JP2016538289A - マクロファージ活性化の主要制御因子としてのparp9およびparp14 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119(e)条の下、2013年11月14日に提出された米国特許仮出願第61/904,241号の恩典を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は、マクロファージ活性化および炎症を調節する方法に関する。
生物における免疫系は、外来病原体を特定することおよび殺滅することによって感染から防御するように機能する。免疫系は、特別な細胞、タンパク質、組織、および器官から構成されている。それは、ウイルスから寄生蠕虫類にわたる病原体を検出し、それらを生物の正常な細胞および組織から識別する。しかし、時に免疫系は、正しく機能し損なって、これが病気に繋がる可能性がある。例えば、マクロファージ活性化の持続のような炎症応答の制御解除が起こって、炎症性疾患を誘発する可能性がある。炎症は、アテローム動脈硬化症、糖尿病などの代謝障害、自己免疫疾患、がん、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、および多発性硬化症を含む、様々な慢性疾患の病理発生に重大な役割を果たす。これらの慢性炎症性疾患は、世界中のほぼ5億人を冒し、それらは、我々の社会の大きな健康問題および経済的負担を表している。そのうえ、これらの疾患の多くは、体を衰弱させ、ますます我々の高齢化社会にありふれたものになりつつある。
本開示の態様は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)およびポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)が、非活性化、非極性化マクロファージ、およびそれらの前駆細胞である単球の調節因子であるという発見に基づく。PARP14遺伝子のサイレンシングは、炎症促進性M1遺伝子(TNFα、IL-1βおよびiNOS)を誘導した一方で、抗炎症性M2のマーカー(Arg1およびMRC1)を減少させるが、これは、PARP14が、M1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、抗炎症性M2の極性化を促進することを示している。対照的に、siRNAのサイレンシング実験によって、PARP9がM1活性化を促進することが実証された。
便宜上、本出願全体(明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲を含む)に採用される特定の用語が、ここに集められる。特に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。したがって、特定の遺伝子もしくはタンパク質の発現または細胞機能によって計測される炎症促進性シグネチャーを有する単球またはマクロファージの任意のサブセットは、PARP9またはPARP14調節の標的であることができる。
特に説明しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes IX, Jones & Bartlett Publishingによって出版, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.によって出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.によって出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出され得る。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。
任意の一方法の一態様では、PARP9阻害剤は、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される。
選択された標的ポリペプチドの発現を阻害するための強力なアプローチは、RNA干渉剤の使用を経由する。RNA干渉(RNAi)は、選択的分解のために、標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを標的化する低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖を使用する。遺伝子発現のsiRNA依存性転写後サイレンシングは、siRNAによってガイドされる部位で標的メッセンジャーRNA分子を切断する段階を伴う。「RNA干渉(RNAi)」は、標的遺伝子と同一または高度に類似の配列のRNAの発現または導入が、その標的化された遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA(mRNA)の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を招き(Coburn, G. and Cullen, B. (2002) J. of Virology 76(18):9225参照)、それによって標的遺伝子の発現を阻害する、進化的に保存された過程である。一態様では、RNAは、2本鎖RNA(dsRNA)である。本過程は、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞において記載されている。自然界では、RNAiは、siRNAと名付けられた、長鎖dsRNAの2本鎖断片への前進型切断を促進するdsRNA特異的エンドヌクレアーゼDicerによって開始される。siRNAは、標的mRNAを認識および切断するタンパク質複合体(「RNA誘導サイレンシング複合体」または「RISC」と名付けられた)内に組み入れられる。RNAiは、また、核酸分子、例えば、合成siRNAまたはRNA干渉剤を導入することによっても開始されて、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングすることができる。本明細書において使用される「標的遺伝子の発現の阻害」は、RNA干渉が誘導されていない状況と比較して、標的遺伝子または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性もしくはレベルにおける任意の減少を含む。減少は、RNA干渉剤によって標的化されていない標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%以上である。
RNA干渉剤、例えばsiRNA、またはRNA干渉剤を含むベクターを、標的細胞、例えばマクロファージ、リンパ球または他の所望の標的細胞に、取込みのために送達する方法には、RNA干渉剤、例えばsiRNAを含有する組成物の注射、または細胞、例えばマクロファージを、RNA干渉剤、例えばsiRNAを含む組成物と直接接触させることが含まれる。別の態様では、RNA干渉剤、例えばsiRNAは、静脈、動脈、細静脈または細動脈などの任意の血管に直接、例えば水力学的注射またはカテーテル挿入を介して注射され得る。投与は、単回注射または2回以上の注射により行われ得る。RNA干渉剤は、薬学的に許容される担体中に入れて送達される。1種または複数種のRNA干渉剤を、同時に使用してもよい。好ましい一態様では、ヒトPARP9を標的化する1種のみのsiRNAが使用される。一態様では、特異的細胞は、RNA干渉の非特異的標的化によって引き起こされるRNA干渉の潜在的副作用を限定しながら、RNA干渉で標的化される。該方法は、例えば、細胞標的化部位と、RNA干渉を細胞内に効果的に送達するために使用されるRNA干渉結合性部位とを含む、複合体または融合分子を使用することができる。例えば、抗体-プロタミン融合タンパク質は、siRNAと混合されるとsiRNAと結合し、抗体によって認識される抗原を発現している細胞内にsiRNAを選択的に送達し、抗原を発現している細胞だけに遺伝子発現のサイレンシングをもたらす。siRNAまたはRNA干渉誘導分子結合性部位は、タンパク質もしくは核酸結合性ドメインまたはタンパク質の断片であり、結合性部位は、標的化部位の一部に融合される。標的化部位の位置は、構築物のカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれか、または融合タンパク質の中間であることができる。ウイルス介在性送達メカニズムもまた、siRNAを細胞にインビトロおよびインビボで、Xia, H.ら、(2002) Nat Biotechnol 20(10):1006)に記載のように送達するために採用することができる。shRNAのプラスミドまたはウイルス介在性送達メカニズムは、また、shRNAを細胞にインビトロおよびインビボで、Rubinson, D.A.ら((2003) Nat. Genet. 33:401-406)およびStewart、S.A.ら((2003) RNA 9:493-501)に記載のように送達するために採用され得る。RNA干渉剤、例えば、siRNAまたはshRNAは、以下の活動:細胞、例えばリンパ球または他の細胞によるRNA干渉剤、例えばsiRNAの取込みを増強する、1本鎖のアニーリングを阻害する、1本鎖を安定化する、またはさもなければ標的細胞への送達を容易にする、および標的遺伝子、例えばPARP9の阻害を増加させる、の1つまたは複数を行う構成要素と共に導入することができる。特定のRNA干渉剤の用量は、特定の標的遺伝子のRNA干渉、例えば翻訳後遺伝子サイレンシング(PTGS)をもたらすことによって、標的遺伝子の発現の阻害または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害に繋がるために必要な量である。
理論に縛られることを望むわけではないが、PARP9のサイレンシングがPARP14 mRNAを増加させる傾向にあることが発見された(例えば、図10A参照)。したがって、PARP9阻害剤である化合物を、PARP14活性化剤としても使用することができる。
投与経路には、非限定的に、エアロゾル、直接注射、皮内、経皮(例えば、徐放ポリマー中に入れて)、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、局所、経口、経粘膜、口腔、直腸、膣、経皮、鼻腔内および非経口経路が含まれる。「非経口」は、非限定的に、眼窩内、輸液、動脈内、関節包内、心臓内、皮内、肝内、器官内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管を含む、一般的に注射に関連する投与経路を表す。任意の他の治療的に効果的な投与経路、例えば、輸液またはボーラス注射、上皮もしくは粘膜皮膚裏層を経由した吸収を使用することができ、または治療用タンパク質もしくはペプチドをコードするDNA分子が、例えばそのタンパク質もしくはペプチドを発現させてインビボで治療レベルで分泌させるベクターを介して、患者に投与される遺伝子療法によることができる。様々な態様では、投与は、例えば噴霧を用いてエアロゾル投与を介して肺への吸入を行うことができる。投与は、また、全身または局所であることができる。
[1] マクロファージM1の活性化の阻害における使用のための、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む、組成物。
[2] PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目1の組成物。
[3] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目1または2の組成物。
[4] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目1〜3のいずれかの組成物。
[5] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目4の組成物。
[6] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目5の組成物。
[7] RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目5または項目6の組成物。
