JP2017007999A - Skin-whitening agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、メラニンの生成を抑制する美白剤、色素沈着又はシミ・ソバカスの予防又は改善剤に関する。 The present invention relates to a whitening agent that suppresses the production of melanin, a preventive or ameliorating agent for pigmentation or freckles.
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化され、メラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。生体内において、色素メラニンは色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームにおいて、前駆体であるチロシンから酵素チロシナーゼの作用によって生合成される。
チロシナーゼは、具体的には、チロシンヒドロキシラーゼ活性、ドーパオキシダーゼ活性及びＤＨＩ活性を有し、チロシン及びドーパを前駆体としたメラニン合成反応を触媒しているが、このうちドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与していることが知られている（非特許文献１）。したがって、ドーパオキシダーゼ活性は、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にもその指標として用いられている。
Pigmentation after skin tanning and spots and freckles generally result from increased production of melanin by activation of pigmented cells (melanocytes) in the skin due to stimulation by ultraviolet exposure to the skin, hormonal abnormalities or genetic factors It is considered a thing. In vivo, pigment melanin is biosynthesized from the precursor tyrosine by the action of the enzyme tyrosinase in melanosomes in pigment cells (melanocytes).
Specifically, tyrosinase has tyrosine hydroxylase activity, dopa oxidase activity, and DHI activity, and catalyzes melanin synthesis reaction using tyrosine and dopa as precursors. It is known to be deeply involved in the mechanism (Non-Patent Document 1). Therefore, the dopa oxidase activity is used as an index when evaluating a melanin production-suppressing material having an inhibitory action on tyrosinase enzyme activity.
チロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制しうる物質を探索し、それらを美白成分として使用することは従来から検討され、例えば、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン等に当該作用があることが報告されている（非特許文献２）。 Searching for substances capable of inhibiting the activity of tyrosinase and suppressing melanin production and using them as whitening ingredients has been studied in the past, for example, ascorbic acid, arbutin, kojic acid, glutathione, etc. have such action Has been reported (Non-Patent Document 2).
また、最近では、例えば、クロマン−２−オン誘導体（特許文献１）、セロトニン化合物（特許文献２）、６−又は７−ヒドロキシインドール骨格を有する化合物（特許文献３）等にチロシナーゼ活性を抑制し美白作用を有することが報告され、更に、ブトコナゾールやスルコナゾールといった特定の抗真菌剤にチロシナーゼ活性を抑制する作用があることが報告されている（特許文献４）。 Recently, for example, chroman-2-one derivatives (Patent Document 1), serotonin compounds (Patent Document 2), compounds having a 6- or 7-hydroxyindole skeleton (Patent Document 3), etc. It has been reported that it has a whitening action, and it is further reported that specific antifungal agents such as butconazole and sulconazole have an action of suppressing tyrosinase activity (Patent Document 4).
しかしながら、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールが皮膚美白作用、メラニン生成抑制作用又はドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有していることは知られていない。 However, it is not known that thioconazole and sertaconazole nitrate have a skin whitening action, a melanin production inhibitory action, or a dopa oxidase activity inhibitory action.
本発明は、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用及びメラニン生成抑制作用を有する、色素沈着又はシミ・ソバカスの予防又は改善剤、皮膚美白剤を提供することに関する。 The present invention relates to providing an agent for preventing or ameliorating pigmentation or blemishes, and a skin lightening agent, which have an excellent dopa oxidase activity inhibitory action and melanin production inhibitory action.
本発明者は、チロシナーゼ活性を抑制する物質について探索したところ、抗真菌剤として汎用されているチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールが、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用及びメラニン生成抑制作用を有し、メラニン過剰生成に伴う皮膚の褐色化やシミ・ソバカス等の予防又は改善に有用であることを見出した。 As a result of searching for substances that suppress tyrosinase activity, the present inventor found that thioconazole and sertaconazole nitrate, which are widely used as antifungal agents, have excellent dopa oxidase activity inhibitory action and melanin production inhibitory action. The present inventors have found that it is useful for preventing or improving the skin browning, stains and freckles associated with the production.
