JP2016532687A - 脂肪酸代謝異常症を治療するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 対象における脂肪酸代謝異常症、特に脂肪酸酸化異常症の阻害、治療、および／または予防のための組成物および方法が提供される。【選択図】 なし

Description

本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１３年７月３１日に提出された米国仮出願第６１／８６０，４３０号の優先権を主張するものである。前述の出願は、その引用により本明細書に組み込まれる。

本発明は米国国立心肺血液研究所によって授与された助成金番号５Ｒ０１ ＨＬ５４９２６−１６の下、政府からの支援によって成されたものである。政府は本発明の一定の権利を有する。

本出願は脂肪酸酸化異常症を治療、予防、および／または阻害する組成物および方法に関するものである。

本発明に係る技術水準を説明するためいくつかの出版物および特許文献が本明細書にわたり引用される。これらの各引用物は引用されることによって本明細書に組み込まれる。

極長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＶＬＣＡＤ）は四つ存在するアシルＣｏＡ脱水素酵素の一つである。ＶＬＣＡＤはホモダイマーのミトコンドリアタンパク質であり、脂肪酸β酸化の第一段階を触媒する。ＶＬＣＡＤは１６〜２４の炭素長を有する脂肪酸ＣｏＡエステルに対し主に活性があり、ヒトの組織および哺乳類の臓器および細胞におけるパルミトイルＣｏＡ脱水素の８０％以上を担っており、そのミトコンドリアにおける脂肪酸酸化において重要な役割を果たすことを示している。

ＶＬＣＡＤ欠損症は１９９３年に初めて確認された常染色体劣性遺伝疾患であり、現在ではミトコンドリアのβ酸化異常症の中でも二番目に多いと考えられている。この関連疾患は３つの主な表現型を示す。最も重篤な型のＶＬＣＡＤ欠損症では新生児期の心筋症および肝疾患を示し、通常生後一年以内に死亡に至る。乳幼児期型の表現型は通常、幼児期の低ケトン性低血糖および肝腫大を示し、心筋症を伴わない。最も軽度の表現型は遅発型の発作性筋疾患と関連しており、間欠的な横紋筋融解症、筋の痙攣および／または筋肉痛、および運動障害を伴う。今日まで、１００以上の病的突然変異が知られており、ヌル（通常この疾患の最も重症型と関連する）およびＶＬＣＡＤタンパク質全長にわたって起こり、且つこの疾患の軽症型と関連しているミスセンス変異を含む。ミスセンス変異は酵素活性の低下および／またはこのタンパク質の低安定性を引き起こし、ミトコンドリア内のアシルＣｏＡ活性の定常状態レベルの低下をもたらす。ＶＬＣＡＤ疾患の診断に際しては、その発症の予防に重きが置かれる。患者は通常、中鎖脂肪酸トリグリセリドによって補給されるカロリー追加を伴う低脂肪のやり方の下に置かれる。より良い治療および予防法が必要とされる。

本発明によれば、脂肪酸代謝異常症、特に脂肪酸酸化異常症を治療、阻害および／または予防する方法が提供される。この方法は少なくとも一つのＳ−ニトロシル化剤を前記対象に投与する工程を含む。ある実施形態では、前記脂肪酸酸化異常症は極長鎖アシルコエンザイムＡ脱水素酵素欠損症（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＶＬＣＡＤＤ）である。ある実施形態では、Ｓ−ニトロシル化剤はＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン（Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＮＯ−ＮＡＣ）である。この方法は、さらに、前記脂肪酸代謝異常症の治療のための少なくとも一つの別の治療剤、例えばトリヘプタノインまたはベザフィブラートなどを投与する工程を有することも出来る。この方法はまた前記Ｓ−ニトロシル化剤を投与する前に、前記対象において脂肪酸酸化異常症を診断する工程を有することが出来る。

本発明の別の観点によれば、脂肪酸代謝異常症、特に脂肪酸酸化異常症を治療、阻害、および／または予防する組成物が提供される。ある実施形態では、前記組成物は少なくとも一つのＳ−ニトロシル化剤、少なくとも一つの薬学的に許容されるキャリア、および、選択的に、少なくとも一つの脂肪酸代謝異常症の治療のための別の治療剤を有する。