[8] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目5〜7のいずれかの組成物。
[9] PARP9阻害剤がPARP9タンパク質の活性を阻害する、項目1または2の組成物。
[10] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目9の組成物。
[11] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目1〜10のいずれかの組成物。
[12] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目11の組成物。
[13] マクロファージM1の活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む、組成物。
[14] PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目13の組成物。
[15] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目13または14の組成物。
[16] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目13〜15のいずれかの組成物。
[17] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目16の組成物。
[18] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目17の組成物。
[19] RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目17または項目18の組成物。
[20] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目17〜19のいずれかの組成物。
[21] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目13または14の組成物。
[22] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目21の組成物。
[23] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目13〜22のいずれかの組成物。
[24] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目23の組成物。
[25] 単球またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
[26] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、項目25の方法。
[27] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目26の方法。
[28] 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)からなる群より選択される、項目27の方法。
[29] マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、項目25〜28のいずれかの方法。
[30] 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1(Arg1)またはマンノース受容体Cタイプ1(MRC1)である、項目29の方法。
[31] 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、項目25〜30のいずれかの方法。
[32] 組成物が、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目25〜31のいずれかの方法。
[33] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目25〜32のいずれかの方法。
[34] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目25〜33のいずれかの方法。
[35] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目34の方法。
[36] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目35の方法。
[37] RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目36の方法。
[38] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目34〜37のいずれかの方法。
[39] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目25〜32のいずれかの方法。
[40] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目39の方法。
[41] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目25〜40のいずれかの方法。
[42] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目41の方法。
[43] 初代マクロファージを、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、M1マクロファージの活性化を阻害する方法。
[44] 単球またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
[45] 単球またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤およびポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
[46] a. 単球またはマクロファージの集団を提供する段階;および
b. 単球またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階
を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
[47] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、項目43〜46のいずれかの方法。
[48] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目43〜47のいずれかの方法。
[49] 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)からなる群より選択される、項目48の方法。
[50] マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、項目43〜49のいずれかの方法。
[51] 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1(Arg1)またはマンノース受容体Cタイプ1(MRC1)である、項目50の方法。
[52] 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、項目43〜51のいずれかの方法。
[53] 組成物が、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目43〜52のいずれかの方法。
[54] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目43、45〜53のいずれかの方法。
[55] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目43、45〜54のいずれかの方法。
[56] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目55の方法。
[57] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目56の方法。
[58] RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目57の方法。
[59] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目55〜58のいずれかの方法。
[60] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目43、45〜53のいずれかの方法。
[61] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目60の方法。
[62] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目44〜61のいずれかの方法。
[63] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目62の方法。
[64] それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、該対象からの単球および/またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
[65] 過度または持続性の炎症を有する対象を選択する段階をさらに含む、項目64の方法。
[66] 過度または持続性の炎症の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、項目64または65の方法。
[67] マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目64〜66のいずれかの方法。
[68] それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および/または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって、該対象からの単球および/またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
[69] 対象において、接触された単球および/またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が阻害される、項目68の方法。
[70] 単球および/またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目69の方法。
[71] 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)からなる群より選択される、項目67または70の方法。
[72] マクロファージ活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、項目64〜67、および71のいずれかの方法。
[73] 対象における単球および/またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される、項目68〜71のいずれかの方法。
[74] 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1(Arg1)またはマンノース受容体Cタイプ1(MRC1)である、項目72または73の方法。
[75] 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、項目64〜74のいずれかの方法。
[76] 組成物が、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、項目64〜75のいずれかの方法。
