JP2016537410A - 組成物およびスクリーニング方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、微生物によって生成されたオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物であって、オリゴ糖は、所定のプロバイオティクス細菌株に選択的であること、および所定のプロバイオティクス細菌によって逆酵素作用により生成することができることを特徴とする、プレバイオティクス組成物に関する。本発明はまた、プレバイオティクスとして使用するのに適した組成物をスクリーニングする方法、およびシンバイオティクス配合物に組み込むためにプレバイオティクスをスクリーニングする方法に関する。

Description

本発明は、所望のプロバイオティクス細菌株の増殖に特異的なプレバイオティクス組成物に関する。
プロバイオティクスは、宿主に健康上の利益を付与する細菌である。典型的に、腸内に天然に存在する細菌集団を補給するために、プロバイオティクス細菌株の培養物が個体によって消費され、または個体に投与される。数例を挙げると、がん、下痢症および過敏性腸症候群の発生の低減を含むいくつかの健康上の利益が、プロバイオティクスに関連するとされている。また予備研究では、プロバイオティクスが、コレステロールの血清レベルおよび血圧の低下に有用であり、糖尿病をモジュレートする一助になり得ることが示されている。
乳酸桿菌（Lactobacilli）は、乳製品に共通のプロバイオティクスであり、現在販売されているプロバイオティクスのおよそ７５％を構成している。しかし、腸内で有用となるのに、乳酸桿菌用量の２％しか生存しないと推定されている。
プレバイオティクスは、乳酸桿菌またはビフィドバクテリウム属などの有益な常在性腸内微生物叢を選択的に増強することができる食事性成分であり、食品部門への適用がかなり増大することが見出されている。プレバイオティクスは、非消化性食品成分であり、大腸細菌によって選択的に代謝され、それによって健康の改善に寄与する。したがってプレバイオティクスを使用すると、常在性腸微生物の環境内の有益な変化を促進することができ、したがってプロバイオティクスの生存を助けることができる。プレバイオティクスは、腸内で選択的に代謝されないペクチン、セルロース、キシランなどのほとんどの食物繊維とは明確に異なる。プレバイオティクスとしての分類基準は、胃酸性度、哺乳動物の酵素による加水分解および胃腸管による吸収に抵抗しなければならないこと、腸管ミクロフローラによって発酵されること、ならびに健康および良好な状態と関連する腸管細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することである。
フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ、イヌリンおよびオリゴフルクトース）およびガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、プレバイオティクス分類基準を満たすことがヒト介入研究で繰り返し実証されている。現在、乳酸桿菌のためのプレバイオティクスは、存在していない。
本発明の一目的は、所与のプロバイオティクス細菌の特異的な増殖を可能にするプレバイオティクス組成物を提供することである。プレバイオティクスが、乳酸桿菌などのプレバイオティクスの有益な株を標的にできれば、やはり望ましいと思われる。本発明のまたさらなる一目的は、ある特定のプロバイオティクス細菌株に選択的なプレバイオティクス組成物を識別し、生成するためのスクリーニング方法を提供することである。
本発明の第１の態様によれば、微生物によって生成されたオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物であって、オリゴ糖は、所定のプロバイオティクス細菌株に選択的であること、および所定のプロバイオティクス細菌株によって逆酵素反応により生成することができることを特徴とする、プレバイオティクス組成物が提供される。
酵素は、糖分解酵素を含むことができる。このような酵素は、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、またはβ−キシロシダーゼの１つから選択されたものであってよい。
プレバイオティクス組成物は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含むことができる。
所定の細菌株は、好ましくは乳酸桿菌を含み、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）亜種ブルガリクス（bulgaricus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）亜種サリバリウス（salivarius）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）またはラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）から選択される株を含むことができる。ＧＯＳ形態は、細菌株における逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成された形態と実質的に同じであることが好ましい。
プレバイオティクス組成物は、好ましくは望ましい常在性腸内微生物叢、特に、好ましいプロバイオティクス細菌株の割合の変化を誘発するために、組成物中に有効量で存在する。微生物叢の変化が急速に必要である場合、または現在存在していない新しい細菌株を腸に播種する助けにするために組成物が使用される場合、より多くの量を利用してもよい。
プレバイオティクス組成物は、被包されていてもよい。多くの被包技術が、当業者には明らかであり、用いられる被包技術は、消化通過中にプロバイオティクス増殖培地に必要な安定性に合わせて調整される。
