JP2017006050A - Construction method of tetraploid populus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高バイオマス性を有する４倍体ポプラの作出方法に関するものである。 The present invention relates to a method for producing tetraploid poplar having high biomass properties.
近年、植物バイオマスの資源化が進められている。植物バイオマスの資源化を実現する上で、原料となる植物バイオマスを効率的に生産する技術開発は極めて重要である。植物バイオマスの中でも、食糧資源と拮抗せず、大規模原料供給が可能な木本系バイオマスとしてポプラやユーカリが注目されている。ここで、ポプラ(poplar)とは、ヤナギ科(Salicaceae family)のヤマナラシ属またはポプラ属に属する樹木（広葉樹）の慣用名であり、成長が早く活着が良く、並木や街路樹、防風林として植生されているものである。
そこで、生産するポプラやユーカリの地上部器官を巨大化して生産量を向上させる方法が考えられる。この点、地球上の被子植物の内、約７０％の被子植物はＤＮＡ倍加により細胞を肥大化させ、器官サイズを大きくしている。ところが、バイオマス生産の原料として注目されているポプラやユーカリではＤＮＡ倍加が起こらないと言われている。
In recent years, resource utilization of plant biomass has been promoted. Technology development to efficiently produce plant biomass as a raw material is extremely important in realizing resource utilization of plant biomass. Among plant biomass, poplar and eucalyptus are attracting attention as woody biomass that can supply large-scale raw materials without competing with food resources. Here, poplar (poplar) is a common name for a tree (broadleaf tree) belonging to the genus Salamaceae or Poplar genus (broadleaf tree) of the Salicaceae family. It is what.
Therefore, it is conceivable to increase the production amount by enlarging the above-ground organs of poplar and eucalyptus to be produced. In this regard, about 70% of the angiosperms on the earth enlarge the cells by doubling DNA and increase the organ size. However, it is said that no DNA doubling occurs in poplar and eucalyptus, which are attracting attention as raw materials for biomass production.
一方で、ユーカリ属について、生産性の向上した個体を短期間に作成できるユーカリ属４倍体の作成方法が知られている（特許文献１を参照）。特許文献１のユーカリ属４倍体の作成方法は、２倍体であるユーカリ属の組織切片について染色体の倍加処理を行い、次いでこの組織切片を培養することにより染色体が倍加した組織を発生させ、この組織から個体を再生して、ユーカリ属４倍体を作成するものである。
しかし、バイオマス生産の原料としてはユーカリ属だけではなくポプラ等も有用であるが、特許文献１に開示された方法は、パルプ材として有用なユーカリ属について４倍体を作成するものに過ぎない。
また、特許文献１の明細書段落００１２によると、ＤＮＡ倍加処理方法として、シュートをコルヒチン等の溶液中に浸漬することにより行うことが、最も一般的としており、実施例においても、コルヒチン水溶液に２４時間浸漬することで倍加処理を行っている。ここで、シュートとは、茎とその上にできる多数の葉からなる単位をいう。
しかしながら、染色体の倍加処理を行う際、ユーカリ属のシュート切片をコルヒチン等の溶液に浸漬して倍加処理を行う方法では、培養のための培地以外に、倍加処理を行うための大規模な装置が必要であり、煩雑であった。
さらに、倍加処理後に、植物ホルモンとしてＢＡＰもしくはカイネチン、ショ糖、ゲランガムもしくは寒天を含有する培地或はそれらを改変した培地により組織培養を行わなければならない方法であったため、かかる点においても簡便な方法とはいえなかった。
On the other hand, for Eucalyptus genus, a method for producing Eucalyptus genus tetraploid that can produce an individual with improved productivity in a short time is known (see Patent Document 1). In the method for preparing Eucalyptus tetraploid in Patent Document 1, a tissue doubling treatment is performed on a tissue section of Eucalyptus genus that is a diploid, and then a tissue with doubled chromosomes is generated by culturing the tissue section. Individuals are regenerated from this tissue to create Eucalyptus tetraploids.
However, as a raw material for biomass production, not only Eucalyptus but also poplar and the like are useful. However, the method disclosed in Patent Document 1 merely creates a tetraploid for Eucalyptus that is useful as a pulp material.
Moreover, according to the specification paragraph 0012 of Patent Document 1, as a DNA doubling treatment method, it is most common to immerse a shoot in a solution of colchicine or the like. The doubling treatment is performed by immersion for a period of time. Here, the shoot refers to a unit composed of a stem and a large number of leaves formed thereon.
However, when doubling the chromosome, the eucalyptus shoot section is immersed in a solution such as colchicine to perform the doubling process. In addition to the culture medium, there is a large-scale apparatus for performing the doubling process. It was necessary and complicated.
In addition, since the tissue culture must be performed with a medium containing BAP or kinetin, sucrose, gellan gum or agar as a plant hormone or a modified medium after the doubling treatment, a simple method also in this respect That wasn't true.
また、ウリ科植物の分裂組織につきアミプロホスメチルを用いて染色体の倍加処理を行う染色体倍加方法が知られている（特許文献２を参照）。特許文献２のウリ科植物の染色体倍加方法は、コルヒチン等の倍加誘発剤を用いずにアミプロホスメチルを用いて倍加処理を行うものであり、倍加効率が高いとされている。
しかし、アミプロホスメチルは、通常、除草剤として用いられているため、植物体に薬害を発生させる危険性があるという問題があった。
また、特許文献２に開示されたウリ科植物の染色体倍加方法においても、染色体の倍加処理を行う際、ウリ科植物のシュート切片をアミプロホスメチル水溶液に浸漬して倍加処理を行っているが、特許文献１と同様、かかる方法は煩雑であり、簡便な方法とはいえなかった。
さらに、倍加処理後に組織培養を介する方法であるため、かかる点においても簡便な方法とはいえなかった。
なお、特許文献２の明細書段落０００３には、温室で栽培中のメロンの腋芽に脱脂綿を乗せコルヒチンを滴下し処理する方法も試みたが倍加シュートは得られなかったと記載されており、従来は、植物の腋芽にコルヒチンを滴下する程度では倍加シュートは得られないのが常識とされていた。ここで、腋芽とは、葉の付け根から出る芽のことをいう。
Further, a chromosome doubling method is known in which a doubling treatment of chromosomes is performed using amiprophosmethyl for meristems of cucurbitaceae plants (see Patent Document 2). The doubling method of the cucurbitaceae plant of Patent Document 2 is such that doubling treatment is performed using amiprophosmethyl without using a doubling inducer such as colchicine, and it is said that doubling efficiency is high.
However, since amiprophosmethyl is usually used as a herbicide, there is a problem in that there is a risk of causing phytotoxicity in plants.