[77] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目64〜76のいずれかの方法。
[78] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目64〜77のいずれかの方法。
[79] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目78の方法。
[80] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目79の方法。
[81] RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目80の方法。
[82] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目78〜81のいずれかの方法。
[83] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目64〜76のいずれかの方法。
[84] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目83の方法。
[85] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目64〜84のいずれかの方法。
[86] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目85の方法。
[87] PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤を含む組成物が、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、項目64〜86のいずれかの方法。
[88] 組成物が、注射、輸液、または点滴注入によって投与される、項目64〜87のいずれかの方法。
[89] 過度または持続性の炎症が、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および/またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、および炎症性腸疾患からなる群より選択される状態において見出される、項目64〜67、71〜72、74〜88のいずれかの方法。
[90] 自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される、項目89の方法。
[91] 過度または持続性の炎症を発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、項目64、66〜90のいずれかの方法。
[92] それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、該対象に、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、方法。
[93] それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および/または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって:
(a)アテローム動脈硬化症を有するまたはそのリスクがある対象を特定する段階;ならびに
(b)該対象に、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階
を含む、方法。
[94] 対象において、単球および/またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が阻害される、項目92または93の方法。
[95] 単球および/またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、項目94の方法。
[96] 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)からなる群より選択される、項目95の方法。
[97] 対象における単球および/またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される、項目92〜96のいずれかの方法。
[98] 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1(Arg1)またはマンノース受容体Cタイプ1(MRC1)である、項目97の方法。
[99] PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、項目92〜97の方法。
[100] PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、項目92〜99のいずれかの方法。
[101] 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、項目100の方法。
[102] RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、項目101の方法。
[103] RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、項目102の方法。
[104] RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、項目101〜103のいずれかの方法。
[105] PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、項目92〜97のいずれかの方法。
[106] PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目105の方法。
[107] PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、項目92〜106のいずれかの方法。
[108] PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、項目107の方法。
[109] 薬学的組成物が、注射、輸液、または点滴注入によって投与される、項目92〜108のいずれかの方法。
[110] 薬学的組成物が、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む製剤を含む、項目92〜109のいずれかの方法。
[111] 過度または持続性の炎症が、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および/またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、ならびに炎症性腸疾患からなる群より選択される状態において見出される、項目92、94〜110のいずれかの方法。
[112] 自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される、項目111の方法。
[113] 過度または持続性の炎症を有するまたは発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、項目92〜112のいずれかの方法。
[114] 前記薬学的組成物の投与のために対象を選択する段階をさらに含む、項目93〜113のいずれかの方法。
[115] アテローム動脈硬化症が、冠動脈、頸動脈、腸骨-大腿動脈、腎動脈または他の動脈において起こる、項目89または111の方法。
[116] マクロファージ活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む、組成物。
[117] マクロファージ活性化の阻害における使用のための、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む、組成物。
[118] 炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、(a)単球もしくはマクロファージの集団または両方の細胞型の混合物を提供する段階;ならびに(b)単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
[119] 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
[120] 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
[121] 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
[122] 単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
[123] 炎症促進性マクロファージの活性化がM1活性化を含む、項目116〜122の方法または組成物。
本発明者らは、病理学的マクロファージ活性化を調節するためのマクロファージ極性化の主要制御因子を、様々な炎症性疾患の新規な治療標的として探究した。タンデム質量タグ付け戦略(TMT)を用いて、M1刺激因子としてのインターフェロンガンマ(IFNγ)またはM1誘導因子としてのインターロイキン4(IL-4)のいずれかに応答した、それぞれマウスおよびヒトマクロファージ細胞系であるRAW264.7およびTHP-1のプロテオームにおける変化を定量した。本発明者らは、マウス細胞系からのタンパク質5816種およびヒト細胞系における4723種を定量した。これらのデータのクラスター解析によって、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ9(PARP9)、PARP14およびDTX3Lが、マクロファージ極性化のマスター制御因子の候補として特定された。PARP14遺伝子のサイレンシングは、炎症促進性M1遺伝子(TNF-α、IL-1βおよびiNOS)を誘導した一方で、抗炎症性M2のマーカー(Arg1およびMRC1)を減少させ、このことは、PARP14が、M1炎症促進性マクロファージの活性化を抑制し、抗炎症性M2の極性化を促進することを示しており、STAT1のリン酸化を誘導し、STAT6のリン酸化を減少させ、このことは、シグナル伝達メカニズムに果たすそれらの役割を示している。追加的に、PARP14欠損マウス由来の初代マクロファージにおいて、M1遺伝子は、劇的に増加し(40倍を超える)、一方でM2マーカーは猛烈に減少した(1/30未満)。対照的に、siRNAのサイレンシング実験によって、PARP9がSTAT1リン酸化を介してM1活性化を促進し、STAT6活性化を抑制することが実証された。免疫沈降アッセイによって、PARP9、PARP14およびDTX3L(deltex 3-様、E3ユビキチンリガーゼ)が直接相互作用を有することが示された。
アテローム動脈硬化症は、米国および他の先進国における死因の第1位である急性心筋梗塞を引き起こす(1)。医学の進歩にかかわらず、虚血性心疾患の世界的負担は、増加の一途である(2)。マクロファージ活性化は、アテローム動脈硬化症を含む多数の障害の病理発生に関与する(3〜6)。脂質異常症および糖尿病などの代謝障害は、循環している単球の血管壁内への動員を促進し、そこで単球はマクロファージに分化する。炎症促進性微小環境は、さらに、マクロファージ活性化を誘導する。本発明者ら自身のものを含む前臨床的証拠は、活性化マクロファージが、アテローム動脈硬化症の発生に関与するだけでなく、アテローム動脈硬化性プラークの完全性を低下させることによって、その血栓合併症もトリガーすると提唱した(7)。臨床的証拠の蓄積は、また、血管炎症と心血管事象とを関連づけた(8)。マクロファージ活性化は、2型糖尿病などの様々な他の疾患の病理発生に主要な役割を果たすように見える(9、10)。したがって、マクロファージ活性化に関連するいくつかの経路は、実証されたように、炎症性疾患の共通メカニズムに寄与し得る(11、12)。心血管疾患では、スタチンによるコレステロール低下などの強力な治療法にかかわらず、実質的な残余リスクが残っており(7、13、14)、そのことが、マクロファージ活性化に対する新規な解決策のための活発な探索を推進している。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(LC-MS/MS)
