even if the culture is repeated, the production amount does not decrease. In this way, in the aerobic culture of Halomonas microorganisms, by repeatedly using the cells separated and recovered from the culture solution, preculture of Halomonas microorganisms becomes unnecessary, simplifying the process, shortening the production time, and the production cost Can be reduced.
ハロモナス属微生物を繰り返し培養する際の培地は特に限定されるものではないが、繰り返し培養しても３−ＨＢの生産量を維持できることから窒素および/またはリン制限培地が好適である。窒素および/またはリン制限培地としては、窒素源および/またはリン源を低濃度に調製した有機炭素含有培地を用いればよい。この場合の窒素源とリン源はそれぞれ通常０．０１〜０．５ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５〜０．１ｗ／ｖ％を培地へ添加することができる。また必要に応じ無機塩類を添加してもよい。有機炭素源、窒素源、リン源、無機塩類としては、上記栄養培地と同様のものを使用することができる。有機炭素源、無機塩類の培地中の含有量も、上記栄養培地と同様とすればよい。 The medium for repeatedly culturing Halomonas microorganisms is not particularly limited, but a nitrogen and / or phosphorus-restricted medium is preferable because 3-HB production can be maintained even after repeated cultivation. As the nitrogen and / or phosphorus-restricted medium, an organic carbon-containing medium in which a nitrogen source and / or a phosphorus source is prepared at a low concentration may be used. In this case, the nitrogen source and the phosphorus source are each usually added in an amount of 0.01 to 0.5 w / v%, preferably 0.05 to 0.1 w / v%. Moreover, you may add inorganic salts as needed. As the organic carbon source, nitrogen source, phosphorus source, and inorganic salts, the same nutrient media as those described above can be used. The contents of the organic carbon source and inorganic salts in the medium may be the same as those in the nutrient medium.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an example is given and the present invention is explained still in detail, the present invention is not limited to these.
実施例１
ハロモナス属微生物の３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエート生産性：
（１）ハロモナス属微生物基準株
ハロモナス属に含まれる多数の種の基準株について培養試験を行った。各基準株は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（茨城県つくば市高野台３−１−１）から分譲されたものを用いた。
（培養試験）
培養試験ではＭＢ培地を用いた。ＭＢ培地はマリンブロス培地（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ ２２１６、ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー製）に５ｗ／ｖ％グルコースを追加し、１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整して使用した。ろ過滅菌した後ＭＢ培地３ｍＬを試験管に分注し、ハロモナス属微生物を接種した後で、３０℃に保温しながら３日間好気培養（２００ｒｐｍで振とう）した。
培養後、３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）は、培養液の上清を高速液体クロマトグラフィーで分析して定量した。菌体重量は、培養液２ｍＬから集菌した菌体を１２０℃で３時間乾燥して測定した。ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）は、培養液２ｍＬから集菌した菌体を硫酸加水分解することによって得られるクロトン酸の量から逆算して求めた。結果を表１に示す。
Example 1
Productivity of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate of Halomonas microorganisms:
(1) Halomonas genus microbial strains Culture tests were conducted on a number of species of microbial strains contained in the genus Halomonas. Each reference stock used was distributed from RIKEN BioResource Center (3-1-1 Takanodai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture).
(Culture test)
In the culture test, MB medium was used. The MB medium was used by adding 5 w / v% glucose to marine broth medium (Marine Broth 2216, manufactured by Becton Dickinson & Company), adjusting the pH to 9 with 10N sodium hydroxide. After sterilizing by filtration, 3 mL of MB medium was dispensed into a test tube and inoculated with a microorganism of the genus Halomonas, followed by aerobic culture (shaking at 200 rpm) for 3 days while keeping the temperature at 30 ° C.
After the culture, 3-hydroxybutyric acid (3-HB) was quantified by analyzing the supernatant of the culture with high performance liquid chromatography. The cell weight was measured by drying the cells collected from 2 mL of the culture solution at 120 ° C. for 3 hours. Polyhydroxybutyric acid (PHB) was determined by calculating back from the amount of crotonic acid obtained by sulfuric acid hydrolysis of the cells collected from 2 mL of the culture solution. The results are shown in Table 1.
