JP2016532125A - ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の1個または複数の翻訳後修飾(ptm)の存在、非存在、数または位置を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を膜貫通ポアと、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアを通って移動するように接触させるステップ;および
(b)ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアに関して移動する際に1つまたは複数の電流測定値を取り、それによりペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の1個または複数のPTMの存在、非存在、数または位置(1個もしくは複数)を決定するステップ
を含む方法を提供する。
(a)ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む生物由来の試料に対して本発明の方法を実行するステップ;および
(b)ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の1個または複数のPTMが存在するかどうかを決定し、それにより生物が疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定するステップ
を含む方法も提供する。
配列番号1は、野生型α溶血素(WT αHL)の1個のサブユニットをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
開示された産生物および方法のさまざまな適用が、当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書において使用される用語は、本発明の具体的な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定する目的ではないことも理解される。
本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の1個または複数のPTMの存在、非存在、数または位置(1個もしくは複数)を決定する方法を提供する。本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の1個または複数のPTMの存在、非存在、数または位置(1個もしくは複数)を決定する方法を好ましくは提供する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアを通って移動するように、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、膜貫通ポアと接触される。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアに関して移動する際に1つまたは複数の電流測定値が取られる。これは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の1個または複数のPTMの存在、非存在、数または位置(1個もしくは複数)の決定を可能にする。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在してよくまたは天然に存在しなくてもよい。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、それらの中に合成または修飾アミノ酸を含んでよい。アミノ酸への多数の異なる種類の修飾が当技術分野において周知である。好適なアミノ酸およびその修飾は、下に考察されている。本発明の目的のために、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が当技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることは理解される。
本発明の方法におけるステップ(a)および(b)は、好ましくはポアにわたって印加された電位と共に実行される。印加された電位は、典型的にはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をポアを通して移行または移動させる。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に、印加された電位は、化学的電位であってよい。この例は、両親媒性層にわたる塩グラジエントを使用することである。塩グラジエントはHolden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。
任意の1個または複数のPTMは、本発明により決定され得る。1個または複数のPTMは、疎水性基での修飾、補因子での修飾、化学基の付加、糖化(糖の非酵素的付着)、ビオチン化およびペグ化から好ましくは選択される。PTMは、それらが生物工学的または生物医学的目的のために実験室で化学的に修飾された非天然物であってもよい。これは、天然対応物とは対照的な実験室作製ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のレベルのモニターすることを可能にできる。
膜貫通ポアは、ある程度膜を横断する構造である。それは、印加された電位によって駆動される水和イオンを膜にわたってまたは膜内に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には膜全体を横断し、それにより水和イオンは、膜の一方の側から膜の他方の側へ流れることができる。しかし膜貫通ポアは、膜を横断しなくてもよい。それは、一方の末端で閉じていてよい。例えばポアは、それに沿ってまたはそれの中に水和イオンが流れることができる膜内のウエルであってよい。膜貫通タンパク質ポアは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアを通して移動できるように、および典型的には膜を横断できるようにする。
電気的測定は、Stoddart, D. S., et al., (2009), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, p7702-7707、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72および国際出願第WO−2000/28312号に記載の標準的な単一チャネル記録装置を使用して行われてよい。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第WO−2009/077734号および国際出願第WO−2011/067559号に記載の多重チャネル系を使用して行われてよい。