図１Ａ〜１Ｄは、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化部位の同定を示す。図１Ａおよび１Ｂは、ＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウスの肝臓ホモジネートおよびｅｘ ｖｉｖｏにおいてＧＳＮＯ処理したｅＮＯＳ^−／−肝臓から得られたＶＬＣＡＤの二重荷電されたスルホン酸を含むトリプシン分解後のペプチド、Ｓｅｒ^２３１−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ^２３８−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ^２４８（配列ＩＤ番号：３；モノアイソトピックｍ／ｚ＝９６０．９５３９および９６０．９５６１）の代用的な質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）スペクトルを提供する（生物学的複製Ｎ＝３）。同ペプチドのスペクトルが野生型マウスの肝臓からも得られた。図１Ｃおよび１Ｄは、ＭＳ／ＭＳスペクトルがＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウス肝臓およびｅｘ ｖｉｖｏにおいてＧＳＮＯ処理したｅＮＯＳ^−／−肝臓中のＶＬＣＡＤの配列およびスルホン酸を含むペプチドの部位を確認したことを示す（生物学的複製Ｎ＝３）。配列ＩＤ番号：３が図１Ｃおよび１Ｄに示される。 図２は野生型およびｏｂ／ｏｂマウスの肝臓のホモジネート中の^３Ｈ標識パルミトイルＣｏＡ酸化速度のグラフを提供する。ボンフェローニ・ポスト・ホック試験を伴う分散分析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ：ＡＮＯＶＡ）を用い、野生型とＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウス間で^＊Ｐ<０．０５（ｎ＝４匹）であった。ボンフェローニ・ポスト・ホック試験を伴うＡＮＯＶＡを用い、ＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウスとＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウス間で^＊＊Ｐ<０．０１（ｎ＝４匹）であった。図２Ｂは野生型マウス、ＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウス、およびＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓のトリアシルグリセリド値を示す。ボンフェローニ・ポスト・ホック試験を伴うＡＮＯＶＡを用い、野生型マウスとＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウス間で^＊Ｐ<０．０００１（ｎ＝４匹）であった。ボンフェローニ・ポスト・ホック試験を伴うＡＮＯＶＡを用い、ＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウスとＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウス間で^＊＊Ｐ<０．００５（ｎ＝４匹）であった。図２Ｃは野生型マウス、ＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウス、およびＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウス血清中におけるトリアシドグリセリド値を示す。統計的有意差はなし（ｎ＝４匹）。図２Ｄは野生型マウス、ＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウス、およびＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウスからの肝臓ホモジネート中のパルミトイルＣｏＡ濃度の関数として測定されたＶＬＣＡＤの代表的な初速度値を提供する。図２Ｅおよび２Ｆは、ＶＬＣＡＤ酵素活性の反応速度解析により、野生型またはＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウスの肝臓と比べてＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウス肝臓は、Ｖ_ｍａｘは同様であったが、ＫＭが顕著に高かったことを示した。ボンフェローニ・ポスト・ホック試験を伴うＡＮＯＶＡにより^＊Ｐ<０．０５（生物学的複製ｎ＝３）であった。図２Ｇは肝臓組織のトリクローム染色により脂肪酸蓄積がＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウス（上図）と比べてＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウス（下図）において減少していることを示す。画像は観察された４匹のマウス肝臓の代表的なものである。示されるスケールバーは左図において１５μｍ、右図において７．５μｍに相当する。図２Ｈは野生型およびｅＮＯＳ^−／−マウスの肝臓ホモジネートにおけるパルミトイルＣｏＡ（０．２５ｍＭ）によるフェリシニウムイオンの減少により決定されたＶＬＣＡＤ特異活性を示す。ｅＮＯＳ^−／−におけるこの特異的活性は野生型または測定の３０分前に５μＭのＧＳＮＯで処理したものと比べて顕著に低かった。ボンフェローニ・ポスト・ホック試験を伴うＡＮＯＶＡを用い、^＊ｐ<０．０００１、^＊＊ｐ<０．０５とした。生物学的複製はＮ＝３を用いた。図２ＩはｅＮＯＳ^−／−マウスの肝臓ホモジネートおよびＧＳＮＯ処理されたｅＮＯＳ^−／−マウス肝臓ホモジネートから得られた、有機水銀に吸着しなかったＶＬＣＡＤ画分（Ｕ＝非修飾ＶＬＣＡＤ）および吸着したＶＬＣＡＤ画分（Ｂ＝Ｓ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤ）を用いたウェスタンブロット解析を示す。未処理のホモジネートにおける吸着した画分におけるＶＬＣＡＤの欠如は、ｅＮＯＳ^−／−肝臓のタンパク質がＳ−ニトロシル化されていなかったことを表す。処理されたホモジネートの吸着した画分において免疫学的な反応があったことから明らかなように、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＧＳＮＯ処理はこのタンパク質画分をＳ−ニトロシル化していた。本実験は後２回繰り返され同様の結果が得られた。図２Ｊは１５０μＭの六フッ化リン酸フェリシニウムを電子アクセプターとして使用した時のＶＬＣＡＤのアシル脱水素酵素活性の代表的なグラフを示す。この活性は０．１２５ｍＭのパルミトイルＣｏＡを添加後のＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウスの肝臓ホモジネートにおいて測定した。ＶＬＣＡＤ活性測定におけるこの測定法の特異性は、抗ＶＬＣＡＤ抗体の存在下ではフェリシニウム低下がなくなったことにより裏付けられた。Ｓ−ニトロシル化のＶＬＣＡＤ活性への影響は、肝臓ホモジネートのＵＶ光分解後の酵素活性の低下によって確認された。この実験は別の生物学的複製によってもう一度行われ、同様の結果を得た。図２Ｋは３群のマウスから得られた肝臓ホモジネートにおいて、パルミトイルＣｏＡ濃度の関数として測定した初速度（Ｖ_０）を示す。ｔ検定によって^＊ｐ<０．０５。生物学的複製Ｎ＝３。 図３ＡはＮａｔｉｖｅゲル（上図）およびＳＤＳゲル（中央図）によってＶＬＣＡＤを分析した代表的なウェスタンブロットを提供する。同一実験における隣接しないレーンについては黒線で示している。図３Ｂは還元条件下のＳＤＳゲルにおける肝臓全体のホモジネートまたは肝臓のミトコンドリア画分中のＶＬＣＡＤの量を数値化したものである。 ＡＮＯＶＡによって統計学的な有意差は見られなかった。ｎ＝３の異なるマウスを用いた。ｃｙｔ ｃはシトクロムｃを表す。図３Ｃは有機水銀レジンから溶出された肝臓ホモジネート中のＶＬＣＡＤの代表的なウェスタンブロットを提供する。このバンドのシグナル強度を、吸着画分（Ｂ）におけるＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤおよび吸着しなかった画分（Ｕ）中に存在する非修飾ＶＬＣＡＤの量を決定するのに使用した。これらのデータは２つの別の肝臓のホモジネートによって反復されたものである。 図４Ａは細胞溶解物の水銀支援捕捉によって吸着していない（ＶＬＣＡＤ）および吸着していた（ＳＮＯ−ＶＬＣＡＤ）画分の代表的なウェスタンブロットを提供する。ＦＬＡＧ（登録商標）標識された野生型またはＣ２３８ＡのＶＬＣＡＤを一時的に発現させたＨｅｐａ１〜６細胞を、ＧＳＮＯにさらした。前記吸着していない画分は非修飾タンパク質の量を示す。前記吸着していた画分はＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの量を示す。どちらの量も精製されたＶＬＣＡＤを用いて較正された抗体結合曲線を使用して決定した。ＶＬＣＡＤ中のＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの百分率を示している。ＮＤは、検出されなかったものを表す。生物学的複製ｎ＝３を用いた。同一実験における隣接していないレーンについては黒線で示している。図４ＢはＶＬＣＡＤの特異活性はＧＳＮＯ処理された野生型ＶＬＣＡＤを発現する細胞では顕著に高いが、ＧＳＮＯ処理された同じ量のＣ２３８Ａの変異型ＶＬＣＡＤタンパク質を発現する細胞ではそうではないことを示す。ボンフェローニ・ポスト・ホック試験を伴うＡＮＯＶＡによって、^＊Ｐ<０．００１、^＊＊Ｐ<０．０５とした。生物学的複製ｎ＝３である。 図５ＡはＶＬＣＡＤダイマーの結晶構造を提供し、Ｃｙｓ^２３８におけるＳ−ニトロシル化部位は両方のモノマーに金色で注釈する。Ｃｙｓ^２３８はループの中にあり、これは通常柔軟性を高くする二次構造であることに注目されたい。図５Ｂは高周波数モードがＳ−ニトロシル化に際しＣｙｓ^２３８が広範囲に移動したことを示していることを表す。ＷＥＢインターフェースであるＥｌＮｅｍｏ（ｉｇｓ−ｓｅｒｖｅｒ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｅｌｎｅｍｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いた非修飾およびＳＮＯ−ＶＬＣＡＤのノーマルモード解析。下線は非修飾ＶＬＣＡＤのアミノ酸残基のＲ^２値を示し、一方で上線はＳ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの同じ残基における値を示している。Ｓ−ニトロソシステイン２３８は非修飾システインと比較してより高いＲ^２値を示し、これはＳ−ニトロシル化によりＣｙｓ^２３８の移動が促進されることを示すことに注意。 図６Ａおよび６Ｂはそれぞれ、細胞株１および２のＶＬＣＡＤ反応速度パラメーターのグラフを提供する。５μｇの細胞溶解物を１５０μＭのフェロセニウムと混合し、表示される濃度のパルミトイルＣｏＡを添加した。３００ｎｍにおける時間の関数として示される、フェリシニウム吸光度の低下が測定されて、この酵素の初速度を時間０から吸光度の全変化の５％に対応する時間までの曲線の傾きにより決定した。

タンパク質のＳ−ニトロシル化は、一酸化窒素由来の主要な可逆的翻訳後修飾であり、酵素活性、タンパク質の局在、および安定性の制御をし、さらに一酸化窒素を介するシグナル伝達における役割も担っている（Ｓｔａｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｅｌｌ １０６：６７５−６８３； Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６：１５０−１６６； Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１０５０−１０５４； Ｊａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ３：１９３−１９７； Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １２：１０９４−１１００； Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｃｅｌｌ １１５：１３９−１５０； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， １：１５４−１５８； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：１０２−１０５； Ｍａｎｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １５４：１１１１−１１１６）。個々のタンパク質におけるＳ−ニトロシル化の機能的役割については報告されてきたが、ｉｎ ｖｉｖｏにおける生理的条件下におけるＳ−ニトロシル化およびＳ−ニトロシル化部位に関する包括的な解析は限られたものに留まる。このため、質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）に基づいたプロテオミクス的手法が実施され、それにより複合混合物中におけるＳ−ニトロシル化システイン残基の部位特異的な同定が可能となっている（Ｄｏｕｌｉａｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０７：１６９５８−１６９６３）。この手法はＳ−ニトロソシステインペプチドまたは完全なＳ−ニトロシル化されたタンパク質のいずれかを有機水銀化合物により選択的に濃縮することを基礎としている。前記ペプチドは、前記システインをスルホン酸に酸化する過ギ酸と共に放出され、ＭＳによるこの修飾ペプチドの正確な検出を可能にしている。または、タンパク質を完全な状態で溶出し、特定のタンパク質に対する抗体によってタンパクを標識することにより、前記修飾タンパク分子を定量化することが可能になる。検出の特異性を確実にするため、ネガティブコントロールは試料を紫外線（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ：ＵＶ）で前処理しＳ−ニトロソシステインを除去することによって得て、同条件下で解析した（Ｄｏｕｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，１０７：１６９５８−１６９６３）。これらの手法が野生型マウスの六個の臓器、また内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｅ：ｅＮＯＳ）欠損マウスにおける同じ臓器における、内在的Ｓ−ニトロシル化タンパク質を同定するために用いられた。マウスにおける包括的なＳ−ニトロソシステインのプロテオーム解析は、Ｓ−ニトロシル化による中心的な生化学的経路の機能制御の可能性および、一酸化窒素の主要酵素供給源の一つの欠損下におけるこのプロテオームの変化を明らかにする。実際、解糖、糖新生、トリカルボン酸回路、および酸化的リン酸化に関わる酵素の選択的なＳ−ニトロシル化が発見されており、この翻訳後修飾が代謝およびミトコンドリアの生体エネルギー機構を制御することを示している。マウス肝臓酵素である極長鎖アシルコエンザイムＡ脱水素酵素（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅＡ（ＣｏＡ） ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＶＬＣＡＤ）のＣｙｓ^２３８におけるＳ−ニトロシル化は、内皮型一酸化窒素合成酵素を欠損するマウスでは失われているが、酵素の触媒効率を改善していた。さらには、Ｓ−ニトロシル化剤のＶＬＣＡＤ変異細胞への投与は、酵素活性を向上した。これらのデータは、タンパク質のＳ−ニトロシル化がミトコンドリアにおける脂肪酸β酸化の制御に関連していることを示唆している。

本発明は脂肪酸代謝異常症を阻害、治療、および／または予防する方法を含む。ある実施形態では、前記脂肪酸代謝異常症は脂肪酸酸化異常症である。脂肪酸酸化異常症は、これらに限定はしないが、極長鎖アシルコエンザイムＡ脱水素酵素欠損症（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＶＬＣＡＤＤ；例えば、１６〜２４炭素）、長鎖アシルコエンザイムＡ脱水素酵素欠損症（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＬＣＡＤＤ；例えば、１２〜１８炭素）、長鎖３−ヒドロキシアシルコエンザイムＡ脱水素酵素欠損症（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＬＣＨＡＤＤ）、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＭＣＡＤＤ；例えば、６〜１２炭素）、短鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＳＣＡＤＤ；例えば、４〜６炭素）、中／短鎖Ｌ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ｍｅｄｉｕｍ／ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ Ｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｍ／ＳＣＨＡＤＤ）、多種アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＭＡＤＤ）、ミトコンドリア三頭タンパク質欠損症、短鎖３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ欠損症（ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＳＫＡＴＤ）、中鎖３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ欠損症（ｍｅｄｉｕｍ ｃｈａｉｎ ３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＭＣＫＡＴＤ）、２，４−ジエノイルＣｏＡレダクターゼ欠損症、およびグルタル酸血症２型（ｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄｅｍｉａ ｔｙｐｅ ＩＩ：ＧＡ−ＩＩ）を含む。ある実施形態では、前記脂肪酸酸化異常症はＶＬＣＡＤＤである。