In addition, in the method for doubling chromosomes of the cucurbitaceae plant disclosed in Patent Document 2, the doubling treatment is performed by immersing the shoot section of the cucurbitaceae plant in an aqueous solution of amiprophos methyl when doubling the chromosome. As with Patent Document 1, this method is complicated and cannot be said to be a simple method.
Furthermore, since this method involves tissue culture after doubling treatment, it cannot be said to be a simple method in this respect.
In addition, in paragraph 0003 of the specification of Patent Document 2, it is described that doubling shoots were not obtained, although a method was also attempted in which colchicine was dropped onto buds of melon grown in a greenhouse and treated with colchicine. It has been common knowledge that doubling shoots cannot be obtained only by dripping colchicine into the buds of plants. Here, the axillary bud refers to a bud that emerges from the base of the leaf.
上述した特許文献１及び２におけるＤＮＡ倍加方法は、何れもポプラを対象としたものではない。また、特許文献１及び２におけるＤＮＡ倍加方法では、何れも倍加処理方法が煩雑であり、かつ、倍加処理後に組織培養を介する方法であるため、簡便な方法ともいえなかった。
かかる状況に鑑みて、本発明は、簡便な方法によりポプラのＤＮＡ倍加処理を行い、かつ、組織培養を介さずに、２倍体ポプラから４倍体ポプラを安定的に作出する方法を提供することを目的とする。
None of the DNA doubling methods in Patent Documents 1 and 2 described above are intended for poplars. In addition, in the DNA doubling methods in Patent Documents 1 and 2, the doubling treatment method is complicated, and since it is a method through tissue culture after the doubling treatment, it cannot be said to be a simple method.
In view of this situation, the present invention provides a method for stably producing tetraploid poplar from diploid poplar by performing DNA doubling treatment of poplar by a simple method and without using tissue culture. For the purpose.
上記課題を解決すべく、本発明者は、ＤＮＡ倍加処理方法につき鋭意検討した結果、コルヒチン溶液にシュート切片を浸漬するのではなく、シュートの腋芽（葉の付け根から出る芽のこと、脇芽或は側芽とも呼ばれる。）にコルヒチン溶液の雫を乗せることで、簡易にＤＮＡ倍加処理が行えることを知見した。また、培養方法としては植え継ぎを行うことで簡易に培養が行えることを知見した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor has intensively studied a DNA doubling treatment method. As a result, the shoots are not immersed in a colchicine solution, but shoot buds (shoots from the root of the leaves, side buds or Is also called side buds.) It was found that DNA doubling treatment can be easily performed by placing a colchicine solution cocoon on the bud. Moreover, it discovered that it can culture | cultivate simply by performing planting as a culture method.
すなわち、本発明の４倍体ポプラの作出方法は、２倍体ポプラのシュートの腋芽に対してコルヒチン溶液を滴下して培養し、出てきた側枝を植え継いで４倍体ポプラを作出することを特徴とする。
コルヒチン処理の対象としては、ポプラを用いる。ここで、コルヒチン処理とは、微小管（紡錘体）の形成を阻害することで、細胞分裂を阻害し、その結果、細胞分裂がなされずに染色体を倍加させるものである。
また、コルヒチン処理の方法としては、２倍体ポプラのシュートの腋芽に対して行うものである。ＤＮＡ倍加処理後は、植え継ぎを行うことで、細胞培養によらずに培養を行うことが可能である。
That is, in the method for producing tetraploid poplar of the present invention, a colchicine solution is added dropwise to a bud bud of a diploid poplar shoot and cultured, and a tetraploid poplar is produced by planting a side branch that has emerged. It is characterized by.
Poplar is used as the target of colchicine treatment. Here, colchicine treatment inhibits the formation of microtubules (spindles), thereby inhibiting cell division and, as a result, doubling chromosomes without cell division.
Moreover, as a method of colchicine treatment, it is performed on the buds of shoots of diploid poplar. After DNA doubling treatment, culturing can be performed without depending on cell culture by performing planting.
本発明の４倍体ポプラの作出方法に用いられるコルヒチン溶液の濃度は、０．００２ｗ／ｖ％以上、０．１ｗ／ｖ％未満であることが好ましく、より好ましくは、０．００５ｗ／ｖ％以上、０．０５ｗ／ｖ％未満である。これは、低濃度とすることで、緩やかな倍加を行うためである。
ここで、０．００２％未満であるとＤＮＡ倍加促進効果が弱く、また、０．１ｗ／ｖ％以上であると、微小管形成を高度に阻害することによる二次的影響が現れるので、上記濃度範囲に調製する。
The concentration of the colchicine solution used in the method for producing tetraploid poplar of the present invention is preferably 0.002 w / v% or more and less than 0.1 w / v%, more preferably 0.005 w / v%. As mentioned above, it is less than 0.05 w / v%. This is because a moderate doubling is performed by using a low concentration.
Here, if it is less than 0.002%, the effect of accelerating DNA doubling is weak, and if it is 0.1 w / v% or more, a secondary influence due to highly inhibiting microtubule formation appears. Adjust to a concentration range.
本発明の４倍体ポプラの作出方法に用いられるコルヒチン溶液には、ゲル化剤が添加されたことが好ましい。これは、腋芽にコルヒチン溶液を乗せた場合に腋芽からコルヒチン溶液が流れ落ちることを防ぐため、添加されるものである。ゲル化剤としては、アガーが好適に用いられる。 It is preferable that a gelling agent is added to the colchicine solution used in the method for producing tetraploid poplar of the present invention. This is added to prevent the colchicine solution from flowing down from the buds when the colchicine solution is placed on the buds. As the gelling agent, agar is preferably used.
本発明の４倍体ポプラの作出方法において、コルヒチン溶液の滴下は、植え継いで育成したシュートの下葉を残して主茎を切除したものの葉の根元の腋芽に対して行うことが好ましい。なお、コルヒチン処理は、１箇所だけではなく、各々の葉の腋芽に行う。 In the tetraploid poplar production method of the present invention, it is preferable that the colchicine solution is dripped on the buds at the base of the leaves obtained by excising the main stem while leaving the lower leaves of the shoots grown after planting. Note that the colchicine treatment is performed not only on one place but also on the buds of each leaf.
本発明の４倍体ポプラの作出方法において、コルヒチン溶液の滴下の頻度は、２回であることが好ましい。また、滴下間隔は１日であることが好ましい。 In the method for producing tetraploid poplar of the present invention, the frequency of dripping the colchicine solution is preferably twice. The dropping interval is preferably 1 day.