本発明は、生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の1個または複数のPTMと関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法も提供する。1個または複数のPTMは、正常または異常であってよい。本発明は、生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化に関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法を好ましくは提供する。
本発明の方法は、他の応用のために使用できる。例えば、加齢細胞での細胞周期の際またはシグナル伝達の際のPTM変化の分析などの、細胞中の生理的条件または変化を分析するために使用され得る。本発明の方法は、医薬品を検査する(それらの有効性をモニタリングするなど)ためにも使用され得る。それは、薬物乱用、毒物、汚染物質などの間接的検査のためにも使用され得る。
αHLナノポア
野生型(WT)αHL単量体を大腸菌(E.coli)中でin vitro転写/翻訳(IVTT)系で発現させ、ウサギ赤血球細胞膜上で七量体ポアを形成するようにオリゴマー形成させた。七量体ポアをドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した41。
チオレドキシン(Trx)V5−C109遺伝子をpET 30a(+)プラスミド(TopGene)にクローン化した。Trx変異体を部位特異的変異導入(QuickChange(登録商標)II XL、Stratagene)によって産生し、DNA配列決定によって確認した。タンパク質発現を対数増殖期におけるIPTGでの誘導後に大腸菌(E.coli)BL21(DE3)細胞(Novagen)を使用して実行した。タンパク質を1mM DTTを含むTE緩衝液(10mM Tris.HCl、1mM EDTA、pH8.3)を使用するサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 75 10/300 GL、Tricorn、GE Healthcare)に続く、1mM DTTを含むTE緩衝液、pH8.3での0〜1M KClのグラジエントで溶出されるイオン交換クロマトグラフィー(HiTrap Q FF、GE Healthcare)によって精製した。タンパク質質量をエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析(ESI LC−MS)37によって確認した37。
プロテインキナーゼA(PKA)のヘキサヒスチジング化触媒サブユニットをTrx変異体の部位特異的セリンリン酸化のために精製した。pET15b PKA Catプラスミド42をRosetta(DE3)pLysS細胞(Novagen)に形質転換した。細胞を37℃、アンピシリン抗菌薬(50mg/mL)を含有するルリア培地でOD600=0.6から0.8まで増殖させた。細胞培養物を最終濃度0.5mMのIPTGで誘導し、18℃、24時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、重力流Ni−NTA Superflow親和性カラム(Qiagen)にロードする前にBugBuster(登録商標)Master Mix(Novagen)で溶解させた。リン酸緩衝液(10mMリン酸、150mM NaCl、pH7.2)での洗浄後、ヘキサヒスチジンタグ化触媒サブユニットをリン酸緩衝液中の500mMイミダゾールで溶出した。タンパク質の質量をESI LC−MSによって確認した。
Trx変異体をPKAの触媒サブユニットを使用してRRXS認識配列のセリン残基でリン酸化した。20mM MgOAcを含有する20mM Tris.HCl緩衝液、pH7.4中のTrx変異体(約0.5〜1mg/mL)を、2mM DTT、0.2mMアデノシン5’−三リン酸(ATP、ジナトリウム塩水和物、Sigma−Aldrich)および約0.06mg/mL PKAでインキュベートした。リン酸化動態をESI LC−MSおよび等電点電気泳動(IEF)ゲル電気泳動によって追跡した。TrxS112−Pでのリン酸化は、2時間以内に完了した。TrxS107−PおよびTrxS95−Pについて、追加的ATPおよびPKAをリン酸化の収量を増加させるために添加し、インキュベーション時間を延長した。リン酸化タンパク質を1mMDTTを含有するTE緩衝液(10mM Tris.HCl、1mM EDTA、pH8.3)中でサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 75 10/300 GL、Tricorn、GE Healthcare)によって精製した。
オリゴヌクレオチド−Trxコンジュゲートを以前記載のとおり得た37。簡潔にはTrx変異体および5’−チオール(ヘキサメチレリンカー)修飾オリゴ(dC)30(Integrated DNA Technologies)を別々に24時間、DTT(1mM)中で還元した。DTTを、PD−10脱塩カラム(GE Healthcare)を使用することによる緩衝液交換(10mM Tris.HCl、pH 8.0)によって除去し、5’−チオールオリゴ(dC)30を2,2’−ジピリジルジスルフィド(アセトニトリル中10mM)で活性化し、PD−10脱塩カラム(GE Healthcare)で精製し、次いで還元Trx変異体と16時間、室温で反応させた(タンパク質の100mM Tris.HCl、pH10.0への緩衝液交換後)。コンジュゲートを0〜1M KCl TE緩衝液(10mM Tris.HCl、1mM EDTA、pH 8.3)のグラジエントを使用して、イオン交換クロマトグラフィー(HiTrap Q FF、GE Healthcare)によって精製した。濃度をオリゴ(dC)30の算出されたモル吸光計数を使用することによって260nmでの吸光度から決定した。
電気的記録を21.0±2.0℃で平面脂質二重層で実施した。1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(Avanti Polar Lipids)の二重層をTeflon film(Goodfellow)の100μm直径の開口部にわたって形成させ、記録装置のcisおよびtransコンパートメントを分けた(各1mL)。両方のコンパートメントを10mM HEPES、2M KCl、pH7.4で満たした。ゲル精製αHL七量体(約0.2μL、約1ng/μL)をアースしたcisコンパートメントに加えた。Trx変異体をcisコンパートメントに加え、0.1〜0.2μMの最終濃度を生じさせた。単一ポアの挿入後、さらなる挿入を防ぐためにcisコンパートメントを新鮮緩衝液で手作業で灌流した。印加された電位によって産生されたイオン電流をパッチクランプ増幅器(Axopatch 200B、Axon Instruments)に繋いだAg/AgCl電極を使用して測定した。シグナルを5kHzで低域通過フィルターにかけ、Digidata 1440A digitizer(Axon Instruments)で25kHzでサンプリングした。データ分析をpClampソフトウェア(Molecular Devices)で実施した。事象を、非常に短い事象(<10ms)および長い遮断(>10秒)を排除して、閾値探索によって回収した。レベル3の残留電流値(IRES%)およびノイズレベル(In)をすべての点のヒストグラム(0.2pAビン)をガウス曲線(IRES%=IB/IOX10041、In=フィットの標準偏差)にフィットさせることによって決定した。各構築物についておよそ100個の個々の事象を2D IRES%対Inプロットに使用した。レベル1、2および3についての休止時間をビニングされていない(unbinned)累積ヒストグラムとしてプロットし、平均休止時間を得るために単一指数関数(Igor Pro 6.12A、WaveMetrics)にフィットさせた。各構築物に対するエラーバーは、3回の独立した実験についての標準偏差を表す。