本発明の方法は、少なくとも一つのニトロシル化剤、特にＳ−ニトロシル化剤を、対象に投与する工程を有する。ここで用いられる「ニトロシル化」という用語は、ポリペプチド、特にチオール基（ＳＨ）、酸素、炭素または窒素への一酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ：ＮＯ）の付加を意味する。「Ｓ−ニトロシル化」という用語は一酸化窒素部位をチオール基に付加し、それによりＳ−ニトロソチオール（Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｏｔｈｉｏｌ：ＳＮＯ）を形成することを指す。「Ｓ−ニトロシル化剤」とは、一酸化窒素基をポリペプチドのチオール基に付加しＳ−ニトロソチオールを形成する化合物を意味する。Ｓ−ニトロシル化剤の例はＦｅｅｌｉｓｃｈ， Ｊ．， Ｓｔａｍｌｅｒ， Ｊ． Ｓ． （１９９６） Ｄｏｎｏｒｓ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｏｘｉｄｅｓ． Ｆｅｅｌｉｓｃｈ， Ｍ． Ｓｔａｍｌｅｒ， Ｊ． Ｓ． ｅｄｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ． Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， ＵＫに示されている。Ｓ−ニトロシル化剤は、これらには限らないが、直接ニトロシル化するＳ−ニトロシル化剤（例えば、ＧＳＮＯ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳ−ニトロシル化剤を形成する前駆剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎ：ＮＡＣ））、およびニトロシル化剤を産生する一酸化窒素源（例えば、窒素とＧＳＨまたはＮＡＣ）と共にこれらのエステルおよび／または塩を含む。Ｓ−ニトロシル化剤は、これらに限らないが、亜硝酸（ａｃｉｄｉｃ ｎｉｔｒｉｔｅ）、塩化ニトロシル、亜硝酸アルキル（例えば、亜硝酸エチル）、亜硝酸アミル、グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンオリゴマー、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、一酸化窒素、Ｓ−ニトロソヘモグロビン、Ｓ−ニトロソアルブミン、５−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−ガンマ−メチル−Ｌ−ホモシステイン、５−ニトロソ−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−ニトロソ−ガンマ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソ−デルタ−チオ−Ｌ−ロイシン、およびＳ−ニトロソアルブミンそして薬学的に許容されるそれらの塩を含む。ある実施形態では、前記Ｓ−ニトロシル化剤はＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−システイン（Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ：ＳＮＯ−ＮＡＣ）である。本発明の方法は、さらに、少なくとも一つの脂肪酸代謝異常症を治療用するための治療剤を（前後および／または同時に）投与する工程を有することが出来る。例えば、前記方法はさらにトリヘプタノインおよび／またはベザフィブラートを投与する工程を有することが可能である。前記対象はまた問題のある脂肪酸（例えば、血管酵素の基質となる脂肪酸）、例えば、（ＶＬＣＡＤＤであるとき）１２以下の炭素の脂肪酸または１２または１６炭素の脂肪酸、の存在を減らしたまたは除去した食事を与えることも可能である。

前記Ｓ−ニトロシル化剤は少なくとも一つの薬学的に許容されるキャリアを含む組成物として前記対象に供給されることも可能である。ある実施形態では、前記組成物は、さらに、上で述べられたように、前記脂肪酸代謝異常症の治療のための少なくとも一つの別の治療剤を含む。

先述のとおり、本発明は、対象において脂肪酸代謝異常症を阻害、治療、および／または予防する方法を含む。前記方法は、さらに、本発明の治療剤を投与する前に、前記対象において脂肪酸代謝異常症を診断する工程を含んでもよい。より具体的には、前記方法はさらに前記対象が健康な対象と比較して異常ＶＬＣＡＤ酵素活性を持つかを決定する工程を含むことも出来る。ＶＬＣＡＤ活性の決定方法は周知の技術である。たとえば、生物試料を前記対象から得て、ＶＬＣＡＤ酵素分析を行い（例えば、フェリシニウムイオンを用いたアシルＣｏＡ脱水素酵素分析）、基準値と比較して（例えば、健康な対象および／または既知の脂肪酸代謝異常症を有する対象と）または直接健康な対象および／または脂肪酸代謝異常症を有する対象から得られた生物試料と比較することが出来る。さらには（または追加的に）、ＶＬＣＡＤ活性は前記対象がＶＬＣＡＤ中にミスセンス変異（例えば、表１に示される変異）および／またはヌル変異（例えば、ＶＬＣＡＤの活性欠損になるような変異）を有するかどうかを決定することにより判断することも出来る。ＶＬＣＡＤ変異はＧｏｂｉｎ−Ｌｉｍｂａｌｌｅ ｅｔ ａｌ． （Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． （２００７）８１：１１３３−１１４３ （例えば、表１を参照））およびＡｎｄｒｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． （１９９９）６４：４７９−４９４（例えば、表２を参照））においてもまた提供されている。これらの引用物の各々が、引用によって本明細書に組み込まれるものとする。ＶＬＣＡＤ変異の同定は当技術分野で周知のものである。例えば、生物試料を前記対象から得て、そのＶＬＣＡＤ遺伝子の配列決定を行う、または前記生物試料の核酸を一つ以上のプローブ（例えば、野生型または変異型特異的）と接触させることも可能である。また、変異型ＶＬＣＡＤの存在は、免疫学的に野生型または変異型ＶＬＣＡＤ特異抗体を用いることによって同定することも可能である。前記対象が異常ＶＬＣＡＤ酵素活性を有する、および／またはミスセンスまたはヌル変異を有すると同定された場合、前記対象は本発明の方法によって治療されることも可能である。

本発明の組成物は、どのような好適な経路、例えば注射（例えば、局所的、直接的、または全身性投与）、経口、肺内、局所的、鼻噴、または別の形態のどのような投与方法でも投与されることが出来る。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、局所的、吸入、経皮、肺内、動脈内、直腸内、筋肉内、および鼻腔内投与を含む、どのような好適な方法でも投与されることが出来る。ある実施形態では、前記組成物は経口および／または腹腔内投与される。薬学的に許容される前記組成物のキャリアは希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、補助剤、および／またはキャリアから成る群より選択されるものである。前記組成物は種々のバッファー内容物（例えば、トリス塩酸、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；そして界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）および増量剤（ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含むことが出来る。前記組成物はまた、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクチド／グリコチド共重合体、エチレン酢酸ビニル共重合体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の微粒子製剤中、またはリポソーム中に混合してもよい。そのような組成物は、本発明の医薬組成物成分の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏにおける放出速度およびｉｎ ｖｉｖｏからの排出速度に影響を与える（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙを参照）。本発明の医薬組成物は、例えば、液体状、または乾燥粉末状（例えば、後で再懸濁するために凍結乾燥）として製剤されることが出来る。

ここで説明される治療剤は医薬製剤として対象／患者に投与される。ここで用いられる「患者」という用語はヒトまたは動物である対象を示す。本発明の組成物は、医師の指示の下において、治療用または予防用として使用されることが出来る。

本発明の薬剤物質を含む前記医薬組成物は、便利のため薬学的に許容されるキャリアと共に調製されることが可能である。選ばれた溶媒中の薬剤物質の濃度は様々であり、この溶媒は前記医薬製剤の望まれる投与経路に基づいて選択されてもよい。ただし標準的に用いられる溶媒または物質が、投与される薬剤物質と不適合である場合、前記医薬製剤においてそれを使用するかについては再考される。

本発明に係る物質を特定の患者に投与する際に好適な用量および用法は、医者によって前記患者の年齢、性別、体重、全身の健康状態、および前記物質が投与されることにより治療または予防される特定の症状、およびその重症度に応じて、決定されることが出来る。前記医者はまた前記投与経路、前記薬学的キャリア、および前記薬剤物質の生体活性を鑑みることも可能である。好適な医薬製剤の選択もまた使用される投与方法に依存する。

本発明の医薬製剤は投与の利便性および用量の均一性のため用量単位形態で調製されることが可能である。ここで用いられるように、用量単位形態とは治療または予防的治療を受けている患者に適切な前記医薬製剤の、物理的に個別の単位のことを指す。各用量は望まれる効果を生むよう計算された量の有効成分を選ばれた薬学的キャリアと共に含まなければならない。適当な用量単位を決定する手法は当業者に周知のものである。

用量単位は前記患者の体重に比例して増減することが出来る。特定症状の緩和または予防に適切な濃度は、当該分野に周知である用量濃度曲線の計算によって決定されることも出来る。