プレバイオティクス組成物は、身体の胃腸管環境を通過し、腸の下部に効率的に送達され放出されるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含むことができる。プレバイオティクスは、濃縮され、かつ／またはフリーズドライされ得る。組成物は、いくつかの型式、例えば飲むことのできる液体および／または固体もしくは液体食料品と混合できる粉末であってもよい。
プレバイオティクス組成物は、１つまたは複数の活性成分、例えばビタミン、ミネラル、植物性化学物質、抗酸化剤、およびそれらの組合せと組み合わせることができる。
ビタミンには、脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミン、ならびにそれらの組合せが含まれ得る。一部の実施形態では、ビタミンには、水溶性ビタミン、例えばビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ（チアミンまたはＢ１、リボフラビン（riboflavoin）またはＢ２５ナイアシンまたはＢ３、ピリドキシンまたはＢ６、葉酸またはＢ９、シアノコバラミン（cyanocobalimin）またはＢ１２、パントテン酸、ビオチン）、およびそれらの組合せが含まれ得る。
ミネラルには、ナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、亜リン酸、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
抗酸化剤には、アスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＥリン酸塩、トコフェロール、ジ−アルファ−トコフェリルリン酸塩、トコトリエノール、アルファリポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、ベータクリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ベータ−カロテン、カロテン、混合カロテノイド、ポリフェノール、フラボノイド（fiavonoid）、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
植物性化学物質には、カロテノイド（cartotenoid）、葉緑素、クロロフィリン、繊維、フラバノイド、アントシアニン（anthocyamn）、シアニジン（cyaniding）、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン（epigailocatechingallate）、テアフラビン、テラルビシン（thearubigin）、プロアントシアニジン（proanthocyanin）、フラボノール、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、フラバノンスヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、フィトエストロゲン、レスベラトロール、イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ダイズイソフラボン、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
本発明のさらなる一態様によれば、コレステロールの管理または高コレステロールの処置に使用するためのプレバイオティクス組成物が提供される。あるいはまたはさらには、組成物は、メタボリック症候群、体重管理もしくは肥満、または糖尿病の管理または処置に使用するためのものであってもよい。微生物によって生成されたオリゴ糖を含む組成物であって、オリゴ糖は、所定のプロバイオティクス細菌株に選択的であること、および所定のプロバイオティクス細菌株によって逆酵素作用により生成することができることを特徴とする、薬品または医薬品および／または栄養補助食品として使用するための、本明細書で先に記載したプレバイオティクス組成物が提供される。
本発明のさらなる一態様によれば、高コレステロール、メタボリック症候群、肥満または糖尿病を処置するための、微生物によって生成されたオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物であって、オリゴ糖は、所定のプロバイオティクス細菌株に選択的であること、および所定のプロバイオティクス細菌株によって逆酵素作用により生成することができることを特徴とする、プレバイオティクス組成物が提供される。
本発明のまたさらなる一態様では、高コレステロール、メタボリック症候群、肥満または糖尿病を処置するための薬品の製造における、微生物によって生成されたオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物の使用であって、オリゴ糖は、所定のプロバイオティクス細菌株に選択的であること、および所定のプロバイオティクス細菌株によって逆酵素作用により生成することができることを特徴とする、使用が提供される。
本発明の第１の態様に記載のプレバイオティクスの特徴は、コレステロール管理のための組成物に適用することができ、交換可能であることも、当業者に明らかとなろう。
組成物は、医薬品または薬品の代わりに（またはそれに加えて）、栄養補助食品、健康補助食品または機能性食品として使用することができる。本発明のまたさらなる一態様は、栄養補助食品、健康補助食品または機能性食品のための、微生物によって生成されたオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物であって、オリゴ糖は、所定のプロバイオティクス細菌株に選択的であること、および所定のプロバイオティクス細菌株によって逆酵素作用により生成することができることを特徴とする、組成物であってもよい。
本発明の第１の態様に関連するプレバイオティクスの特徴は、栄養補助食品、健康補助食品または機能性食品のための組成物に適用することができ、交換可能であることも、やはり当業者に明らかとなろう。
さらに組成物は、既存の食料品、例えばヨーグルトに組み込むことができ、または食料品と容易にブレンドすることができ、もしくは液体飲料に作製することができる粉末として組み込むことができる。