本発明の４倍体ポプラの作出方法において、腋芽に乗せるコルヒチン溶液量は、腋芽に雫の玉ができる量、かつ、腋芽から流れ落ちない量であることが好ましい。これは、本発明におけるコルヒチン処理は腋芽に乗せるという簡易な方法で行うため、腋芽に乗せるコルヒチン溶液量が多いと腋芽から流れ落ちてしまい、正常なコルヒチン処理がなされないこととなるからである。 In the tetraploid poplar production method of the present invention, the amount of the colchicine solution to be placed on the buds is preferably an amount that allows the buds to form bud balls and that does not flow down from the buds. This is because the colchicine treatment in the present invention is carried out by a simple method of placing on the buds, and if the amount of colchicine solution placed on the buds is large, it will flow down from the buds and normal colchicine treatment will not be performed.
本発明の４倍体ポプラの作出方法においては、コルヒチン溶液の滴下後、４倍体ポプラの倍数性が安定するまで、植え継ぎを繰り返すことが好ましい。植え継ぎを繰り返す回数としては、２〜４回が好ましく、より好ましくは３回である。 In the method for producing tetraploid poplar of the present invention, it is preferable to repeat transplantation until the ploidy of tetraploid poplar is stabilized after the colchicine solution is dropped. As a frequency | count of repeating planting, 2-4 times are preferable, More preferably, it is 3 times.
本発明の４倍体ポプラの作出方法は、コルヒチン溶液を用いた４倍体ポプラの作出方法であって、下記１）〜５）のステップから成る。
１）２倍体ポプラのシュートを培地へ植え継ぎ、植え継ぎから略２８日後にシュートの下の葉を少なくとも１枚残して主茎を切除するコルヒチン処理準備ステップ
２）シュートの腋芽にコルヒチン溶液を乗せ、略２４時間培養を行った後、残った雫を除く第１のコルヒチン処理ステップ
３）第１のコルヒチン処理ステップの後、腋芽に新たにコルヒチン溶液を乗せ、さらに略２４時間培養後、残っている雫を除き、滅菌水を乗せて洗浄する第２のコルヒチン処理ステップ
４）略１ヵ月培養し、出てきた側枝を新しい培地に植え継ぎ、側枝の下葉の倍数性を測定して、４倍体ポプラを作出状況を確認する作出状況確認ステップ
５）４倍体ポプラの倍数性が安定するまで、植え継ぎと倍数性の測定を繰り返す倍数性安定化ステップ
The tetraploid poplar production method of the present invention is a tetraploid poplar production method using a colchicine solution, and comprises the following steps 1) to 5).
1) Planting a shoot of diploid poplar into the medium, and preparing a colchicine treatment step for cutting out the main stem, leaving at least one leaf under the shoot approximately 28 days after planting, 2) Applying a colchicine solution to the buds of the shoot After culturing for about 24 hours, the first colchicine treatment step for removing the remaining wrinkles 3) After the first colchicine treatment step, a new colchicine solution was placed on the axillary buds, and after further incubation for about 24 hours, the remaining The second colchicine treatment step 4) which is washed with sterilized water except for the wrinkles that are removed, is cultured for approximately one month, the side branch that has emerged is transplanted to a new medium, the ploidy of the lower leaf of the side branch is measured, Production status confirmation step for confirming the production status of tetraploid poplars 5) Ploidy stabilization step for repeating planting and ploidy measurement until the ploidy of tetraploid poplars is stabilized
第２のコルヒチン処理ステップは、第１のコルヒチン処理ステップのみでは、紡錘体の形成（細胞分裂）を十分に阻害できないために行うものである。すなわち、コルヒチンは細胞周期の内の紡錘体の形成（細胞分裂）を開始する時期（Ｍ期）を阻害するが、細胞周期が１周するのに約１日かかることから、すべての細胞がＭ期に到達してからコルヒチンの作用を受けるようにするため、このように２４時間後に再び第２のコルヒチン処理を行う。第２のコルヒチン処理ステップにおいて、洗浄作業は、数回繰り返し、５〜１０分間行う。本発明の４倍体ポプラの作出方法を用いた場合でも、すべてのシュートにつき４倍体ポプラを作出することができるわけではなく、その確率は総ライン数に対して５〜７％である。 The second colchicine treatment step is performed because the spindle formation (cell division) cannot be sufficiently inhibited only by the first colchicine treatment step. That is, colchicine inhibits the time (M phase) at which spindle formation (cell division) starts in the cell cycle, but since it takes about one day for the cell cycle to make one round, In order to receive the action of colchicine after reaching the period, the second colchicine treatment is performed again after 24 hours. In the second colchicine treatment step, the cleaning operation is repeated several times and performed for 5 to 10 minutes. Even when the tetraploid poplar production method of the present invention is used, tetraploid poplar can not be produced for every shoot, and the probability is 5 to 7% with respect to the total number of lines.
本発明の４倍体ポプラの作出方法によれば、簡便なＤＮＡ倍加処理により、４倍体のポプラを安定的に作出することができるといった効果がある。 According to the tetraploid poplar production method of the present invention, there is an effect that tetraploid poplar can be stably produced by a simple DNA doubling treatment.
以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。 Hereinafter, an example of an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. The scope of the present invention is not limited to the following examples and illustrated examples, and many changes and modifications can be made.
図１は、実施例１の４倍体ポプラの作出方法のフロー図を示している。
図１に示されるように、まず、２倍体ポプラのシュートの植え継ぎを行う（Ｓ０１）。そして、２８日経過後、下の葉を２〜４枚残し、主茎を切除する（Ｓ０２）。次に、シュートの腋芽にコルヒチン溶液を乗せる（Ｓ０３）。かかる状態で２４時間培養を行い、培養後、残った雫を除く（Ｓ０４）。さらに、シュートの腋芽にコルヒチン溶液を乗せる（Ｓ０５）。かかる状態で２４時間培養を行い、培養後、残った雫を除く（Ｓ０６）。そして、滅菌水で腋芽を洗浄する（Ｓ０７）。その後、４週間培養し（Ｓ０８）、出てきた側枝を新しい培地に植え継ぎ、側枝の下葉の倍数性を測定する（Ｓ０９）。このとき、ＤＮＡ倍加が確認できた個体の主茎を、葉を４枚程度残すように切除し、新しい培地に植え継ぎ、２８日間培養する（Ｓ１０）。この植え継ぎを４倍体ポプラの倍数性パターン（Ploidy pattern）が安定するまで繰り返す（Ｓ１１）。すなわち、植え継ぎに側枝を用いるのは、コルヒチン処理後だけであり、その後は、主茎の先端側を切除して植え継ぎに用いる。そして、その倍数性パターンが４倍体（４ｎ）に収束する個体を選抜していく。
なお、１回の植え継ぎだけでは、倍数性パターンの安定化を確認できないので、少なくとも２回の植え継ぎが必要である。安定化のためには３回植え継ぎを行っても構わない。
FIG. 1 shows a flow chart of a method for producing tetraploid poplar of Example 1.
