JP2016539635A - 抗原特異的調節性ｔ細胞の誘導方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、インビトロまたはインビボで抗原特異的調節性細胞を取得する方法に関する。該調節性細胞は、ＮＫＴ細胞によって抗原提示細胞のアポトーシスを誘導することによって取得可能である。特に、天然型の、または隣接残基内にチオレダクターゼモチーフを含有するように改変されたＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープに曝露することによって、インビトロまたはインビボでＮＫＴ細胞を誘発する。本発明は、自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギー性疾患などの疾患を抑制または予防するためのアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を負荷した未熟抗原提示細胞を誘発するための方法、ならびにそれに関連する医薬を開示する。自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギー性疾患などの疾患を抑制または予防するための抗原特異的調節性細胞の使用、ならびにそれに関連する医薬がさらに開示される。本方法によって取得される抗原特異的調節性細胞集団がさらに開示される。

Description

発明の分野
本発明は、抗原特異的調節性Ｔ細胞を取得する方法、および自己免疫疾患、アレルギー性疾患または移植片拒絶などの症状を治療するための医薬としてのそれらの使用に関する。

発明の背景
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、特に転写抑制因子Ｆоｘｐ３を発現する調節性Ｔ細胞は、正常な免疫恒常性を維持するのに必須である。このような細胞が存在しなければ、糖尿病および他の自己免疫疾患などの臨床徴候と共に、自己免疫が急速に生じる（Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１８ ５４−５８で概説されている）。Ｆоｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、胸腺において能動的に選択され、Ｆоｘｐ３を安定発現する末梢血に見られる細胞集団を構成する。胸腺上皮細胞によって提示される自己ペプチドの同族認識によって胸腺で細胞が選択される基準は、エフェクターＴ細胞とは対照的に、有意な親和性を有するＦｏｘｐ３＋細胞が末梢血中に見られることである。現時点での見解は、とりわけ、低い親和性を有する自己抗原特異的エフェクター細胞と、高い親和性を有するＦоｘｐ３＋細胞との間のバランスによって、末梢寛容が維持されており、それにより、寛容への均衡がもたらされるというものである。調節性Ｔ細胞のこの中心的選択に加えて、末梢において、転写因子Ｆｏｘｐ３を発現するように細胞を変換し得る。しかしながら、発現は、胸腺で選択された集団での発現よりも低く、獲得された表現型のいくらかの可逆性が観察されている。

胸腺で選択され、高度かつ安定的なＦｏｘｐ３発現を特徴とする天然調節性Ｔ細胞の特性は、自己免疫応答を特徴とする病状を制御する手段としてだけではなく、わずかな例を挙げれば、移植片または制御下のアレルゲンに対する望ましくない応答を維持するための治療ツールとして、それらを非常に魅力的なものにする。しかしながら、末梢における抗原特異的天然調節性Ｔ細胞の数は非常に少なく、インビボまたはインビトロでそれらを増殖させるための方法は明確に定義されておらず、信頼性も低い。調節性Ｔ細胞集団を選択的に増殖させることが可能な方法は、生物が有益な応答を開始する全能力に影響を与えずに、疾患過程を予防または抑制する可能性を伴うであろう。

アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、組織恒常性を維持するのに役立つ生理的な機構である（ＦｕｃｈｓおよびＳｔｅｌｌｅｒ（２０１１）Ｃｅｌｌ １４７，７４２−７５８で概説されている）。人体では、１分間に最大１０^６個の細胞がアポトーシスによって破壊されると計算されている。細胞死によって放出される多量の抗原は、自己タンパク質に対する免疫応答の誘発を回避するように制御されなければならない。実際、アポトーシス細胞は、スカベンジャー細胞（主に、未熟樹状細胞）によって取り込まれ、次いで、寛容を誘導するようにプロセシングされる。アポトーシス細胞由来の抗原の交差提示は、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの増殖を誘発することが知られているクラスＩＩ組織適合性主複合体（ＭＨＣ）において提示される。したがって、炎症のない場合に起こる細胞のアポトーシスは、調節性Ｔ細胞を増殖させる生理的方法の代表的なものである。

したがって、（例えば、アレルギー性疾患または移植片拒絶などにおいて）免疫応答が望まれない自己抗原または抗原を提示する細胞のアポトーシスを誘導し、次いで、アポトーシス小体を生成し、抗原特異的調節性Ｔ細胞の増殖をもたらすことが可能な方法を考案することが望ましい。当技術分野で既知の非特異的免疫抑制療法は、一般に、重度の感染症および生活の質に悪影響を与える他の深刻な結果を引き起こしやすい。このように、抗原特異的調節性Ｔ細胞を使用して、従来の治療法による望ましくない効果を伴わずに免疫疾患を治療する方法を開発することが有利であろう。

ＣＤ１ｄ拘束性ＮＴＫ細胞ペプチドエピトープの同族認識によって、抗原特異的ＮＫＴ細胞を誘発することが可能な一般的な方法が記載されている（国際公開第２０１２０６９５７２号）。ペプチド特異的ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ−ＴＣＲ相互作用によって、抗原提示細胞のアポトーシスを誘導することが示された。さらに、レドックスモチーフをペプチドエピトープの隣接残基に追加すると、ＣＤ１ｄ結合ペプチドは、抗原提示細胞のアポトーシスを誘発する能力の有意な増加を示すことが記載されている（国際公開第２０１２０６９５６８号）。

Ｋｕｓｈｗａｈら（２０１０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０，１０２５−１０３５では、樹状細胞によるアポトーシス細胞の取り込みが記載されている。これらのアポトーシス細胞は、ＵＶ照射による非特異的な方法で取得されたので、不均一なアポトーシス細胞集団がもたらされた。

Ｓａｇら（２０１４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４，３７２５−３７４０では、インターロイキン１０（ＩＬ１０）の産生および分泌、ならびにＴｒｅｇに見られるタンパク質の発現などの調節性細胞の特徴を獲得しているアルファＧａｌＣｅｒ処理ＮＴＫ細胞集団が記載されている。

国際公開第２０１２０６９５７２号 国際公開第２０１２０６９５６８号

Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１８ ５４−５８ ＦｕｃｈｓおよびＳｔｅｌｌｅｒ（２０１１）Ｃｅｌｌ １４７，７４２−７５８ Ｋｕｓｈｗａｈら（２０１０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０，１０２５−１０３５ Ｓａｇら（２０１４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４，３７２５−３７４０

発明の概要
本発明は、移植片から放出された同種抗原、自己抗原またはアレルゲン由来のＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを有する抗原提示細胞のアポトーシスを誘導することによって、調節性Ｔ細胞（例えば、抗原特異的Ｆｏｘｐ３調節性Ｔ細胞）を増殖させる方法を提供する。

ＮＫＴ細胞は、動物の能動免疫によって取得され得、表面特異的抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用してアフィニティー精製によって調製され得る。あるいは、ＮＫＴ細胞は、インビトロで取得され得る（動物からＮＫＴ細胞を単離すること、および培養液中でＣＤ１ｄ拘束性エピトープに曝露することを含む方法）。本明細書またはそれぞれ国際公開第２０１２０６９５７２号および国際公開第２０１２０６９５６８号に記載されているように、このエピトープは、天然型であり得るか、または隣接残基内にチオレダクターゼモチーフを含有するものであり得る。

ＮＫＴ細胞は、抗原提示細胞のアポトーシスを誘導するためにインビボで使用され得る（ＮＫＴ細胞を動物に移植して、ＮＫＴ細胞によって認識される抗原に対する免疫応答を引き起こすことを含む方法）。

ＮＫＴ細胞は、ＮＫＴ細胞によって認識されるエピトープを提示する抗原提示細胞と共にインビトロで培養液中で使用して、アポトーシス小体を生成または取得し得る。

インビトロ培養から取得されたアポトーシス小体は、未熟抗原提示細胞を負荷するために使用され得、未熟抗原提示細胞は、ナイーブな動物から取得されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団を使用した刺激サイクルによって、抗原特異的調節性Ｔ細胞を生成または取得するために使用され得る。

インビトロ培養から取得されたアポトーシス小体は、未熟抗原提示細胞を負荷するために使用され得、未熟抗原提示細胞は、ナイーブな動物から取得されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団を使用した刺激サイクルによって、抗原特異的調節性ＮＫＴ細胞を生成または取得するために使用され得る。

インビトロ培養から取得されたアポトーシス小体を負荷した未熟抗原提示細胞は、治療を必要とする動物への受動伝達に使用され得る。

アポトーシス小体を負荷した未熟抗原提示細胞は、調節性Ｔ細胞（クラスＩＩ拘束性調節性Ｔ細胞およびＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ調節性細胞を含む）を生成または取得するためにインビトロで使用され得、次いで、これらは、治療を必要とする動物への受動伝達に使用され得る。

本明細書に記載される方法によって取得（および／または単離）された調節性Ｔ細胞（クラスＩＩ拘束性調節性Ｔ細胞およびＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ調節性細胞を含む）は、疾患の予防または治療を必要とする被験体における疾患の予防または治療に使用される。疾患は、自己免疫疾患、アレルギー性障害または移植片拒絶であり得る。