表１に示すとおり、ハロモナス・コーリエンシス、ハロモナス・ハロフィラ、ハロモナス・サリフォディナエ、ハロモナス・パシフィカの４種は、好気培養でポリヒドロキシ酪酸を菌体内に蓄積するとともに、３−ヒドロキシ酪酸を菌体外へ放出することが確認された。 As shown in Table 1, four species of Halomonas choriensis, Halomonas halophylla, Halomonas salifodnae, and Halomonas pacifica accumulate polyhydroxybutyric acid in the cells by aerobic culture, and 3-hydroxybutyric acid outside the cells. Was confirmed to be released.
ハロモナス属微生物の中には、好気培養によりポリヒドロキシ酪酸を合成し、菌体内に蓄積するものが存在するが、蓄積したポリヒドロキシ酪酸を、その構成成分である３−ヒドロキシ酪酸に分解して菌体外へ放出させるためには、好気条件から微好気条件ないし嫌気条件に変更する必要があるとされており（特許文献４参照）、これまで好気条件下で３−ヒドロキシ酪酸を菌体外へ分泌するハロモナス属微生物の存在は知られていなかった。そして、従来の方法では、３−ヒドロキシ酪酸は、菌体内に蓄積したポリヒドロキシ酪酸を分解して得られることから、実質的に両者を同時に生産することは困難であり、またその生産量は、菌体内に蓄積され得るポリヒドロキシ酪酸の量に制限される。これに対し、上記４種のハロモナス属微生物は、好気培養することにより、菌体内にポリヒドロキシ酪酸を蓄積するとともに、菌体外へ３−ヒドロキシ酪酸を分泌するため、両者の同時生産が可能であり、ポリヒドロキシ酪酸の生産量が定常状態に達した後であっても、その量に制限されることなく、好気培養を継続することで３−ヒドロキシ酪酸を高収量で得ることができる。 Some microorganisms of the genus Halomonas synthesize polyhydroxybutyric acid by aerobic culture and accumulate in the cells, but the accumulated polyhydroxybutyric acid is decomposed into its constituent component, 3-hydroxybutyric acid. In order to release the cells outside the cells, it is necessary to change from aerobic conditions to slightly aerobic conditions or anaerobic conditions (see Patent Document 4). The existence of Halomonas microorganisms secreted outside the cell body has not been known. And in the conventional method, since 3-hydroxybutyric acid is obtained by decomposing polyhydroxybutyric acid accumulated in the cells, it is difficult to produce both at the same time. The amount of polyhydroxybutyric acid that can be accumulated in the microbial cells is limited. On the other hand, the above four kinds of genus Halomonas microorganisms accumulate a polyhydroxybutyric acid inside the cell body and secrete 3-hydroxybutyric acid outside the cell body by aerobic culture, so that both can be produced simultaneously. Even after the production amount of polyhydroxybutyric acid reaches a steady state, it is possible to obtain 3-hydroxybutyric acid in a high yield by continuing aerobic culture without being limited to that amount. .
（２）ハロモナス・エスピー（ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＯＩＴＣ１２６１株
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は海岸堆積物から分離した。その１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列（配列表の配列番号１）について、既知の菌種との相同性検索を行ったところ、ハロモナス・サリフォディナエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｆｏｄｉｎａｅ）やハロモナス・パシフィカ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｐａｃｉｆｉｃａ）と相同性が高いことから、ハロモナス属微生物に分類された。ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は、平成２７年３月１９日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０２７として寄託されている。
(2) Halomonas sp. OITC1261 strain The Halomonas sp. OITC1261 strain was isolated from coastal sediment. The 16S rRNA gene sequence (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) was subjected to a homology search with a known bacterial species. It was classified as a microorganism of the genus Halomonas. Halomonas sp. OITC1261 strain was registered with NITE P-02027 on March 19, 2015 at the National Institute of Technology and Evaluation of Microorganisms (2-5-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture). Has been deposited.