高分解能/正確度LTQ-Orbitrap Elite(Thermo Scientific)でTMTペプチド試料を分析し、Q Exactive(Thermo Scientific)で、インビトロでリボシル化されたペプチドを分析した。両方の質量分析装置にNanospray FLEXイオン源を前置し、Easy-nLC1000 HPLCポンプ(Thermo Scientific)を連結しておく。ペプチドを、2カラム設定:Acclaim PepMap RSLC C18トラップカラム、75um×20cm(Q Exactiveでは50um×15cm);およびAcclaim PepMap RSLC C18分析カラム、75um×250mm(Thermo Scientific)に供した。TMT分析のために、250nl/minで90分間かけて10〜30%溶媒B(アセトニトリル/0.1%ギ酸)の分析勾配をかけ、続いて95%溶媒Bを5分間流した。溶媒Aは0.1%ギ酸であった。リボシル化ペプチドについて、250nl/minで30分間かけて5〜28%溶媒Bの勾配をかけ、続いて95%溶媒Bを5分間流した。全ての試薬はHPLC等級であった。ペプチド配列解析(MS/MS)のために、LTQ-Orbitrapを分解能120Kに設定し、上位20種の前駆イオン(スキャン範囲380〜2000m/z内)を、高エネルギー衝突誘起解離(HCD、衝突エネルギー40%、選択幅3m/z、動的排除可能、開始m/zを120m/zに固定、および分解能を30Kに設定)に供した。上位10種前駆体選択法で、Q Exactiveを分解能140Kに設定した(スキャン範囲380〜1500m/z)。MS/MSのために、HCDを段階式規準化衝突エネルギー25±10%、選択幅1.6m/z、動的排除可能に設定し、分解能を17.5Kに設定した。MS/MSスキャンにおいて、m6ピーク348.1によってリボシル化ペプチド候補をスクリーニングした(39、40)。観測された前駆体からADP-リボース(541.06Da)の質量を差し引くことによって未修飾形態を計算した。修飾および未修飾m/z値ならびに対応する保持時間枠を包含リストに提出し、Q Exactiveのデータ独立獲得モジュールを用いて解析した(R=35K)。
タンパク質の存在度の中央値をゼロ時間に基準化し、対数空間に変換した。M1において増加するが、M2において減少するタンパク質を抽出するために、利用可能なM0データセットを活用した単純なフィルタリング論理を適用した。本研究において、M0は、本システムにおける生物学的雑音に関するベースライン対照として役立つ;すなわち、ベースラインの端部を越えるM1およびM2タンパク質のトレースは、真のM1またはM2特異的応答の可能性が高い。その存在度が、INFγの補充(すなわち0時間)後のベースラインに勝ったタンパク質のプロファイルで、全時間のM1データセットに関する全般閾値を制定した。このカットオフ値(相対存在度のlog10が+0.13)は、RAW264.7およびTHP-1の両方のM1データセットについて使用された、まさにその値であった。そのうえ、M1フィルタリング段階から抽出されたタンパク質を、M0データセットだけでなく、M2データセットとも相互参照した。M2データセットでは、時点にかかわらず、タンパク質がM1と逆のプロファイルを有すると予想された。したがって、候補タンパク質の最終リストは、M1およびM2の存在度が、それらのベースライン対照からそれぞれ増加および減少したプロファイルを有した。
有限混合モデルに基づくRにモデルベースのアルゴリズム(44)を使用して、クラスタリングを行った。このように、本アルゴリズムは、マクロファージ極性化実験のために獲得されたデータなどの、時系列データ解析にうまく適用することができる(43)。このアプローチでは、各時系列(タンパク質プロファイル)yi[i=1,2,...,N](Nは、TMTチャネルの数である)は、線によって結合された単一の実体であると見なされる。クラスタリングは、従来の有限混合モデルについて各時系列yiをクラスターに割り当てることによって達成される。教師なしモデルベースクラスタリングは、プロファイルを特定のクラスターに割り当てるために期待値最大化アルゴリズム(EM)を使用する。MCLUSTは、データセット内の変動性を最大化することによって、ベイズ情報量基準(Bayesian Information Criteria)(BIC)を使用してデータセットを最良に分割するクラスター数を決定するという利点を有する。最終的に、合計の規準化によって、2時点のセットの間のより強力な共分散(およびしたがって依存性)が可能になる(45)。クラスタリングを行った後に、プロファイルがM1において増加し、M2において減少したが、M0において基礎レベルに維持されたタンパク質を特定する目的で、RAW264.7およびTHP-1細胞の両方について3つ全てのデータセット(M0、M1およびM2)で共通のタンパク質に焦点を合わせた。M1におけるゼロ時間に対する任意の時点でのタンパク質の相対存在度の増加を探しながら全てのクラスターを点検し、続いてプロファイルが減少した、およびベースライン内に残ったタンパク質について、それぞれM2およびM0クラスターを相互参照した。これらの3つの基準を満たしたタンパク質を、RAW264.7およびTHP-1細胞のデータセットについてのヒートマップに示す(図7B)。最終的に、関心対象のタンパク質のリストをさらに狭めるために、両方の種に共通であったタンパク質に、同一のUniprotタンパク質IDによって決定される優先順位を付けた(図7B)。行に沿って得られたZスコアに従ってタンパク質発現レベルを配列するためだけに、ヒートマップを使用した(すなわちz=(x-平均)/sd)。ユークリッド距離および平均連結法を用いてタンパク質を水平方向に階層的にクラスタリングさせた。このデータ行列では、各列は、TMT時点分析の0、8、12、24、48、72時間を表し、各行は、タンパク質の遺伝子IDに対応する。
心血管疾患および代謝性疾患としてのPARP14およびPARP9の候補資格をさらに研究するための並行アプローチとして、潜在的PARP14/PARP9インタラクトームがその関連する血管疾患ネットワーク/モジュールに近接するという前提で、インシリコまたはネットワークに基づく予測法を使用した。
本研究において、マウスおよびヒトの10ng/mlインターフェロンガンマ(IFNγ)および10ng/mlインターロイキン4(IL-4)(R&D systems)を、それぞれM1およびM2刺激として使用した。
マウス単球/マクロファージ細胞系RAW264.7をAmerican Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD)から入手し、加湿5%CO2中でペニシリンおよびストレプトマイシン(Corning)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma)を含有する10%ウシ胎児血清(FBS, Life Technologies)中で37℃で維持した。M1およびM2刺激(それぞれ10ng/ml IFNγおよび10ng/ml IL-4)の前に、細胞を0.1% FBS含有培地で24時間飢餓状態にした。THP-1もATCCから購入し、加湿5%CO2中でペニシリンおよびストレプトマイシンを有する10%FBS中のRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地中にて37℃で維持した。THP-1単球をPMA(200ng/ml, Sigma)で48時間処理することによって、マクロファージ様状態を得た。マイコプラズマ汚染試験を日常的に行った(1ヶ月に1回)。
マウス腹腔マクロファージ。4%チオグリコレート(Fisher Scientific)2.5〜3mlの腹腔内注射の4日後に腹腔マクロファージを得、10%FBSを含有するRPMIを用いて細胞5×105個を24ウェルプレート(Corning)上で培養した。非接着性細胞を16時間後に捨てた。PBSで洗浄後、細胞をM1またはM2刺激(それぞれ10ng/ml IFNγおよび10ng/ml IL-4)を加えながら回収まで24時間インキュベーションした。
リンパ球分離培地(LSM、MP Biomedicals)を使用して末梢血単核細胞(PBMC)をバフィーコートから単離した。PBMCの単離後、抗CD14抗体(Dynabeads FlowComp human CD14, Invitrogen)と組み合わせたDynabeadsによって、製造業者の説明書通りにCD14+細胞を単離した。簡潔には、磁石を使用してCD14+ dynabeads結合細胞(CD14+細胞)を単離した。細胞からDynabeadsを放出後、ビーズ不在のCD14+ PBMC(細胞5×105個)を、5% CO2中において、10% FBSを補充したRPMI 0.5mlを有する24ウェルディッシュプレート中にて37℃で培養した。
試料を7μmに薄切りし、凍結切片をアセトン中で固定した。4%の適切な血清中でブロッキング後、切片を一次抗体(Mac3(1:200, M3/84, BD Pharmingen)、PARP14(1:50, HPA01206 Sigma-Aldrich)、PARP9(1:100, ab53796, Abcam)、およびヒトCD68(1:200, M0876, Dako))と共に、続いてビオチン標識二次抗体(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)およびストレプトアビジン結合型Alexa Fluor 488抗体(Life Technologies)と共にインキュベーションした。アビジン/ビオチンブロッキング(Vector Laboratories)後の免疫蛍光二重標識のために、第2の一次抗体に続いて、ビオチン標識二次抗体およびストレプトアビジン結合型Alexa Fluor 594抗体(Life Technologies)を4℃で一晩適用した。切片をPBS中で洗浄し、DAPI(Vector Laboratories)含有封入剤中に包埋した。最初のビオチン標識二次抗体のインキュベーション後の組織切片に対する明視野免疫組織化学分析のために、切片をストレプトアビジン標識HRP溶液(Dako)に続いてAEC溶液と共にインキュベーションした。Eclipse 80i顕微鏡(Nikon, Melville, NY, USA)または共焦点顕微鏡A1(Nikon)を使用してスライドを検鏡した。全ての画像をElements 3.20ソフトウェア(Nikon)で処理した。
アテローム硬化性頸動脈(n=10)を、Brigham and Women's Hospitalで動脈内膜切除術を受けている患者からIRBプロトコール#1999P001348(PL)に従って収集した。全ての試料は「廃棄された材料」と見なされるので、インフォームドコンセントは不必要であった。試料は、それぞれ、マクロファージが多い(「不安定」、n=5)プラークおよびマクロファージが多くない(「安定」、n=5)プラークなどの2群を有する。試料をOCTコンパウンド中に包埋し、使用まで-80℃で保存した。各試料の3つの異なる視野で(n=5)、CD68陽性細胞を有する細胞200個(核)がPARP14および/またはPARP9(1試料あたり細胞600個)を発現するかどうかを評価した。免疫蛍光の定量は、群の割り当て(不安定プラーク対安定プラーク)に関して知らされなかった試験者によって行われた。