一態様では、本発明は、抗原特異的調節性Ｔ細胞を取得するインビトロ方法に関する。これらは、天然調節性細胞または誘導調節性細胞であり得る。これらの方法は、
ａ）ＣＤ１ｄ分子に結合することができるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを含むタンパク抗原に抗原特異的ＮＫＴ細胞を提供する工程；
ｂ）該抗原を提示するＡＰＣを提供する工程；
ｃ）ｂ）のＡＰＣをａ）の抗原特異的ＮＫＴ細胞に曝露することによって、該ＡＰＣのアポトーシスを誘導する工程；
ｄ）工程ｃにおいてアポトーシスを受けたＡＰＣからアポトーシス細胞および／またはアポトーシス小体を単離する工程；
ｅ）工程ｄ）のアポトーシス細胞またはアポトーシス小体由来の抗原を提示することができる細胞と共に、該アポトーシス細胞または該アポトーシス小体をインキュベートし、それにより、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を負荷した抗原提示細胞を取得する工程；
ｆ）工程ｅ）において取得した負荷抗原提示細胞をＣＤ４＋細胞源と接触させ、それにより、抗原特異的調節性細胞集団を取得する工程
を含む。

これらの方法の実施形態では、工程ａ）におけるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを含む抗原は、ＣＤ１ｄ分子に結合することができるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープが、該抗原の野生型配列に存在する抗原であり得るか；またはＣＤ１ｄ分子に結合することができるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープが、該抗原の配列の突然変異誘発によって作製される抗原であり得るか；またはＣＤ１ｄ分子に結合することができるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープが、融合タンパク質として該抗原に結合している抗原であり得る。

これらの方法の実施形態では、末梢細胞と、ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを含むペプチドとを接触させることによって、工程ａ）における抗原特異的ＮＫＴ細胞を取得する。

特定の実施形態では、該ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープは、モチーフ［ＷＦＹＨＴ］−Ｘ−Ｘ−［ＶＩＬＭ］−Ｘ−Ｘ−［ＷＦＹＨＴ］、より具体的にはモチーフ［ＷＦ］−Ｘ−Ｘ−［ＩＬ］−Ｘ−Ｘ−［ＷＦ］を含む。

特定の実施形態では、該ペプチドは、モチーフＣ−Ｘ−Ｘ−［ＣＴＳ］または［ＣＳＴ］−Ｘ−Ｘ−Ｃ、例えばＣ−Ｘ（２）−Ｃを有する配列をさらに含む。

これらの方法の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞または極性化ＣＤ４＋Ｔ細胞から、工程ａ）における抗原特異的ＮＫＴ細胞を取得する。

これらの方法の実施形態では、アフィニティー精製、遠心分離、ゲルろ過、磁気ビーズ選別および蛍光活性化選別からなる群より選択される方法によって、工程ｄにおけるアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を単離する。

これらの方法の実施形態では、該アポトーシス細胞または該アポトーシス小体由来の抗原を提示することができる工程ｅ）における細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ＭＨＣクラスＩＩ決定基を発現することができる細胞、ＣＤ１ｄ決定基を発現することができる細胞からなる群より選択される。

これらの方法の実施形態では、工程ｅ）における該アポトーシス細胞または該アポトーシス小体由来の抗原を提示することができる工程ｅ）における細胞は、末梢血単球および骨髄由来前駆体の形質転換によって取得可能な未熟ＡＰＣからなる群より選択される。

特定の実施形態では、工程ｆ）における該ＣＤ４＋細胞源は、クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞である。

他の特定の実施形態では、工程における該ＣＤ４＋細胞源は、ＣＤ１ｄ拘束性ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞である。

さらなる実施形態では、該方法は、該抗原特異的調節性Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３およびＣＤ４＋の発現を決定する工程を含む。

さらなる実施形態では、該方法は、表面マーカーの発現、サイトカインの産生またはＦｏｘｐ３の発現に基づいて、該抗原特異的調節性Ｔ細胞を区別可能なサブセットに分離する工程を含む。

本発明の別の態様は、上記方法によって取得可能な抗原特異的調節性Ｔ細胞集団（例えば、抗原特異的調節性ＮＫＴ細胞集団）に関する。

本発明の別の態様は、医薬として使用するための、上記方法によって取得可能な抗原特異的調節性Ｔ細胞集団の使用に関する。例えば、自己免疫疾患、アレルギー性疾患もしくは移植片拒絶（例えば、細胞または組織起源のもの）の治療もしくは予防、全身性自己免疫疾患もしくは器官特異的自己免疫疾患の治療もしくは予防、または慢性炎症性疾患の治療である。

これとの関連における自己免疫疾患の例は、サイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ＴＳＨ受容体、インスリン（プロインスリン）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、チロシンホスファターゼＩＡ−２、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質および熱ショックタンパク質ＨＳＰ６５からなる抗原の群より選択される抗原に対する自己免疫疾患である。

本発明との関連におけるアレルギー性疾患の例は、空中アレルゲン、食物アレルゲン、接触アレルゲンおよび全身アレルゲンからなる群より選択されるアレルゲンに対するアレルギー性疾患である。

ペプチドを負荷していない樹状細胞、非関連非同族ペプチドまたは配列番号：１の同族ペプチドを負荷した樹状細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。図の左側は、配列番号：１のペプチドに曝露することによって増殖させたＮＫＴ細胞を追加することによって誘導されたアポトーシス細胞の割合を示す；右側は、配列番号：２のペプチドによって増殖させたＮＫＴ細胞を用いて取得した以外は同じ結果を示す。 ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しないＪＡＷＳ２細胞を使用した以外は同じ設定で得られたデータを示す。 ＭＨＣ不適合性株由来のＢ細胞株（ＷＥＨＩ２３１）を用いた以外は同じ条件下で得られたデータを示す。

ペプチド配列
配列番号：１ ＩＡＦＲＤＮＦＩＧＬＭＹＹ
配列番号：２ ＣＨＧＣＧＧＦＩＧＬＭＹＹ
配列番号：３ ＩＡＦＲＤＮＦＩＧＬＭＹＷ
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合された２〜２００アミノ酸のアミノ酸配列を含む分子であって、特定の実施形態では、非アミノ酸構造（例えば、結合有機化合物）を含み得る分子を指す。本発明のペプチドは、従来の２０アミノ酸もしくはその改変型のいずれかを含み得るか、または化学ペプチド合成、化学修飾もしくは酵素修飾によって組み込まれた天然に存在しないアミノ酸を含み得る。

特定の実施形態では、ペプチドは、多くとも２０、２５、３０、５０、７５、１００または１５０アミノ酸の長さを有する。

ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを含むペプチドは、典型的には、少なくとも７、８、９または１０アミノ酸の長さを有する。

ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープとレドックスモチーフ配列とを含むペプチドは、典型的には、少なくとも１１、１２、１３、１４の長さを有する。ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープとレドックスモチーフとの間のさらなるアミノ酸（０、１、２、３、４、５、６、７アミノ酸）の存在に応じて、このようなペプチドは、１１〜１８アミノ酸の任意の値の長さを有する。

本明細書で使用される「抗原」という用語は、（多糖の有無にかかわらず）巨大分子（典型的には、タンパク質）の構造、または１つ以上のハプテンと、少なくとも１つのＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープもしくはクラスＩＩ拘束性エピトープとを含むタンパク質組成物からなる構造を指す。

本明細書で使用される「抗原タンパク質」という用語は、少なくとも１つのＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープまたはクラスＩＩ拘束性エピトープを含むタンパク質を指す。本明細書で使用される自己抗原または自己抗原タンパク質は、体内に存在するヒトタンパク質または動物タンパク質であって、そのヒトまたは動物の体内で免疫応答を誘発するものを指す。抗原タンパク質の群および具体例は、疾患に関する以下のセクションに示されており、ここでは抗原が上記障害の原因因子である。

「食物または医薬の抗原タンパク質」という用語は、食物製品または医薬製品（例えば、ワクチン）中に天然に存在する抗原タンパク質を指す。抗原タンパク質の群および具体例は、疾患に関する以下のセクションに示されており、ここでは抗原が上記障害の原因因子である。

「エピトープ」という用語は、抗原タンパク質の（構造エピトープを規定し得る）一部分または複数部分であって、抗体もしくはその一部（Ｆａｂ’、Ｆａｂ２’など）、またはＢ細胞リンパ球もしくはＴ細胞リンパ球の細胞表面に提示された受容体によって特異的に認識および結合され、この結合によって免疫応答を誘導することができるものを指す。

本発明との関連での「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、優性、準優性または少数のＴ細胞エピトープ（すなわち、Ｔリンパ球の細胞表面の受容体によって特異的に認識および結合される抗原タンパク質の一部）を指す。エピトープが優性、準優性または少数であるかは、エピトープに対して誘発される免疫反応に依存する。優性は、このようなエピトープがＴ細胞によって認識されて、タンパク質の考えられるすべてのＴ細胞エピトープのうちのそれらを活性化することができる頻度に依存する。特定の実施形態では、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識されるエピトープであって、ＭＨＣＩＩ分子の溝に収まる＋／−９アミノ酸の配列からなるエピトープである。Ｔ細胞エピトープに相当するペプチド配列内では、エピトープ中のアミノ酸はＰ１〜Ｐ９とナンバリングされ、エピトープのアミノ酸のＮ末端はＰ−１、Ｐ−２などとナンバリングされ、エピトープのアミノ酸のＣ末端はＰ＋１、Ｐ＋２などとナンバリングされる。

より具体的には、それは、ヒトの免疫系によって認識されるようなエピトープを指す。
「酸化還元酵素モチーフ」とも称される「レドックスモチーフ」は、還元活性を有するテトラペプチドモチーフであって、より詳細にさらに記載されるように、配列［ＣＳＴ］−Ｘ−Ｘ−ＣまたはＣ−Ｘ−Ｘ−［ＣＳＴ］を有するテトラペプチドモチーフである。

「ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープ」という用語は、Ｔリンパ球の細胞表面の受容体によって特異的に認識および結合される抗原タンパク質の一部を指す。特に、ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープは、ＣＤ１ｄ分子によって結合されるエピトープである。

より具体的には、それは、ヒトの免疫系によって認識されるようなエピトープを指す。
本発明との関連では、これは、以下でより詳細に説明されるように、ＣＤ１ｄ結合部分にヘプタペプチドモチーフ［ＦＷＹＴＨ］−ｘ−ｘ−［ＶＩＬＭ］−ｘ−ｘ−［ＦＷＹＴＨ］を有する配列を含むペプチドに関する。

「ＣＤ４＋エフェクター細胞」という用語は、Ｔ細胞のＣＤ４陽性サブセットに属する細胞であって、その機能が、他の細胞、例えばＢ細胞などを援助することである細胞を指す。通常、これらのエフェクター細胞は、Ｔｈ細胞（Ｔヘルパー細胞）と報告されており、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞などの様々なサブセットがある。

「ＮＫＴ細胞」という用語は、ＮＫ１．１およびＮＫＧ２Ｄなどの受容体を運搬し、ＣＤ１ｄ分子によって提示されるエピトープを認識するという事実を特徴とする自然免疫系の細胞を指す。本発明との関連では、ＮＫＴ細胞は、１型（不変異体）または２型サブセットのいずれかに属し得る。

「ＣＤ１ｄ分子」という用語は、両側が開かれた深い疎水性溝内に配置された３本のアルファ鎖および逆平行セットのベータ鎖とからなる非ＭＨＣ由来の分子であって、脂質、糖脂質または疎水性ペプチドをＮＫＴ細胞に提示することができる分子を指す。

「免疫障害」または「免疫疾患」という用語は、免疫系の反応が、生物における機能異常もしくは非生理的状況の原因であるか、またはそれらを持続させる疾患を指す。本発明との関連での免疫障害は、感染因子および腫瘍監視によって誘導される病態を指す。

「同種抗原」という用語は、同じ種の２つの個体間においてタンパク質多型によって生成される抗原を指す。

「同種反応性」という用語は、移植片のレシピエントとドナーとの間の対立形質の差に対する免疫応答を指す。同種反応性は、抗体およびＴ細胞に適用される。本発明は、ＭＨＣ決定基との関連でペプチドＭＨＣ複合体として提示される同種抗原のＴ細胞認識に基づくＴ細胞同種反応性に全体的に依拠する。

「主要組織適合抗原」は、ヒトのＨＬＡ系（マウスのＨ２）に属する分子を指し、２つのクラスに大別される。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞表面のベータ２ミクログロブリンと結合する３つのドメイン（アルファ１、２および３）を含む単一多型鎖からなる。ヒトでは、クラスＩ分子は、Ａ、Ｂ、およびＣと称される３つの遺伝子座によってコードされる。このような分子は、ペプチドをＣＤ８＋サブセットのＴリンパ球に提示する。クラスＩＩ分子は、各々が２本の鎖を含む２本の多型鎖（アルファ１および２、ならびにベータ１および２）からなる。ヒトでは、これらのクラスＩＩ分子は、ＤＰ、ＤＱ、およびＤＲの３つの遺伝子座によってコードされる。

「非主要組織適合抗原」という用語は、正常な細胞タンパク質に由来するペプチドであって、クラスＩ複合体および／またはクラスＩＩ複合体に属するＭＨＣによって提示されるペプチドを指す。細胞表面のこのようなペプチドの提示に定性的または定量的に影響を与える任意の遺伝的多型が、非主要組織適合抗原を生じさせ得る。

本発明との関連で使用されるエピトープに関して本明細書で使用される「相同体」という用語は、天然に存在するエピトープと少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、それにより、エピトープが抗体に、またはＢ細胞および／もしくはＴ細胞の細胞表面受容体に結合する能力を維持する分子を指す。エピトープの相同体の特定の実施形態は、多くとも３アミノ酸、より具体的には多くとも２アミノ酸、最も具体的には１アミノ酸が改変された天然エピトープに対応する。

本発明のペプチドに関して本明細書で使用される「誘導体」という用語は、少なくともペプチド活性部分（すなわち、細胞溶解性ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の活性を誘発することができる）を含み、これに加えて、ペプチドを安定化するか、またはペプチドの薬物動態特性もしくは薬力学的特性を変化させるなどの異なる目的を有し得る相補的部分を含む分子を指す。

本明細書で使用される２つの配列の「配列同一性」という用語は、２つの配列をアライメントした場合の、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸を有する位置の数を、これらの配列の短い方のヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割ったものに関する。特定の実施形態では、この配列同一性は、７０％〜８０％、８１％〜８５％、８６％〜９０％、９１％〜９５％、９６％〜１００％または１００％である。

本明細書で使用される「ペプチドコードポリヌクレオチド（または核酸）」および「ペプチドをコードするポリヌクレオチド（または核酸）」という用語は、適切な環境で発現させた場合に、関連ペプチド配列またはその誘導体もしくは相同体の生成をもたらすヌクレオチド配列を指す。このようなポリヌクレオチドまたは核酸としては、ペプチドをコードする通常の配列だけではなく、これらの核酸の誘導体および断片であって、必要な活性を有するペプチドを発現することができるものが含まれる。一実施形態によれば、本発明のペプチドをコードする核酸またはその断片は、該ペプチドをコードする配列またはその断片であって、哺乳動物に由来するか、または哺乳動物に対応するもの、最も具体的にはヒトペプチド断片である。

「減少した活性を有する有機化合物」という用語は、本発明との関連では、タンパク質のジスルフィド結合に対する減少した活性を有する化合物、より具体的にはアミノ酸配列を指す。

「免疫障害」または「免疫疾患」という用語は、免疫系の反応が、生物における機能異常もしくは非生理的状況の原因であるか、またはそれらを持続させる疾患を指す。免疫障害には、とりわけ、アレルギー性障害および自己免疫疾患が含まれる。

本明細書で使用される「アレルギー性疾患」または「アレルギー性障害」という用語は、アレルゲンと称される特定の物質（花粉、刺傷、薬物または食物）に対する免疫系の過敏反応を特徴とする疾患を指す。アレルギーは、個々のアトピー患者が、様々な疾患、特に呼吸器系の疾患および症候、例えば気管支喘息をもたらし得る、該患者が敏感なアレルゲンに遭遇した場合に必ず観察される兆候および症候の全体を指す。様々な種類の分類が存在し、アレルギー性障害は主に、それが発症する哺乳動物の体内の部位に応じて異なる名前を有する。「過敏症」は、個体が敏感な抗原に曝露されると、個体内において生じる望ましくない（損傷を与え、不快感を引き起こし、時には致命的な）反応である。「即時過敏症」は、ＩｇＥ抗体の産生に依存するので、アレルギーと同等である。

「自己免疫疾患」または「自己免疫障害」という用語は、生物が自身の構成部分を（分子下レベルまで）「自己」として認識できないことにより、自身の細胞および組織に対する生物の異常な免疫応答に起因する疾患を指す。疾患群は、２つのカテゴリ、すなわち臓器特異的疾患（アジソン病、溶血性もしくは悪性の貧血、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、若年型糖尿病、ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、天疱瘡、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肺炎、自己免疫性心臓炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自発性不妊症など）および全身性疾患（紅斑性狼瘡、乾癬、脈管炎、多発性筋炎、強皮症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、関節リウマチ、およびシェーグレン症候群など）に分けられ得る。したがって、自己免疫障害は、自己の細胞または組織に対するものであり、特定の哺乳類生物の自己の構成部分である抗原（例えば、タンパク質の）を意味する「自己抗原」に対する反応を含む。この機構では、自己抗原は、このような自己抗原に対する免疫反応を組み込むＢ細胞および／またはＴ細胞によって認識される。

したがって、「自己免疫疾患」または「自己免疫障害」という用語に含まれる非限定的な疾患のリストは、急性散在性脳脊髄膜炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、円形脱毛症、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、ベーチェット病、小児脂肪便症、炎症性腸感染（ＩＢＤ）（クローン病および潰瘍性大腸炎など）、皮膚筋炎、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、混合結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症およびアトピー性皮膚炎を含む。

「アレルゲン」は、素因を有する（特に、遺伝的性質を有する）個々の（アトピー）患者においてＩｇＥ抗体の産生を誘発する物質（通常は、巨大分子またはタンパク質組成物）と定義される。同様の定義が、Ｌｉｅｂｅｒｓら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２６，４９４−５１６に示されている。

「炎症性疾患」または「炎症性障害」という用語は、炎症の典型的な特徴が観察される疾患を指す。したがって、この用語は、炎症の様相も存在する他の疾患と重複し得る。当技術分野では、「急性炎症」と「慢性炎症性疾患」との間で区別がされ得ることが知られている。「炎症性疾患」または「炎症性障害」という用語は、限定されないが、関節リウマチ、結膜炎、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、気管支炎、結核、慢性胆嚢炎、炎症性腸感染、急性膵炎、敗血症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、乾癬やアトピー性皮膚炎などの皮膚炎症性疾患、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、癌関連炎症、腫瘍関連血管新生の減少、糖尿病、移植片対宿主病および関連する組織の拒絶炎症反応の治療、クローン病、遅延型過敏症、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症などの中枢神経系疾患の免疫介在性および炎症性要素の群から選択される疾患を含む。