As shown in FIG. 1, first, shoots of diploid poplar shoots are transplanted (S01). Then, after 28 days, 2 to 4 lower leaves are left and the main stem is excised (S02). Next, a colchicine solution is placed on the shoots of the shoots (S03). Cultivation is carried out for 24 hours in this state, and the remaining sputum is removed after culturing (S04). Further, a colchicine solution is placed on the shoots of the shoots (S05). Cultivation is carried out for 24 hours in this state, and the remaining sputum is removed after culturing (S06). Then, the buds are washed with sterilized water (S07). Thereafter, the cells are cultured for 4 weeks (S08), and the side branch that has emerged is planted in a new medium, and the ploidy of the lower leaf of the side branch is measured (S09). At this time, the main stem of the individual in which DNA doubling has been confirmed is excised so as to leave about 4 leaves, transplanted to a new medium, and cultured for 28 days (S10). This planting is repeated until the ploidy pattern of tetraploid poplar is stabilized (S11). That is, the side branch is used for planting only after colchicine treatment, and thereafter, the distal end side of the main stem is excised and used for planting. Then, individuals whose ploidy pattern converges to tetraploid (4n) are selected.
In addition, since the stabilization of the ploidy pattern cannot be confirmed with only one planting joint, at least two planting joints are necessary. For stabilization, three times of planting may be performed.
実施例１の４倍体ポプラの作出手順について、図２を参照して説明する。
まず、コルヒチン処理準備ステップについて説明する。最初に、コルヒチン処理の対象となる２倍体ポプラのシュート１ａをポット６の中に設けられた培地７に植え継ぐ。植え継ぎを行ってから２８日後にシュート１ａ下の葉を３枚程度残して主茎を切除する。
図２（１）は、コルヒチン処理準備ステップが完了し、これから第１のコルヒチン処理ステップに移行する状態を示している。図２（１）に示されるように、２倍体ポプラのシュート１ａは、ポット６の中に設けられた培地７に植え継がれている。シュート１ａは、茎３と葉（４ａ，４ｂ，４ｃ）から成り、根５はシュート１ａから伸びたものである。シュート１ａは、下の葉を３枚程度残して主茎が切除されている。
The production procedure of the tetraploid poplar of Example 1 will be described with reference to FIG.
First, the colchicine treatment preparation step will be described. First, the shoot 1a of the diploid poplar to be subjected to colchicine treatment is planted in the medium 7 provided in the pot 6. 28 days after planting, the main stem is excised, leaving about 3 leaves under the shoot 1a.
FIG. 2 (1) shows a state in which the colchicine treatment preparation step is completed and the process proceeds to the first colchicine treatment step. As shown in FIG. 2 (1), the shoot 1 a of the diploid poplar is planted in the medium 7 provided in the pot 6. The shoot 1a consists of stems 3 and leaves (4a, 4b, 4c), and the root 5 extends from the shoot 1a. The main stem of the shoot 1a is cut away, leaving about three lower leaves.
次に、第１のコルヒチン処理ステップについて説明する。
コルヒチン処理は、葉４ａの根元の腋芽８にピペット１０を用いてコルヒチン溶液２を乗せることで行う。ここで用いたコルヒチン溶液は、コルヒチン濃度が０．０１ｗ／ｖ％であり、これにゲル化剤としてアガーを添加している。アガーの濃度は０．２ｗ／ｖ％である。アガーは、腋芽８の上に乗せたコルヒチン溶液２が腋芽８から流れ落ちないように、安定的に留めるための粘性のゲル化剤として用いている。
図２（２）はコルヒチン溶液２が腋芽８の上に乗せられた状態を示している。図２（２）に示されるように、腋芽８に乗せるコルヒチン溶液２の量は、雫の球ができ、かつ、雫が流れ落ちないくらいの量にする。雫が流れ落ちないようにし、かかる状態で２４時間培養を行う。２４時間培養後、残ったコルヒチン溶液２の雫を除く。
Next, the first colchicine treatment step will be described.
The colchicine treatment is performed by placing the colchicine solution 2 on the axillary bud 8 at the root of the leaf 4a using the pipette 10. The colchicine solution used here has a colchicine concentration of 0.01 w / v%, to which agar is added as a gelling agent. The concentration of agar is 0.2 w / v%. The agar is used as a viscous gelling agent for stably keeping the colchicine solution 2 placed on the buds 8 from flowing down from the buds 8.
FIG. 2 (2) shows a state where the colchicine solution 2 is placed on the buds 8. As shown in FIG. 2 (2), the amount of the colchicine solution 2 to be placed on the buds 8 is set so that the bud balls are formed and the buds do not flow down. Incubate for 24 hours in such a state so that the sputum does not flow down. After incubation for 24 hours, the remaining colchicine solution 2 sputum is removed.
次に、第２のコルヒチン処理ステップについて説明する。
第１のコルヒチン処理ステップにおいて、残ったコルヒチン溶液２の雫を除いた後、腋芽８に新たにコルヒチン溶液２を乗せる。さらに２４時間培養後、残っている雫を除き、滅菌水（図示せず）を乗せて洗浄する作業を２回、繰り返し行う。
Next, the second colchicine treatment step will be described.
In the first colchicine treatment step, the remaining colchicine solution 2 is removed, and then the colchicine solution 2 is newly placed on the bud 8. After further incubation for 24 hours, the remaining sputum is removed and the operation of washing with sterilized water (not shown) is repeated twice.
次に、作出状況確認ステップについて説明する。
図２（３）は、第２のコルヒチン処理ステップが完了後、４週間培養を行った状態を示している。図２（３）に示されるように、４週間シュート１ａを培養したことにより側枝が伸びた状態となっている。出てきた側枝については切除し、シュート１ｂとして新しい培地に植え継ぎを行う。図２（４）は、切除した側枝を植え継ぎ培養を行った状態を示している。図２（４）に示されるように、切除した側枝はシュート１ｂとして新しい培地に植え継がれている。その際に、シュート１ｂの下葉の倍数性を測定し、作出状況を確認する。
Next, the production status confirmation step will be described.
FIG. 2 (3) shows a state in which the culture was performed for 4 weeks after the completion of the second colchicine treatment step. As shown in FIG. 2 (3), the side branch has been extended by culturing the shoot 1 a for 4 weeks. The side branch that comes out is excised and transplanted to a new medium as a shoot 1b. FIG. 2 (4) shows a state where the excised side branch is transplanted and cultured. As shown in FIG. 2 (4), the excised side branch is planted in a new medium as a shoot 1b. At that time, the ploidy of the lower leaf of the shoot 1b is measured to confirm the production status.