単一部位でのリン酸化の検出
以前の仕事では本発明者らは、共移行タンパク質アンフォールディングを検討するためにチオレドキシン(Trx)変異体V5(A22P、I23V、C32S、C35S、P68A)を使用した。この変異体は、触媒ジスルフィドを欠いており、3個の安定化変異(A22P、I23V、P68A)を含有する。C末端(Cys−109)のシステイン残基で、Trx V5は、移行実験のためのDNAオリゴヌクレオチドとカップリングできる37。この仕事のために本発明者らは、C末端にPKAリン酸化部位(RRAS)を有するTrx V5由来の変異体(TrxS112−P;配列番号12)を作った、ここで下線を引いた標的セリンはSer−112である(図1b,c)。本発明者らは、TrxS112−PのC末端Cys−113をジスルフィド結合を通じてオリゴ(dC)30にカップリングさせた。コンジュゲート、TrxS112−P−オリゴ(dC)30を+140mVの印加された電位の下でαHLポアに移行させ、以前記載の37特徴的なイオン電流サインを産生した(図1a)(図4)。簡潔には(図1a)、オリゴヌクレオチドリーダーはポア(ステップ1←2)に通され、DNA上の力はタンパク質のC末端領域をアンフォールドし(ステップ2←3)、タンパク質の残部は自発的にアンフォールドし(ステップ3←4)、ポアを通じて拡散し(レベル4)、最終的にtransコンパートメントに出て行く(ステップ4←1)。ステップ2←3(すなわちレベル2での休止時間)は電圧依存性である一方で、ステップ3←4および4←1は、電圧非依存性である37。
異なる場所でのリン酸化を識別するαHLポアの能力を探索するために、本発明者らは、Trx V5に基づいて2個の追加的変異体を作った:チオレドキシンのC末端αヘリックス中の位置Ser−107にリン酸化部位(RRNS)を有するTrxS107−P(配列番号13)(図1b,g)および位置C末端αヘリックスに直前にあるループ中の位置Ser−95に部位(RRLS)を有するTrxS95−P(配列番号14)(図1b,k)。
本発明者らは、次に1つはC末端αヘリックス(RRLS、Ser−107)中および1つはC末端伸長(RRAS、Ser−112)中にアラニン残基によって分離された2個のリン酸化部位を有するチオレドキシン構築物、TrxS107−P/S112−P(配列番号15)を作った(図1b)。第1の場合にはTrxS107−P/S112−PのSer−107をAlaに変異させることによって(TrxA107/S112−P;配列番号16)、第2の場合にはSer−112をAlaに変異させることによって(TrxS107−P/A112;配列番号17)、単一のリン酸化部位を含有する2個の対照構築物を作った。3個すべての構築物は、オリゴ(dC)30付着のためのC末端システイン(Cys113)を保持していた。
Ser−107およびSer−112での一リン酸化と両方の部位でのリン酸化とを識別する能力に基づいて、本発明者らはTrxS107−P/S112−Pの不完全リン酸化を検討した。本発明者らは、等電点電気泳動(IEF)によってリン酸化の経時変化をモニターし(図3a)、2時間後に、一方は二重リン酸化され、他方は1個だけの部位でリン酸化された、2個のリン酸化タンパク質の集団が存在することを示した。IEFはSer−112でのリン酸化からSer−107でのリン酸化を識別できない。しかし、ESI LC−MSは、2時間後にTrxA107/S112−Pがほとんど完全にリン酸化され、一方TrxS107−P/A112は、PKAおよびATPのさらなる添加を伴う48時間後でさえ完全にはリン酸化されないことを示した。したがって、2時間後にTrxS107−P/S112−P由来の2個のリン酸化化学種は、Ser−112だけがリン酸化されたものおよび両方の部位がリン酸化されたものであると考えられる。
DNAリーダー配列を伴ったモデルタンパク質がαHLポアを通って移行でき、同時にアンフォールドされ、特徴的なイオン電流サインを提供する37という本発明者らの初期の発見に基づいて、本発明者らは、側鎖リン酸化、重要なPTMを電流サインにおける変化を通じて単一分子レベルで検出できることをいまや見出している。注目すべきことに、タンパク質中の異なる場所でのリン酸化が異なるサインを生じ、修飾部位間の迅速な識別を可能にする。本発明者らは、2個の隣接部位(1残基によって分離されている)のリン酸化状態:すなわち、非リン酸化状態、2個の一リン酸化状態および二重リン酸化状態、を識別でき、定量できることも示している。2個の隣接部位の1個でのタンパク質一リン酸化は、MSによって識別することが特に困難であり、本発明者らは、単一のポリペプチド鎖内のリン酸化部位の占有率および結合性は、ナノポア手法に理想的にふさわしい課題であることを示唆している。
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Claims (17)
- ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の1個または複数の翻訳後修飾(PTM)の存在、非存在、数または位置(1個もしくは複数)を決定する方法であって、
(a)前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を膜貫通ポアと、前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアを通って移動するように接触させるステップ;および
(b)前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアに関して移動する際に1つまたは複数の電流測定値を取り、それにより前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の1個または複数のPTMの存在、非存在、数または位置(1個もしくは複数)を決定するステップ