PARP14欠損(PARP14-/-)雄性マウス(25、48)および齢が一致する野生型(PARP14+/+)雄性マウスを血管傷害に供した。以前に記載されたように(49)、10週齢マウスについて顕微鏡観察下(Leica M80)で大腿動脈中にストレートスプリングワイヤー(直径0.38mm, C-SF-15-15, Cook)を挿入することによって経管的動脈傷害を誘導した。傷害の2週間後に、動脈試料を収集するために、過量のペントバルビタールの腹腔内投与によってマウスを安楽死させ、次に左心室を経由して一定圧力で0.9% NaCl溶液を灌流した(50)。収集された組織をO.C.T.コンパウンド(Tissue-Tek)中に包埋し、次に液体窒素中で凍結し、さらに使用するまで-80℃で保存した。Beth Israel Deaconess Medical Centerの施設内動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)は、全ての手技を承認した(プロトコール#017-2010)。内膜および中膜面積ならびに傷害大腿動脈のそれらの比を、各動物(n=5)において間隔100μmで3つの異なるレベルの少なくとも3つの切片を、Elements 3.20ソフトウェア(Nikon)を使用して手作業でトレースすることによって測定した。群の割り当て(PARP14+/+対PARP14-/-)を知らされなかった試験者が、組織検査および免疫組織化学検査の定量を行った。無作為化法は使用しなかった。
以前に記載されたようにRNAサイレンシングを行った(51)。簡潔には、20nmol/lのPARP14に対するsiRNA(ヒト細胞についてL-023583、マウス細胞についてL-160447)およびPARP9に対するsiRNA(ヒト細胞についてL-014734、マウス細胞についてL-05024901)(全てONTARGETplus SMART-pool, Thermo Scientific)または非標的化siRNA(スクランブル対照siRNA, ON-TARGET Non-Targeting Pool, Thermo Scientific)を、製造業者の説明書に従ってSilenceMag(BOCA Scientific, Boca Raton, FL)を使用してマクロファージ内に導入した。siRNAプールの標的配列は以下の通りであった。
細胞増殖、生存度、およびアポトーシスを、製造業者の説明書に従って、それぞれCellTiter 96 AQueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay Kit(MTS)、Cell Titer Blueアッセイ、およびApo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay Kit(Promega)により判定した。
TriZol(Life Technologies)を使用して、細胞培養物から総RNAを単離し、QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して逆転写を行った。TaqManに基づくリアルタイムPCR反応(Life Technologies)によってmRNAの発現を決定した。以下のTaqManプローブを使用した:Hs99999902_m1(ヒトRPLP0)、Mm00725448_s1(マウスRPLP0)、Hs00981511_m1(ヒトPARP14)、Mm00520984_m1(マウスPARP14)、Hs00967084_m1(ヒトPARP9)、Mm00518778_m1(マウスPARP9)、Hs00174128_m1(ヒトTNF)、Mm00443258_m1(マウスTNF)、Hs00174097_m1(ヒトIL-1β)、Mm01336189_m1(マウス1L1β)Mm00475988_m1(マウスARG1)、Hs00267207_m1(ヒトMRC1)、Mm00485148_m1(マウスMRC1)、Mm00440502_m1(マウスNOS2)およびHs00234140_m1(ヒトCCL2)。発現レベルをRPLP0に対して規準化した。デルタ-デルタCt法を用いて結果を計算し、任意の単位として提示した。
Leica LMD6500マイクロダイセクションシステムでLCMを行った。以下のLCMパラメーターを使用して新生内膜を切断した:出力50mW;パルス幅2ms;およびスポットサイズ20Hm。製造業者のプロトコールに従って、PicoPure RNA Isoaltion Kitを用いてRNAを単離し、続いてRiboAmp HS Plus RNA Amplification Kit(共にArcturus, Mountain View, CA, USA)を用いてRNAを増幅した。Fluidigm PCRシステムを用いてPCRアレイを行った。
プロテアーゼ阻害剤(Roche)を含有するRIPA緩衝液を用いて細胞を溶解させた。ビシンコニン酸(BCA)法(Thermo Scientific)を用いてタンパク質濃度を測定した。総タンパク質を8〜10% SDS-PAGEによって分離し、iBlotウエスタンブロットシステム(Life Technologies)を用いて移行させた。ヒトおよびマウスPARP14に対する一次抗体(1:250, HPA01206 Sigma-Aldrich)、ヒトおよびマウスPARP9に対する一次抗体(1:250, ab53796, Abcam)、ヒトおよびマウスSTAT1に対する一次抗体(1:1000, #9172, cell signaling)、リン酸化STAT1に対する一次抗体(1:1000, #9167, cell signaling)、ヒトおよびマウスSTAT6に対する一次抗体(1:2000, #9362, cell signaling)、マウスリン酸化STAT6に対する一次抗体(1:1000, ab54461, Abcam)、ヒトリン酸化STAT6に対する一次抗体(1:2000, #9361, cell signaling)、ならびにヒトおよびマウスβ-アクチンに対する一次抗体(1:5000; Novus)を使用した。Pierce ECLウエスタンブロット基質試薬(Thermo Scientific)およびImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)を用いてタンパク質の発現を検出した。
刺激後に培地中に放出されたTNFαおよびIL-1βの量を、製造業者の説明書に従ってELISAキット(Duoset Kit, R&D)により測定した。未刺激のマクロファージの培地を陰性対照として使用した。特異的モノクローナル捕捉抗体で予備コーティングされていたELISAウェルプレートに標準、対照、または試料溶液を添加した。室温で3時間静かに振盪後、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションした抗TNFαポリクローナル抗体を溶液に添加し、室温で1時間インキュベーションした。過酸化水素および色素原を含有する基質溶液を添加し、20分間反応させた。プレートリーダーによって450nmでサイトカインレベルを判定し、標準溶液の存在度により規準化した。
iNOS濃度を模倣している、マクロファージの細胞培養培地中の一酸化窒素を定量するために、Greiss試薬キット(G-7921, Life technologies)を使用した。
免疫沈降(IP)溶解緩衝液(Thermo Scientific)中で細胞を溶解させた。タンパク質100μgをPARP14抗体(5μg, Invitrogen)およびDynabeadsストレプトアビジン(Life Technologies)と共に4℃で一晩回転させることによってインキュベーションし、続いてPBS/Tween 20(0.02%)で3回洗浄し、各洗浄の後に磁石を使用してビーズを収集した。沈降したタンパク質試料の5%をSDS-PAGEに供した。Pierce ECLウエスタンブロット基質試薬およびImageQuant LAS 4000を用いてタンパク質の発現を検出した。
組換えヒトPARP14およびPARP9(BPS Bioscience Inc.)タンパク質およびBSA(Sigma-Aldrich)を、終濃度5ng/μlの組換えヒトSTAT1α(OriGene Technologies, Inc.)または終濃度5ng/μlのSTAT6タンパク質(Sino Biological Inc.)と共に、100μM β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物(NAD; Sigma-Aldrich)または6-ビオチン-17-NAD(Trevigen, Inc.)の存在下で、50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)中で、室温で1時間インキュベーションした。トリプシン消化後のLC-MS/MSまたはSDS-PAGE後のストレプトアビジン-HRP(Abcam)を使用したウエスタンブロットによって、STAT1αおよびSTAT6のリボシル化を検出した。未修飾ペプチドに対して修飾ペプチドのモノアイソトピックピークの抽出イオンクロマトグラム(XIC)の曲線下面積(AUC)を計算することによって、リボシル化STAT1αペプチドの相対存在度の定量を完了した。比をAUC mod./(AUC mod. + AUC unmod)として報告した。
ドナー2人由来のCD14+ PBMCの単一細胞分析のために、製造業者の説明書に従ってC1システム(Fluidigm)を用いて細胞捕獲および標的予備増幅を行った。BioMark 96.96 Dynamic Arrayプラットフォーム(Fluidgm)を用いて定量リアルタイムPCRを行った(37)。バフィーコートからCD14+ PBMCを単離後、細胞を10日間培養した。M0状態の細胞を10日目に回収し、10ng/ml IFNγと共に24時間インキュベーション後の11日目にM1細胞を回収した。C1チップによる細胞捕捉率は、ドナー1のM0において89.6%(86/96)およびM1において83.3%(84/96)であり、ドナー2のM0において96.9%(93/96)およびM1において89.6%(86/96)であり、ドナー3のM0において93.8%(90/96)および84.3%(81/96)であった。RPLP0/GAPDH遺伝子発現を使用することによって、各細胞における標的遺伝子のデルタ-デルタCt値を計算した。各遺伝子についてのデルタ-デルタCTスコアを細胞対遺伝子の行列として記憶させた。各細胞に、1からn(nは総細胞数)の範囲の数的IDを割り当てた。ハウスキーピング遺伝子(GAPDHおよびRPLP0)に対して規準化された直接遺伝子測定から、デルタ-デルタCTスコアが得られる。
データを平均±SDとして示す。ここで、「n」は、独立した実験の数または動物/試料の数を示す。0.05未満のP値を有する検定を統計的に有意と見なした。スチューデントのt検定を用いて群の対比較を行った(GraphPad prism 5, Prism Software Inc.(La Jolla、CA))。F検定から分散が有意に異なったと示された場合、Welch補正を行って、独立t検定を行った。Grubbs検定によって排除基準を設定した。試料サイズを予備決定するために統計的方法を用いなかった。実験を無作為化しなかった。
全体的プロテオミクスによって、マクロファージ極性化における主要分子の候補としてPARP9およびPARP14が特定された
インビトロプロトコールは、マウスRAW264.7細胞およびヒトTHP-1細胞の極性化の評価(図1A)と、上流の制御因子を特定するための定量プロテオミクスの適用とを可能にした。RAW264.7細胞およびTHP-1細胞におけるそれぞれ5137および5635種のタンパク質を、以下の3条件にわたり定量した:M0(未刺激または未極性化マクロファージ)、M1(IFNγ)およびM2(IL-4)(図1B)。3条件にわたるタンパク質強度の概要から、各M1およびM2条件についてのタンパク質の発現レベルの分布が、RAW264.7細胞およびTHP-1細胞の両方においてM0の強度を超えたことが明らかとなった(図1C)。