次に、倍数性安定化ステップについて説明する。
作出状況確認後、４倍体ポプラの倍数性パターンが安定するまで、２８日毎に主茎を植え継いで、倍数性を測定する。ここで、シュート１ａから植え継がれたシュート１ｂだけではなく、コルヒチン処理した他の腋芽由来のシュートも含め、異なる腋芽から発生した個体の単位をラインと呼ぶ。１つのラインにつき複数回の植え継ぎを行い、その度に繰り返しシュートが得られることになる。
Next, the ploidy stabilization step will be described.
After confirming the production status, the main stem is planted every 28 days until the ploidy pattern of tetraploid poplar is stabilized, and ploidy is measured. Here, not only the shoot 1b planted from the shoot 1a but also shoots derived from other buds treated with colchicine, the unit of individuals generated from different buds is called a line. A plurality of times of planting are performed per line, and a shoot is repeatedly obtained each time.
倍数性安定化ステップにおいて、個々のラインにおけるシュートの倍数性が安定しているかを判定するためには、各シュートの倍数性を測定する必要があるが、倍数性の測定は、フローサイトメトリーと呼ばれる分析方法により行う。フローサイトメトリーとは、試料の細胞や核などを蛍光性の色素で染色し、その蛍光強度をフローサイトメーターという分析装置で読み取り、相対的なＤＮＡ量を測定する分析方法である。すなわち、通常の２倍体の蛍光強度のピーク値を２Ｃとすると、蛍光強度のピーク値は、４倍体では２倍体のおよそ２倍（４Ｃ）、８倍体では２倍体のおよそ４倍（８Ｃ）と、倍数性に比例して大きくなることになる。 In the ploidy stabilization step, it is necessary to measure the ploidy of each shoot in order to determine whether the ploidy of each shoot is stable in each line. The analysis method is called. Flow cytometry is an analytical method in which cells or nuclei of a sample are stained with a fluorescent dye, the fluorescence intensity is read with an analyzer called a flow cytometer, and the relative DNA amount is measured. That is, assuming that the peak value of the fluorescence intensity of the normal diploid is 2C, the peak value of the fluorescence intensity is approximately twice that of the diploid (4C) in the tetraploid, and approximately 4 times that of the diploid in the octaploid. Double (8C) increases in proportion to the ploidy.
図３は、実施例１の４倍体ポプラの作出方法のＤＮＡ倍数性解析結果の比較グラフを示し、（１）はコルヒチン処理を行っていない２倍体ポプラ、（２）はコルヒチン処理を行った２倍体と４倍体のキメラのポプラ、（３）はコルヒチン処理を行った４倍体ポプラ、（４）はコルヒチン処理を行った４倍体と８倍体のキメラのポプラを示している。蛍光強度を示す横軸上に表示された点線は、蛍光強度のピーク値が現れている場合に倍数性が認められる基準となる蛍光強度（２Ｃ，４Ｃ，８Ｃ）を示し、蛍光強度（２Ｃ）は２倍体、蛍光強度（４Ｃ）は４倍体、蛍光強度（８Ｃ）は８倍体を示す基準となる。また、２ｎとは２倍体を示し、４ｎは４倍体、８ｎは８倍体、１６ｎは１６倍体をそれぞれ示す。なお、「２ｎ，４ｎ」とは２倍体と４倍体のキメラのポプラを示す。ここで、キメラとは、同一個体内に異なったＤＮＡ倍数性を持つ細胞が混じっていることをいう。 FIG. 3 shows a comparison graph of DNA ploidy analysis results of the tetraploid poplar production method of Example 1, wherein (1) is a diploid poplar not subjected to colchicine treatment, and (2) is subjected to colchicine treatment. Diploid and tetraploid chimeric poplar, (3) shows tetraploid poplar treated with colchicine, (4) shows tetraploid and octaploid chimeric poplar treated with colchicine Yes. The dotted line displayed on the horizontal axis indicating the fluorescence intensity indicates the fluorescence intensity (2C, 4C, 8C) that serves as a reference for ploidy when the peak value of the fluorescence intensity appears, and the fluorescence intensity (2C). Is a diploid, fluorescence intensity (4C) is tetraploid, and fluorescence intensity (8C) is a reference indicating octaploid. 2n represents a diploid, 4n represents a tetraploid, 8n represents an 8-fold, and 16n represents a 16-fold. Note that “2n, 4n” indicates diploid and tetraploid chimeric poplar. Here, chimera means that cells having different DNA ploidy are mixed in the same individual.
（１）のグラフでは、コルヒチン処理を行っていない２倍体ポプラを用い、ピーク値が現れている蛍光強度を、２倍体ポプラを示す基準となる蛍光強度（２Ｃ）として設定している。かかる基準を元に、４倍体ポプラを示す基準となる蛍光強度（４Ｃ）及び８倍体ポプラを示す基準となる蛍光強度（８Ｃ）を設定して測定を行う。
（２）のグラフでは、蛍光強度（２Ｃ，４Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、２倍体と４倍体のキメラのポプラであることが測定できる。
（３）のグラフでは、蛍光強度（４Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、４倍体ポプラであることが測定できる。
（４）のグラフでは、蛍光強度（４Ｃ，８Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、４倍体と８倍体のキメラのポプラであることが測定できる。
In the graph of (1), a diploid poplar that has not been subjected to colchicine treatment is used, and the fluorescence intensity at which the peak value appears is set as a reference fluorescence intensity (2C) indicating the diploid poplar. Based on such a reference, measurement is performed by setting a reference fluorescence intensity (4C) indicating tetraploid poplar and a reference fluorescence intensity (8C) indicating octaploid poplar.
In the graph of (2), since the peak value of the fluorescence intensity appears in the vicinity of the fluorescence intensity (2C, 4C), it can be measured that the poplar is a diploid and tetraploid chimera.
In the graph of (3), since the peak value of the fluorescence intensity appears in the vicinity of the fluorescence intensity (4C), it can be measured to be tetraploid poplar.
In the graph of (4), since the peak value of the fluorescence intensity appears in the vicinity of the fluorescence intensity (4C, 8C), it can be measured that it is a tetraploid and an 8-fold chimera poplar.
下記表１は、コルヒチン処理後のシュートの倍加状況を上記方法により解析した一覧を示している。コルヒチン処理後に発生した側枝を１回植え継いで測定したものであり、倍数性パターンは未だ安定していない段階である。 Table 1 below shows a list of shoot doubling situations after colchicine treatment analyzed by the above method. The side branch generated after colchicine treatment was measured by planting once, and the ploidy pattern is not yet stable.
上記表１に示されるように、コルヒチン処理後、１回植え継ぎを行った結果、総ライン数３６１の内、４倍体ポプラが２６作出されていることが確認できている。安定化前とはいえ、そもそもＤＮＡ倍加が起こり難いポプラにおいては、約７．２０％（２６／３６１）という数値は、非常に高い数値であるといえる。 As shown in Table 1 above, after colchicine treatment, it was confirmed that 26 tetraploid poplars were produced out of the total number of lines 361 as a result of one transplantation. In the poplar where DNA doubling hardly occurs in the first place even before stabilization, the numerical value of about 7.20% (26/361) can be said to be a very high numerical value.