を含む方法。 - ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の2個以上のPTMの存在、非存在、数または位置を決定するためである、請求項1に記載の方法。
- 1個、2個、3個または4個のアミノ酸によって分離されている、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の2個以上のPTMの存在、非存在、数または位置を決定するためである、請求項1に記載の方法。
- 前記1個または複数のPTMが、疎水性基での修飾、補因子での修飾、化学基の付加、糖化、ビオチン化およびペグ化から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- (a)疎水性基での前記修飾が、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化およびグリピエーションから選択され;
(b)補因子での前記修飾が、リポイル化、フラビネーション、ヘムCの付着、ホスホパンテテイニル化およびレチニリデンシッフ塩基形成から選択され;
(c)化学基の前記付加が、アシル化、アセチル化、ホルミル化、アルキル化、アミド化、ブチル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ポリシアル酸化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ブロム化;シトルリン化;ヌクレオチド付加、ADPリボシル化、酸化、リン酸化、アデニリル化、プロピノイル化、ピログルタミン酸形成、S−グルタチオン付加、SUMO化;S−ニトロシル化、リジンへのサクシニル基のサクシニル化付加およびセレノイル化およびユビキニル化から選択される、
請求項4に記載の方法。 - 前記1個もしくは複数のPTMが1個もしくは複数のリン酸化である、または前記2個以上のPTMが2個以上のリン酸化である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)における前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、オリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーに共有結合している、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記膜にカップリングしている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、コレステロールを使用して前記膜にカップリングしている、請求項8に記載の方法。
- 前記ポアが、膜貫通タンパク質ポア、固体ポアまたはハイブリッド膜固体ポアである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜貫通タンパク質ポアが、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)ポリンA(MspA)、外膜ホスホリパーゼA、ナイセリア(Neisseria)自己輸送体リポタンパク質(NalP)、OMPおよびWza由来である、請求項10に記載の方法。
- 前記膜貫通タンパク質が、(a)配列番号2に示す7個の同一のサブユニットから形成されている、または(b)前記7個のサブユニットの1個または複数が配列番号2に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも50%相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、請求項11に記載の方法。
- 前記膜貫通タンパク質が、(a)配列番号4に示す4個の同一のサブユニットおよび配列番号6に示す4個の同一のサブユニットから形成されているγ溶血素、または(b)前記サブユニットの1個または複数が配列番号4に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも50%相同性を有し、および/または前記サブユニットの1個または複数が配列番号6に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも50%相同性を有し、前記ポアがポア活性を保持しているその変種である、請求項11に記載の方法。
- 前記膜貫通タンパク質が(a)配列番号8に示す7個の同一のサブユニットから形成されている、または(b)前記7個のサブユニットの1個または複数が配列番号8に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも50%相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、請求項11に記載の方法。
- 生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の1個または複数の異常なPTMに関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法であって、
(a)前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む前記生物由来の試料に対して請求項1から14のいずれか一項に記載の方法を実行するステップ;および
(b)前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の1個または複数のPTMが存在するかどうかを決定し、それにより前記生物が疾患、前記障害または表現型を有するかどうかを決定するステップ
を含む方法。 - 前記生物が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化に関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定するための、請求項15に記載の方法。
- 前記疾患または障害が、がん、慢性炎症性疾患、筋緊張性筋ジストロフィー、X連鎖無ガンマグロブリン血症、ブルトンチロシンキナーゼ、ヒルシュスプルング病、常染色体劣性SCID、X連鎖SCID、頭蓋骨癒合症、乳頭状腎臓がん、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ポイツ・ジェガーズ症候群、コフィン・ローリー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、リー・フラウメニ症候群、ウイリアムズ症候群、妖精症、糖尿病、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ウォルコット・ラリソン(Wolcott−Rallison)症候群またはX連鎖筋細管ミオパチーである、請求項15または16に記載の方法。
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