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株について、培地をＭＢ培地からＳＯＴ改変培地又は糖蜜培地に代えた以外は上記（１）と同様にして培養試験を行い、培養中の３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢ）、菌体重量及びポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を分析した。ＳＯＴ改変培地はスピルリナ生育培地（Ogawa, T., Terui, G. 1970 Studies on the growth of Spirulina platensis. (I) On the pure culture of Spirulina platensis. J. Ferment. Technol., 48, 361-367.）を改変したものである。基本培地の組成を表２に示す。このＳＯＴ改変基本培地に５ｗ／ｖ％グルコースを追加して使用した。また糖蜜培地の組成を表３に示す。ＳＯＴ改変培地と糖蜜培地はろ過滅菌した後、それぞれ３ｍＬを試験管に分注して使用した。分注した培地にハロモナス属微生物を接種した後で、３０℃に保温しながら３日間好気培養（２００ｒｐｍで振とう）した。結果を表４に示す。 Halomonas sp. OITC1261 strain was subjected to a culture test in the same manner as in (1) above except that the medium was changed from MB medium to SOT modified medium or molasses medium, and 3-hydroxybutyric acid (3-HB), Body weight and polyhydroxybutyric acid (PHB) were analyzed. SOT-modified medium (Ogawa, T., Terui, G. 1970 Studies on the growth of Spirulina platensis. (I) On the pure culture of Spirulina platensis. J. Ferment. Technol., 48, 361-367. ) Is modified. The composition of the basic medium is shown in Table 2. This SOT-modified basal medium was supplemented with 5 w / v% glucose. The composition of the molasses medium is shown in Table 3. The SOT modified medium and molasses medium were sterilized by filtration, and 3 mL each was dispensed into a test tube. After inoculating the dispensed medium with a microorganism of the genus Halomonas, it was subjected to aerobic culture (shaking at 200 rpm) for 3 days while keeping the temperature at 30 ° C. The results are shown in Table 4.
表４に示すとおり、ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は、３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシ酪酸の生産量が非常に高く、他のハロモナス属微生物と比べて４倍以上の３−ヒドロキシ酪酸を菌体外へ産生すると同時に、菌体重量あたり４０質量％のポリヒドロキシ酪酸を菌体内に蓄積した。糖蜜培地ではＳＯＴ改培地と比べさらに３−ヒドロキシ酪酸の生産量が向上し、菌体重量も著しく増加した。 As shown in Table 4, Halomonas sp. OITC1261 strain has a very high production amount of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxybutyric acid, and more than 4-fold more 3-hydroxybutyric acid than other genus Halomonas microorganisms. Simultaneously with the production, 40% by mass of polyhydroxybutyric acid per cell weight was accumulated in the cells. In the molasses medium, the production amount of 3-hydroxybutyric acid was further improved and the cell weight was significantly increased as compared with the modified SOT medium.
実施例２
ハロモナス属微生物の菌学的性質：
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株、ハロモナス・サリフォディナエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｆｏｄｉｎａｅ）及びハロモナス・パシフィカ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｐａｃｉｆｉｃａ）について、以下の方法により、コロニーの特徴や運動性、利用可能な基質、生育可能な塩化ナトリウム濃度の範囲、生育可能なｐＨの範囲を調べ比較した。結果を表５に示す。
（１）コロニーの特徴は、マリンアガー培地（Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６、ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー製）を１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整した寒天培地上に菌を接種して３０℃で５日間静置培養し、生育したコロニーの色を観察した。
（２）運動性の有無は、マリンブロス培地（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ ２２１６、ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー製）に寒天０．２ｗ／ｖ％とグルコース１％を加えて、１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整した半流動培地に菌を接種して３０℃で７日間静置培養して判定した。
（３）利用可能な炭素源の判定は、表２のＳＯＴ改変培地にいずれかの基質（グルコース、スクロース、キシロース、マルトース、グルコン酸、グリセリン、エタノール、乳酸、クエン酸、酢酸、酪酸、水飴）を３ｗ／ｖ％加えてｐＨ９に調整した培地各３ｍＬに菌を接種し、３０℃で３日間好気培養（２００ｒｐｍで振とう）した後、培養液の濁りの有無で生育を確認し、生育が確認できたものは利用可能とした。
（４）利用可能な窒素源の判定は、硝酸ナトリウム培地（ＳＯＴ改変培地に３ｗ／ｖ％グルコースを加えた培地）又は尿素培地（ＳＯＴ改変培地の硝酸ナトリウムを尿素に代えて、３ｗ／ｖ％グルコースを加えた培地）の各３ｍＬに菌を接種し、３０℃で３日間好気培養した後、培養液の濁りの有無で生育を確認し、生育が確認できたものは利用可能とした。