すなわち、以下の１）〜４）に係るものである。
１）チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
２）チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
３）チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤。
４）チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚美白剤。
That is, it relates to the following 1) to 4).
1) A dopa oxidase activity inhibitor comprising one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate as an active ingredient.
2) The melanin production inhibitor which uses as an active ingredient 1 or more types chosen from thioconazole and certaconazole nitrate.
3) A preventive or ameliorating agent for skin pigmentation, blemishes or freckles comprising one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate as an active ingredient.
4) A skin lightening agent containing one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate as an active ingredient.
本発明によれば、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、皮膚の色素沈着、シミ、又はソバカスの予防又は改善や、皮膚美白のための肌ケアが可能となる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the excessive production of melanin in skin is suppressed, skin prevention for pigmentation of a skin, a spot, or freckles, or skin care for skin whitening is attained.
本発明におけるチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾール（以下、「本発明の化合物」とも称する）は、下記式で示されるイミダゾール化合物であり、いずれも抗真菌剤として、市販されている。 The thioconazole and sertaconazole nitrate (hereinafter also referred to as “the compound of the present invention”) in the present invention are imidazole compounds represented by the following formula, and both are commercially available as antifungal agents.
後記実施例に示すように、本発明の化合物は、ドーパオキシダーゼ活性を強く抑制するという優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有する。ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与する（非特許文献１）ことから、ドーパオキシダーゼ活性を抑制すれば、メラニン生成抑制効果、紫外線被爆等による皮膚の色素沈着、シミ、ソバカスの症状の予防又は改善効果、或いは皮膚美白効果を得ることができる。実際に、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールはメラニン生成抑制作用を有する。
したがって、本発明の化合物を、動物、好ましくはヒトに投与することにより、ドーパオキシダーゼ活性を抑制し、メラニン生成を抑制することにより、皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善、或いは皮膚美白が可能となる。
As shown in Examples described later, the compound of the present invention has an excellent dopa oxidase activity inhibitory action of strongly suppressing dopa oxidase activity. Since dopa oxidase activity is deeply involved in the mechanism of melanin production (Non-Patent Document 1), if dopa oxidase activity is suppressed, melanin production inhibitory effect, skin pigmentation due to ultraviolet exposure, etc., prevention of symptom of spots and freckles Alternatively, an improvement effect or a skin whitening effect can be obtained. In fact, thioconazole and sertaconazole nitrate have a melanin production inhibitory action.
Therefore, the administration of the compound of the present invention to animals, preferably humans, suppresses dopa oxidase activity and suppresses melanin production, thereby preventing or improving skin pigmentation, spots or freckles, or skin whitening. Is possible.
すなわち、本発明の化合物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤、色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤、及び皮膚美白剤となり、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスを予防又は改善するため、或いは皮膚美白のために使用することができる。 That is, the compound of the present invention becomes a dopa oxidase activity inhibitor, a melanin production inhibitor, a pigmentation, a spot or buckwheat preventive or ameliorating agent, and a skin lightening agent, for inhibiting dopa oxidase activity, for inhibiting melanin production, It can be used to prevent or ameliorate skin pigmentation, spots or freckles, or for skin whitening.
本明細書において、本発明の化合物のヒトへの使用は、治療的使用であってもよく、又は美容目的での使用を含む非治療的使用であってもよい。
「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための本発明の化合物の使用、例えばエステティシャン、美容師等による使用等が挙げられる。
また、本明細書において、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
As used herein, the use of the compounds of the invention in humans may be therapeutic or non-therapeutic, including for cosmetic purposes.
“Non-therapeutic” does not include medical practice, ie does not include methods for surgery, treatment or diagnosis of humans, more specifically a doctor or a health care professional or a person who has received instructions from a doctor. It is a concept that does not include a method for performing surgery, treatment, or diagnosis on a patient. Non-therapeutic uses include the use of the compounds of the invention for skin whitening for cosmetic or aesthetic purposes, such as use by estheticians, beauticians and the like.