図４は、実施例１の４倍体ポプラの作出方法におけるシュートの倍加状況を示し、（１）は初代が４倍体のポプラの継代による倍数性の変化、（２）は初代が４倍体と８倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化、（３）は初代が４倍体，８倍体及び１６倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化、（４）は初代が８倍体のポプラの継代による倍数性の変化、（５）は初代が８倍体と１６倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化を示している。
ここでは、１回植え継ぎを行ったラインにおけるシュートを初代のシュートと呼んでいる。
FIG. 4 shows the doubling situation of shoots in the tetraploid poplar production method of Example 1, wherein (1) is a change in ploidy due to passage of poplar whose primary is tetraploid, and (2) is 4 that is primary. Change in ploidy by passage of the poplar of the haploid and the haploid chimera, (3) shows change of ploidy by passage of the poplar of the tetraploid, octuploid and 16-fold of the chimera ( 4) shows the change in ploidy due to passage of the first generation of an eight-fold poplar, and (5) shows the change in ploidy due to passage of the first generation of eight-fold and 16-fold chimeric poplar.
Here, the shoot in the line where the planting is performed once is called the first shoot.
図４（１）に示されるように、初代のシュートが４倍体のポプラとなっているライン数は２６であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、２倍体ポプラが４、２倍体と４倍体のキメラのポプラが９に、４倍体ポプラが１３になっている。２代目に４倍体ポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、２倍体と４倍体のキメラのポプラが１に、４倍体ポプラが１０になっている。 As shown in FIG. 4 (1), the number of lines in which the first shoot is a tetraploid poplar is 26, but in the second shoot that has been transplanted again, there are 4 diploid poplars. The diploid and tetraploid chimera poplar is 9 and the tetraploid poplar is 13. In the shoot of the third generation, in which the shoot that became tetraploid poplar in the second generation was further planted, the chimera poplar of diploid and tetraploid became 1, and the tetraploid poplar became 10.
図４（２）に示されるように、初代のシュートが４倍体と８倍体のキメラのポプラとなっているライン数は２８であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、２倍体ポプラが７に、２倍体と４倍体のキメラのポプラが９に、４倍体ポプラが８に、４倍体と８倍体のキメラのポプラが３になっている。
また、２代目に４倍体ポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、４倍体ポプラが８になっている。２代目に４倍体と８倍体のキメラのポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、４倍体と８倍体のキメラのポプラが１になっている。
As shown in FIG. 4 (2), the number of lines in which the first shoot is a tetraploid and octaploid chimera poplar is 28, but in the second shoot that has been transplanted again, The diploid poplar is 7, the diploid and tetraploid chimeric poplar is 9, the tetraploid poplar is 8, and the tetraploid and octaploid chimeric poplar is 3.
In addition, the tetraploid poplar is 8 in the third-generation shoot in which the shoot that became tetraploid poplar in the second generation is further planted. In the shoot of the third generation, in which the shoots that became tetraploid and octaploid chimeric poplars in the second generation were further planted, the tetraploid and octaploid chimeric poplars became 1.
図４（３）に示されるように、初代のシュートが４倍体，８倍体及び１６倍体のキメラのポプラとなっているライン数は７であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、２倍体ポプラが１に、２倍体と４倍体のキメラのポプラが５に、４倍体ポプラが１に、４倍体，８倍体及び１６倍体のキメラのポプラが０になっている。２代目に４倍体ポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、２倍体と４倍体のキメラのポプラが１になっている。 As shown in FIG. 4 (3), the number of lines in which the first shoot is a quadruplet, 8-fold and 16-fold chimera poplar is 7, but the second generation was transplanted again. Shoots of diploid poplar, diploid and tetraploid chimera poplar, 5, tetraploid poplar to 1, tetraploid, octaploid and 16-fold chimera poplar Is 0. In the shoot of the third generation, in which the shoot that became tetraploid poplar in the second generation was further planted, the chiropractic poplar of diploid and tetraploid is 1.
図４（４）に示されるように、初代のシュートが８倍体のポプラとなっているライン数は４であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、２倍体ポプラが１に、８倍体ポプラが２になっている。２代目に８倍体ポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、８倍体ポプラが２になっている。 As shown in FIG. 4 (4), the number of lines in which the first shoot is an octaploid poplar is 4, but in the second shoot that has been transplanted again, the diploid poplar is 1 In addition, the octaploid poplar is two. In the third-generation shoot, in which the shoot that became the 8-fold poplar in the second generation was further planted, the octaploid poplar was 2.
図４（５）に示されるように、初代のシュートが８倍体と１６倍体のキメラのポプラとなっているライン数は２であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、４倍体ポプラが１になっている。 As shown in FIG. 4 (5), the number of lines in which the first shoot is a poplar chimera of 8-fold and 16-fold chimera is 2, but in the second-generation shoot that has been transplanted again, The tetraploid poplar is 1.
図５は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラの木部細胞面積及び木部細胞数の比較グラフを示している。なお、２倍体を示す２ｎの後の＃は各々の個体をナンバリングしたものである。
図５に示されるように、２倍体ポプラと４倍体ポプラでは、木部細胞面積については、２倍体ポプラが７０〜８５ｍｍ２であるのに対し、４倍体ポプラは１１０〜１４５ｍｍ２である。
また、木部細胞数については、２倍体ポプラと４倍体ポプラの何れについても５〜７個となっており、殆ど違いは無いことが分かる。
木部細胞数については殆ど違いが無いにもかかわらず、木部細胞面積については４倍体ポプラは２倍体ポプラより１．５倍以上広い面積を有しているので、４倍体ポプラの木部細胞は、２倍体ポプラより１．５倍以上大きいことが確認できた。
FIG. 5 shows a comparative graph of the xylem cell area and the number of xylem cells in Example 1 of diploid and tetraploid poplar. In addition, # after 2n which shows a diploid is numbering each individual | organism | solid.
As shown in FIG. 5, in the diploid poplar and tetraploid poplar, for xylem cells area, whereas diploid poplar is 70～85Mm 2, tetraploid poplar 110～145Mm 2 It is.
Further, the number of xylem cells is 5 to 7 for both diploid and tetraploid poplar, and it can be seen that there is almost no difference.
Despite almost no difference in the number of xylem cells, tetraploid poplar has an area 1.5 times larger than diploid poplar in terms of xylem cell area. It was confirmed that xylem cells were 1.5 times larger than diploid poplar.