「治療有効量」という用語は、患者において望ましい治療効果または予防効果をもたらす細胞数を指す。例えば、疾患または障害に関して、それは、疾患または障害の１つ以上の症候をある程度軽減する細胞数であり、より具体的には、疾患もしくは障害に関連するか、または疾患もしくは障害の原因となる生理的パラメータまたは生化学的パラメータを正常へと部分的または完全に回復させる細胞数である。本発明の特定の一実施形態によれば、治療有効数は、正常な生理的状態の改善または回復につながる細胞数である。例えば、免疫障害に罹患した哺乳動物を治療処置するために使用される場合、それは、哺乳動物の体重１ｋｇ当たりの１日細胞数である。

本明細書のペプチドまたは配列に関する「天然」という用語は、その配列が天然に存在する配列と同一であるという事実に関する。これとは対照的に、「人工」という用語は、それ自体は天然に存在しない配列またはペプチドを指す。場合により、天然に存在する配列内の１アミノ酸以上の変化などの限定的な改変によって、または天然に存在する配列のＮ末端もしくはＣ末端にアミノ酸を付加することによって、人工配列は、天然配列から取得される。本明細書では、アミノ酸は、フルネーム、三文字略語または一文字略語を用いて称される。

「調節性Ｔ細胞」は、エフェクター細胞の活性化に対して抑制活性を発揮する細胞と定義される。エフェクター細胞は、クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞、クラスＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞、抗原提示細胞、ＮＫＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。

この表現は、古典的な「クラスＩＩ拘束性調節性Ｔ細胞」（別名「Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞」または「Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞」）およびＮＫＴ調節性細胞（ＮＫＴｒｅｇ）を包含する。ＮＫＴ調節性細胞はＣＤ１ｄ拘束性であり、転写因子「前骨髄球性白血病ジンクフィンガータンパク質」（ＰＬＺＦ）の発現によってさらに場合により定義される。

したがって、「ＮＫＴ調節性細胞」は、上記エフェクター細胞に対して抑制活性を等しく発揮する細胞である。

発明の詳細な説明
本発明の一般原理は、特定の抗原を負荷した抗原提示細胞から取得したアポトーシス小体を使用して、抗原特異的調節性Ｔ細胞、例えばＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞およびＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ調節性細胞の産生を誘発することである。具体的には、本発明の目的は、ＣＤ１ｄ決定基との関連では、免疫応答が望ましくない自己抗原または抗原（例えば、アレルゲン、治療目的で使用される移植片由来の同種抗原または同種因子）を提示する抗原提示細胞から選択的アポトーシスを得る方法を提供することである。したがって、以下でより詳細に記載されているように、本発明は、抗原特異的調節性Ｔ細胞（クラスＩＩ拘束性調節性Ｔ細胞およびＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ調節性細胞を含む）を生成、取得または単離する方法を提供し、それにより、所定の抗原に対する特異的な免疫応答のスイッチを切る可能性を提供する。

アポトーシスが誘導された細胞は、ホスファチジルセリン、多糖および糖脂質の酸化を含む複数の表面変化を経て、食細胞により認識可能となる。加えて、アポトーシス細胞は、トロンボスポンジン−１などの新たなタンパク質を発現し、ならびに／またはホスファチジルセリン、ＤＮＡおよびヌクレオソームなどの細胞内要素をそれらの表面に局在化する。要するに、これらの表面変化は、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＯＤまたはＲＩＧなどの先天性受容体による連結の非存在下では、食細胞が、自然免疫反応を引き起こさずにアポトーシス細胞を貪食する可能性を提供する。

アポトーシス細胞を除去する食細胞は、ＣＤ１４、スカベンジャー受容体およびＣ型レクチン受容体などの認識受容体を備える（ＲａｖｉｃｈａｎｄｒａｎおよびＬｏｒｅｎｚ，（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，９６４−９７４）。スカベンジャー受容体は、酸化またはアセチル化された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）ならびにポリアニオン性リガンドおよびアポトーシス細胞に結合することができる表面糖タンパク質である。スカベンジャー受容体の例としては、ＣＤ３６、ＬＯＸ−１およびＣＬＡ−１が挙げられる。認識後、迅速にインターナリゼーションされ、アポトーシス細胞の場合には破壊され、エンドソームおよびリソソームと融合される。特に興味深いのは、アポトーシス細胞によるトロンボスポンジン−１（これは、食細胞上に発現するＣＤ３６との可溶性架橋として作用する）の産生である。トロンボスポンジン−１の発現は、カスパーゼ依存性である。

可溶性因子は、アポトーシス細胞を除去する役割も果たす。例としては、コレクチンならびにマンノース結合レクチンおよびＣ１ｑなどのコレクチン様分子が挙げられる。両方とも、食細胞の表面に発現するカルレティキュリンと相互作用する。血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および原型ペントラキシン（ＰＴＸ）を含むペントラキシンのファミリーもアポトーシス細胞に結合する。

要するに、自然なプログラム細胞死またはアポトーシスを受けている細胞を処理するために生理的条件下で使用される多数の因子が存在する（Ｊｅａｎｎｉｎら（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，５３０−５３７）。哺乳動物では、正常な細胞数および活性を維持するために定期的な細胞の再生が行われる（Ｓｔｅｉｎｍａｎら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９１，４１１−４１６）。炎症症状がなければ、アポトーシス小体は、器官内で抗原提示細胞によって取り込まれ、抗原提示細胞は、局所リンパ節に向けて遊走し、局所リンパ節では、直接的に、または遊走する抗原提示細胞の迅速な溶解の結果として、リンパ節樹状細胞とのアポトーシス小体の交換が起こる。局所リンパ節に遊走する樹状細胞の少なくとも一部は未熟であることが分かっており、アポトーシス細胞に対する高い食細胞能力を示す。リンパ節では、樹状細胞は主に未熟な状態であるが、クラスＩ決定基およびクラスＩＩ決定基の両方に抗原を提示する能力を示すサブセットに属すると考えられる。非炎症症状に関連する共刺激シグナルがなければ、ＭＨＣクラスＩＩの提示により、調節性Ｔ細胞に必要な動員シグナルおよび活性化シグナルが提供される。このような調節性Ｔ細胞は抗原特異的（自己抗原に対して）であり、このような自己抗原に対する応答の活性化を抑制する。したがって、非炎症との関連で起こるアポトーシスは、自己抗原に対する寛容を維持する抗原特異的調節性Ｔ細胞を誘発する。

逆に、炎症症状下では、それは、自己免疫疾患において、または同種抗原もしくはアレルゲンに対する応答において、または感染因子に対して生じる免疫応答中に起こるので、アポトーシス小体の産生が増加し、それらは局所リンパ節に運ばれる。アポトーシス小体を負荷した細胞のこの膨大な流入は、調節性Ｔ細胞を動員および活性化するために、リンパ節樹状細胞がこのようなアポトーシス小体を捕捉してそれらを提示する能力を超える。加えて、炎症促進性サイトカインの存在は、リンパ節樹状細胞の表現型を変化させて成熟へと誘導し、その結果として、調節性Ｔ細胞の損失に対するエフェクターＴ細胞の活性化を増加させる。感染因子に対する応答中は、これは望ましい効果であるが、自己免疫疾患、アレルギー反応および移植片拒絶との関連では、残念なことに、それは、さらなる組織の破壊および炎症につながる。したがって、非炎症状況では、アポトーシス小体を生成または取得して抗原特異的調節性Ｔ細胞を生成、取得または単離する能力を増加させる新たな方法を考案することが有利であろう。

天然型の、または隣接残基内にチオレダクターゼモチーフを有するＴ細胞エピトープを使用した細胞傷害性細胞の誘発に関する研究中に、予想外のことに、細胞傷害性細胞を誘導すると、Ｆоｘｐ３＋調節性Ｔ細胞が標的器官に蓄積することが見出された。したがって、皮膚移植片拒絶モデルでは、同種移植片の長期存続は、Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞が移植片それ自体に存在することを伴うものであった。多発性硬化症の実験モデルで同じ観察を行ったところ、疾患の予防または抑制は、Ｆоｘｐ３＋調節性Ｔ細胞が中枢神経系（ＣＮＳ）白質に蓄積することを伴うものであった。したがって、本知見は、本発明を実施するための論理的根拠および教示を提供する。

したがって、特定の実施形態では、本発明はまた、それぞれ国際公開第２０１２０６９５７２号および国際公開第２０１２０６９５６８号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、隣接残基内にさらなるチオレダクターゼモチーフを場合により有するＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープの使用を含む。

ＣＤ１ｄ提示ペプチドエピトープに曝露することによって誘発されるＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ結合ペプチド複合体と、ＮＫＴ細胞の抗原特異的受容体との間にシナプスが形成されている抗原提示細胞のアポトーシスを誘導する固有特性を有することを理解すべきである。しかしながら、ＣＤ１結合ペプチドの隣接残基内にチオレダクターゼモチーフを追加することにより、ＮＫＴ細胞のアポトーシス誘導能が維持されるか、または実験条件に応じて、この能力がさらに増加し得る。