前記薬剤物質を含む前記医薬製剤は好適な間隔、例えば、病理学的症状が軽減または緩和されるまで少なくとも一日二回またはそれ以上、その後前記用量は維持用のレベルにまで減らし投与することが可能である。特定の場合における好適な間隔は通常、その患者の状態に依るものである。

ここで説明される特定の組成における毒性および効能（例えば、治療用、予防用の）は、これらに限らないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞培養で、ｅｘ ｖｉｖｏで、または実験動物においてなど、標準的な薬学的手法で決定することが可能である。これらの実験から得られたデータは、ヒトに用いられる範囲の用量で調剤されるために使われることが可能である。前記用量は投与の形態および経路によって変わることがある。投与用量および間隔は、個別に治療上または予防上効果的な量を送達するのに十分な有効成分のレベルに調製してもよい。

定義
下記の定義は本発明の理解を簡単にするために提供される。

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに文脈からそうでない限り、複数形の指示対象も含むものである。

「薬学的に許容される」は、動物、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦の規制機関若しくは州政府による承認を指すか、または米国薬局方または他の一般に認識される薬局方に掲載されていることを指す。

「キャリア」は、例えば、本発明の有効物質と共に投与される希釈剤、アジュバント、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、トリス塩酸、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、助剤（ａｕｘｉｌｌｉａｒｙ ａｇｅｎｔ）またはビヒクルを意味する。薬学的に許容されるキャリアは水および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油等の、無菌の液体でもよい。水または生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、とりわけ注射用液のキャリアとして使用されることが出来る。好適な薬学的キャリアは、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ" ｂｙ Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）； Ｇｅｎｎａｒｏ， Ａ． Ｒ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）； Ｌｉｂｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．； ａｎｄ Ｋｉｂｂｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに記載される。

ここで用いられる「治療」という用語は、疾患に苦しむ患者に、その患者の症状の改善（例えば、１またはそれ以上の症状）、その症状の進行を遅らせるなどの利益を与える、あらゆる種類の治療を意味する。

ここで用いられるように「予防」という用語は、発症の危険がある（例えば、脂肪酸酸化異常症）対象において、その対象が発症する確率を下げることに繋がる予防的な治療を指す。

化合物または医薬組成物の「治療上有効な量」は特定の疾患や異常および／またはそれらの症状の、予防、阻害、または治療に有効な量を意味する。例えば、「治療上有効な量」は対象における脂肪酸酸化を変化させるのに十分な量を指すことが可能である。

ここで用いられるように、「対象」という用語は動物、特に哺乳類、特にヒトを指す。

ここで用いられるように「生物試料」は対象、とくにヒトである対象から得られた組織、組織サンプル、細胞、および生体液（例えば、血液）を含む対象から得た生体物質の試料を指す。

本明細書に用いる「プローブ」の用語は、精製された制限酵素の消化で自然に発生する
か、合成されたかによらず、前記プローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングす
るか、特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチ
ド、またはＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの核酸を指す。プローブは一本鎖または二本鎖の
可能性がある。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブ供給源、および前記方法を何に利用するかを含む多くの要素によって決まる。例えば、診断に応用する場合、標的配列の複雑さにより、前記オリゴヌクレオチドプローブは典型的に１０〜３０または１５〜２５、またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それよりも少ないヌクレオチドを含むこともある。本明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に相補的となるように選択される。これは、一連の事前に決定された条件下、前記プローブがそれぞれの標的鎖と「特異的にハイブリダイズする」またはアニーリングすることができるよう、十分相補的である必要があることを意味する。従って、前記プローブの配列は前記標的の厳密に相補的な配列を反映している必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントが前記プローブの５’または３’末端に結合しており、前記プローブ配列の残りの部分が前記標的鎖と相補的であることも考えられる。または、前記プローブ配列は前記標的核酸の配列と十分相補的で、それと特異的にアニーリングするという前提条件下で、非相補的塩基またはそれよりも長い配列が前記プローブ内に点在していることも可能である。

以下の実施例は本発明の様々な実施形態を説明するために提供されるものである。これらは決して本発明を限定するためのものではない。

材料および方法
化学薬品および試薬
パルミトイルＣｏＡリチウム塩および六フッ化リン酸フェリシニウムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより得られた。マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ抗体はそれぞれＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＡｂｃａｍより得られた。抗ＶＬＣＡＤのウサギおよびヤギ（クローンＧ−１６）ポリクロ―ナル抗体は、ＧｅｎｅＴｅｘおよびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙよりそれぞれ得られた。すべての薬品および試薬は分析グレードのものである。

マウス臓器の単離およびタンパク質ホモジネートの調製
全てのマウス実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ‘ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによる審査および承認を経ている。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｎｏｓ３^{ｔｍ１Ｕｎｃ}（ｅＮＯＳ^−／−）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、およびＬｅｐ^ｏｂ（ｏｂ／ｏｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの成体マウスはジャクソン研究所より、得られた。一日置きにＰＢＳまたは５ｍＭのＧＳＮＯが注射されたｏｂ／ｏｂマウスにおいて４週間にわたり食餌摂取量および体重の記録をとった。ＰＢＳおよびＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウスの平均食餌摂取量はそれぞれ４２±９と４１±１０ｇであった（各遺伝子型につきｎ＝４匹ずつ）。同じ期間における、平均体重変化はＰＢＳ注射されたｏｂ／ｏｂマウスとＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウスにおいて、それぞれ２８．２±１．０と２８．１±４．０であった（各遺伝子型にｎ＝４匹ずつ）。マウスはＣＯ_２によって麻酔にかけ、左心室に浸み込む前に血液を回収した。完全な状態で臓器を回収し、すぐに液体窒素によって凍結して、使用されるまで−８０℃で保存された。組織は３ｍｌのリシスバッファー［１ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、０．１ｍネオクプロイン、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、およびプロテアーゼ阻害剤を含む２５０ｍＭヘぺス−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．７）］中でテフロン乳棒およびＪｕｍｂｏ Ｓｔｉｒｒｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってホモジナイズした。このホモジネートはその後、４℃において１３，０００ｇで３０分遠心分離した。この可溶性タンパク質層を回収して、このタンパク質濃度をブラッドフォード分析によって同定した。試料およびネガティブコントロール試料の作成は、（Ｄｏｕｌｉａｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０７：１６９５８−１６９６３）に説明されるよう行った。

Ｓ−ニトロソシステインプロテオームの化学的濃縮と部位特異的同定
カラムの調製および活性化、有機水銀レジンとの反応のためのホモジネート調製、に関する詳細な実験操作は（Ｄｏｕｌｉａｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０７：１６９５８−１６９６３）で説明される。各臓器から３つの生物学的複製が解析された。各試料には対応する同条件下で解析されたＵＶ前処理済みのネガティブコントロールも用意した。偽発見率は脳において<６％、他の全ての臓器において<３％とした。洗浄については、六臓器間での脂質含有量に差があるため厳しい条件を選んだ。カラムは最初５０ベッド体積の３００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５％ＳＤＳを含む５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．４）で、その後５０ベッド体積の０．０５％ＳＤＳを含む同バッファーを用いて洗浄した。カラムは３００ｍＭのＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、そして１Ｍ尿素を含む５０ベッド体積の５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ ７．４）で、その後０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１Ｍ尿素を含む５０ベッド体積の同バッファーで洗浄をした。最後に、カラムは２００ベッド体積の水で洗浄されて、タンパク質を１０ｍｌの５０ｍＭ β−メルカプトエタノール水により溶出した。試料を濃縮しゲル−ＬＣ（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）−ＭＳ／ＭＳ分析によって分析をした。最後の水による洗浄後のカラム中消化には、前記カラムを１０ベッド体積の０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムによって洗浄した。吸着したタンパク質はＴｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（１μｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む１ベッド体積の０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムを添加することによって暗中において１６時間室温で消化した。前記レジンは次に、４０ベッド体積の３００ｍＭ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．４）で、その後４０体積のＮａＣｌを除いた同バッファーによって洗浄をした。カラムはその後４０体積の０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムで、そして２００体積の脱イオン水で洗浄した。吸着ペプチドの溶出のため、前記レジンは、１ベッド体積の過ギ酸水（過ギ酸は１％のギ酸と０．５％の過酸化水素を少なくとも６０分間、遮光されたガラスバイアル中で振盪させることによって反応させて合成される）中に３０分間室温にて置いた（Ｄｏｕｌｉａｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０７：１６９５８−１６９６３）。溶出されたペプチドは、前記レジンを１ベッド体積の脱イオン水で洗浄することにより回収した。溶出物は一晩−８０℃で保存し、凍結乾燥後して３００μｌの０．１％ギ酸中で再懸濁した。ペプチド懸濁液は低吸着性試験管（Ａｘｙｇｅｎ）に移して、高速バキューム機によって体積を３０μｌまで減らした。２０マイクロリットルのペプチド懸濁液は高速液体クロマトグラフィーの用のバイアルに移されてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に出した。