本発明の別の態様によれば、プレバイオティクスとして使用するのに適した組成物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）プロバイオティクス細菌株のパネルをアセンブルするステップと、
（ｂ）オリゴ糖活性を有することが見出された株を選択するステップと、
（ｃ）選択されたプロバイオティクス株が、逆酵素反応によってオリゴ糖プレバイオティクス組成物を生成するように誘導するステップと、
（ｄ）オリゴ糖プレバイオティクス組成物を単離するステップと
を含む、方法が提供される。
該方法は、
（ｅ）単離されたオリゴ糖プレバイオティクス組成物を使用して、選択されたプロバイオティクス細菌株の増殖および／または生存を評価するステップ
をさらに含むことができる。
プロバイオティクスに特異的なプレバイオティクスを生成するために、プロバイオティクス細菌株において逆酵素反応を利用すると、その後プレバイオティクスを使用することにより、他の細菌株を消費して所望のプロバイオティクス株の増殖促進の特異性をより高めることができる。
オリゴ糖がＧＯＳを含むことが好ましい。
該方法は、本明細書で先に記載したプレバイオティクス組成物の識別および生成に使用することができる。
本発明のまたさらなる一態様によれば、シンバイオティクス配合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）プロバイオティクス細菌株のパネルをアセンブルするステップと、
（ｂ）オリゴ糖活性を有することが見出された株を選択するステップと、
（ｃ）選択されたプロバイオティクス株が、逆酵素反応によってオリゴ糖プレバイオティクス組成物を生成するように誘導するステップと、
（ｄ）選択された株ごとに、オリゴ糖プレバイオティクス組成物を単離するステップと、
（ｅ）選択された各株および対応する単離されたオリゴ糖プレバイオティクス組成物を、配合物として組み合わせるステップと、
（ｆ）腸モデルにおける配合物ごとに選択されたプロバイオティクス細菌株の増殖および／または生存の改善を評価し、増殖および／または生存の改善を示す配合物を識別するステップと
を含む、方法が提供される。
腸モデルは、所与の配合物を投与する前、および投与した後に、個体の腸内微生物細菌叢を調査するインビボ方法を含むことができる。代替として、腸モデルは、腸内条件を実質的に模倣するインビトロ方法を含むことができる。
本発明の第１の態様に関連するプレバイオティクスの特徴は、スクリーニングされた配合物の一部を形成する組成物の所望の属性となることも、当業者に明らかとなろう。
本発明の詳細な説明
ここで、本発明の実施形態を、以下の図面の詳細な説明を単なる例として用いて説明する。
［図１Ａ］Ｌ．プランタルム（plantarum）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図１Ｂ］Ｌ．カゼイ（casei）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図１Ｃ］Ｌ．サリバリウス（salivarius）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図１Ｄ］Ｌ．ファーメンタム（fermentum）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。 ［図１Ｅ］Ｌ．ラムノサス（rhanmosus）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図１Ｆ］Ｌ．デルブリュッキ（delbrueckii）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。 ［図２Ａ］Ｌ．プランタルム（plantarum）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｂ］Ｌ．カゼイ（casei）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｃ］Ｌ．サリバリウス（salivarius）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｄ］Ｌ．デルブリュッキ（delbrueckii）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。 ［図２Ｅ］Ｌ．ラムノサス（rhanmosus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｆ］Ｌ．アシドフィルス（acidophilus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。［図２Ｇ］Ｌ．ヘルベティカス（helveticus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数のグラフである。 ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１４時間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ６００を毎時間測定した）。 ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、試験前２日間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ６００を毎時間測定した）。 Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ＯＤ４２０で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。 Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ＯＤ４２０で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。 Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ｏ−ＮＰ（ｕＭ）で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。 