一般に、本発明で使用すべきペプチドは、免疫反応を引き起こす能力を有する（自己または非自己）抗原の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプチドである。これらのペプチドは、それらの天然配列を変化させずに、または（国際公開第２０１２０６９５７２号に記載されているように）ＣＤ１ｄ分子との相互作用を増加させるためのアミノ酸の付加、置換もしくは欠失後に、または（国際公開第２０１２０６９５６８号に記載されているように）エピトープ隣接残基内にチオレダクターゼモチーフを追加した後に使用され得る。このようなペプチドは、アミノ酸の付加、欠失または置換と、隣接残基内へのチオレダクターゼモチーフの追加との任意の組み合わせの結果であり得ることをさらに理解すべきである。

チオレダクターゼモチーフは、還元活性を有する有機化合物、例えばチオレダクターゼ配列モチーフ［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］である。ＮＫＴ細胞エピトープおよび有機化合物は、リンカー配列によって場合により分離される。特定の実施形態では、本発明で使用すべきペプチドは、チオレダクターゼ配列モチーフ［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］（［ＣＳＴ］の少なくとも１つは、Ｃｙｓである）を含む。したがって、該モチーフは、Ｃ−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］または［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−Ｃのいずれかである。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、配列モチーフＣ−Ｘ（２）−［ＣＳ］または［ＣＳ］−Ｘ（２）−Ｃを含有する。より具体的な実施形態では、ペプチドは、配列モチーフＣ−Ｘ（２）−Ｓ、Ｓ−Ｘ（２）−ＣまたはＣ−Ｘ（２）−Ｃを含有する。

上記セクションでは、そして本出願の他の部分では、角括弧［］は、ペプチド中のある位置における代替アミノ酸を示すために使用される。数字内の丸括弧（）は、繰り返しを示す。したがって、（Ｘ）２は、Ｘ−Ｘを意味する。

これらのペプチドは、非天然アミノ酸の組込みを可能にする化学合成によって作製され得る。したがって、本発明の特定の実施形態の化合物を還元するモチーフでは、Ｃは、システイン、またはチオール基を有する別のアミノ酸（例えば、メルカプトバリン、ホモシステイン、またはチオール官能基を有する他の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸）のいずれかを表す。還元活性を有するために、モチーフ中に存在するシステインは、シスチンジスルフィド架橋の一部として存在すべきではない。それにもかかわらず、該モチーフは、インビボで遊離チオール基を有するシステインに変換される修飾システイン（例えば、メチル化システイン）を含み得る。

本発明の還元化合物の特定の実施形態の［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフにおけるアミノ酸Ｘは、Ｓ、ＣまたはＴを含む任意の天然アミノ酸であり得るか、または非天然アミノ酸であり得る。特定の実施形態では、Ｘは、小さな側鎖を有するアミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。さらなる特定の実施形態では、Ｘは、大きな側鎖を有するアミノ酸、例えばＴｙｒではない。さらなる特定の実施形態では、［ＣＳＴ］−Ｘ（２）−［ＣＳＴ］モチーフにおける少なくとも１つのＸは、ＨｉｓまたはＰｒｏである。またさらなる実施形態では、Ｘは、Ｃではない。

本発明では、上記化合物のレドックスモチーフは、存在する場合には、ペプチド内のＮＫＴ細胞ペプチドエピトープ配列に直接隣接して配置されるか、またはリンカーによってＮＫＴ細胞ペプチドエピトープから分離される。より具体的には、リンカーは、７アミノ酸以下のアミノ酸配列を含む。最も具体的には、リンカーは、１、２、３または４アミノ酸を含む。あるいは、リンカーは、６、８または１０アミノ酸を含み得る。モチーフ配列がエピトープ配列に隣接する本発明のペプチドの特定の実施形態では、これは、エピトープ配列と比較して位置Ｐ−４〜Ｐ−１またはＰ＋１〜Ｐ＋４と示される。

タンパク質配列におけるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープは、機能アッセイおよび／または１つ以上のインシリコ予測アッセイによって同定され得る。ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープ配列におけるアミノ酸は、ＭＨＣタンパク質の結合溝におけるそれらの位置にしたがってナンバリングされる。特定の実施形態では、本発明のペプチド内に存在するＮＫＴ細胞ペプチドエピトープは、８〜２５アミノ酸、さらにより具体的には８〜１６アミノ酸からなり、さらに最も具体的には８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６アミノ酸からなる。より具体的な実施形態では、ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープは、９アミノ酸の配列からなる。さらなる特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞エピトープは、ＣＤ１ｄ分子によってＮＫＴ細胞に提示されるエピトープである。本発明の特定の実施形態では、ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープ配列は、ＣＤ１ｄタンパク質のクレフトに収まるエピトープ配列、より具体的にはＣＤ１ｄクレフトに収まる７アミノ酸のペプチドである。このヘプタペプチドは、一般モチーフ［ＦＷＹＴＨ］−ｘ−ｘ−［ＶＩＬＭ］−ｘ−ｘ−［ＦＷＹＴＨ］を有する。このペプチドにおけるアミノ酸は、Ｐ１〜Ｐ７とナンバリングされる。このモチーフのより狭いバージョンでは、アミノ酸Ｐ１および／またはＰ７は、［ＦＷＹＨ］、［ＦＷＨ］または［ＦＷ］である。さらなる代替では、Ｐ４のアミノ酸は、ＩまたはＬである。このモチーフの特定のバージョンは、［ＦＷ］−ｘ−ｘ−［ＩＬ］−ｘ−ｘ−［ＦＷ］である。

本発明のペプチドのＮＫＴ細胞ペプチドエピトープは、タンパク質の天然エピトープ配列に対応し得るか、またはその改変バージョンであり得る（ただし、改変ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープは、天然ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープ配列と同様に、ＣＤ１ｄクレフト内に結合する能力を保持する）。改変ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープは、天然エピトープと同じＣＤ１ｄタンパク質結合親和性を有し得るが、親和性が低下していてもよい。特定の実施形態では、改変ペプチドの結合親和性は、元のペプチドの１０分の１以上、より具体的には５分の１以上である。

天然ＮＫＴ細胞エピトープが、クラスＩＩ拘束性エピトープを含む抗原中に存在する場合、既存のＮＫＴ細胞ペプチドエピトープ配列を使用して、ＮＫＴ細胞のアポトーシス特性を誘導または増加させれば十分である。抗原中に存在するクラスＩＩ ＭＨＣ決定基を介した提示のために、アポトーシス小体は、未熟樹状細胞によって貪食されて取り込まれる。

ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを突然変異誘発によって取得するか、または融合タンパク質として提供する場合、典型的には、抗原が、ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープおよび１つ以上のクラスＩＩ拘束性エピトープの両方を含有するように、全抗原配列を使用する。

あるいは、導入したＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープとは別に、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープが改変抗原の断片中に存在する限り、この断片を使用することが可能である。

ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープが由来し得る本発明で使用するための（自己）抗原の例は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）、筋肉型ニコチン性アセチルコリン受容体およびαグリアジンである。

限定を意図するものではないが、本発明の一般的な作用機構は、以下のとおりである：
（ａ）アポトーシス小体を負荷した未熟樹状細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ決定基中で提示される決定基に対して特異的な調節性Ｔ細胞を誘発し、
（ｂ）該調節性Ｔ細胞が、望ましくない免疫応答が存在する部位に遊走し、
（ｃ）該調節性Ｔ細胞が標的部位に蓄積すると、該調節性Ｔ細胞の多数の抗炎症特性の結果として、炎症が制御され、
（ｄ）組織破壊およびアポトーシス細胞の産生が抑制され、標的部位における正常な細胞回転が再確立され、それにより、正常な組織機能が回復する。

アポトーシス小体を負荷した未熟樹状細胞が、ＣＤ１ｄ決定基中で提示される決定基に対して特異的な調節性Ｔ細胞を誘発する類似のプロセスも想定される。

本発明は、抗原特異的調節性Ｔ細胞を取得し得る様々な実施形態を提供する。本発明の実施形態では、抗原提示細胞のアポトーシスは、ＮＫＴ細胞への曝露によりインビトロで取得され得る。アポトーシス小体は、未熟樹状細胞を負荷するために使用される。次いで、アポトーシス小体を負荷した未熟樹状細胞は、細胞療法に使用され得るか、または細胞療法に使用され得る抗原特異的調節性Ｔ細胞を生成、単離もしくは取得するためにインビトロで使用され得る。本発明との関連での細胞療法は、哺乳動物に投与するための細胞を調製する工程を含む。

インビトロで細胞のアポトーシスを誘導するための一般的な方法は、当技術分野で説明されており、既知である。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球のアポトーシスは、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する不溶化抗体の存在下でこれらを培養することによって取得され得る。細胞が実際にアポトーシス細胞であるかを決定するために使用される方法は、当技術分野で十分に説明されている。このような方法は、アポトーシス細胞の表面に発現しているリン脂質にアネキシンＶを結合させること、カスパーゼを活性化すること、および核酸を分解することを含む。これらの方法に関する概説は、ＦｕｃｈｓおよびＳｔｅｌｌｅｒ（２０１１）Ｃｅｌｌ １４７，７４２−７５８などの刊行物に見ることができる。

本発明では、先行技術とは異なり、抗原提示細胞で誘導されるアポトーシスは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とアポトーシス誘導細胞（すなわち、ＮＫＴ細胞）との間のシナプスの形成を必要とする。シナプスの形成により、ＮＫＴ細胞の細胞溶解特性が活性化され、対応する抗原由来のＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを提示する細胞のアポトーシスのみが誘導される。有利なことに、これは、厳密な抗原特異性を提供する。アッセイ系のための抗ＣＤ３抗体などのいかなるさらなる試薬もない場合、本発明に記載されるアポトーシスのインビトロ誘導は、インビボで起こるものに近い状況を再現する。