In the present specification, “improvement” refers to improvement of symptoms or conditions, prevention or delay of deterioration of symptoms or conditions, or reversal, prevention or delay of progression of symptoms or conditions.
In the present specification, “prevention” means prevention or delay of the onset of symptoms in an individual or reduction of the risk of onset of symptoms in an individual.
また、本発明の化合物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤、色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤、或いは皮膚美白剤を製造するために使用することができる。 Moreover, the compound of this invention can be used in order to manufacture a dopa oxidase activity inhibitor, a melanin production inhibitor, pigmentation, a spot or freckles prevention or improvement agent, or a skin lightening agent.
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤及び皮膚美白剤は、ドーパオキシダーゼ活性抑制、メラニン生成抑制、皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善、又は皮膚美白を目的とした、医薬品、医薬部外品若しくは化粧品であり得、又は当該医薬品、医薬部外品若しくは化粧品を製造するための原料又は素材であり得る。 The dopa oxidase activity inhibitor, the melanin production inhibitor and the skin lightening agent of the present invention are pharmaceuticals intended for dopa oxidase activity inhibition, melanin production inhibition, skin pigmentation, spot or buckwheat prevention or improvement, or skin whitening. It can be a quasi-drug or a cosmetic, or it can be a raw material or material for producing the pharmaceutical, quasi-drug or cosmetic.
上記医薬品又は医薬部外品は、投与形態は任意であり、経口投与、非経口投与の何れでもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形製剤、ならびにエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体製剤が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、貼付等の各製剤が挙げられる。好ましくは、当該医薬品又は医薬部外品は、外用剤の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の形態が挙げられる。 The drug or quasi-drug may be administered in any form and may be administered orally or parenterally. Dosage forms for oral administration include, for example, solid preparations such as tablets, granules, powders, capsules, and liquid preparations such as elixirs, syrups and suspensions. Examples of the dosage form include various preparations such as injection, external use, transdermal, transmucosal, nasal, enteral, inhalation, suppository, and patch. Preferably, the medicinal product or quasi drug is preferably in the form of an external preparation, and specific examples include ointments, creams, emulsions, lotions, gels, aerosols, patches, tapes, sprays and the like. .
上記化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられ、特に限定されない。好ましくは、上記化粧品は皮膚美白用化粧料である。 Examples of the cosmetics include any form that can be used for cosmetics, such as creams, emulsions, lotions, suspensions, gels, powders, packs, sheets, patches, sticks, cakes, and the like, and are not particularly limited. Preferably, the cosmetic is a skin whitening cosmetic.
上記医薬品、医薬部外品若しくは化粧品に係る製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明の化合物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等と共に混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明の化合物の他、それぞれ医薬品、医薬部外品、化粧品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。また、美白効果を更に高めるべく、他の美白成分を適宜配合することもできる。 The above pharmaceutical composition, quasi-drug, or cosmetic preparation composition is prepared by a general production method, and the compound of the present invention is a pharmaceutically acceptable carrier such as various oils, surfactants, gelling agents, Mix and disperse with preservatives, antioxidants, solvents, alcohol, water, chelating agents, thickeners, UV absorbers, emulsion stabilizers, pH adjusters, dyes, fragrances, etc., and then process them into the desired form. Can be obtained by: In addition to the compound of the present invention, these pharmaceutical compositions include a plant extract, a bactericidal agent, a moisturizing agent, an antibacterial agent, as appropriate, depending on the type of the pharmaceutical, quasi-drug, cosmetics, etc. Medicinal components such as a refreshing agent can be appropriately blended within a range that does not interfere with the effects of the present invention. Moreover, in order to further enhance the whitening effect, other whitening components can be appropriately blended.
当該製剤組成物中の本発明の化合物の含有量は、一般的に好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％である。 The content of the compound of the present invention in the pharmaceutical composition is generally preferably 0.01% by mass or more, more preferably 0.1% by mass or more, and preferably 10% by mass or less, more preferably 5% by mass. Or less, preferably 0.01 to 10% by mass, more preferably 0.1 to 5% by mass.