（５）生育可能な塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度範囲については、０〜２０ｗ／ｖ％のＮａＣｌを含む培地中での菌の生育の有無を判定した。すなわち、１０Ｎ水酸化カリウムでｐＨ８に調整した基本培地（０．４ｗ／ｖ％酵母抽出物、０．５ｗ／ｖ％硫酸マグネシウム、５ｗ／ｖ％スクロース）にＮａＣｌを加えて、７段階のＮａＣｌ濃度（０、０．５、１、５、１０、１５、２０ｗ／ｖ％）にした培地４ｍＬに菌を接種し、３０℃で３日間好気培養した後、培養液の濁りの有無で生育を判定した。
（６）生育可能なｐＨ範囲については、ｐＨ５〜１０に調整した培地中での菌の生育の有無を判定した。すなわち、２Ｌの基本培地（０．４ｗ／ｖ％酵母抽出物、０．５ｗ／ｖ％硫酸マグネシウム、１ｗ／ｖ％塩化ナトリウム、３ｗ／ｖ％スクロース）を６段階のｐＨ（ｐＨ５、６、７、８、９、１０）に調整したものに菌を接種し、卓上型培養装置（ジャーファーメンター）で培養条件を一定（温度：３０℃、攪拌速度：７００ｒｐｍ、通気量：５Ｌ／分、１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液と１Ｎ塩酸溶液でｐＨを自動調整）に保ちながら３日間好気培養し、培養液の濁りの有無で生育を判定した。
Example 2
Mycological properties of Halomonas microorganisms:
About Halomonas sp. OITC1261 strain, Halomonas salifodinae and Halomonas pacifica, colony characteristics, motility, usable substrate, range of viable sodium chloride concentration, growth by the following methods The range of possible pH was examined and compared. The results are shown in Table 5.
(1) The colony is characterized by inoculating a marine agar medium (Marine Agar 2216, manufactured by Becton Dickinson & Company) on an agar medium adjusted to pH 9 with 10N sodium hydroxide and incubating at 30 ° C. for 5 days. The color of the grown colonies was observed.
(2) The presence or absence of motility was adjusted to pH 9 with 10N sodium hydroxide by adding 0.2 w / v% agar and 1% glucose to marine broth medium (Marine Broth 2216, manufactured by Becton Dickinson & Company). Bacteria were inoculated into a semi-fluid medium, and determined by static culture at 30 ° C. for 7 days.
(3) The available carbon source is determined by any substrate (glucose, sucrose, xylose, maltose, gluconic acid, glycerin, ethanol, lactic acid, citric acid, acetic acid, butyric acid, varicella) in the SOT modified medium shown in Table 2. 3 w / v% of each medium adjusted to pH 9 was inoculated with bacteria, and after 3 days aerobic culture (shaking at 200 rpm) at 30 ° C., the growth was confirmed by the presence or absence of turbidity in the culture solution. Those that could be confirmed were made available.
(4) The determination of the nitrogen source that can be used is sodium nitrate medium (medium in which 3 w / v% glucose is added to SOT-modified medium) or urea medium (sodium nitrate in SOT-modified medium is replaced with urea, and 3 w / v% After inoculating bacteria in 3 mL of each of the medium to which glucose was added and aerobic culture at 30 ° C. for 3 days, the growth was confirmed by the presence or absence of turbidity in the culture solution.
(5) About the viable sodium chloride (NaCl) concentration range, the presence or absence of bacterial growth in a medium containing 0 to 20 w / v% NaCl was determined. That is, NaCl is added to a basic medium (0.4 w / v% yeast extract, 0.5 w / v% magnesium sulfate, 5 w / v% sucrose) adjusted to
(6) About the pH range which can be grown, the presence or absence of the growth of the microbe in the culture medium adjusted to pH 5-10 was determined. That is, 2 L of basic medium (0.4 w / v% yeast extract, 0.5 w / v% magnesium sulfate, 1 w / v% sodium chloride, 3 w / v% sucrose) was added to 6 stages of pH (
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株と、ハロモナス・サリフォディナエ又はハロモナス・パシフィカとは、コロニーの色、エタノール資化性、酪酸資化性、尿素培地での生育、生育可能なＮａＣｌ濃度範囲及びｐＨ範囲において特徴が異なることが分かった。 Halomonas sp. OITC1261 strain and Halomonas sarifodinae or Halomonas pacifica have different characteristics in colony color, ethanol utilization, butyric acid utilization, growth in urea medium, viable NaCl concentration range and pH range. I understood that.