ゲル内消化の詳細およびＭＳ／ＭＳ分析の条件は以前に提供されている（Ｄｏｕｌｉａｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０７：１６９５８−１６９６３； Ｋｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ９：７６８−７８２）。Ｓ−ニトロソシステインのプロテオーム生成のためのＭＳ分析後の解析（表Ｓ１〜Ｓ６）は、以下の例外を除き、説明に従って実施した：システインを含有するペプチドで同じ臓器のタンパク質とマッチしないペプチドは、別の臓器から独立に同定されたタンパク質とマッチする。

細胞内局在は存在するＵｎｉＰｒｏｔのアノテーション（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）またはＢａＣｅｌＬｏ（ｇｐｃｒ．ｂｉｏｃｏｍｐ．ｕｎｉｂｏ．ｉｔ／ｂａｃｅｌｌｏ）による予想、のいずれかによって決定した。最も重要な生体機能を決定する機能解析はＵｎｉＰｒｏｔおよびＦａｔｉｇｏ（ｗｗｗ．ｆａｔｉｇｏ．ｏｒｇ）によって行われた。前記ＭＳ／ＭＳの生データはｗｗｗ．ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｈｏｐ．ｅｄｕ／ｔｏｏｌｓ／ｍｓｍｓ／ｓｐｅｃｔｒａ．ｐｄｆに保存されている。

ＶＬＣＡＤ活性解析
ＶＬＣＡＤの酵素活性は（Ｌｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １８６：２８０−２８４）に説明されるように解析した。簡単に述べると、フェリシニウムイオンを、ＶＬＣＡＤを介するパルミトイルＣｏＡ脱水素化の人工的な電子アクセプターとして使った。０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ ７．２）中の肝臓のホモジネート（最終濃度０．０３μｇ／μｌ）または細胞溶解液（最終濃度０．０９μｇ／μｌ）を、１５０ｍＭのフェリシニウムイオンと混合し、そしてパルミトイルＣｏＡ（最終的な体積は１３０μｌ）を添加することによって反応を開始させた。３００ｎｍにおけるフェリシニウム吸光度の減少を時間の関数として記録して、時間０（パルミトイルＣｏＡが添加された時点）から吸光度の総変化の５％に対応する時間までの曲線の傾きを、前記酵素の初速度（Ｖ_ｏ）とした。各動物のＶＬＣＡＤの見かけ上のＶ_ｍａｘおよびＫ_Ｍの実験による算出に、０．０１５〜２ｍＭの範囲で、少なくとも９つの濃度のパルミトイルＣｏＡを用いた。これらの実験データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトによって、ミカエリス・メンテン式に非線形回帰により当てはめられた。酵素活性の単位は室温で1分あたり１ｍｍｏｌのフェリシニウムの減少に繋がる酵素量で定義される（３００ｎｍにおいてε＝４．３ｍＭ^−１ｃｍ^−１）（Ｉｚａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７：１０２７−１０３３）。この分析法の特異性を確かめる実験として、１０ｍｇの抗ＶＬＣＡＤ抗体を、事前に肝臓のホモジネートと２０分反応させた。ＵＶ光分解をＳ−ニトロソシステインを除去するために使用するときは、前記肝臓のホモジネートを氷上で１０分間、従来型のＵＶトランスイルミネーターによって照射した。肝臓ホモジネート（図２Ｈ）および細胞溶解液（図４）におけるＶＬＣＡＤの特異活性測定は、それぞれ０．２５および０．１２５ｍＭのパルミトイルＣｏＡ存在下において実施した。

Ｓ−ニトロシル化ＶＬＣＡＤの割合を計算するため、このタンパク質を有機水銀レジンに捕捉させた。複数回の洗浄後、捕捉されたタンパク質を溶出して抗ＶＬＣＡＤ抗体によって標識した。

肝臓の組織構造およびトリグリセリド濃度の算出
ホルマリン固定された肝臓の切片をトリクローム染色キット（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ （Ｓｉｇｍａ））を用い製造業者の説明書に従い染色した。トリグリセリドはＦｏｌｃｈ法（Ｆｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９５７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２２６：４９７−５０９）によって抽出した。血清および肝臓のトリグリセリド濃度をｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用し製造業者の説明書に従って測定した。

脂肪酸β酸化の測定
脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（２．５ ｍｇ／ｍｌ）、２．５ｍＭパルミチン酸、１０ｍＭカルチニン、および４ｍＣｉの９，１０−^３Ｈ−パルミトイルＣｏＡ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含むＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸イオンバッファー中に、１ミリグラムのタンパク質懸濁液を加えた。この混合物は、暗中の３７℃において二時間振盪して、その後Ｆｏｌｃｈ法を用いて、９，１０−^３Ｈ−パルミトイルＣｏＡと^３Ｈ_２Ｏを分離した（Ｆｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９５７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２２６：４９７−５０９）。この水相を回収し、１０％ＴＣＡの添加後に１０分間室温で８０００ｇにおいて遠心分離することにより、タンパク質を回収した。残りの放射性パルミトイルＣｏＡはＡＧ １−Ｘ８ギ酸塩レジン（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて 強アニオン交換クロマトグラフィーによって除去した。^３Ｈ_２Ｏを含む流出液は回収してシンチレーション検出に用いた。各実験は、バックグラウンド値の測定と共に行うため、タンパク質を含まない試料も用いて行われた。このバックグラウンド測定値は対応する実験用の試料の各測定値から引いた。

Ｃ２３８Ａ ＶＬＣＡＤ変異作製のための部位特異的変異導入
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標） Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＶＬＣＡＤをコードするｃＤＮＡに１アミノ酸変異の導入を行った。アミノ酸位置２３８番目の、システインからアラニンへの変異は、マウスＶＬＣＡＤをコードするプラスミドと３個のＦＬＡＧ（登録商標）タグをこのタンパク質のＣ末端部位で結合させた（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）、Ｅｘ−Ｍｍ０１０１３−Ｍ１４（以下、ｐＶＬＣＡＤ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標））をテンプレートとして行った。フォワードプライマー：５′−ＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＣＴＣＴＣ−３′（配列ＩＤ番号：１）およびリバースプライマー：５′−ＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡ−３′（配列ＩＤ番号：２）をｐＶＬＣＡＤ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）においてシステインのコドンをアラニンのコドンに置換する工程に用いて、これによりｐＶＬＣＡＤ−Ｃ２３８Ａ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）を作成した。ｐＶＬＣＡＤ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）およびｐＶＬＣＡＤ−Ｃ２３８Ａ−３ｘＦＬＡＧ（登録商標）の配列は、次の実験に移る前に確認した。

細胞培養、トランスフェクション、およびＧＳＮＯ処理
Ｈｅｐａ１〜６細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）を用い、３７℃で５％ＣＯ_２を含む空気中で培養した。細胞は５×１０^４細胞／ｃｍ^２の濃度において通常の条件下で２４時間培養した。細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＦＬＡＧ（登録商標）標識された野生型ＶＬＣＡＤまたはＦＬＡＧ（登録商標）標識されたＣ２３８ＡＶＬＣＡＤを製造者の説明書に従いトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、増殖培地は血清なしＤＭＥＭと交換されて、新たに調製された２５０ｍＭのＧＳＮＯが３０分間添加され、その後この細胞はＰＢＳにより複数回洗浄をした。細胞溶解液はＧＳＮＯ除去後すぐ、６０、１２０、および２４０分後回収された。これらの試料はＵＶ光から保護されていた。溶解液はタンパク質濃度が分析され、試料あたり等量のタンパク質を有機水銀支援捕捉に用いた。

Ｓ−ニトロシル化されたシステインの構造生成およびノーマルモード解析
ヒトＶＬＣＡＤの結晶構造はＰＤＢ（ＩＤ ２ＵＸＷ）よりダウンロードした。異常または欠損残基に関してはＰｙｍｏｌ（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）のＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓツールによって補填した。Ｓ−ニトロソシステインはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ＴｏｏｌｋｉｔにおいてＴｉｍｅｒｇｈａｚｉｎ研究室によるＰｙｔｈｏｎスクリプト「Ｓ−ｎｉｔｒｏｓａｔｏｒ」を使用して生成した。Ｓ−ｎｉｔｒｏｓａｔｏｒはＳ−ニトロソシステイン残基をへリックスに関してＰＣＭ−ＯＮＩＯＭ（ＰＢＥ０／ｄｅｆ２−ＴＺＶＰＰＤ：ＡｍｂｅｒＦＦ）計算によって算出されたチオレドキシンおよびχ３値を座標として使用している。ＥｌＮｅｍｏ（Ｓｕｈｒｅ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３２：Ｗ６１０−Ｗ６１４）を最も低い１００周波数モードを観察するために用い、ＶＬＣＡＤの初めの重要な５モードについて摂動したモデルの生成を行った。残基の平均二乗変位（ｒ^２）をタンパク質の移動を同定するために用いた。

統計学的解析
データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ｄソフトによって解析した。全ての正規分布データは、平均±標準偏差で示される。群のものは一元配置分散分析によって解析した。