Ａ ＭＲＳブロス、Ｂ １％ラクトース基本培地およびＣ ５％ラクトース基本培地中、ｏ−ＮＰ（ｕＭ）で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリーニングした、様々な乳酸桿菌種の結果を示すグラフである。 Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６による１６８時間にわたるＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率を示すグラフである。 Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６による１６８時間にわたるＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率を示すグラフである。 Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。 Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。 Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。 Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。 １８Ｕ．のＬ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。 １８Ｕ．のＬ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。 ３０Ｕ．のＬ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。 ３０Ｕ．のＬ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６に関する継時的な糖（ＧＯＳ、ラクトースおよび単糖）の量およびＧＯＳ％のグラフである。 Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６から生成されたＧＯＳ混合物上で増殖した様々な細菌の相対的増殖プロファイルを示すグラフである。 Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６から生成されたＧＯＳ混合物上で増殖したより小さい範囲の細菌の相対的増殖プロファイルを示す第２のグラフである。
機構的に、グリコシダーゼは、それらの好ましいアクセプター分子として水を使用するすべてのトランスフェラーゼである。しかし、これらの酵素は、高濃度の基質炭水化物などの適切な状況下では、単糖部分を、基質（グリコシルドナーとして作用する）から他の基質または非基質炭水化物（グリコシルアクセプターとして作用する）に転移させる。典型的に、これらの反応の生成物は、すべての可能なグリコシド連結を異なる量で含有する複合体混合物である。反応は動力学的に制御されるので、合成された連結プロファイルは、生成する酵素による連結の加水分解の速度定数に対してマッピングすべきである。結果的にオリゴ糖は、胃腸管の生態系において、生成する生物によって他の生物よりも容易に代謝され得る。この手法は、実験室での試験で見込みがあることが示されている。
しかし、多くの酵素合成反応では、ラクトースに加えてアクセプターとして作用する他の炭水化物を含むことが可能である。このように、新規な構造を含有する新規な混合物を構築することができた。
乳酸桿菌およびビフィドバクテリウム属などのプロバイオティクス種は、高度に糖分解性であり、しばしば様々なグリコシダーゼ酵素を生成する。これらの酵素は、転移活性を有することができ、オリゴ糖を合成することができる。この活性は、β−ガラクトシダーゼについては広く報告されているが、α−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、またはβ−キシロシダーゼなどの他の酵素については集中的に研究されていない。スクロース依存性グリコシルトランスフェラーゼを使用して、オリゴ糖を合成することも可能である。これらは、フルクトースまたはグルコース部分のいずれかを、スクロースからスクロースアクセプターに転移し、多糖体の長鎖を構築する。しかしこれらは、適切なアクセプターが存在する状態では、しばしばヘテロ−オリゴ糖を合成する。これは、デキストランスクラーゼおよびアルテルナンスクラーゼ（alternansucrase）と共に生じることが示されており、レバンスクラーゼ（laevansucrase）と共に生じる場合もある。
ある合成反応の生成物を、その後の反応においてアクセプターとして使用する戦略を探求するための実験が求められている。プロバイオティクスがβ−ガラクトシダーゼおよびレバンスクラーゼを生成する場合、例えば酵素抽出物は、ガラクトオリゴ糖を合成するために使用することができた。次に、この生成物混合物を、同じ抽出物およびグリコシルドナーとしてのスクロースと併用すると、フルクタンを合成することができた。これらのフルクタンの多くは、アクセプターとして作用し得るガラクトオリゴ糖上に構築され得る。このようにして、生成する生物によって発酵が高度に調整されるはずである、新規な複合体混合物を生成することができた。
本実験の基礎は、新規なＧＯＳを生成するために、微生物においてβ−ガラクトシダーゼを可逆的に使用することであった。β−ガラクトシダーゼは、普通はラクトースを消化するはずである。しかし、基質および温度に関して反応条件を変化させることによって、酵素は可逆的に作用し、ラクトース（ＧＯＳ）のオリゴ糖版を産生する。
乳酸桿菌は、ビフィドバクテリウム属であるプロバイオティクスとしてより頻繁に使用されているが、乳酸桿菌に選択的なプレバイオティクスは存在していない。またこれらのプロバイオティクスは、β−ガラクトシダーゼ活性を備えているので、実験によって、これらのプロバイオティクスに特異的なＧＯＳの生成を誘発した。ＧＯＳなどのプレバイオティクスの代謝作用は、種に特異的であり（バイ−イムノ（Bi-Immuno）細菌およびビフィド（Bifido）細菌によって証明される通り）、したがって乳酸桿菌のＧＯＳは、乳酸桿菌の増殖、生存性、および健康上の利益を潜在的に増強する。