実施例３
好気培養条件による３−ＨＢ及びＰＨＢ生産量に対する影響：
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株を用い、３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの発酵生産における好気培養条件の影響を確認した。
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は、ＳＯＴ改変培地（１％グルコース含有）を用いて、３５℃で一晩、前培養した。この前培養液０．２ｍＬをＳＯＴ改変培地２０ｍＬへ加えて３３℃で本培養した。本培養では、好気条件について、２００ｒｐｍ（振とう）、３００ｒｐｍ（スターラー撹拌）及び４５０ｒｐｍ（スターラー撹拌）の３段階で比較した。培地中の有機炭素源にはグルコースを用いた。初発グルコースを１０ｗ／ｖ％とし、２４時間後と４８時間後にそれぞれ終濃度１０ｗ／ｖ％分のグルコースを追加した。培養途中で採取した培養液１ｍＬを用いて、実施例１と同様にして、菌体重量、３−ヒドロキシ酪酸濃度及びポリヒドロキシ酪酸濃度を測定した。また、分光光度計（日本分光株式会社製、型式Ｖ−５５０）を用いて吸光度（６００ｎｍ）を測定した。結果を図１〜４に示す。
Example 3
Effects of aerobic culture conditions on 3-HB and PHB production:
The effect of aerobic culture conditions on the fermentation production of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate was confirmed using Halomonas sp.
Halomonas sp. OITC1261 strain was pre-cultured overnight at 35 ° C. using SOT-modified medium (containing 1% glucose). 0.2 mL of this preculture solution was added to 20 mL of SOT modified medium, and main culture was performed at 33 ° C. In the main culture, aerobic conditions were compared in three stages of 200 rpm (shaking), 300 rpm (stirrer stirring) and 450 rpm (stirrer stirring). Glucose was used as the organic carbon source in the medium. The initial glucose was 10 w / v%, and glucose was added at a final concentration of 10 w / v% after 24 hours and 48 hours, respectively. Using 1 mL of the culture solution collected during the culture, the cell weight, 3-hydroxybutyric acid concentration, and polyhydroxybutyric acid concentration were measured in the same manner as in Example 1. Further, the absorbance (600 nm) was measured using a spectrophotometer (manufactured by JASCO Corporation, model V-550). The results are shown in FIGS.
撹拌速度２００ｒｐｍと３００ｒｐｍ、４５０ｒｐｍで比較したところ、撹拌速度を上げてより好気的にした方が３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの生産性が高くなった。４５０ｒｐｍで好気培養したとき２７ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸と１７ｇ／Ｌのポリヒドロキシ酪酸を生産した（図１、２）。また、２００ｒｐｍと比べ３００ｒｐｍ、４５０ｒｐｍの方が菌体重量も増加した（図３，４）。 When the stirring speeds were compared at 200 rpm, 300 rpm, and 450 rpm, the productivity of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate was higher when the stirring speed was increased to make it more aerobic. When aerobic culture was performed at 450 rpm, 27 g / L of 3-hydroxybutyric acid and 17 g / L of polyhydroxybutyric acid were produced (FIGS. 1 and 2). In addition, the cell weight increased at 300 rpm and 450 rpm compared to 200 rpm (FIGS. 3 and 4).