結果
マウスＳ−ニトロソシステインのプロテオーム
野生型マウスの脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、および胸腺で、６４７個のタンパク質中に１０１１個のＳ−ニトロソシステインを含むペプチドを同定した。広範な文献検索によれば、この拡張されたＳ−ニトロソシステインプロテオームは、既に生理学的条件下で修飾されていると報告されている４６のタンパク質を同定し、９７１のこれまで知られていなかった内在性のＳ−ニトロシル化部位を明らかにしていた。全６臓器で、Ｓ−ニトロシル化部位の数はタンパク質の数を超えており、ｉｎ ｖｉｖｏで複数のＳ−ニトロシル化がタンパク質制御に関わっている可能性を示唆した（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３：４７３６−４７４１）。前記６臓器で同定されたタンパク質を各臓器少なくとも３つの生物学的複製を用いて比較したところ、平均で、７２％のタンパク質が２臓器以上で同定されており、Ｓ−ニトロシル化がｉｎ ｖｉｖｏにおいて全体的な機能を持っていることを示唆している。さらに、これらのデータはこれらのプロテオームを取得するのに用いた方法が正確かつ再現性を有することを示している。１つの臓器のみにおいて同定されたタンパク質は２１〜４６％の範囲にあり、Ｓ−ニトロシル化が臓器特異的な役割もまた務めること示す。ｉｎ ｖｉｖｏのＳ−ニトロシル化のｅＮＯＳによって生成される一酸化窒素への依存度はｅＮＯＳヌルマウス（ｅＮＯＳ^−／−）の同じ臓器における内在性Ｓ化部位を解析することによって調べた。同定されたタンパク質の４７〜８７％のＳ−ニトロシル化にｅＮＯＳの存在が必要であったことから、ｅＮＯＳは内在性のＳ−ニトロソシステインプロテオームに大きく貢献している。前記脳および前記心臓は他の臓器と比べてｅＮＯＳ活性への依存が最も少なく、これらの臓器におけるタンパク質のＳ−ニトロシル化への神経型一酸化窒素合成酵素などの他のアイソフォームの貢献を示唆している。ｅＮＯＳ^−／−マウスの臓器における相当数のＳ−ニトロソシステインペプチドの欠如は、Ｓ−ニトロソシステインプロテオームを同定する本方法の正確性をさらに強固なものにしている。

Ｓ−ニトロソシステインプロテオームの細胞内局在の全体像は全マウスプロテオームと比較して組織全体にわたる細胞質基質およびミトコンドリアタンパクでの顕著な濃縮を明らかにした。細胞膜および核のタンパク質におけるＳ−ニトロシル化部位は過小であった。膜タンパク質におけるこの過小化は組織の破砕が膜タンパク質の抽出に最適化されていなかったことから、手法的な問題の結果である可能性がある。タンパク質のＳ−ニトロシル化は核においても起こり、核タンパク質における新たな部位の発見はシグナル伝達および転写制御におけるＳ−ニトロシル化の潜在的重要性をさらに強調している（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １２：１０９４−１１００）。前記脳、腎臓、肺、および胸腺におけるＳ−ニトロソプロテオームの２０〜２５％がミトコンドリアタンパク質においてであるのに対して、前記マウス心臓においては前記修飾タンパク質の５６％がミトコンドリアに局在していた。これらのミトコンドリアのプロテオームは前記心臓を除いて７０％以上がｅＮＯＳ活性に依存しており、前記心臓では前記プロテオームの３６％のみがＳ−ニトロシル化にｅＮＯＳ由来の一酸化窒素を必要としていた。この心臓ミトコンドリアにおけるＳ−ニトロシル化のｅＮＯＳへの低依存性は、別の機能性ＮＯＳアイソフォームの存在を示唆している。前記Ｓ−ニトロソプロテオームの機能的分類はＳ−ニトロシル化されている酵素が中心的役割を果たす重要な代謝経路を明らかにした。解糖、糖新生、ピルビン酸代謝、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路、酸化的リン酸化、アミノ酸代謝、ケトン体形成、および脂肪酸代謝経路を制御する数多くの酵素が、Ｓ−ニトロシル化されており、その多くがｅＮＯＳ^−／−マウスではＳ−ニトロシル化されていないと同定されていた。この結果はｅＮＯＳヌルマウスが代謝活性障害を持つという報告と一致している（Ｓｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １７８２：１８０−１８７； Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８８：５１５−５２８）。したがって、タンパク質のＳ−ニトロシル化は代謝制御とｅＮＯＳ活性を繋ぐ機序的な繋がりを提供している。

Ｓ−ニトロシル化による極長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素の酵素活性制御
脂肪酸代謝に関わるタンパク質のクラスタリングが本解析において明確であった。前記マウス肝臓において、Ｓ−ニトロシル化タンパク質はレプチンホルモンに対する肝臓の反応を取り巻くネットワーク内にクラスター化していた（Ｄｏｕｌｉａｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０７：１６９５８−１６９６３）。本実験で、脂肪酸β酸化の律速段階を触媒するＶＬＣＡＤは、野生型マウスの肝臓ではＳ−ニトロシル化されていたがレプチン欠損マウス（ｏｂ／ｏｂ）、またはｅＮＯＳ^−／−マウスではされていなかった（図１）。Ｓ−ニトロシル化のＶＬＣＡＤ活性および主要代謝器官である、前記肝臓における脂肪酸代謝に対する生物学的な影響を調べた。

レプチン欠損マウスは生後４〜５週で標準飼料下において自然に脂肪肝を発症し、パルミチン酸酸化速度の低下およびトリグリセリドの形態で脂肪蓄積が肝細胞中に蓄積することが特徴である（Ｂｒｉｘ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｔａｂ．， ７５：２１９−２２６； ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｎｕｔｒ．， ２７：２９９−３０５）。ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓のホモジネートによる^３Ｈ標識されたパルミトイルＣｏＡの酸化は野生型に比べて４７％の速度になっていた（図２Ａ）。このパルミトイルＣｏＡ酸化速度の顕著な低下はミトコンドリアにおける脂肪酸β酸化の異常を示唆している。ｏｂ／ｏｂマウスにおいてＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステインの送達により脂肪肝の改善が見られたことから（ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｎｕｔｒ．， ２７：２９９−３０５）、生後５週のｏｂ／ｏｂマウスにＳ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）を腹腔内注射した。ＧＳＮＯはその低細胞透過性にも関わらず、この薬剤がＳ−ニトロシル化によるタンパク質修飾の細胞モデルにおいて多用されているので、一酸化窒素の等価物を送達するために用いた（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７：６６５−６７４； Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１３２８−１３３１）。ＧＳＮＯを注射されたｏｂ／ｏｂマウスは野生型マウスと同様のパルミトイルＣｏＡ酸化速度を示しリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を注射したｏｂ／ｏｂマウスより、顕著に速度が増加していた（図２Ａ）。さらに、ＧＳＮＯを注射したｏｂ／ｏｂマウスにおけるパルミトイルＣｏＡ酸化の回復は、肝臓トリグリセリド濃度の著しい低下と連動していた。ＰＢＳを注射したｏｂ／ｏｂマウスの肝臓トリグリセリド濃度は野生型マウスにおいて顕著に高いが、ｏｂ／ｏｂマウスをＧＳＮＯにより処置すると肝臓のトリグリセリド濃度が著しく低下した（図２Ｂ）。血清トリグリセリド濃度は野生型マウス、ＰＢＳ処置されたｏｂ／ｏｂマウス、およびＧＳＮＯ処置されたｏｂ／ｏｂマウス間で同様であった（図２Ｃ）。ＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるパルミトイルＣｏＡ酸化の回復は解剖学的な評価でも補強されており、ＰＢＳ注射されたｏｂ／ｏｂマウスにおいてよりもＧＳＮＯ注射された肝臓切片でより少ない脂肪滴が見られた（図２Ｇ）。

ＭＳ／ＭＳ分析により野生型およびＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウス両方においてＶＬＡＣＡＤの修飾部位がＣｙｓ２３８に特定された（図１Ａおよび１Ｂ）。またｅＮＯＳ^−／−マウスではＶＬＣＡＤはＳ−ニトロシル化により修飾されていないが、ｅｘ ｖｉｖｏでは肝臓ホモジネートをＧＳＮＯ処置することによりシステイン残基Ｃｙｓ２３８において容易に修飾されることが分かった（図２Ｈおよび２Ｉ）。

ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化はＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウス肝臓におけるパルミトイルＣｏＡのアシル脱水素酵素による酸化の増加と連動していた（図２Ｄ、２Ｊ、および２Ｋ）。この増加はＵＶ光分解に弱くＶＬＣＡＤ特異抗体の追加によって消滅した（図２Ｊ）。ミカエリス・メンテン動力学の解析（図２Ｄ）によってＶＬＣＡＤのＶ_ｍａｘ が野生型、ＰＢＳ注射された、およびＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウス間で同じであることを示した（図２Ｅ）。しかしながら、ＰＢＳ注射されたｏｂ／ｏｂマウスからのホモジネートより測定された見かけ上のミカエリス定数（Ｋ_Ｍ）の値は、野生型およびＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウスのそれに比べて５倍以上高かった（図２Ｆ）。このＶＬＣＡＤ酵素活性のＫ_Ｍもまたｅｘ ｖｉｖｏにおいてＧＳＮＯ処置されたｅＮＯＳ^−／−肝臓ホモジネートには処置されていないｅＮＯＳ^−／−肝臓ホモジネートと比較して５倍以上高かった（図２Ｈ）。肝臓ホモジネートおよび濃縮されたミトコンドリア調製物中のＶＬＣＡＤタンパク質量の測定は、野生型、ＰＢＳ注射された、およびＧＳＮＯ注射されたｏｂ／ｏｂマウス間で量に差がなかったことを表していた（図３Ａおよび３Ｂ）。さらにＮａｔｉｖｅゲル電気泳動により全３群のマウスからのミトコンドリア画分において等量のＶＬＣＡＤダイマーが確認された（図３Ａ、上図）。よって、これらのデータはＳ−ニトロシル化がＶＬＣＡＤのＫ_Ｍを低下させることを示している。

Ｓ−ニトロシル化されたＶＬＣＡＤの割合の測定によりＧＳＮＯ処理されたマウスでは、肝臓ＶＬＣＡＤ分子の２５±３％がＳ−ニトロシル化されていることを示した。これらの結果は野生型およびＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウスの肝臓ではＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化を示すがＰＢＳ処理されたｏｂ／ｏｂマウスの肝臓では示さないという前記ＭＳ／ＭＳ分析と一致している（図３Ｃ）。ＶＬＣＡＤタンパク質の濃度はＰＢＳとＧＳＮＯ処理されたｏｂ／ｏｂマウス間で同様であり、定常状態において平均して全タンパク質の２５％がＳ−ニトロシル化されたＶＬＣＡＤであったため、Ｓ−ニトロシル化はＶＬＣＡＤの触媒効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ）（Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．（２００２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３０：２１１−２１３）を修飾されていないこのタンパク質に比べて２９倍上げることが出来る。この触媒効率の顕著な上昇はｏｂ／ｏｂマウス肝臓において脂肪酸の効率的な除去の提供を可能にしている。

ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化の機能的重要性の更なる証拠を、野生型またはＳ−ニトロシル化されない点変異型（Ｃ２３８Ａ）のＶＬＣＡＤを一過的に発現する、マウス肝細胞から得た。ＧＳＮＯ処理は野生型ＶＬＣＡＤに２７±３％のＳ−ニトロシル化を起こし（図４Ａ）、同時にＶＬＣＡＤ特異活性を５倍増加させた（図４Ｂ）。同じ実験条件下において、前記Ｃ２３８Ａ ＶＬＣＡＤ変異型はＳ−ニトロシル化されておらず、その定常活性もＧＳＮＯ処理による変化はなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。この培地からＧＳＮＯを除去し複数回洗浄後、Ｓ−ニトロシル化されたＶＬＣＡＤの量および酵素特異活性の両方が経時的に低下した（図４Ａおよび４Ｂ）。これらのデータはＣｙｓ^２３８におけるＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化がその酵素活性制御に必要であることを示唆し、この工程は可逆的であり、脱ニトロシル化によって制御されている可能性がある。

分子動力学シミュレーションを、Ｓ−ニトロシル化のＶＬＣＡＤ構造へ与える影響についての理解を深めるため、使用した。量子力学／分子力学の計算がまず前記ＶＬＣＡＤのタンパク質構造［ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ） ＩＤ２ＵＸＷ］内で部位２３８におけるＳ−ニトロソシステイン残基を生成した（図５Ａ）。最も低い振動数のノーマルモードの試験は、大まかで包括的なまたは集合的なタンパク質の動きを示すが、Ｓ−ニトロシル化によりタンパク質立体構造に大きな変化はなかった。結合部位の近くで起こっているかもしれないより小さな局所的な動きを調べるための、より高い振動数モードの試験によりＣｙｓ２３８のＳ−ニトロシル化に反応して原子の動きに差があったことが明らかになった（図５Ｂ）。Ｃｙｓ２３８残基はループ内に存在し、ループは通常タンパク質の柔軟性のある箇所を表す。よって、前記データはＳ−ニトロシル化がループの柔軟性を高めることを示し、タンパク質の動作拡大をもたらし、それにより基質結合を促進し、よってＶＬＣＡＤのＫ_Ｍを下げている。Ｃｙｓ^２３８は基質結合部位より≧３０オングストロームであって、より長距離の動作がこの酵素が基質に結合する能力に影響を与えることが出来ることを示している。

システインのＳ−ニトロシル化は一酸化窒素による翻訳後修飾であり、生理学的および病的状態下におけるタンパク質の活性、タンパク質間の相互作用、および細胞内局在を調節する（Ｓｔａｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｅｌｌ １０６：６７５−６８３； Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６：１５０−１６６； Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１０５０−１０５４； Ｊａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ３：１９３−１９７； Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １２：１０９４−１１００； Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｃｅｌｌ １１５：１３９−１５０； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， １：１５４−１５８； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：１０２−１０５； Ｍａｎｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １５４：１１１１−１１１６）。野生型マウスの組織におけるＳ−ニトロソシステイン残基の部位特異的マッピングを用いることにより、代謝経路に関わる幅広いタンパク質の修飾および修飾タンパク質の顕著なミトコンドリア内局在を発見した。この選択的な局在はミトコンドリア生態における一酸化窒素の機能的な役割を示す多くの報告（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＦＥＢＳＬｅｔｔ．， ３５６：２９５−２９８； Ｋｏｂｚｉｋ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２１１：３７５−３８１； Ｎｉｓｏｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：３１４−３１７）と一致しており、特にタンパク質のＳ−ニトロシル化が心臓を虚血再灌流障害から守る、心臓について一致している（Ｐｒｉｍｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０６：１０７６４−１０７６９； Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０６：６２９７−６３０２； Ｋｏｈｒ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， １１１：１３０８−１３１２）。心臓への一酸化窒素ドナーの特異的な送達は、全体的にミトコンドリア内のＳ−ニトロシル化タンパク質の量を増やし、虚血性傷害を防いでいる（Ｐｒｉｍｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０６：１０７６４−１０７６９； Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０６：６２９７−６３０２； Ｋｏｈｒ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， １１１：１３０８−１３１２）。これらのミトコンドリアおよび代謝の機能的制御における一酸化窒素の重要な生物学的寄与にも関わらず、Ｓ−ニトロシル化ミトコンドリアタンパク質の同定はほとんどされていない。マウスの異なる６組織にわたる、ミトコンドリアタンパク質におけるＳ−ニトロシル化の具体的な部位の特定は、生体エネルギーおよび代謝を制御する一酸化窒素を介する分子および生化学的経路を明らかにする機能的研究を容易にするための大きな進歩をもたらす。他の翻訳後修飾と同様に、Ｓニトロシル化は動的な工程であり、この翻訳後修飾を元に戻す多くの経路が報告されている（Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１０５０−１０５４）。よって、本Ｓ−ニトロソシステインプロテオームは通常の生理学的条件下での、内在的な修飾タンパク質の一部を表している可能性もある。

Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳ−ニトロシル化の生物学的役割を調べるため、体内の主要代謝臓器である肝臓における脂肪酸の代謝を調べた。食餌、脂肪組織、およびｄｅ ｎｏｖｏの脂質合成が肝臓における脂肪酸の主要な供給源である。前記肝臓における脂肪酸の可能である運命として、トリグリセリドへのエステル化され、それが貯蔵され、または超低比重リポタンパク質粒子の一部としてアポリポタンパク質Ｂ−１００と共にパッケージングされて輸送される。脂肪酸はまた、リン脂質に変換されるか、ミトコンドリアに輸送されるためアシルカルチニンに変換され、β酸化される（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２：１５１９−１５２３）。脂肪酸代謝の入力を増加させるあるいは出力を低下させるどのような工程も脂肪肝の発症に寄与する可能性を有する（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２：１５１９−１５２３）。β酸化は４段階の酵素サイクルであり、このサイクルの各回転が脂肪酸の長さを２炭素原子分ずつ縮小し、それが効率的な脂肪酸の利用に重要となる。ＶＬＣＡＤはβ酸化の第一段階を触媒し、ヒトの肝臓におけるパルミチン酸脱水素酵素活性の約８０％およびマウスの肝臓におけるパルミチン酸酸化の７０％近くを担っている（Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９５：２４６５−２４７３； Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：４２５８−４２６４； Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９２：１０４９６−１０５００）。ＶＬＣＡＤは６７ｋＤのサブユニットからなるホモダイマーであり、ミトコンドリア内膜中に存在する（Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９５：２４６５−２４７３； Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：４２５８−４２６４； Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９２：１０４９６−１０５００）。ＶＬＣＡＤの酵素活性はタンパク質の量とＳｅｒ^５８６におけるリン酸化によって制御されると考えられている（Ｋａｂｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２９８：Ｃ１０７−Ｃ１１３）。上記に示されるデータはｅＮＯＳから得られた一酸化窒素を介したＶＬＣＡＤのＣｙｓ^２３８におけるＳ−ニトロシル化は、この酵素のＫ_Ｍを変える構造変化を通して酵素活性の可逆的な活性化に繋がり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける脂肪酸β酸化に顕著な影響をあたえることが出来ることを示している。総体的に、マウス組織におけるＳ−ニトロシル化たんぱく質の包括的な解析はこの翻訳後修飾が細胞内の代謝経路およびミトコンドリア機能に大きな影響を与えることを明らかにした。