実施した実験は、以下の通りであった。
１．様々なプロバイオティクスの乳酸桿菌を集め、ＧＯＳを産生するそれらの能力について試験し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定すること、
２．逆酵素手順を使用してプレバイオティクスＧＯＳを産生すること、
３．新規な分子をスケールアップして、インビトロ試験を行うこと、
４．プロバイオティクスおよびシンバイオティクスを試験する一連の「腸モデル」実験において、プレバイオティクスが存在しない状態および存在する状態で、乳酸桿菌の生存および増殖を比較すること、
５．乳酸桿菌のための被包材料としてＧＯＳを使用できる可能性を評価すること、ならびに
６．被包材料の送達特性を試験すること。
実験の第１段階中に最初に調査した細菌株を、以下の表１に示す。
細菌増殖曲線の決定を、ＰＢＳ９００μＬ中、培養物の希釈系列１００μＬを使用して、０時間、３時間、５時間、８時間および２４時間間隔で培養物をサンプリングすることによって行った。各系列２０μＬを、陰性対照と共に瓶上に広げ、増殖を評価した。
株のいくつかの細菌計数を、０．１％ラクトースを増殖培地として使用することによって評価した。図１Ａ〜１Ｆは、Ｌ．プランタルム（plantarum）、Ｌ．カゼイ（casei）、Ｌ．サリバリウス（salivarius）、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）、Ｌ．ラムノサス（rhanmosus）、およびＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）のための増殖培地として０．１％ラクトースを使用した経時的な細菌計数が、すべておよそ６．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌから、約１３時間目には９．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌをわずかに超える定常増殖曲線をもたらし、増殖が、２５時間目までには増大しなくなった通り漸減したことを示している。
株のいくつかの細菌計数を、５％ラクトースを増殖培地として使用することによって評価した。図２Ａ〜２Ｇは、Ｌ．プランタルム（plantarum）、Ｌ．カゼイ（casei）、Ｌ．サリバリウス（salivarius）、Ｌ．デルブリュッキ（delbrueckii）、Ｌ．ラムノサス（rhanmosus）、Ｌ．アシドフィルス（acidophilus）およびＬ．ヘルベティカス（helveticus）のための増殖培地として５％ラクトースを使用した、経時的な細菌計数を示している。ここでもすべてが、およそ６．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌから、約１３時間目には９．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌをわずかに超える定常増殖曲線をもたらし、次に、増殖は、２５時間目までには増大しなくなった通り平坦になった。
次に、コレステロールを細菌株の培養培地に含め、各株をインキュベーション後にコレステロールの量について試験した。
使用したコレステロールアッセイは、次式によるものである。
コレステロール％×乾燥重量（ｇ）−１＝（Ｂ−Ｔ／Ｂ×１００）／Ｗ
式中、Ｂ＝接種されなかった対照中のコレステロール含量（ｍｇ／ｌ−１）、Ｔ＝培養培地中のコレステロール（ｍｇ／ｌ−１）およびＷ＝細胞（１２時間のインキュベーション後の乾燥重量（ｇ））。
培養物のペレット重量を、上清（supernanent）とは独立に測定し、消費されたブロス（蒸発した残留物）も測定した。コレステロールアッセイを数回実施して、三連で実施した。
図３は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１４時間にわたる異なる細菌株の増殖を示しており（ＯＤ６００を毎時間測定した）、いくつかの細胞株が、この培地において増殖するのにはるかにより有効であったことを示している。Ｌ．プランタルム（Planatarum）は、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）、Ｌ．カゼイ（casei）およびＬ．ファーメンタム（fermentum）が続いた。図３は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、１２時間にわたる異なる細菌株の増殖を示しており（ＯＤ６００を毎時間測定した）、いくつかの細胞株が、この培地において増殖するのにはるかにより有効であったことを示している。Ｌ．プランタルム（planatarum）は、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）、Ｌ．カゼイ（casei）およびＬ．ファーメンタム（fermentum）が続いた。
図４は、ＭＲＳ培地中、０．４％のｏｘｇａｌｌおよび１００ｍｇ／Ｌのコレステロール濃度における、試験前２日間にわたる異なる細菌株の結果を示すグラフである（ＯＤ６００を毎時間測定した）。Ｌ．ファーメンタム（fermentum）は、最良の増殖プロファイルを示し、その後にＬ．ラムノサス（rhanmosus）、Ｌ．ヘルベティカス（halveticus）、Ｌ．ヘルベティカス（halveticus）およびＬ．サリバリウス（salivarius）が続いた。
次に、コレステロール活性をさらに測定するために、直接的なプレートアッセイ試験を株に対して実施した。静止細胞の胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性を測定して、コンジュゲートした胆汁酸の加水分解からのアミノ酸の放出を評価した。胆汁酸塩の脱コンジュゲーション（遊離コール酸の放出に基づく）を測定し、最後に、脱コンジュゲーションした胆汁とコレステロールの共沈殿を評価した。以下の表２は、直接的なプレートアッセイの結果を示す。