実施例４
有機炭素源としてグルコースを用いた場合の３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの生産性：
有機炭素源としてグルコースを用いて、ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株を好気培養し、３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの生産量、菌体重量を測定した。
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は、表６に示すＳＯＴ改変培地２に終濃度５ｗ／ｖ％のグルコースを加えた培地１００ｍＬで一晩好気培養（３０℃、２００ｒｐｍ）したものを前培養液として用いた。本培養では、ＳＯＴ改変培地２に終濃度１０ｗ／ｖ％のグルコースを加えた培地２Ｌを前培養液とともに卓上型培養装置（ジャーファーメンター）に加えて、培養条件を一定に保ちながら好気培養した（温度：３０℃、攪拌速度：７００ｒｐｍ、通気量：５Ｌ／分、ｐＨ８．５）。本培養では、培養開始から１９時間後と４８時間後にそれぞれ終濃度１０ｗ／ｖ％のグルコースを加えた。培養途中で培養液を５ｍＬ分取して、３−ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸及び菌体重量を実施例１と同様にして分析した。結果を図５に示す。また培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素センサー（株式会社丸菱バイオエンジ社製、型式ＯＸ−２５００）で測定した。結果を図６に示す。
Example 4
Productivity of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate when glucose is used as the organic carbon source:
Using glucose as an organic carbon source, the Halomonas sp. OITC1261 strain was subjected to aerobic culture, and the production amount and cell weight of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate were measured.
The Halomonas sp. OITC1261 strain was used as a pre-culture solution after aerobic culture (30 ° C., 200 rpm) overnight in 100 mL of a medium in which SOT modified
その結果、培養開始から１７時間後には３−ヒドロキシ酪酸（０．９ｇ／Ｌ）とポリヒドロキシ酪酸（１０．７ｇ／Ｌ）の生産が確認され、さらに６５時間後には３５ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸と２４ｇ／Ｌのポリヒドロキシ酪酸が生産された（図５）。
培養開始から１０時間後までの対数増殖期では、菌体増殖のために培地中の溶存酸素が多く消費されたが、その後の定常期では３−ヒドロキシ酪酸およびポリヒドロキシ酪酸の生産が始まるとともに、酸素消費量が減少して、溶存酸素濃度は２．３ｍｇ−Ｏ／Ｌから４．５ｍｇ−Ｏ／Ｌまで徐々に上昇した（図６）。
As a result, production of 3-hydroxybutyric acid (0.9 g / L) and polyhydroxybutyric acid (10.7 g / L) was confirmed 17 hours after the start of the culture, and 35 g / L of 3-hydroxybutyric acid was further 65 hours later. Butyric acid and 24 g / L polyhydroxybutyric acid were produced (FIG. 5).
In the logarithmic growth phase from the start of culture to 10 hours later, a large amount of dissolved oxygen in the medium was consumed for cell growth, but in the subsequent stationary phase, production of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxybutyric acid started. As the oxygen consumption decreased, the dissolved oxygen concentration gradually increased from 2.3 mg-O / L to 4.5 mg-O / L (FIG. 6).
実施例５
有機炭素源としてスクロースを用いた場合の３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの生産性：
有機炭素源としてスクロースを用いて、ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株を好気培養し、３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの生産量、菌体重量を測定した。
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は、ＳＯＴ改変培地２（表６）に終濃度５ｗ／ｖ％のグルコースを加えた培地１００ｍＬで一晩好気培養（３５℃、２００ｒｐｍ）したものを前培養液として用いた。本培養では、ＳＯＴ改変培地２に終濃度１０ｗ／ｖ％のスクロースを加えた培地２Ｌを前培養液とともに卓上型培養装置（ジャーファーメンター）に加えて、培養条件を一定に保ちながら好気培養した（温度：３５℃、攪拌速度：７００ｒｐｍ、通気量：５Ｌ／分、ｐＨ８．５）。本培養では、培養開始から１７時間後に終濃度１０ｗ／ｖ％のスクロースを加え、さらに２４時間後に終濃度５ｗ／ｖ％のスクロースを加えた。培養途中で培養液を５ｍＬ分取して、３−ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸及び菌体重量を実施例１と同様にして分析した。結果を図７に示す。また培養液中の溶存酸素濃度は、溶存酸素センサー（株式会社丸菱バイオエンジ社製、型式ＯＸ−２５００）で測定した。結果を図８に示す。
Example 5
Productivity of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate when sucrose is used as the organic carbon source:
Using Sucrose as the organic carbon source, the Halomonas sp. OITC1261 strain was aerobically cultured, and the production amount and cell weight of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate were measured.