PARP9およびPARP14の潜在的な臨床影響を予測するために、ネットワークに基づく解析を適用して、包括的相互作用ネットワーク(「インタラクトーム」)におけるこれらの遺伝子の影響を理解した(図8)。分子相互作用ネットワークアプローチに関する最近の進歩を活用して、様々な疾患モジュールに対するPARP14およびPARP9の機能の潜在的相互依存について知識を探索した。増え続ける証拠は、疾患遺伝子がインタラクトーム上にランダムに分布するのではなく、むしろ類似の生物学的モジュールまたは経路において一緒に働くことを示している(29、30)。そのうえ、同じ表現型に連結した遺伝子産物(例えばタンパク質)は、互いに相互作用し、同じネットワーク近傍域にクラスター化する可能性が高い(30)。これらの観察に基づき、PARP9またはPARP14が疾患のネットワーク近傍域に影響するならば、その直近傍は、ランダムな期待と比較して疾患モジュールに近接するはずであると仮定した(29、30)。異なる起源、例えば全ゲノム関連研究(GWAS)、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)およびMalaCardsからの疾患遺伝子を用いて、ランダムウォーク法で心血管疾患および代謝性疾患のための疾患モジュールとして遺伝子セットを定義した(31)(図15)。次に、心血管障害および代謝障害の疾患モジュールへのPARP9-PARP14ネットワークの直近傍の平均最短距離を測定した。主として、インタラクトームは、タンパク質間の物理的または機能的関連のセットを説明し、細胞または組織特異性を提供しない。したがって、この場合、公的データベースにおけるマクロファージでの直近傍の発現を検査し、発現されなかったものを除去した。このPARP9-PARP14ネットワークが、他の心血管疾患および代謝性疾患と比較して冠動脈疾患モジュールに有意に大きく近接していたことが見出された(図8)。この結果は、動脈疾患の病理発生または臨床的合併症の発症に及ぼすPARP9および/またはPARP14の潜在的な主影響を示している。
PARP9およびPARP14がマクロファージ活性化および動脈疾患を制御するという新規な仮説を検定するため、およびマクロファージM1/M2極性化におけるこれらのタンパク質の関与を検討するために、包括的なインビトロおよびインビボアプローチを使用した。プロテオミクスデータに一致して(図2B、16および17)、PARP9およびPARP14のmRNAレベルはM1において増加し、M2において減少した(図2C)。タンパク質レベルで、PARP14は、M1刺激に対してPARP9よりも早く増加した(図9A)。マウス(図9B)およびヒト(データは示さず)アテローム硬化性病変は、PARP14およびPARP9タンパク質を示したが、これはさらに、これらのPARP制御異常が動脈疾患の一因になるという仮説を支持している。
M1およびM2マクロファージにおけるPARP14およびPARP9の発現パターンが類似であったものの(図2B〜2C)、それらのそれぞれのsiRNA実験は、反対の結果をもたらした(図3A〜3D、3F)。IFNγシグナル伝達は、炎症促進性STAT1の活性化(リン酸化)を伴い、一方で、IL-4経路は、抗炎症性STAT6のリン酸化を使用する(32、33)。PARP14のサイレンシングは、M1マクロファージにおけるIFNγ誘導型STAT1リン酸化を加速し、かつM2マクロファージにおけるIL-4促進型STAT6リン酸化を抑制した(図4A)。対照的に、PARP9のサイレンシングは、M1マクロファージにおけるSTAT1のリン酸化を減少させた(図4C)。したがって、PARP14は、IFNγ-STAT1軸を調節することによってM1極性化を抑制し、IL-4-STAT6-M2経路を促進し得る。対照的に、PARP9は、IFNγ-STAT1シグナル伝達を活性化してM1極性化を誘導し得る。証拠は、様々な状況での免疫応答におけるSTAT3の関与を示している(34)が、PARP14またはPARP9のサイレンシングは、STAT3のリン酸化に有意な効果を生じなかった(図19)。
上に実証された結果から、PARP14およびPARP9の間の制御相互関係の仮説が生まれた。実際に、PARP14のサイレンシングは、PARP9 mRNAの発現を有意に増加させ、一方で、PARP9のサイレンシングはPARP14 mRNAを増加させる傾向であった(図10A)。以前の報告は、Bリンパ球において、IL-4がPARP14の触媒活性を促進し、HDAC2、HDAC3、およびp100のリボシル化、ならびにSTAT6の活性化に繋がることによって、IL-4応答性遺伝子プロモーターへのその結合を促進することを示している(25、26、35、36)。THP-1細胞における免疫共沈アッセイが、PARP9およびPARP14によって形成された複合体を示したので(図10B)、これらの2つの分子がマクロファージにおいて相互に物理的に相互作用し得る。組換えPARP14タンパク質は、PARP14自体、PARP9、およびSTAT1αのADP-リボシル化を誘導した(図10C)。PARP9は、STAT1αをADPリボシル化しなかったが、このことは、PARP9が触媒活性を欠如することを示している以前の報告を立証する(27)。興味深いことに、PARP9の補充は、STAT1αのリボシル化を抑制した(図10C)。PARP1などの他のPARPファミリーメンバーの大部分がポリ-ADP-リボシル化酵素である一方で、PARP14は、モノ-ADP-リボシルトランスフェラーゼである(24)。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(LC-MS/MS)で、STAT1αのGlu657およびGlu705がPARP14によってモノ-ADP-リボシル化されたことが決定された(図10Dおよび10E)。Glu657およびGlu705は、STAT1αの機能的に重要なリン酸化部位であるTyr701に隣接する(図10Dおよび10E)。LC-MS/MSで、さらに、組換えPARP9がSTAT1αのGlu657およびGlu705でのPARP14誘導型モノADP-リボシル化を阻害したことが明らかになった(図10F)。まとめると、これらの結果は、PARP9が抑制する過程である、PARP14が炎症促進性STAT1αをモノ-ADPリボシル化し得るマクロファージ活性化についての潜在的メカニズムを示している。
PARP14-/-マウスは、さらに、PARP14が動脈病変形成およびマクロファージ活性化に関与するというインビボ証拠を提供した。PARP14-/-またはPARP14+/+マウス腹腔マクロファージは、マクロファージの表現型および血管病変の形成の検査を可能にした。培養マクロファージにおけるインビトロsiRNA実験に一致して、データは、PARP14+/+細胞と比較してPARP14-/-マクロファージにおいて、炎症促進性M1の極性化に関連する因子の顕著に高いmRNAおよびタンパク質レベルならびに低いM2分子を示した(図11Aおよび11B)。PARP14欠乏は、また、腹腔マクロファージにおけるM1条件で誘導されたSTAT1のリン酸化を増強し、M2でのSTAT6リン酸化を減少させた(図11C)。PARP14-/-骨髄細胞由来初代マクロファージは、M1およびM2遺伝子について類似の結果を示した(図11D)。
マクロファージ介在性疾患についての新規な治療標的を発見する目標で、不偏プロテオミクスおよびバイオインフォマティクスによって、PARP9およびPARP14がマクロファージ活性化の潜在的制御因子として特定された。初代平滑筋細胞および内皮細胞と比較して、PARP9およびPARP14の両方のmRNA発現は、初代培養マクロファージの方が高かった(図20A)。したがって、本研究は、マクロファージの生物学に果たすこれらのPARPファミリーメンバーの役割に焦点を当てている。それにもかかわらず、他の血管細胞型におけるPARP9およびPARP14の可能な機能を検討した。マウス大動脈から単離された初代平滑筋細胞(SMC)において、IFNγは、TNFαおよびiNOSの発現増加によって測定される炎症応答を誘導し、SMC分化マーカー遺伝子SM α-アクチン、SM22α、およびミオシン重鎖(SM-MHC)の発現を抑制した(図20A)。IFNγによるTNFαおよびiNOSの誘導は、PARP14+/+マウス由来SMCよりもPARP14-/- SMCにおいて増強された。PARP14欠乏は、SM α-アクチン、SM22αおよびSM-MHCのインビトロ発現において有意な変化を生じなかった。PARP14+/+およびPARP14-/-マウスの機械的に傷害された大腿動脈の内膜において、SM α-アクチンに対して免疫反応性の内膜細胞の絶対面積および%面積は、異ならなかった(n=4)(図20A)。これらの結果は、PARP14欠乏が内膜SMCのインビボ蓄積に効果を示さなかったことを示している。培養内皮細胞(EC)において、IFNγは、ICAM-1、VCAM-1、およびTNFαの発現を誘導したが、PECAM-1を変化させなかった(図20B)。PARP9のサイレンシングは、IFNγによるICAM-1誘導を部分的に抑制したが、VCAM-1、TNFα、またはPECAM-1に効果を生じなかった。PARP14のサイレンシングは、IFNγに対するこれらの分子の応答に変化を引き起こさなかった。これらの結果は、PARP9およびPARP14が、SMCおよびECの活性化に少なくともインビトロで幾分かの役割を果たし得ることを示している。しかし、理論に縛られることを望むわけではなく、動脈疾患へのSMCまたはEC由来PARP9およびPARP14の相対的寄与は、マクロファージにおいて発現されるPARPファミリーメンバーと比較して実質的でない場合がある。
動脈疾患に果たすPARP14およびPARP9の潜在的役割についての追加的なインビボ証拠を探すために、血管内膜摘除術によって外科的に除去されたヒト頸動脈アテローム動脈硬化性プラークを検査した。免疫蛍光染色で、重複するCD68陽性シグナルによって示されるように、PARP14およびPARP9シグナルがプラークマクロファージに主に局在化したことが明らかになった(データを示さず)。マクロファージに乏しい「安定」プラークと比較して、マクロファージが豊富な「不安定」プラークにおいて、より多くのマクロファージが、炎症促進性分子PARP9に対して免疫反応性であったが、一方で、PARP14陽性マクロファージにおいて有意差はなかった(図12、データは示さず)。ヒトプラークにおける一部のマクロファージは、PARP14およびPARP9を同時発現したものの、他の細胞は、PARP14またはPARP9のいずれかの一方のみについて陽性染色された(データは示さず)。これらの一連のインビボ証拠は、動脈病変におけるマクロファージが不均一であることを示しており、これは、個別細胞における多種多様なレベルの炎症促進性活性化を反映し得る。
ヒトプラークにおけるPARP9およびPARP14の発現パターンの多様性は、PBMC由来ヒトCD14陽性マクロファージの単一細胞遺伝子発現プロファイリング(BioMark, Fluidigm)(37)を用いたマクロファージ亜集団の追加的な判定を引き起こした。検査細胞数は、それぞれドナー1のM0において86個であり、M1では84個であり、ドナー2のM0では93個であり、M1では86個であり、ドナー3のM0では90個であり、M1では81個であった。具体的には、検査で、M0細胞が群全体としてM1の遺伝子発現を増加させるかどうか、または個別の細胞がIFNγに対して異なる応答をするかを検討した。さらなる分析で、3人の異なるドナー(n=3)由来のM0およびM1マクロファージにおける標的遺伝子63種の発現パターンが強調された。各細胞にわたる距離を、それらの遺伝子発現類似性に基づき評価した(マンハッタン距離)(National Institute of Standards and TechnologyでのDictionary of Algorithms and Data Structuresのworld-wide web)。距離を距離行列として記憶させ、距離に基づくグラフとして表現した。ドナー3人における2条件(M0/M1)のチップ全6個を組み合わせることによって、M0細胞(淡灰色)およびM1細胞(濃灰色)は、明らか分離される。しかし、M0表現型に食い込むM1の「跡(trail)」がある。逆に、M0細胞はM1空間と混ざらない。各ドナーにおける同じ分析がドナー-ドナー変動を示すものの、ドナー3人にわたり類似のパターンが観察された(図13A)。これらの結果は、「M1極性化」マクロファージが不均一であることを示している。同様に、全ての条件/ドナーの全細胞の遺伝子63種の発現レベルによるPearson相関(38)でも、CD14+ PBMCの不均一性が明らかとなった。細胞類似性行列(データは示さず)は、IFNγで刺激されたM1細胞(1)、未刺激のM0細胞(2)およびこれらの混合集団(3)の別個の分布だけでなく、各集団内の亜集団も示す。具体的に、IFNγで刺激されたM1細胞に少なくとも2つの亜集団があり(データは示さず)、マクロファージの機能に関係する遺伝子を検討した。PARP9およびPARP14の両方は、群1よりも群2の方が有意に高かった。興味深いことに、プロテアーゼMMP9ならびにCD36、TLR2およびTLR4などのパターン認識受容体は、群2の方が高かったので、群2においてマクロファージがさらに活性化され、PARP9およびPARP14がそのような活性化マクロファージにおいて役割を果たし得ると示している(図13B)。全ての細胞にわたる遺伝子の相関行列(データは示さず)は、PARP9およびPARP14が、IFNγシグナル伝達に関与することが公知であるJAK、STATおよびIRF遺伝子などの遺伝子と密接に関連することを示している。この相関は、これらの遺伝子において高度に特異的であり、このアッセイで検査された他の遺伝子に及ばない。そのうえ、PARP9およびPARP14のクラスター内関連は、JAK3を除くSTAT1、2、6、JAK1、2およびIRF1、5などのこれらのIFNγ経路遺伝子と密接に相関関係にあることが見出された(図13C)。関心がもたれることに、これらの相関は、M0(未刺激)と比較してM1(IFNγ刺激)において明らかに増強されている(図21)。