上記医薬品、医薬部外品、化粧品の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、本発明の化合物として、例えば好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．００１〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。 The dosage of the above-mentioned pharmaceuticals, quasi drugs, and cosmetics can be an amount that can achieve the effects of the present invention. The dosage may vary according to the subject's condition, weight, sex, age or other factors, but for adults (60 kg) per day as a compound of the present invention, for example, preferably 0.001 mg or more, more preferably Is 0.01 mg or more, preferably 1000 mg or less, more preferably 100 mg or less. Moreover, Preferably it is 0.001-1000 mg, More preferably, it is 0.01-100 mg.
また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、好ましくは、皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善を所望するヒト、皮膚美白を所望するヒトである。
The preparation can be ingested / administered according to any ingestion / administration plan, but is preferably divided into once to several times a day and continuously administered for several weeks to several months.
The target of application of the cosmetic, pharmaceutical or quasi-drug is not particularly limited as long as it is necessary, but preferably a human who wants to prevent or improve skin pigmentation, spots or freckles, and skin whitening. The desired human.
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。 With respect to the above-described embodiment, the following aspects are further disclosed in the present invention.
＜１＞チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
＜２＞チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
＜３＞チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤。
＜４＞チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚美白剤。
<1> A dopa oxidase activity inhibitor comprising one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate as an active ingredient.
<2> A melanin production inhibitor comprising as an active ingredient at least one selected from thioconazole and sertaconazole nitrate.
<3> A preventive or ameliorating agent for skin pigmentation, spots or freckles comprising one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate as an active ingredient.
<4> A skin lightening agent comprising one or more selected from thioconazole and seltaconazole nitrate as an active ingredient.
＜５＞ドーパオキシダーゼ活性抑制剤を製造するための、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上の使用。
＜６＞メラニン生成抑制剤を製造するための、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上の使用。
＜７＞皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤を製造するための、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上の使用。
＜８＞皮膚美白剤を製造するための、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上の使用。
<5> One or more uses selected from thioconazole and sertaconazole nitrate for producing a dopa oxidase activity inhibitor.
<6> Use of one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate for producing a melanin production inhibitor.
<7> One or more uses selected from thioconazole and sertaconazole nitrate for producing an agent for preventing or improving skin pigmentation, spots or freckles.
<8> Use of one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate for producing a skin lightening agent.
＜９＞ドーパオキシダーゼ活性抑制に使用するためのチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上。
＜１０＞メラニン生成抑制に使用するためのチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上。
＜１１＞皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善に使用するためのチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上。
＜１２＞皮膚美白に使用するためのチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上。
<9> One or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate for use in inhibiting dopa oxidase activity.
<10> One or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate for use in suppressing melanin production.
<11> One or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate for use in preventing or improving skin pigmentation, spots or freckles.
<12> One or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate for use in skin whitening.
＜１３＞ドーパオキシダーゼ活性抑制方法であって、それを必要とする対象にチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１４＞メラニン生成抑制方法であって、それを必要とする対象にチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１５＞皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療する方法であって、それらを必要とする対象にチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１６＞皮膚美白方法であって、それを必要とする対象にチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<13> A method for inhibiting dopa oxidase activity, comprising administering or ingesting an effective amount of one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate to a subject in need thereof.
<14> A method for inhibiting melanin production, comprising administering or ingesting an effective amount of one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate to a subject in need thereof.
<15> A method for preventing, ameliorating, or treating symptoms such as skin pigmentation, blemishes, freckles, etc., in an effective amount of at least one selected from thioconazole and certaconazole nitrate A method comprising administering or ingesting.
<16> A skin whitening method, comprising administering or ingesting an effective amount of one or more selected from thioconazole and sertaconazole nitrate to a subject in need thereof.
＜１７＞上記＜９＞〜＜１２＞において、上記使用は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための非治療的な使用である。
＜１８＞上記＜１３＞〜＜１６＞において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための非治療的な方法である。
<17> In the above items <9> to <12>, the use is preferably a non-therapeutic use for skin whitening for cosmetic or aesthetic purposes.