Ｌ．カゼイ（casei）、Ｌ．デルブリュッキ（delbrueckii）およびＬ．アシドフィルス（acidophilus）は、すべて信頼できるＢＳＨ活性を有していたことが分かった。
コレステロールを含有する培地で増殖できる株およびＢＳＨ活性を有する株の結果を比較することによって、Ｌ．カゼイ（casei）およびＬ．デルブリュッキ（delbrueckii）、は、特定のプレバイオティクスＧＯＳを生成し、識別するのに適した候補であると思われる。
特定の株によって産生されたＧＯＳプレバイオティクスは、ＧＯＳを生成するだけでなく代謝する、最適化された代謝作用を有する（逆酵素手順から産生される通り）。したがってＧＯＳは、プロバイオティクスにとって非常に選択的な環境を作り出すことができるシンバイオティクスに、プロバイオティクスと共に組み込むことができる。プロバイオティクスは、健康上の特定の利益を有することができるので、健康上の特定の利益に合わせて調整されるシンバイオティクス配合物を産生することができる。
本発明の一態様によるシンバイオティクス組成物を識別し、配合するためのスクリーニング方法は、以下のステップに従う。
（ａ）健康上の必要性を識別するステップ、
（ｂ）プロバイオティクス作用、例えばＢＳＨ活性、コレステロール同化および心疾患にとって非常に重要な交差（interjection）点を識別するステップ、
（ｃ）ハイスループットスクリーニング方法を使用するプロバイオティクスライブラリーをスクリーニングするステップ、
（ｄ）潜在的な活性および健康上の利益を有する株を識別するステップ、
（ｅ）発酵過程を使用して活性の発現を最適化するステップ、
（ｆ）ベータガラクトシダーゼ活性について株をスクリーニングするステップ、
（ｇ）新規なＧＯＳを産生するステップ、
（ｈ）インビトロ試験を可能にするためにスケールアップするステップ、
（ｉ）プレバイオティクスが存在しない状態および存在する状態で、インビトロプレートアッセイおよび腸モデルを使用して、プロバイオティクスの生存および増殖を比較するステップ（株が特徴付けられたら、集団変化を経時的に研究するための分子方法論を使用する。このことは、数の増大または活性の増大に起因して影響を受ける場合にわかる）、ならびに
（ｊ）プレバイオティクスおよびプロバイオティクスを組み合わせて、組み合わされたプレバイオティクスおよびプロバイオティクスの効果を調査するステップ。
新規なＬ．ロイテリ（reuteri）ＧＯＳの嫌気的利用の評価
これらの実験では、嫌気性培養物を試験して、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を使用して２４時間目の腸内細菌群の集団をモニタすることによって、新規なラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のガラクトオリゴ糖のインビトロ利用を評価した。フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、メリビオースおよびラフィノースを、参照炭水化物として使用した。以下の表は、これらの実験結果を示している。
結果は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuterri）のＧＯＳが、ビフィドバクテリウム属および乳酸桿菌の集団数において有意な増大を示し、プレバイオティクス効果（affect）を呈することを示している。さらにＧＯＳは、いかなる他の糖よりも乳酸桿菌の増殖速度を１０８％も増大し、属の特異性を示唆した。ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuterri）の株を添加すると、プレバイオティクス効果が増大し、ビフィドバクテリウム集団が１２０％増大した。
このことは、ＧＯＳを生成する生物を、その生物によって生成されたＧＯＳに添加すると、ＧＯＳ単独よりも腸ミクロフローラ集団に対する効果が大きかったことを示唆している。
乳酸桿菌β−ガラクトシダーゼのスクリーニングアッセイ
これらの実験では、１０種類の乳酸桿菌種を、β−ガラクトシダーゼ活性について、標準酵素アッセイを使用してｏ−ＮＰＧを基質として用いて三連でスクリーニングした。実験は、ＭＲＳ、基本培地中１％および５％ラクトースの３種類の異なる培地で実施した。ラクトースは、β−ガラクトシダーゼのための一次基質なので、最高活性を呈すると予測された。活性を０〜２４時間の間の時点で測定し、最高活性は、２４時間後に示された。図５〜６に示されている通り、一般に、５％ラクトースは、最高酵素活性を呈し、ＭＲＳブロス（炭素源としてグルコースだけを含有する）よりも高い傾向がある。高い酵素活性は、ＧＯＳを産生するために必須であり、全体的に高い活性を示す３種類の生物は、両方のＬ．ファーメンタム（fermentum）株およびＬ．カゼイ（casei）を含む。
Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６から長時間かけて生成されたＧＯＳ
これらの実験では、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６を、それらのＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の生成（および消費）に関して１６８時間かけて評価した。
Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６のＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率を、以下および図７に示す。
Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６のＧＯＳ、ラクトースおよび単糖の収率を、以下および図８に示す。
２０％ラクトース培地中、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６から２４時間かけて生成されたＧＯＳ