ＣＤ４＋Ｔ細胞による抗原提示細胞のアポトーシスは、Ｊａｎｓｓｅｎｓら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１，４６０４−４６１２で報告されている。調節性Ｔ細胞は、一部の状況下では、標的細胞のアポトーシスを誘導し得、パーフォリンの有無にかかわらず、グランザイムＢのＩＤＯ放出の活性化を含む多数の誘導機構が記載されている。これらの機構に関する概説は、（Ｓｈｅｖａｃｈ（２０１１）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２，１３７−１７６）に見ることができる。本発明では、ＮＫＴ細胞は、ユニークな細胞サブセットに相当し、表現型特性および機能特性の両方について調節性Ｔ細胞と異なる。このようなＮＫＴ細胞を誘導し得る方法は、国際公開第２０１２０６９５７２号および国際公開第２０１２０６９５６８号に見ることができる。

アポトーシス小体を認識および単離するための方法は、当技術分野で既知である。上記のように、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体は、それらの表面に多数の新規要素を発現し、加えて、可溶因子によってオプソニン化され得る。これら２種類の変化により、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を単離する方法が提供される。この例は、当技術分野に見ることができる（Ｓｃｈｉｌｌｅｒら（２００８）Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆ．１５，１８３−１９１）。一例は、アポトーシスサイクルに入ることによってトロンボスポンジンを発現する細胞または細胞残屑を単離するために、トロンボスポンジンに対する抗体を使用することである。

本発明の一実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ決定基との関連では、単離されたアポトーシス小体またはアポトーシス細胞を樹状細胞と共にインキュベートして、貪食、プロセシングおよび提示を可能にする。機能、表面表現型および成熟度の異なる樹状細胞の異なるサブセットが説明されている。一般に、未熟樹状細胞は、アポトーシス細胞およびアポトーシス小体を取り込む高い能力を有するが、ＭＨＣクラスＩＩ決定基内のエピトープの発現の点では効率的でない可能性がある。しかしながら、樹状細胞のいくつかのサブセット（特に、リンパ節内に存在するもの）は、２つの特性（アポトーシス細胞またはアポトーシス小体の取り込み、およびそれらの表面におけるエピトープの提示）を併せ持つ。

しかしながら、本発明との関連では、樹状細胞は、当技術分野で十分に説明されている方法によってインビトロで派生し、未熟な状態に維持される。先行技術では、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）の存在下における樹状細胞の誘導体化は、高度な成熟状態を誘導するのに対して、ＩＬ−４は、樹状細胞を未熟状態に維持することが教示されている。樹状細胞は、末梢血単球または骨髄前駆体のいずれかに由来し得る。上記のように取得されたアポトーシス細胞およびアポトーシス小体を未熟樹状細胞と共にインキュベートし、それにより、ＭＨＣクラスＩＩ決定基による提示が可能となる。

当業者には、樹状細胞が好ましいが、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体からプロセシングされる抗原を提示することができる提示細胞を取得するための唯一の手段ではないことが明らかなはずである。代替としては、限定されないが、ＭＨＣクラスＩＩ発現で誘導され得るマクロファージ、内皮細胞または上皮細胞が挙げられる。

本発明の別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体由来の抗原を負荷した樹状細胞を細胞療法に使用し得る。例として、自己抗原を提示する抗原提示細胞上のＮＫＴ細胞の細胞溶解作用によって取得されるアポトーシス小体由来のクラスＩＩ拘束性エピトープを提示する樹状細胞は、自己抗原に対する免疫応答が関係する疾患過程に罹患した動物に静脈内投与され得る。このような細胞療法の結果は、免疫応答の特異的な抑制および疾患の治癒である。さらなる例を以下に示すが、本発明の範囲はこのような例に限定されない。

別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を負荷した未熟樹状細胞は、調節性Ｔ細胞を生成、単離または取得するインキュベーションのために、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を追加した培養液中で維持される。

この実施形態では、限定されないが、１）ナイーブ動物から取得され、例えば特異的な抗体によってコーティングされた磁気ビーズを使用した親和性（クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋細胞またはＣＤ１ｄ拘束性ＣＤ４＋細胞の特異的親和性分離を含む）により調製される細胞；２）調節性Ｔ細胞を誘発することが望ましい（自己）抗原に対する免疫応答に関連する疾患過程が進行中の動物の脾臓、リンパ節、組織または末梢血から取得した極性化ＣＤ４＋Ｔ細胞；または３）Ｆоｘｐ３転写抑制因子の高度かつ安定的な発現を示すと定義される天然調節性Ｔ細胞を含むいくつかの可能なＣＤ４＋Ｔ細胞源を使用し得る。

当業者には、ＣＤ４＋Ｔ細胞のこれら３つの供給源の１つはそれぞれ、適切な状況があれば、他のものよりも適切であり得ることが明らかなはずである。例として、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血からであっても容易に利用可能であり、任意の抗原を認識するのに十分に大きなレパートリーを提供する。疾患過程を予防することが好ましく、それにより、とりわけ所定の動物のＭＨＣクラスＩＩハプロタイプにしたがって抗原を選択し得る状況では、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、最良の選択に相当するであろう。他方、極性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ペプチドＭＨＣ複合体に対する高い親和性を有する細胞を使用することが好ましい状況では、本発明を実施するための細胞源に相当する。一例は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるインスリン由来ペプチドの認識が、ペプチドＭＨＣ複合体に対する不完全な結合によって主に起こって、比較的低いＴ細胞受容体親和性がもたらされる１型糖尿病に見られる自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞によって提供される。

本発明では、好ましい一実施形態は、供給源として天然調節性Ｔ細胞を使用することである。調節性Ｔ細胞のレパートリーは、自己抗原の認識に向けて形成され、上記のように、このような細胞は、抗原提示細胞とシナプスを機能的に形成する十分な親和性を有する。所定の抗原に対する抗原特異的天然調節性Ｔ細胞の数は過度に小さく、このために、調節性Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞の総数のわずか５％〜１０％に相当する。本発明は、このような少数をインビトロで増加させ得る方法を提供する。本発明における調節性Ｔ細胞調節性細胞を使用することのさらなる利点は、報告された表現型安定性である。したがって、天然では、Ｆｏｘｐ３の発現は高度であり、時間が経過しても、様々な活性化条件下においても安定的に維持される。対照的に、末梢内に誘導されてＦｏｘｐ３発現を獲得する調節性Ｔ細胞は不安定であり得、例えば炎症症状下で、それらが活性である状況が変化した場合に調節特性を喪失し得る。

本発明では、アポトーシス細胞が負荷された抗原提示細胞（例えば、ｉＤＣ）は、ＣＤ４＋表現型を有する細胞を、調節特性を有する細胞に変換し得ることが示される。

等しくＣＤ４＋であるＮＫＴ細胞は、調節特性（ＩＬ−１０の産生を含む）を有する細胞型に変換し得ることが明らかになっている（上記Ｓａｇら）。本出願の実施例セクションは、調節性Ｔ細胞へのクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導と、ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞の誘導との間の類似点の証拠を提供する。

生理的に無関係な糖脂質（例えば、アルファＧａｌＣｅｒ）によって通常は誘導されるＮＫＴ細胞に関する先行技術とは逆に、本発明の実験は、ＣＤ１ｄ分子に結合して生理的に関係するプロセスを模倣するペプチドエピトープを用いて実施される。

本発明の一態様では、アポトーシス小体を負荷したＡＰＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、調節表現型を有する細胞に誘導し得、この方法をクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞に適用して、古典的なｆｏｘｐ３ ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を取得し得るだけではなく、ＣＤ１ｄ拘束性ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞に適用して、実施例９に開示されている細胞マーカーによって場合によりさらに定義される調節特性を有するＮＫＴ細胞を取得し得る。

本発明の別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体由来の抗原を提示する未熟樹状細胞と共にインビトロで培養されることによって増殖した（天然調節性Ｔ細胞）または誘導された（ナイーブまたは極性化）調節性Ｔ細胞が細胞療法に使用される。このような療法は、例えば移植片拒絶の予防などにおける予防療法、または例えば１型糖尿病における抑制療法として投与され得る。

場合により、本発明に記載される方法によって取得される調節性Ｔ細胞は、このような調節性Ｔ細胞の数をさらに増加させることが望ましい場合には、非特異的手段を使用してさらに増殖させることができる。このような非特異的方法の例は、当技術分野で既知である。例えば、不溶化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２の存在下でインキュベートされた細胞は、桁違いに増殖し得る。

当業者には、細胞投与前に、さらなる工程を追加し得ることが明らかなはずである。１つの可能性は、調節性Ｔ細胞を適応させることが望ましい１つ以上の合成ペプチドを負荷したＭＨＣクラスＩＩ決定基の四量体と共に細胞をインキュベートすることによって、調節性Ｔ細胞の特異性をさらに制限することである。別の可能性は、表面マーカーまたは様々な程度のＦｏｘｐ３の発現によって、細胞を選別することである。特に高いＦｏｘｐ３発現を有する細胞集団は、天然調節性Ｔ細胞集団の全体の一部であり、本発明との関連でそれらを特に適切なものにする特徴を示すことが知られている。