The Halomonas sp. OITC1261 strain was used as a pre-culture solution after aerobic culture (35 ° C., 200 rpm) overnight in 100 mL of medium in which SOT-modified medium 2 (Table 6) was added with glucose at a final concentration of 5 w / v%. . In the main culture, aerobic culture is performed while keeping the culture conditions constant by adding 2 L of medium containing sucrose having a final concentration of 10 w / v% to SOT-modified
その結果、培養開始から１７時間後にポリヒドロキシ酪酸（１２ｇ／Ｌ）の生産が確認され、２４時間後には３−ヒドロキシ酪酸（１１ｇ／Ｌ）の生産が確認された。培養終了時（６５時間後）には３９ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸と２０ｇ／Ｌのポリヒドロキシ酪酸が生産された（図７）。
スクロースを炭素源として用いた場合においても、培養開始から１０時間後までの対数増殖期では、菌体増殖のために培地中の溶存酸素が多く消費されたが、その後の定常期では３−ヒドロキシ酪酸およびポリヒドロキシ酪酸の生産が始まるとともに、酸素消費量が減少して、溶存酸素濃度は２．４ｍｇ−Ｏ／Ｌから４．５ｍｇ−Ｏ／Ｌまで徐々に上昇した（図８）。
As a result, production of polyhydroxybutyric acid (12 g / L) was confirmed 17 hours after the start of culture, and production of 3-hydroxybutyric acid (11 g / L) was confirmed 24 hours later. At the end of the culture (after 65 hours), 39 g / L of 3-hydroxybutyric acid and 20 g / L of polyhydroxybutyric acid were produced (FIG. 7).
Even when sucrose was used as a carbon source, in the logarithmic growth phase from the start of culture to 10 hours later, a large amount of dissolved oxygen in the medium was consumed for cell growth, but in the subsequent stationary phase, 3-hydroxy As the production of butyric acid and polyhydroxybutyric acid started, the oxygen consumption decreased, and the dissolved oxygen concentration gradually increased from 2.4 mg-O / L to 4.5 mg-O / L (FIG. 8).
実施例６
各種有機炭素源を用いた場合の３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの生産性：
有機炭素源としてスクロース、マルトース、グリセリン、グルコン酸、水飴、焼酎蒸留残液を用いて、ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株を好気培養し、３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの生産量、菌体重量を測定した。
ＳＯＴ改変培地（表２）にいずれかの基質（スクロース、マルトース、グリセリン、グルコン酸、水飴）を２〜５ｗ／ｖ％加えてｐＨ９に調整した培地、又は焼酎蒸留残液（沖縄県工業技術センターで製造した泡盛もろみを単式常圧蒸留してアルコール分を除去したもの)を濾過してｐＨ９に調製した培地を各１０ｍＬずつフラスコへ分注し、菌を接種して３０℃で２〜３日間好気培養（２００ｒｐｍで振とう）した。その結果を表７に示す。
Example 6
Productivity of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate when using various organic carbon sources:
Using sucrose, maltose, glycerin, gluconic acid, starch syrup, and shochu distillation residue as an organic carbon source, the Halomonas sp. OITC1261 strain was aerobically cultured to produce 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate, and the weight of the cells Was measured.
A medium prepared by adding 2 to 5 w / v% of any substrate (sucrose, maltose, glycerin, gluconic acid, syrup) to SOT-modified medium (Table 2) or adjusted to pH 9 or shochu distillation residue (Okinawa Industrial Technology Center) 10 ml each of the medium prepared by filtering the awamori moromi mash prepared in
表７に示すとおり、ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株は様々な種類の糖類やアルコール、有機酸を有機炭素源として利用し、３−ヒドロキシ酪酸およびポリヒドロキシ酪酸を生産することが分かった。また、安価な材料である水飴（澱粉加水分解物）や焼酎蒸留残液を培地として用いた場合にも、これらを有機炭素源として利用できることが分かった。 As shown in Table 7, it was found that Halomonas sp. OITC1261 strain produces 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxybutyric acid using various types of sugars, alcohols, and organic acids as organic carbon sources. Moreover, it was found that even when syrup (starch hydrolyzate) or shochu distillation residue, which is an inexpensive material, is used as a medium, these can be used as an organic carbon source.