<18> In the above items <13> to <16>, the method is preferably a non-therapeutic method for skin whitening for cosmetic or aesthetic purposes.
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on an Example, this invention is not limited to this.
＜評価サンプルの調製＞
チオコナゾール（ＡＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、硝酸セルタコナゾール（ＡＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アルブチン（シグマアルドリッチ）、ルシノール（和光純薬工業）、ラノコナゾール（ＦＬＵＫＡ）をそれぞれ１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解した。
<Preparation of evaluation sample>
Thioconazole (AK Scientific), Sertaconazole nitrate (AK Scientific), Arbutin (Sigma Aldrich), Lucinol (Wako Pure Chemical Industries), and Ranoconazole (FLUKA) were dissolved in DMSO to a concentration of 10 mM.
実施例１ メラノサイトにおけるドーパオキシダーゼ活性抑制作用
（１）細胞培養
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社）を９６ウェルプレートに１×１０4細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下にて培養した。培地には、ＰＭＡを除いた増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ ２５４を用いた。翌日、それぞれ培地中終濃度で１ｎＭになるように調整したＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ＥＴ−１）、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ＰＧＥ2とともに、表１に示す濃度の評価サンプルを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５日間培養を行った。
Example 1 Inhibition of dopa oxidase activity in melanocytes (1) Cell culture Normal human neonatal epidermis-derived melanocytes (NHEMs; Kurabo Industries) were seeded in a 96-well plate at a cell density of 1 × 10 4 cells / well (100 μL / well). The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 . Medium 254 containing a growth additive (HMGS) excluding PMA was used as the medium. On the next day, evaluation samples having the concentrations shown in Table 1 were added together with Endothelin-1 (ET-1), SCF, α-MSH, Histamine, and PGE2 adjusted to 1 nM in the final concentration in the medium, respectively, Cultivation was performed for 5 days under conditions of 5% CO 2 .
（２）ドーパオキシダーゼ活性の測定
培養終了後、アラマーブルー（Bio-Rad社）試薬を２０μＬ／ウェルで添加し、２〜３時間インキュベートした後、培地の蛍光強度を測定して細胞呼吸活性を測定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％ ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍLアプロチニン）を２０μＬ／ウェル、アッセイバッファー（４％ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ウェル添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326）を参考に、以下の方法で行った。
可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記アッセイバッファーを８０μＬ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μＬ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。
(2) Measurement of dopa oxidase activity After completion of the culture, Alamar Blue (Bio-Rad) reagent was added at 20 μL / well, incubated for 2 to 3 hours, and then the fluorescence intensity of the medium was measured to determine cell respiration activity. It was measured. Thereafter, the cells were washed with PBS, and extraction buffer (0.1 M Tris-HCL (pH 7.2), 1% NP-40, 0.01% SDS, 100 μM PMSF, 1 μg / mL aprotinin) was 20 μL / well, assay. A buffer (4% dimethylformamide, 100 mM sodium phosphate-buffered (pH 7.1)) was added at 20 μL / well, the cells were solubilized at 4 ° C. for 3 hours, and the dopa oxidase activity was measured. The dopa oxidase activity was measured by the following method with reference to the MBTH method (Winder A. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 198: 317-326).
In each well of the solubilized cell solution, 80 μL of the above assay buffer, 60 μL of 20.7 mM MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone) solution, and 5 mM L-dopa (L-dihydroxyphenylalanine) solution as a substrate 40 μL of each was added and reacted at 37 ° C. for 30-60 minutes, and then the color reaction was measured by absorbance at 490 nm. The measured value was expressed as a relative value to the control result.
（３）結果
結果を表１及び図１に示す。チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールによってドーパオキシダーゼ活性が抑制された。また、アラマーブルー法による細胞呼吸活性の測定から、表１に示す濃度のサンプルが細胞増殖に影響を及ぼさないことを確認した。
(3) Results The results are shown in Table 1 and FIG. Dopa oxidase activity was inhibited by thioconazole and sertaconazole nitrate. Moreover, it was confirmed from the measurement of cell respiration activity by the Alamar Blue method that the samples having the concentrations shown in Table 1 do not affect cell proliferation.