別の実施形態では、本発明によって取得された調節性Ｔ細胞は、疾患過程の発症について、所定の抗原またはエピトープの関連性を立証するために使用され得る。多くの疾患では、過程に関与する複数の抗原があり、最も重要なものを同定することは依然として困難である。本発明を実施することによる抗原特異的調節性Ｔ細胞の生産は、疾患の発症における特定の抗原を単離してその役割を同定する手段として、特定の抗原のスイッチを切る方法を提供する。

別の実施形態では、本発明によって取得された抗原特異的調節性Ｔ細胞は、調節性Ｔ細胞表現型の機能の重要性を決定する方法を提供する。例として、グランザイムの発現にしたがって、抗原特異的調節性Ｔ細胞を選別し得、インビトロまたはインビボのいずれかで応答を抑制する能力の点で、グランザイム＋の集団とグランザイム（−）の集団とを比較する。また別の例は、ニューロピリンなどの表面マーカーの発現である。

以下の実施例では、本発明の様々な適用を例示する。しかしながら、本発明の範囲は、このような実施例に限定されるものではない。

実施例

実施例１．インビトロにおけるアポトーシスの誘導
遺伝子治療および遺伝子ワクチン接種のレシピエントでは、治療遺伝子がクローニングされているウイルスベクター骨格のタンパク質に対して誘発される免疫応答が強いため、ウイルスベクターを使用する遺伝子治療および遺伝子ワクチン接種を実施することができない。したがって、ウイルスベクター骨格のウイルスタンパク質に対するこのような応答を抑制して、それにより、導入遺伝子の長期発現、または免疫原の持続による強い免疫原性を可能にすることが有利であろう。本実施例では、ウイルスカプシドの抗原決定基に対して特異的なＮＫＴ細胞を使用して、ＣＤ１ｄ結合エピトープを提示する抗原提示細胞を排除することを説明する。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスから抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製し、遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種に使用されるアデノウイルス５ベクターのヘキソン−６カプシドタンパク質のＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを含むペプチドを負荷した。

したがって、以下のペプチドを使用した：
ＩＡＦＲＤＮ ＦＩＧＬＭＹＹ［配列番号：１］（これは、ヘキソン−６タンパク質のアミノ酸残基３２７〜３３９に対応する）、および
ＣＨＧＣＧＧ ＦＩＧＬＭＹＹ［配列番号：２］（これは、隣接残基（ＧＧ）内にチオレダクターゼモチーフ（ＣｘｘＣ）を含有するヘキソン−６タンパク質のアミノ酸残基３３３〜３３９に対応する）。

次いで、これらのペプチドの一方を負荷した樹状細胞を脾臓から取得されたナイーブＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋細胞と共にインキュベートした。数回の刺激サイクルの後、対応するＡＰＣのアポトーシスを誘導するＮＫＴ細胞の能力を測定し、アポトーシス誘導能ついてペプチド間で比較を行った。

図１に示されている結果（２回の実験の平均およびＳＥＭ）は、配列番号：１または配列番号：２のいずれかのペプチドで増殖させたＮＫＴ細胞が、アネキシンＶ結合によって測定した場合に、樹状細胞のアポトーシスを誘発することを示している。陰性対照は、ペプチドなしでインキュベートした樹状細胞を含む。

図２は、ＡＰＣとしてＪＡＷＳ２細胞を使用する以外は同様の実験の結果（２回の実験の平均およびＳＥＭ）を示す。ＪＡＷＳ２細胞は、クラスＩＩ拘束性分子を発現しない。この結果は、ＡＰＣのアポトーシスの効率的な誘導を裏付けており、ＣＤ１ｄ結合ペプチドの提示を介して、認識が起こったことを裏付けている。

図３は、Ｂ細胞株（ＷＥＨＩ２３１細胞）を使用する以外は同様の実験（２回の実験の平均およびＳＥＭ）を示す。ＷＥＨＩ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）ではなく、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）に由来する。これらの２系統間の組織不適合性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス用に設計したペプチドがＢＡＬＢ／ｃ ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるのを妨げるが、非多型ＣＤ１ｄ分子による提示は妨げられない。この図は、配列番号：１または配列番号：２のペプチドのいずれかで誘発したＮＫＴ細胞による有意なアポトーシス誘導を示している。

疎水性アミノ酸をモチーフの位置Ｐ７に導入することによって、ＣＤ１ｄ結合モチーフのコア配列の改変を行い、位置７のＷがＣＤ１ｄの疎水性ポケットに対する結合を増加させるペプチドＩＡＦＲＤＮ ＦＩＧＬＭＹＷ［配列番号：３］を作製した。この置換は、シナプスを形成するＡＰＣのアポトーシスを誘導するＮＫＴ細胞の能力をさらに増強することが示されている。

実施例２．アポトーシス小体の分離
実施例１で取得したアポトーシス細胞の上清を回収し、２回の遠心分離工程（５００×ｇ、５分間）に供して、細胞を除去した。次いで、上清を１．２μＭ親水性シリンジフィルタに通してろ過した。１００，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、ペレットに含まれるアポトーシス小体を採取し、細胞実験に使用した。

あるいは、アポトーシスの結果として発現した細胞表面要素に対する抗体を使用して、アフィニティーによってアポトーシス細胞およびアポトーシス小体を単離し得る。これらの例は、抗トロンボスポンジン抗体である。好ましい調製工程では、抗トロンボスポンジン抗体を磁気マイクロビーズに共有結合させる。穏やかに振盪しながら２０℃で１時間インキュベートした後、磁気ビーズを磁石上に保持した。次いで、弱酸性緩衝液を用いて溶離することによって、アポトーシス小体を回収した。

これらの方法は、先行技術に記載されている。例えば、Ｓｃｈｉｌｌｅｒら（２００８），Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆ．１５，１８３−１９１およびＧａｕｔｉｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２８，４９−５８を参照のこと。

実施例３．未熟樹状細胞（ｉＤＣ）の生成または取得
上膝骨および下膝骨から骨髄前駆細胞を取得した。それぞれＣＤ１９マイクロビーズおよびＣＤ９０マイクロビーズによる磁気枯渇によって、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を除去した。ｉＤＣ前駆体を含有する陰性画分を、５００Ｕ／ｍｌ組換えＧＭ−ＣＳＦを含有する無血清培地に再懸濁し、組織培養プレート上に播種し（３×１０^６細胞／ｍｌ）、３７℃で維持した。凝集体を破壊しないようにして、細胞を６日間にわたって１日置きに洗浄した。６日目に、ｉＤＣ凝集体を除去し、洗浄し、新たなプレートに追加した。７日目に、細胞を採取し、アッセイに使用した。

これらの方法は、先行技術に記載されている。例えば、Ｃｕｒｒ．ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｗｉｌｅｙ ｅｄｉｔｏｒｓ，ｖｏｌ １，ｓｕｐｐｌ．８６，３．７．１０−１２を参照のこと。

実施例４．抗原を負荷した未熟樹状細胞の生成または取得
ｉＤＣは、高いアポトーシス小体貪食能力を示す。したがって、実施例３で取得したｉＤＣを、実施例２で取得したアポトーシス小体と共にインキュベートした。この場合、３７℃で３０分間インキュベートすることによって、２×１０^５個のｉＤＣをマイクロ培養ウェルにプレーティングした。次いで、３７℃でさらに１６時間インキュベートするために、アポトーシス小体の懸濁液を培養液に追加した。次いで、細胞を洗浄し、培地に再懸濁した。

実施例５．細胞療法のための抗原負荷樹状細胞の使用
疾患誘導の前または後に、アポトーシス小体を負荷したｉＤＣ（２×１０^５細胞）を、静脈内経路によって動物に注射した。

したがって、ＭＯＧペプチド（配列番号：１のペプチドについては、実施例１を参照のこと）の完全フロイントアジュバント溶液（マイコバクテリウム抽出物を含む）を投与し、百日咳毒素を２回注射することを含むプロトコールに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを供した。このプロトコールは、ＭＯＧペプチドの投与後２週間以内に、ヒト多発性硬化症と同程度の発症兆候の進展を誘発する。

このようなモデルでは、疾患誘導の前日に、または最初の疾患兆候の呈示後に（すなわち、誘導の２週間後に）、実施例４で取得したアポトーシス小体を負荷したｉＤＣをマウスに注射した。

ｉＤＣを注射していない対照動物、または負荷されていないｉＤＣを注射した対照動物と比較して、疾患兆候が有意に予防または抑制されることが示されている。

実施例６．抗原特異的調節性Ｔ細胞を誘発するための、抗原を負荷した樹状細胞の使用
アポトーシス小体を負荷したｉＤＣを使用して、インビトロで調節性Ｔ細胞を生成し得る。

したがって、実施例４に記載されているｉＤＣを培養液中で維持した。
抗体を使用して磁気マイクロビーズ選別によってＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１２７＋細胞を枯渇させ、続いて、ＣＤ２５＋細胞を陽性選択することによって、ナイーブマウスの脾臓からＴ細胞を単離した。細胞透過後に、Ｆｏｘｐ３特異的抗体を使用して蛍光活性化細胞選別（ｆａｃｓ）によって、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞の割合をチェックした。先行技術では、このような細胞を取得するための方法が開示されている（Ｐｅｔｅｒｓら（２００８）Ｐｌｏｓ ｏｎｅ ３，ｅ３１６１）。８５％超の細胞純度が得られた。