一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ：ＮＯ）はミトコンドリアの代謝を正常および病的な状態において制御する。一酸化窒素がその制御機能を達成する機序の１つがタンパク質におけるシステイン残基のＳ−ニトロシル化を通してである。上記に示すように、ｉｎ ｖｉｖｏ（マウスモデル）におけるＶＬＣＡＤ分子の２５％はシステイン２３８においてＳ−ニトロシル化されている。Ｓ−ニトロシル化は見かけ上のＶＬＣＡＤのＫｍを５倍下げ、酵素効率を非修飾酵素と比較して２９倍改善する。ヒトの疾患の特徴（低ＶＬＣＡＤ活性、低β酸化速度、トリグリセリドの肝臓蓄積）と類似するマウスモデルにおいて、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化は、酵素活性を回復させ、β酸化の速度を正常化しそして脂肪肝である表現型を減少させた。これらの結果に基づけば、ミスセンス変異を持つヒトＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化はその酵素活性を改善し前記疾患の予後に良い結果をもたらすはずである。

この結論を確かめるため、病的なＶＬＣＡＤ変異を有する４種のヒト繊維芽細胞株を用いた（表１）。細胞は１００μＭのＮ−アセチルシステインまたはＳＮＯ−ＮＡＣに３０分間暴露させて、ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化状態を上で説明されたよう有機水銀支援捕捉および質量分析によって決定した。細胞株１および２からの細胞溶解物を用い、ＶＬＣＡＤはＳＮＯ−ＮＡＣ処理後システイン２３７（ヒトＶＬＣＡＤは少ないアミノ酸数を持つ）において修飾されていることを同定した。細胞溶解物中のＶＬＣＡＤ酵素活性はパルミトイルＣｏＡがこの酵素の基質として存在する下においてフェロセニウムの減少をモニターすることによって解析した。図６は、細胞株１および２のミカエリス・メンテン曲線を示しＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化がＫｍに顕著な影響があり（この非修飾酵素と比較して１４倍低下）、Ｖ_ｍａｘにも程度は小さいが影響があった。

詳細な反応速度解析を他の変異型および野生型ＶＬＣＡＤについて行った（表２）。ＮＡＣ処理されたＶＬＣＡＤ異常繊維芽細胞はコントロール細胞に比べて低ミトコンドリア脂肪酸酸化（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ：ｍＦＡＯ）能およびＶＬＣＡＤ活性を示した。表２において、初速度（Ｖｏ）を反応曲線の直線部分において時間０から元の吸光度から５％低下する時点までの傾きを計算することによって決定した。ＫｍおよびＶｍａｘの決定は、０．０１５〜２ｍＭの範囲でパルミトイルＣｏＡの１０つの濃度を使用した。ｍＦＡＯの速度は^３Ｈ−パルミチン酸に暴露された細胞から培地中に放出された^３Ｈ_２Ｏの測定を行うことによって決定された。下の表は２回の異なる実験の平均値を示すものである。この２つの値は１０％未満の差である。

全ての場合において、このタンパク質は一般的なミカエリス・メンテン反応速度論に従っていた。全ての変異型は野生型ＶＬＣＡＤのそれに比べてはるかに下回る定常活性を持っていた。これらの見かけ上のミカエリス定数（Ｋｍ）は野生型タンパク質のＫｍと比較して７〜１４倍高く、それに対しこれらの見かけ上のＶｍａｘは野生型ＶＬＣＡＤに比べて１５〜５０％低いあるいは２倍であった。重要なことに、変異型ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化は見かけ上のＫｍを７〜１４倍の範囲で低下させた（平均で１１倍低下）。さらには、変異型ＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化はＶｍａｘを微減させた。まとめると、このデータはシステイン２３７におけるＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化が変異型ＶＬＣＡＤの酵素的欠陥を、Ｋｍを下げることによって修復する。言い換えると、見かけ上のＫ_Ｍが正常になっていることからわかるようにＳＮＡＣ処理はＶＬＣＡＤの酵素活性を増加させ、ｍＦＡＯ能をＶＬＣＡＤ異常細胞で回復させた。

さらに、水銀レジン支援捕捉（ｍｅｒｃｕｒｙ ｒｅｓｉｎ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ：ＭＲＣ）技術の後に質量分析を用いた検出によってＳＮＯ−ＮＡＣ処理がシステイン２３７のＳ−ニトロシル化に繋がることを確認した。特に、前記ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ヒトＶＬＣＡＤ配列２３１〜２４７に対応する、２重荷電されたペプチドＴＳＡＶＰＳＣ_２３７ＧＫＹＹＴＬＮＧＳＫの存在をＳＮＡＣ処理されたＶＬＣＡＤ異常細胞の細胞溶解物でのみ発見した。重要なことに、ＶＬＣＡＤにおける他の修飾は検出されなかった。これらのデータはＶＬＣＡＤのＳ−ニトロシル化が、他の変異存在下において酵素効率を高め、かつタンパク質のＳ−ニトロシル化がＶＬＣＡＤの酵素的欠陥を修復することを証明した。

本発明のいくつかの好適な実施形態を説明し具体的に上記に例示したが、本発明がこれらの実施形態に限定されることを意図したものではない。以下の特許請求の範囲に含まれるような、本発明の範囲および意図から外れることなく様々な修正がそれらに加えられることが出来る。

Claims (10)

1. 脂肪酸酸化異常症を対象において治療する方法であって、少なくとも一つのＳ−ニトロシル化剤を前記対象に投与する工程を有する、方法。
2. 請求項１記載の方法において、前記脂肪酸酸化異常症は、極長鎖アシルコエンザイムＡ脱水素酵素欠損症（ＶＬＣＡＤＤ）、長鎖３−ヒドロキシアシルコエンザイムＡ脱水素酵素欠損症（ＬＣＨＡＤＤ）、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤＤ）、短鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＳＣＡＤＤ）、中／短鎖Ｌ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（Ｍ／ＳＣＨＡＤＤ）、多種アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＡＤＤ）、ミトコンドリア三頭タンパク質欠損症、短鎖３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ欠損症（ＳＫＡＴＤ）、中鎖３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ欠損症（ＭＣＫＡＴＤ）、２，４−ジエノイルＣｏＡレダクターゼ欠損症、およびグルタル酸血症ＩＩ型（ＧＡ−ＩＩ）から成る群から選択される、方法。
3. 請求項２記載の方法において、前記脂肪酸酸化異常症はＶＬＣＡＤＤである、方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法において、前記Ｓ−ニトロシル化剤は、亜硝酸（ａｃｉｄｉｃ ｎｉｔｒｉｔｅ）、塩化ニトロシル、亜硝酸アルキル、亜硝酸エチル、亜硝酸アミル、グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンオリゴマー、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン、ニトログリセリン、ニトロプルシド、一酸化窒素、Ｓ−ニトロソヘモグロビン、Ｓ−ニトロソアルブミン、５−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−ガンマ−メチル−Ｌ−ホモシステイン、５−ニトロソ−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−ニトロソ−ガンマ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソ−デルタ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソアルブミン、および薬学的に許容されるそれらの塩から成る群より選択される、方法。
5. 請求項４記載の方法において、前記Ｓ−ニトロシル化剤はＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン（ＳＮＯ−ＮＡＣ）である、方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法であって、さらに、前記脂肪酸酸化異常症の治療のための少なくとも一つの別の治療剤を投与する工程を有する、方法。
7. 請求項６記載の方法において、前記別の治療剤はトリヘプタノインまたはベザフィブラートである、方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法であって、さらに、Ｓ−ニトロシル化剤を投与する前に、前記対象において脂肪酸酸化異常症を診断する工程を有する、方法。
9. 請求項８記載の方法において、前記診断する工程が、
   ａ）前記対象から生体試料を入手する工程と、
   ｂ）前記試料における前記極長鎖アシルコエンザイムＡ脱水素酵素（ＶＬＣＡＤＤ）の酵素活性を決定する工程と、
   ｃ）工程ｂ）で決定されたＶＬＣＡＤ酵素活性量と、健康な対象由来の対応する生体試料におけるＶＬＣＡＤ酵素活性量とを比較する工程であって、前記健康な対象と比べた前記対象の生物試料におけるＶＬＣＡＤ酵素活性の低下は、前記対象における脂肪酸酸化異常症の兆候である、前記比較する工程と
   を有する方法。
10. 請求項８記載の方法において、前記診断する工程は、前記対象から得た生物試料中の前記極長鎖アシルコエンザイムＡ脱水素酵素（ＶＬＣＡＤＤ）をコードする核酸分子における変異の存在を決定する工程であって、ＶＬＣＡＤをコードする核酸分子中の変異の存在は、前記対象における脂肪酸酸化異常症の兆候である、前記決定する工程を有する方法。

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