本研究は、PARP9およびPARP14がマクロファージ活性化を制御することを示している。本報告で実証された具体的な新規の知見には:1)PARP9がマウスおよびヒトのマクロファージの活性化を促進し;2)PARP14がマウスおよびヒトのマクロファージの活性化を抑制し;3)PARP9およびPARP14が物理的および機能的相互作用をもつと考えられ;4)PARP9およびPARP14がマクロファージにおけるIFNγシグナル伝達の構成要素と密接に相互作用し;5)PARP14のインビボ欠乏が、マウスにおけるマクロファージ活性化および動脈病変発生を加速し;6)PBMC由来ヒトM1マクロファージが、細胞のサブセットを含み;ならびに7)PARP9およびPARP14インタラクトームが、冠動脈疾患モジュールに有意に近接する(ネットワーク解析)ことが含まれる。集学的アプローチは、マルチスケールのインビトロおよびインビボ研究を用いてPARP9およびPARP14の役割についての明白な証拠を立証することを目標とした。
Claims (123)
- マクロファージM1の活性化の阻害における使用のための、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む、組成物。
- PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項1記載の組成物。
- PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項1または2記載の組成物。
- PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
- 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項4記載の組成物。
- RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項5記載の組成物。
- RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項5または請求項6記載の組成物。
- RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項5〜7のいずれか一項記載の組成物。
- PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項1または2記載の組成物。
- PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項9記載の組成物。
- PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
- PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項11記載の組成物。
- マクロファージM1の活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む、組成物。
- PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項13記載の組成物。
- PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項13または14記載の組成物。
- PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項13〜15のいずれか一項記載の組成物。
- 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項16記載の組成物。
- RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項17記載の組成物。
- RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項17または請求項18記載の組成物。
- RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項17〜19のいずれか一項記載の組成物。
- PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項13または14記載の組成物。
- PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項21記載の組成物。
- PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項13〜22のいずれか一項記載の組成物。
- PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項23記載の組成物。
- 単球またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
- マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、請求項25記載の方法。
- マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項26記載の方法。
- 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
- マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、請求項25〜28のいずれか一項記載の方法。
- 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1(Arg1)またはマンノース受容体Cタイプ1(MRC1)である、請求項29記載の方法。
- 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、請求項25〜30のいずれか一項記載の方法。
- 組成物が、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項25〜32のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項25〜33のいずれか一項記載の方法。
- 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項34記載の方法。
- RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項35記載の方法。
- RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項36記載の方法。
- RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項25〜32のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項39記載の方法。
- PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項25〜40のいずれか一項記載の方法。
- PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
- 初代マクロファージを、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、M1マクロファージの活性化を阻害する方法。
- 単球またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
- 単球またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤およびポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。
- a. 単球またはマクロファージの集団を提供する段階;および
b. 単球またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階
を含む、マクロファージM1の活性化を阻害する方法。 - マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
- マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項43〜47のいずれか一項記載の方法。
- 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
- マクロファージM1の活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、請求項43〜49のいずれか一項記載の方法。
- 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1(Arg1)またはマンノース受容体Cタイプ1(MRC1)である、請求項50記載の方法。
- 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、請求項43〜51のいずれか一項記載の方法。
- 組成物が、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項43〜52のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項43、45〜53のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項43、45〜54のいずれか一項記載の方法。
- 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項55記載の方法。
- RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項56記載の方法。
- RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項57記載の方法。
- RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項55〜58のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項43、45〜53のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項60記載の方法。
- PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項44〜61のいずれか一項記載の方法。
- PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項62記載の方法。
- それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、該対象からの単球および/またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