実施例７
繰り返し培養による３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの生産：
ハロモナス属微生物を好気培養した後、培養液から菌体を回収して繰り返し３−ヒドロキシ酪酸とポリヒドロキシアルカノエートを発酵生産する方法について検討した。
ハロモナス・エスピーＯＩＴＣ１２６１株を、ＳＯＴ改変培地２（表６）に終濃度５ｗ／ｖ％のグルコースを加えた培地１００ｍＬで３日間好気培養（３０℃、２００ｒｐｍ）した。
繰り返し生産では、まず、この培養液のうち１０ｍＬを遠心分離して上清を除いた回収菌体をｐＨ１０に調整した窒素およびリン制限培地（１．３％炭酸水素ナトリウム、３．４％炭酸ナトリウム、０．１％リン酸水素二カリウム、０．１％硝酸ナトリウム、０．５％塩化ナトリウム、１％糖蜜、１０％グルコース）１０ｍＬとともに三角フラスコへ移して１回目の好気培養（３０℃、２００ｒｐｍ）を行った。１回目の培養液のうち１ｍＬは３−ヒドロキシ酪酸とポリヒドロキシ酪酸の分析に用い、残りの培養液は遠心分離して菌体を回収し、新たな窒素およびリン制限培地１０ｍＬとともに再び三角フラスコへ移して２回目の好気培養を行った。２回目以降の成分分析や菌体回収、培養においても１回目と同様の操作を繰り返して行い、生産量の変化を調べた。これらの操作で用いた器具や試薬は全て加熱滅菌せずに使用した。この一連の操作を合計７回繰り返した。結果を図９に示す。
Example 7
Production of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate by repeated culture:
After aerobic culture of the genus Halomonas, the cells were collected from the culture and repeatedly examined for a method for producing 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate by fermentation.
The Halomonas sp. OITC1261 strain was aerobically cultured (30 ° C., 200 rpm) for 3 days in 100 mL of a medium in which SOT modified medium 2 (Table 6) was added with glucose at a final concentration of 5 w / v%.
In repetitive production, first, 10 mL of the culture broth was centrifuged, and the recovered cells after removing the supernatant were adjusted to
回収した菌体を用いて培養を繰り返している間、１３．７〜１６．５ｇ／Ｌのポリヒドロキシ酪酸を菌体内に維持したまま、各培養ごとに１０．１〜１１．４ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸を生産することができた。培養を複数回繰り返しても３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシ酪酸の生産量は低下することがなかった。さらに強アルカリ条件で操作することによって、培養を繰り返しても雑菌汚染による生産性の低下はなく、安定的に生産を行うことができた。 While the culture was repeated using the recovered cells, 13.7 to 16.5 g / L of 3 to 16.5 to 16.5 g / L was maintained for each culture while maintaining 13.7 to 16.5 g / L of polyhydroxybutyric acid in the cells. -Hydroxybutyric acid could be produced. Even when the culture was repeated several times, the production amounts of 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxybutyric acid did not decrease. Furthermore, by operating under strong alkaline conditions, even if the culture was repeated, the productivity was not reduced by contamination with various bacteria, and stable production was possible.
本発明によれば、３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートを簡便に効率よく、しかも低コストで生産することができる。したがって、バイオプラスチックやその原料として利用し得る３−ヒドロキシ酪酸及びポリヒドロキシアルカノエートの製造方法として極めて有用なものである。 According to the present invention, 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate can be easily and efficiently produced at low cost. Therefore, it is extremely useful as a method for producing 3-hydroxybutyric acid and polyhydroxyalkanoate that can be used as bioplastics and their raw materials.
Claims (8)
（１） コロニー：クリーム色
（２） エタノール資化性：有
（３） 酪酸資化性：有
（４） 尿素を窒素源とする培地での生育：可能
（５） 生育可能な塩化ナトリウム濃度：０．５〜１５％（ｗ／ｖ）
（６） 生育可能なｐＨ範囲：６〜１０ A microorganism belonging to the genus Halomonas that includes the base sequence of the 16S rRNA gene shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing with a homology of 98% or more and exhibits the following mycological properties.
(1) Colony: Cream color (2) Ethanol assimilation: Existence (3) Butyric acid assimilation: Existence (4) Growth in medium using urea as nitrogen source: Possible (5) Concentration of viable sodium chloride: 0.5-15% (w / v)
(6) pH range in which growth is possible: 6 to 10
The microorganism according to claim 7, which is a Halomonas sp. OITC1261 strain (NITE P-02027).
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| JP6521243B2 (en) | 2019-05-29 |
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