この実験では、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６のβ−ガラクトシダーゼからのＧＯＳの合成を調査した。溶解した後、粗製抽出物を、２０％ラクトース中、２４時間かけてインキュベートし、試料を０時間目および２４時間目に得た。
以下の表は、Ｔ０において存在している糖を示す。
以下の表は、Ｔ２４において存在している糖を示す。
Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６から短時間に生成されたＧＯＳ
この実験では、ＧＯＳを、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６から生成し、糖の酵素活性対ＧＯＳ％を、先の実験中にほとんどの活性が生じたとき、そのままの状態で５０時間にわたって評価した。
プロトコル
ＧＯＳを、以下のプロトコルを使用して生成した。
１．Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６のために、２％ラクトースを補充した改変ＭＲＳブロス中、終夜の培養物５０ｍｌをセットアップする。
２．２％ラクトースを含有するｍＭＲＳブロス１Ｌに、終夜の培養物５０ｍｌを懸濁させる。
３．嫌気性キャビネット中で３７℃においてインキュベートする。
４．Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６については１４時間。
５．Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６については８時間。
６．ＯＤ６６０を測定する。
７．培養物を１００００ｇ×１０分で遠心分離処理する。
８．リン酸ナトリウム緩衝液中、４０％ラクトースを作製する。４００ｇ／Ｌ。
９．上清を捨てる。
１０．ペレットをリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させる（５０ｍＭ、ｐＨ６．８）。
１１．ｆａｌｃｏｎ５０ｍｌにペレットをプールする。
１２．液体窒素で３回凍結融解させる。
１３．フレンチプレスする。３０，０００ＰＳＩ、１回通過、５滴／分。
１４．溶菌液を遠沈させる−１５，０００ｇ×４５分。
１５．上清を新しいｆａｌｃｏｎに注ぐ。
１６．βガル活性アッセイを実施して、酵素濃縮を行う。
１７．遊離細胞抽出物を、４０％ラクトース／リン酸ナトリウム緩衝液と共にインキュベートする。
１８．２００μｌを５０時間にわたって２時間ごとにサンプリングする。
１９．試料を凍結させる。
２０．０．２μｍフィルタを介してすべての試料を滅菌濾過する。
２１．ＨＰＬＣで分析する。
結果−ＧＯＳの生成
図９〜１２に示されている通り、ラクトース変換は３０〜４５％であり、ＧＯＳ収率は１０％であった。
酵素活性
Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６およびＬ．ファーメンタム（fermentum）ＮＣＩＭＢ３０２２６から生成されたＧＯＳの酵素活性（したがって効率）を確認するために、さらなる実験を実施した。
培養物を、１Ｌ中でＦは８時間増殖させ、Ｆ＊については１４時間増殖させ、１２，０００ｇ×１０分で収集した。細胞を溶解し、細胞抽出物を１５，０００ｇ×４５分で遠心沈殿させた。次にこれを、４０％ラクトースリン酸ナトリウム緩衝液＋ＭｇＣｌ２中、同じＵの酵素／反応と共に４０℃でインキュベートし、活性を、ＨＰＬＣにより３６時間かけて２時間の時点で分析した。
酵素単位の算出は、以下の通りであった。
結果
図１３〜１６に示されている通り、ラクトース変換は４０〜５０％であり、ＧＯＳ収率は１５〜２０％であった。
乳酸桿菌の特異性とＧＯＳ純度
この実験では、この種に特異的なＧＯＳが任意の増殖特異性を提供するかどうかを知るために、Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６から生成されたＧＯＳを、様々な細菌の増殖培地の一部として使用した。
ＧＯＳの合成
Ｌ．ファーメンタム（fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６を、２％ラクトースを補充した改変ＭＲＳ中、培養物１Ｌにおいて１４時間増殖させた。培養物を遠心沈殿させ、リン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させた。細胞を、液体窒素およびフレンチプレスを使用して溶解し、溶菌液をスピンして、遊離細胞抽出物を得た。遊離細胞抽出物を、４０％ラクトースと共にインキュベートし、試料を５０時間にわたって２時間ごとに得た。試料を、分析のためにすべての時点後にＨＰＬＣに搭載した。
２０％ＧＯＳ混合物の増殖曲線
初期に生成された不純ＧＯＳの１％を、ｍＭＲＳ ｈｕｎｇａｔｅ９ｍｌに添加した。この混合物上で、以下の様々な生物の増殖を分析した。クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）ＡＴＣＣ１１９７６、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）およびラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueccki）。実験を、列挙したものを用いて、０、３、６、８、１６および２４時間において３回の反復で三連で実施した。
結果
図１７および１８に示されている通り、Ｃ．ディフィシレ（difficile）には増殖はほとんど見出されなかったが、最良の増殖が、Ｌ．ラムノサス（rhamnosus）に見出された。２０％ＧＯＳ混合物は、一般に、乳酸桿菌に対してより選択的であった。
前述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護範囲を制限するものではなく、本発明を実施することができる方法を例示する。

Claims (23)

  1. 微生物によって生成されたオリゴ糖を含むプレバイオティクス組成物であって、前記オリゴ糖が、所定のプロバイオティクス細菌株に選択的であること、および前記所定のプロバイオティクス細菌株によって逆酵素反応により生成することができることを特徴とする、プレバイオティクス組成物。