- 過度または持続性の炎症を有する対象を選択する段階をさらに含む、請求項64記載の方法。
- 過度または持続性の炎症の阻害が、炎症促進性M1の極性化を阻害することを含む、請求項64または65記載の方法。
- マクロファージM1の活性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項64〜66のいずれか一項記載の方法。
- それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および/または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって、該対象からの単球および/またはマクロファージの集団を、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
- 対象において、接触された単球および/またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が阻害される、請求項68記載の方法。
- 単球および/またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項69記載の方法。
- 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)からなる群より選択される、請求項67または70記載の方法。
- マクロファージ活性化の阻害が、抗炎症性M2のマーカーの発現を増加させることを含む、請求項64〜67、および71のいずれか一項記載の方法。
- 対象における単球および/またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される、請求項68〜71のいずれか一項記載の方法。
- 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1(Arg1)またはマンノース受容体Cタイプ1(MRC1)である、請求項72または73記載の方法。
- 単球またはマクロファージの集団が、エクスビボまたはインビトロまたはインビボで接触される、請求項64〜74のいずれか一項記載の方法。
- 組成物が、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入製剤を含む、請求項64〜75のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項64〜76のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項64〜77のいずれか一項記載の方法。
- 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項78記載の方法。
- RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項79記載の方法。
- RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項80記載の方法。
- RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項78〜81のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項64〜76のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項83記載の方法。
- PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項64〜84のいずれか一項記載の方法。
- PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
- PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤を含む組成物が、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項64〜86のいずれか一項記載の方法。
- 組成物が、注射、輸液、または点滴注入によって投与される、請求項64〜87のいずれか一項記載の方法。
- 過度または持続性の炎症が、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および/またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、および炎症性腸疾患からなる群より選択される状態において見出される、請求項64〜67、71〜72、74〜88のいずれか一項記載の方法。
- 自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される、請求項89記載の方法。
- 過度または持続性の炎症を発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、請求項64、66〜90のいずれか一項記載の方法。
- それを必要とする対象において過度または持続性の炎症を阻害する方法であって、該対象に、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、方法。
- それを必要とする対象においてアテローム動脈硬化症および/または血管疾患を治療するまたは予防する方法であって:
a. アテローム動脈硬化症を有するまたはそのリスクがある対象を特定する段階;ならびに
b. 該対象に、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階
を含む、方法。 - 対象において、単球および/またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化が阻害される、請求項92または93記載の方法。
- 単球および/またはマクロファージの炎症促進性M1の極性化の阻害が、炎症促進性M1遺伝子の抑制を含む、請求項94記載の方法。
- 抑制される炎症促進性M1遺伝子が、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)からなる群より選択される、請求項95記載の方法。
- 対象における単球および/またはマクロファージでの抗炎症性M2のマーカーの発現が増加される、請求項92〜96のいずれか一項記載の方法。
- 抗炎症性M2のマーカーが、アルギナーゼ1(Arg1)またはマンノース受容体Cタイプ1(MRC1)である、請求項97記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9の発現を阻害する、請求項92〜97記載の方法。
- PARP9阻害剤が、小分子または核酸である、請求項92〜99のいずれか一項記載の方法。
- 核酸が、PARP9特異的RNA干渉剤、またはPARP9特異的RNA干渉剤をコードするベクターである、請求項100記載の方法。
- RNA干渉剤が、PARP9核酸配列とハイブリダイズする、請求項101記載の方法。
- RNA干渉剤が、GENBANK(商標)アクセッション番号BC039580を有するヒトPARP9遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項102記載の方法。
- RNA干渉剤が、SEQ ID NO:1〜28、33〜36、および41〜44からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項101〜103のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9タンパク質の活性を阻害する、請求項92〜97のいずれか一項記載の方法。
- PARP9阻害剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項105記載の方法。
- PARP14活性化剤が、PARP14の発現および/またはPARP14タンパク質の活性を増加させる、請求項92〜106のいずれか一項記載の方法。
- PARP14活性化剤が、PARP9に対する抗体またはその抗原結合性断片、小分子、および核酸からなる群より選択される、請求項107記載の方法。
- 薬学的組成物が、注射、輸液、または点滴注入によって投与される、請求項92〜108のいずれか一項記載の方法。
- 薬学的組成物が、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤の脂質封入ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む製剤を含む、請求項92〜109のいずれか一項記載の方法。
- 過度または持続性の炎症が、アテローム動脈硬化症、肥満症、2型糖尿病、血管炎、肢虚血、静脈グラフト疾患、動静脈瘻および/またはグラフト、脂肪肝疾患、脳卒中後の脳損傷、脳外傷、急性心筋梗塞後の心臓リモデリング、心臓弁疾患、組織工学による器官、移植器官、がん、ゴーシェ病、自己免疫性または自己炎症性疾患、ならびに炎症性腸疾患からなる群より選択される状態において見出される、請求項92、94〜110のいずれか一項記載の方法。
- 自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、エリテマトーデス、およびベーチェット病からなる群より選択される、請求項111記載の方法。
- 過度または持続性の炎症を有するまたは発生させるリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、請求項92〜112のいずれか一項記載の方法。
- 前記薬学的組成物の投与のために対象を選択する段階をさらに含む、請求項93〜113のいずれか一項記載の方法。
- アテローム動脈硬化症が、冠動脈、頸動脈、腸骨-大腿動脈、腎動脈または他の動脈において起こる、請求項89または111記載の方法。
- マクロファージ活性化を阻害するための医薬の製造における使用のための、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む、組成物。
- マクロファージ活性化の阻害における使用のための、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー9(PARP9)の阻害剤および/またはポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼファミリーメンバー14(PARP14)の活性化剤を含む、組成物。
- 炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法であって、(a)単球もしくはマクロファージの集団または両方の細胞型の混合物を提供する段階;ならびに(b)単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、方法。
- 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤およびPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
- 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤および/またはPARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
- 単球またはマクロファージの集団を、PARP9阻害剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
- 単球またはマクロファージの集団を、PARP14活性化剤を含む組成物の有効量と接触させる段階を含む、炎症促進性マクロファージの活性化を阻害する方法。
- 炎症促進性マクロファージの活性化がM1活性化を含む、請求項116〜122記載の方法または組成物。
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