実施例２ 三次元培養皮膚モデルにおけるメラニン産生抑制作用
ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ＰＧＥ2を終濃度１ｎＭで添加したＥＰＩ−１００−ＮＭＭ１１３培地を用いて、三次元培養皮膚モデル（ＭＥＬ３００Ａ）を３７℃、５％ＣＯ2条件下にて培養した。培養初日より、評価サンプル（チオコナゾール、硝酸セルタコナゾール、アルブチン、ルシノール）を培養カップ上層に終濃度５０μMで添加した。培地交換は３日に一度行った。１４日後に、アラマーブルー試薬を用いて実施例１と同様に細胞呼吸活性を測定した。続いて三次元培養皮膚を培養支持体であるカップごとＰＢＳで洗浄し、ピンセットで皮膚シートを剥離してチューブに移し、さらにＰＢＳで３回洗浄した。５０％エタノールで３回、１００％エタノールで２回洗浄した後、室温で一晩放置して完全に乾燥させた。最終的に２Ｍ ＮａＯＨを２００μＬ加えた後で１００℃にて溶解させ、遠心分離によって得られた上清について４０５ｎｍの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。結果を図２に示す。
図２より、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールの添加により、細胞のメラニン量はそれぞれ、６３．１％及び８０．６％減少した。これは、メラニン生成抑制作用を有し、美白成分として汎用されているアルブチン及びルシノールに比べて遥かに高いことが示された。また、アラマーブルー法による細胞呼吸活性の測定から、何れのサンプルも細胞増殖に影響を及ぼさないことを確認した。
Example 2 Melanin production inhibitory action in a three-dimensional cultured skin model Using an EPI-100-NMM113 medium supplemented with ET-1, SCF, α-MSH, Histamine, PGE 2 at a final concentration of 1 nM, a three-dimensional cultured skin model ( MEL300A) was cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . From the first day of the culture, evaluation samples (thioconazole, sertaconazole nitrate, arbutin, lucinol) were added to the upper layer of the culture cup at a final concentration of 50 μM. The medium was changed once every 3 days. After 14 days, cell respiration activity was measured in the same manner as in Example 1 using Alamar Blue reagent. Subsequently, the three-dimensional cultured skin was washed with PBS as a culture support with PBS, the skin sheet was peeled off with tweezers, transferred to a tube, and further washed with PBS three times. After washing 3 times with 50% ethanol and 2 times with 100% ethanol, it was left at room temperature overnight to dry completely. Finally, 200 μL of 2M NaOH was added and then dissolved at 100 ° C., and the supernatant obtained by centrifugation was measured for absorbance at a measurement wavelength of 405 nm to calculate the amount of melanin. The measured value was expressed as a relative value to the control result. The results are shown in FIG.
From FIG. 2, the addition of thioconazole and sertaconazole nitrate decreased the cell melanin levels by 63.1% and 80.6%, respectively. This was shown to be much higher than arbutin and lucinol, which have a melanin production inhibitory action and are widely used as whitening ingredients. Moreover, it was confirmed from the measurement of cell respiration activity by the Alamar Blue method that none of the samples affected cell proliferation.
比較例 メラノサイトにおけるドーパオキシダーゼ活性抑制作用
表２に示す濃度の評価サンプルを用いて、実施例１と同様にして、メラノサイトにおけるドーパオキシダーゼ活性抑制作用を測定した。結果を表２並びに図３及び図４に示す。
チオコナゾールは、同種のイミダゾール系抗真菌剤であるラノコナゾール及び硝酸スルコナゾールに比べて、遥かに優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有することが示された。
Comparative Example Dopa Oxidase Activity Inhibiting Action in Melanocytes Using the evaluation samples having the concentrations shown in Table 2, the dopa oxidase activity inhibiting action in melanocytes was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 2 and FIGS.
It was shown that thioconazole has a far superior dopa oxidase activity inhibitory action compared to lanconazole and sulconazole nitrate, which are the same kind of imidazole antifungal agents.
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