  2. 前記酵素が、糖分解酵素を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記酵素が、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−およびβ−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、またはβ−キシロシダーゼから選択される、請求項１または２に記載の組成物。
  4. ガラクトオリゴ糖を含む、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
  5. 前記所定のプロバイオティクス細菌株が、乳酸桿菌株を含む、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
  6. 前記乳酸桿菌株が、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）亜種ブルガリクス（bulgaricus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）亜種サリバリウス（salivarius）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）またはラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）から選択される株を含む、請求項４に記載の組成物。
  7. 前記乳酸桿菌株が、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）株を含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記オリゴ糖が、ＧＯＳを含み、前記ＧＯＳが、前記プロバイオティクス細菌株における逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成された形態と実質的に同じである、請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
  9. 被包されている、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
  10. 身体の胃腸管環境を通過し、その機能的特性を保持できるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
  11. 飲むことのできる液体の形態であり、かつ／または固体もしくは液体食料品と混合することができる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 薬品として使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 栄養補助食品として使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  14. コレステロールの管理または高コレステロールの処置に使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  15. メタボリック症候群の管理または処置に使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 体重管理に使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 糖尿病の管理または処置に使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  18. プレバイオティクスとして使用するのに適した組成物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）プロバイオティクス細菌株のパネルをアセンブルするステップと、
    （ｂ）オリゴ糖活性を有することが見出された株を選択するステップと、
    （ｃ）前記選択されたプロバイオティクス株が、逆酵素反応によってオリゴ糖プレバイオティクス組成物を生成するように誘導するステップと、
    （ｄ）前記オリゴ糖プレバイオティクス組成物を単離するステップと
    を含む、方法。
  19. （ｆ）前記単離されたオリゴ糖プレバイオティクス組成物を使用して、前記選択されたプロバイオティクス細菌株の増殖および／または生存を評価するステップ
    をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記オリゴ糖が、ＧＯＳを含む、請求項１８および１９に記載の方法。
  21. 請求項１から１７のいずれか一項に記載のプレバイオティクス組成物の生成に使用するための、請求項１８または１９のいずれかに記載の方法。
  22. シンバイオティクス配合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）プロバイオティクス細菌株のパネルをアセンブルするステップと、
    （ｂ）オリゴ糖（oligosacharride）活性を有することが見出された株を選択するステップと、
    （ｃ）前記選択されたプロバイオティクス株が、逆酵素反応によってオリゴ糖プレバイオティクス組成物を生成するように誘導するステップと、
    （ｄ）選択された株ごとに、前記オリゴ糖プレバイオティクス組成物を単離するステップと、
    （ｅ）選択された各株および対応する単離されたオリゴ糖プレバイオティクス組成物を、配合物として組み合わせるステップと、
    （ｆ）腸モデルにおける配合物ごとに前記選択されたプロバイオティクス細菌株の増殖および／または生存の改善を評価し、増殖および／または生存の改善を示す配合物を識別するステップと
    を含む、方法。
  23. 前記腸モデルが、所与の配合物を投与する前、および投与した後に、個体の腸内微生物細菌叢を調査するインビボ方法を含む、請求項２２に記載の方法。
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