次いで、ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞を、実施例４に記載されているｉＤＣの培養物に追加した（１ウェル当たり１×１０^６細胞）。ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）の存在下、３７℃における７日間の刺激サイクルの後、細胞を洗浄し、アポトーシス小体を負荷したｉＤＣの新鮮なバッチを使用して、同じプロトコールにしたがって再インキュベートした。この第２の刺激サイクルの後、ＩＬ−２の存在下、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングした磁気ビーズと共にインキュベートすることによって、細胞を場合によりさらに増殖させ得る。次いで、細胞を洗浄し、ｆａｃｓによって、Ｆｏｘｐ３の発現について評価した。

実施例７．細胞療法のための抗原特異的調節性Ｔ細胞の使用
自己免疫疾患との関連では、実施例６で調製した細胞を受動投与に使用し得る。

したがって、ｉＤＣに代えて、２×１０^５個のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞を静脈内投与することを含む以外は、実施例５に記載されているものと同様のプロトコールにしたがった。

ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞を注射していない対照動物と比較して、疾患兆候が有意に予防または抑制されることが示されている。

実施例８．分析目的のための抗原特異的調節性Ｔ細胞の選別
ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞集団をさらに分析して、作用機序に関する単一の構成要素または構成要素の組み合わせの重要性を決定し得る。

したがって、ＦａｓＬに対する抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズを使用してＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞を分離した。次いで、２つの細胞群（ＦａｓＬ＋およびＦａｓＬ（−））を機能試験し、それらの寛容誘発能力について比較した。ＣＤ４＋ＣＤ２５（−）表現型を特徴とするポリクローナルエフェクターＣＤ４＋リンパ球をナイーブ動物の脾臓から単離するアッセイ系を使用して、これを行った。

通常、天然調節性Ｔ細胞は、エフェクター細胞に対してバイスタンダー抑制を発揮する能力によって定義される。ここで使用するアッセイ系は、非特異的な刺激（すなわち、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体との組み合わせ）によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を活性化することを含む。

ＦａｓＬ＋ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５（−）Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を、ＦａｓＬ（−）ＣＤ４＋Ｆоｘｐ３^ｈｉｇｈ細胞の能力と比較した。

ＦａｓＬを発現する細胞は、高いエフェクター細胞増殖抑制能力を示すことが示されている。

実施例９．抗原特異的調節性ＮＫＴ細胞を誘発するための抗原負荷樹状細胞の使用
アポトーシス小体を負荷したＭＨＣクラスＩＩ欠損ｉＤＣを使用して、インビトロで調節性ＮＫＴ細胞を作製し得る。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ欠損マウス、またはあるいは安定ＭＨＣクラス陰性ｉＤＣ細胞株（例えば、ＪＡＷＳ２細胞）のいずれかから取得した以外は実施例４に記載されているように作製したｉＤＣを培養液中で維持した。

それぞれ抗原提示細胞、Ｂ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞およびクラスＩＩ拘束性Ｔｒｅｇの細胞集団の枯渇のために、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１９、ＣＤ８、ＤＸ５、ＣＤ２５に対する抗体を使用して磁気マイクロビーズ選別によって、ナイーブマウスの脾臓からＴ細胞を単離した。

ＮＫＧ２ＤおよびＮｋｐ４６および転写因子ＰＬＺＦに対する抗体を使用して蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞の割合をチェックした。８５％超のＣＤ４＋細胞純度が得られた。

次いで、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞を、実施例４に記載されているように調製したＭＨＣクラスＩＩ欠損ｉＤＣの培養物に追加した（１ウェル当たり１ｘ１０^６細胞）。ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（２０ＩＵ／ｍｌ）の存在下、３７℃における７日間の刺激サイクルの後、細胞を洗浄し、アポトーシス小体を負荷したｉＤＣの新鮮なバッチを使用して、同じプロトコールにしたがって（場合により）再インキュベートした。この第２の刺激サイクルの後、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（２０ＩＵ／ｍｌ）の存在下、抗ＣＤ３および抗ＮＫＧ２Ｄ抗体でコーティングした磁気ビーズと共にインキュベートすることによって、細胞を場合によりさらに増殖させ得る。

次いで、細胞を洗浄し、例えば、ＣＴＬＡ−４およびニューロピリン−１に対する抗体を使用してｆａｃｓによって、調節活性に関連する表面抗原の発現について評価した。

自己免疫疾患、例えば実施例５に記載されている多発性硬化症との関連では、調節機能を有するＮＫＴ細胞を実施例７のように使用した。

Claims (23)

1. 抗原特異的調節性Ｔ細胞を取得するインビトロ方法であって、
   ａ）ＣＤ１ｄ分子に結合することができるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを含むタンパク抗原に抗原特異的ＮＫＴ細胞を提供する工程；
   ｂ）前記抗原を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する工程；
   ｃ）ｂ）のＡＰＣをａ）の抗原特異的ＮＫＴ細胞に曝露することによって、前記ＡＰＣのアポトーシスを誘導する工程；
   ｄ）工程ｃにおいてアポトーシスを受けたＡＰＣからアポトーシス細胞またはアポトーシス小体を単離する工程；
   ｅ）工程ｄ）のアポトーシス細胞またはアポトーシス小体由来の抗原を提示することができる細胞と共に、前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス小体をインキュベートし、それにより、アポトーシス細胞またはアポトーシス小体を負荷したＡＰＣを取得する工程；
   ｆ）工程ｅ）において取得した前記負荷ＡＰＣをＣＤ４＋細胞源と接触させ、それにより、抗原特異的調節性細胞集団を取得する工程
   を含む、インビトロ方法。
2. 工程ａ）におけるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを含む抗原が、
   −ＣＤ１ｄ分子に結合することができるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープが、該抗原の野生型配列に存在する抗原、または
   −ＣＤ１ｄ分子に結合することができるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープが、該抗原の配列の突然変異誘発によって作製される抗原、または
   −ＣＤ１ｄ分子に結合することができるＮＫＴ細胞ペプチドエピトープが、融合タンパク質として該抗原に結合している抗原
   である、請求項１に記載の方法。
3. 末梢細胞と、ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープを含むペプチドとを接触させることによって、工程ａ）における前記抗原特異的ＮＫＴ細胞を取得する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞ペプチドエピトープが、モチーフ［ＷＦＹＨＴ］−Ｘ−Ｘ−［ＶＩＬＭ］−Ｘ−Ｘ−［ＷＦＹＨＴ］を含む、請求項２または３に記載の方法。
5. 該モチーフが［ＷＦ］−Ｘ−Ｘ−［ＩＬ］−Ｘ−Ｘ−［ＷＦ］である、請求項４に記載の方法。
6. 前記ペプチドが、モチーフＣ−Ｘ−Ｘ−［ＣＴＳ］または［ＣＳＴ］−Ｘ−Ｘ−Ｃを有する配列をさらに含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 工程ａ）において、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞または極性化ＣＤ４＋Ｔ細胞から前記抗原特異的ＮＫＴ細胞を取得する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 工程ｄ）において、アフィニティー精製、遠心分離、ゲルろ過、磁気ビーズ選別および蛍光活性化選別からなる群より選択される方法によって、前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス小体を単離する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程ｅ）における前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス小体由来の抗原を提示することができる細胞が、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ＭＨＣクラスＩＩ決定基を発現することができる細胞、ＣＤ１ｄ決定基を発現することができる細胞からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 工程ｅ）における前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス小体由来の抗原を提示することができる細胞が、末梢血単球および骨髄由来前駆体の形質転換によって取得可能な未熟ＡＰＣからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程ｆ）において、該ＣＤ４＋細胞源がクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 工程ｆ）において、該ＣＤ４＋細胞源がＣＤ１ｄ拘束性ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記抗原特異的調節性Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３およびＣＤ４＋の発現を決定する工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 表面マーカーの発現、サイトカインの産生またはＦｏｘｐ３の発現に基づいて、前記抗原特異的調節性Ｔ細胞を区別可能なサブセットに分離する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 請求項１に記載の方法によって取得可能な、抗原特異的調節性Ｔ細胞集団。
16. 抗原特異的調節性ＮＫＴ細胞である、請求項１５に記載の抗原特異的調節性Ｔ細胞集団。
17. 医薬として使用するための、請求項１５または１６に記載の抗原特異的調節性Ｔ細胞集団。
18. 自己免疫疾患、アレルギー性疾患または移植片拒絶の治療または予防に使用するための、請求項１５または１６に記載の抗原特異的調節性Ｔ細胞集団。
19. 全身性自己免疫疾患または器官特異的自己免疫疾患の請求項１８に記載の治療または予防に使用するための、請求項１５または１６に記載の細胞集団。
20. サイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ＴＳＨ受容体、インスリン（プロインスリン）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、チロシンホスファターゼＩＡ−２、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質および熱ショックタンパク質ＨＳＰ６５からなる抗原の群より選択される抗原に対する自己免疫疾患の請求項１８または１９に記載の治療または予防に使用するための、請求項１５または１６に記載の細胞集団。
21. 空中アレルゲン、食物アレルゲン、接触アレルゲンおよび全身アレルゲンからなる群より選択されるアレルゲンに対するアレルギー性疾患の請求項１８に記載の治療または予防に使用するための、請求項１５または１６に記載の細胞集団。
22. 移植片が細胞または組織起源のものである移植片拒絶の請求項１８に記載の治療または予防に使用するための、請求項１５または１６に記載の細胞集団。
23. 慢性炎症性疾患の治療に使用するための、請求項１５または１６に記載の細胞集団。

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