図６は、ＣＯ２固定化に関する２倍体と４倍体ポプラの比較データを示し、（１）は光合成有効放射量による比較、（２）は葉内ＣＯ２濃度による比較を示している。なお、グラフ縦軸を示すＣＯ２固定速度とは、単位時間・単位葉面積あたりのＣＯ２固定量のことである。
図６（１）に示されるように、丸印で示される２倍体ポプラ（２ｎ），三角印で示される４倍体ポプラ（４ｎ＃１３）及び四角印で示される４倍体ポプラ（４ｎ＃１６）の葉につき、照射する光量を変化させた場合のＣＯ２固定速度については、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）のＣＯ２固定速度に有意差は認められなかった。
図６（２）に示されるように、丸印で示される２倍体ポプラ（２ｎ），三角印で示される４倍体ポプラ（４ｎ＃１３）及び四角印で示される４倍体ポプラ（４ｎ＃１６）の葉につき、葉内のＣＯ２濃度を変化させた場合のＣＯ２固定速度については、大気中のＣＯ２濃度に近い４００ｐｐｍ以下では、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）のＣＯ２固定速度に有意差は認められなかった。
FIG. 6 shows comparison data between diploid and tetraploid poplar regarding CO 2 fixation, (1) shows a comparison by photosynthetic effective radiation amount, and (2) shows a comparison by intra-leaf CO 2 concentration. The CO 2 fixed speed indicating the vertical axis of the graph is the fixed amount of CO 2 per unit time / unit leaf area.
As shown in FIG. 6 (1), a diploid poplar (2n) indicated by a circle mark, a tetraploid poplar (4n # 13) indicated by a triangle mark, and a tetraploid poplar (4n) indicated by a square mark per leaf # 16), for CO 2 fixation rate of varying the amount of light to be irradiated, the CO 2 fixation rate of diploid poplar (2n) and tetraploid poplar (4n # 13,4n # 16) There was no significant difference.
As shown in FIG. 6 (2), a diploid poplar (2n) indicated by a circle mark, a tetraploid poplar (4n # 13) indicated by a triangle mark, and a tetraploid poplar (4n) indicated by a square mark For the # 16) leaves, the CO 2 fixation rate when the CO 2 concentration in the leaves is changed is diploid poplar (2n) and tetraploid poplar at 400 ppm or less, which is close to the CO 2 concentration in the atmosphere. There was no significant difference in the CO 2 fixation rate of (4n # 13, 4n # 16).
図７は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラの下からの葉の枚数と葉面積の相関図を示し、（１）は２倍体ポプラ、（２）は４倍体ポプラを示している。
図７に示されるように、（１）の２倍体ポプラにおいては、葉面積は最大のものでも約３０ｃｍ２であるが、（２）の４倍体ポプラにおいては、葉面積は最大のものになると６０ｃｍ２以上であることが分かる。また、それ以外についても２倍体ポプラよりも４倍体ポプラの方が、葉面積が広い傾向にあることがわかる。
FIG. 7 shows the correlation between the number of leaves and the leaf area from the bottom of the diploid and tetraploid poplar of Example 1, where (1) is diploid poplar and (2) is tetraploid poplar. Show.
As shown in FIG. 7, in the diploid poplar of (1), the leaf area is about 30 cm 2 at maximum, but in the tetraploid poplar of (2), the leaf area is the largest. When it becomes, it turns out that it is 60 cm < 2 > or more. In addition, it can be seen that the tetraploid poplar tends to have a larger leaf area than the diploid poplar.
図８は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラのＣＯ２固定速度に関する比較グラフを示し、（１）は総葉面積、（２）は個体あたりのＣＯ２固定速度を示している。
図８（１）に示されるように、２倍体ポプラの総葉面積は４３４ｃｍ２であるのに対し、４倍体ポプラの総葉面積は６８３ｃｍ２である。したがって、４倍体ポプラの総葉面積は２倍体ポプラの総葉面積の約１．６倍となっており、葉についても巨大化されていることが分かる。
また、図８（２）に示されるように、個体あたりのＣＯ２固定速度についても、２倍体ポプラの個体あたりのＣＯ２固定速度は１６．９μｍｏｌ ＣＯ２／ｍｉｎであるのに対し、４倍体ポプラの個体あたりのＣＯ２固定速度は２３．９μｍｏｌ ＣＯ２／ｍｉｎである。したがって、４倍体ポプラの個体あたりのＣＯ２固定速度は２倍体ポプラの個体あたりのＣＯ２固定速度の約１．４倍となっており、ＣＯ２固定速度についても上昇していることが分かる。
FIG. 8 shows a comparison graph regarding the CO 2 fixation rate of the diploid and tetraploid poplar of Example 1, (1) shows the total leaf area, and (2) shows the CO 2 fixation rate per individual. .
As shown in FIG. 8 (1), the total leaf area of diploid poplar is 434 cm 2 , while the total leaf area of tetraploid poplar is 683 cm 2 . Therefore, the total leaf area of tetraploid poplar is about 1.6 times the total leaf area of diploid poplar, and it can be seen that the leaves are also enlarged.
Further, as shown in FIG. 8 (2), the CO 2 fixation rate per individual is 16.9 μmol CO 2 / min, whereas the CO 2 fixation rate per individual of diploid poplar is 4 The CO 2 fixation rate per individual poploid poplar is 23.9 μmol CO 2 / min. Therefore, the CO 2 fixation rate per individual of tetraploid poplar is about 1.4 times the CO 2 fixation rate per individual of diploid poplar, and the CO 2 fixation rate is also increased. I understand.
図９は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラの茎についての比較グラフを示し、（１）は茎の高さ、（２）は茎の太さ、（３）は茎の体積を示している。
図９に示されるように、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）では、（１）茎の高さ、（２）茎の太さ、（３）茎の体積の何れについても２倍体ポプラ（２ｎ）よりも４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）の方が高い数値を示している。特に（３）茎の体積については、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１６）では２倍以上の差となっており、木部の巨大化に成功していることが分かる。
FIG. 9 shows a comparison graph for stems of diploid and tetraploid poplar of Example 1, where (1) is the height of the stem, (2) is the thickness of the stem, and (3) is the volume of the stem. Is shown.
As shown in FIG. 9, in diploid poplar (2n) and tetraploid poplar (4n # 13, 4n # 16), (1) stem height, (2) stem thickness, (3) For any stem volume, tetraploid poplar (4n # 13, 4n # 16) shows a higher value than diploid poplar (2n). In particular, (3) the stem volume is more than twice the difference between diploid poplar (2n) and tetraploid poplar (4n # 16). I understand.
図１０は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラの重量についての比較グラフを示し、（１）は生重量、（２）は乾重量を示している。ここで、生重量は水分を含んだ状態であり、乾重量は水分を含まない状態である。
図１０（１）及び（２）に示されるように、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）では、葉及び茎の総重量について、生重量と乾重量の何れにおいても４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）の方が高い数値を示している。２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３）では、特に、その差は顕著であり、約１．５倍以上の差となっている。このように重量の点からも、４倍体ポプラの作出方法では、木部の巨大化に成功していることがわかる。
FIG. 10 shows a comparison graph of the weights of the diploid and tetraploid poplar of Example 1, (1) shows the raw weight, and (2) shows the dry weight. Here, the raw weight is in a state including water, and the dry weight is in a state not including water.
As shown in FIGS. 10 (1) and (2), in the diploid poplar (2n) and the tetraploid poplar (4n # 13, 4n # 16), the total weight of leaves and stems is measured with the fresh weight and the dry weight. In any weight, tetraploid poplar (4n # 13, 4n # 16) shows a higher numerical value. The difference is particularly significant between diploid poplar (2n) and tetraploid poplar (4n # 13), which is a difference of about 1.5 times or more. Thus, from the point of weight, it can be seen that the tetraploid poplar production method has succeeded in enlarging the xylem.
ここで、２倍体ポプラではなく２倍体ユーカリを用いて、本発明のＤＮＡ倍加処理を行った結果を説明する。２倍体ユーカリを用いるという点以外は、上記の処理と同じ条件、やり方を行っている。
図１１は、４倍体ユーカリの作出方法のＤＮＡ倍数性解析結果の比較グラフを示し、（１）はコルヒチン処理を行っていない２倍体ユーカリ、（２）はコルヒチン処理を行った２倍体と４倍体のキメラのユーカリ、（３）はコルヒチン処理を行った４倍体ユーカリを示している。倍数性の測定についても、同様に、フローサイトメトリーと呼ばれる分析方法により行う。
Here, the result of performing the DNA doubling treatment of the present invention using diploid eucalyptus instead of diploid poplar will be described. Except for using diploid eucalyptus, the same conditions and methods as the above-mentioned processing are performed.
FIG. 11 shows a comparison graph of DNA ploidy analysis results of a tetraploid eucalyptus production method, (1) diploid eucalyptus not treated with colchicine, and (2) diploid treated with colchicine. And tetraploid chimeric eucalyptus, (3) shows tetraploid eucalyptus treated with colchicine. Similarly, ploidy is measured by an analysis method called flow cytometry.
（１）のグラフでは、コルヒチン処理を行っていない２倍体ユーカリを用い、ピーク値が現れている蛍光強度を、２倍体ユーカリを示す基準となる蛍光強度（２Ｃ）として設定している。かかる基準を元に、４倍体ユーカリを示す基準となる蛍光強度（４Ｃ）を設定して測定を行う。
（２）のグラフでは、蛍光強度（２Ｃ，４Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、２倍体と４倍体のキメラのユーカリであることが測定できる。
（３）のグラフでは、蛍光強度（４Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、４倍体ユーカリであることが測定できる。
下記表２は実施例２の４倍体ユーカリの作出結果を示した表である。
In the graph of (1), diploid eucalyptus that has not been subjected to colchicine treatment is used, and the fluorescence intensity at which the peak value appears is set as the fluorescence intensity (2C) that serves as a reference indicating diploid eucalyptus. Based on this standard, the measurement is performed with the fluorescence intensity (4C) serving as a standard indicating tetraploid eucalyptus being set.
In the graph of (2), since the peak value of the fluorescence intensity appears in the vicinity of the fluorescence intensity (2C, 4C), it can be measured that it is a eucalyptus of diploid and tetraploid chimeras.
In the graph of (3), since the peak value of the fluorescence intensity appears in the vicinity of the fluorescence intensity (4C), it can be measured to be tetraploid eucalyptus.
Table 2 below is a table showing the results of producing tetraploid eucalyptus of Example 2.
上記表２に示されるように、コルヒチン処理後、１回植え継ぎを行った結果、総ライン数８１の内、４倍体ユーカリが３個体、作出されていることがわかる。約３．７０％（３／８１）という割合は、４倍体ポプラの作出割合よりも低い値である。 As shown in Table 2 above, after colchicine treatment, as a result of one planting joint, it can be seen that 3 tetraploid eucalyptus out of 81 total lines are produced. The ratio of about 3.70% (3/81) is lower than the production ratio of tetraploid poplar.
本発明は、植物バイオマスの資源化に有用である。 The present invention is useful for recycling plant biomass.
１ シュート
２ コルヒチン溶液
３ 茎
４ 葉
５ 根
６ ポット
７ 培地
８ 腋芽
１０ ピペット
1 shoot 2 colchicine solution 3 stem 4 leaf 5 root 6 pot 7 medium 8 bud 10 pipette
Claims (9)
２）シュートの腋芽にコルヒチン溶液を乗せ、略２４時間培養を行った後、残った雫を除く第１のコルヒチン処理ステップと、
３）第１のコルヒチン処理ステップの後、腋芽に新たにコルヒチン溶液を乗せ、さらに略２４時間培養後、残っている雫を除き、滅菌水を乗せて洗浄する第２のコルヒチン処理ステップと、
４）略１ヵ月培養し、出てきた側枝を新しい培地に植え継ぎ、側枝の下葉の倍数性を測定して、４倍体ポプラを作出状況を確認する作出状況確認ステップと、
５）４倍体ポプラの倍数性が安定するまで、植え継ぎと倍数性の測定を繰り返す倍数性安定化ステップ、
から成ることを特徴とする４倍体ポプラの作出方法。
1) A colchicine treatment preparation step in which shoots of diploid poplar are transplanted into the medium, and after approximately 28 days after planting, at least one leaf under the shoot is left and the main stem is excised.
2) A colchicine solution is placed on the shoots of the shoots, cultured for about 24 hours, and then the first colchicine treatment step for removing the remaining buds;
3) After the first colchicine treatment step, a colchicine solution is newly placed on the axillary bud, and after further incubation for about 24 hours, the remaining cocoon is removed, and the second colchicine treatment step is washed with sterilized water,
4) Cultivation for approximately one month, planting the emerged side branch in a new medium, measuring the ploidy of the lower leaf of the side branch, and confirming the production status of the tetraploid poplar;
5) Ploidy stabilization step of repeating planting and ploidy measurement until the ploidy of tetraploid poplar is stabilized,
A method for producing tetraploid poplar, comprising:
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| JP2015073510A (en) * | 2013-10-11 | 2015-04-20 | 国立大学法人 新潟大学 | Brassicaceae plant modified from seed-stage vernalization characteristic to green-stage vernalization characteristic, and production method thereof |
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2015
- 2015-06-22 JP JP2015125160A patent/JP6593684B2/en active Active
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