JP2016512606A - イムノブロッティングのためのマイクロ流体デバイス - Google Patents

Abstract

本発明は、マイクロ流体デバイス、システム、及びイムノブロッティング用途での使用方法を提供する。特に、本発明で提供されるデバイス及び方法は、処理速度及び多重化能を向上させ、且つ時間を短縮し、試料、及び試薬必要量を低減しながらも、従来のウエスタンブロッティングの利点を有する。【選択図】図１

Description

本出願は２０１３年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７７７，６８２号に対する優先権を主張するものであり、この出願の全内容は、参照により本明細書に包含される。

本発明は、マイクロ流体デバイス、システム、及びイムノブロッティング用途での使用のための方法を提供する。特に、本発明で提供されるデバイス及び方法は、処理速度及び多重化能を向上させ、且つ時間を短縮し、試料、及び試薬必要量を低減しながらも、従来のウエスタンブロッティングの利点を有する。

従来のウエスタンブロット分析（又はイムノブロッティング）は、細胞、組織、臓器、体液などの中の特定のタンパク質を検出するために用いられる。この技術は生化学及び分子生物学に主力である。試料中のタンパク質は、ゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され、次いでゲルからメンブレン（例えばニトロセルロースやＰＶＤＦ）に転写される。その後、標的タンパク質に特異的な抗体でメンブレンを染色する。有用な情報が確実に得られるものの、この技術は時間がかかり、技術スキルを必要とし、多くの試薬を必要とし、処理速度が限られており、また多重化にあまり適していない。処理速度及び多重化能を向上させ、且つ試薬必要量を低減しながらも、従来のウエスタンブロッティングの利点を与える技術が必要とされている。

本発明は、マイクロ流体デバイス、システム、及びイムノブロッティング用途での使用方法を提供する。特に、本発明で提供されるデバイスおよび方法は、処理速度及び多重化能を向上させ、且つ時間を短縮し、試料及び試薬必要量を低減しながらも、従来のウエスタンブロッティングの利点を有する。

いくつかの実施形態では、本発明は、平らなメンブレン接触表面と、複数の非接続の平行なマイクロ流体流路とを含み、前記マイクロ流体流路の全長がメンブレン接触表面に開口している、マイクロ流体イムノブロッティングデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体流路は、２つ以上の流路セットに空間的にグループ化されている。いくつかの実施形態では、この２つ以上の流路セットそれぞれが２〜２０個のマイクロ流体流路を含んでいる。いくつかの実施形態では、１つの流路セットでマイクロ流体流路を隔てる距離は、流路セット間の距離よりも小さい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体流路（例えば各マイクロ流体流路）は、マイクロ流体流路の一端にリザーバーを含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体流路（例えば各マイクロ流体流路）は、マイクロ流体流路の両端にリザーバーを有する。いくつかの実施形態では、各マイクロ流体流路は幅５０〜３００μｍである。いくつかの実施形態では、各マイクロ流体流路は幅１００〜２００μｍである。いくつかの実施形態では、各マイクロ流体流路は幅１４０〜１６０μｍである。いくつかの実施形態では、各マイクロ流体流路は深さ３０〜２００μｍである。いくつかの実施形態では、各マイクロ流体流路は深さ５０〜１５０μｍである。いくつかの実施形態では、各マイクロ流体流路は深さ９０〜１１０μｍである。いくつかの実施形態では、マイクロ流体流路の幅対深さの比は１０：１未満（例えば＜９：１、＜８：１、＜７：１、＜６：１、＜５：１、＜４：１、＜３：１、＜２：１）である。いくつかの実施形態では、マイクロ流体流路の幅対深さの比は３：１〜１：３（例えば２：１〜１：２）である。いくつかの実施形態では、マイクロ流体流路の幅対深さの比は９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、又は１：９である。いくつかの実施形態では、マイクロ流体流路の幅対深さの比は３：１〜１：３（例えば２：１〜１：２）である。いくつかの実施形態では、デバイスはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む。いくつかの実施形態では、デバイスは本質的にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のデバイスを使用してメンブレンに抗体溶液を塗布することを含む、イムノブロッティング方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のデバイスと、メンブレンとを含む、システム（例えば分析）を提供する。いくつかの実施形態では、前記デバイスと前記メンブレンとの間に活性化溶液が位置する、あるいは配置される。いくつかの実施形態では、活性化溶液はポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）及びＢＳＡを含有する。いくつかの実施形態では、活性化溶液は０．０１〜０．５％のＴｗｅｅｎ−２０及び０．０１〜０．５％のＢＳＡを含有する。いくつかの実施形態では、活性化溶液は０．０５〜０．１５％のＴｗｅｅｎ−２０及び０．０５〜０．１５％のＢＳＡを含有する。いくつかの実施形態では、活性化溶液は０．１％のＴｗｅｅｎ−２０及び０．１％のＢＳＡを含有する。いくつかの実施形態では、メンブレンはニトロセルロースメンブレン又はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンを含む。いくつかの実施形態では、メンブレンはその上又はその中にペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、システムは、マイクロ流体流路の中に１種以上の抗体含有溶液を更に含む。いくつかの実施形態では、１つの流路セットの各マイクロ流体流路は、異なる抗体含有溶液を含む。いくつかの実施形態では、各流路セットは同じ組み合わせの抗体含有溶液を含む。いくつかの実施形態では、各マイクロ流体流路は、異なる抗体含有溶液を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のシステムを使用してメンブレンに抗体溶液を塗布することを含む、イムノブロッティング方法を提供する。

いくつかの実施形態では、（ａ）タンパク質を試料からメンブレン上に転写することと、（ｂ）マイクロ流体イムノブロッティングデバイスのメンブレン接触面を、メンブレン上に置くことと、（ｃ）前記デバイスのマイクロ流体流路に活性化緩衝液を導入する（例えば注入する）ことと、（ｄ）前記デバイスのマイクロ流体流路に一次抗体溶液を導入する（例えば注入する）ことと、（ｅ）前記抗体溶液による抗体の前記タンパク質への結合を検出することとを含む、イムノブロッティング方法を提供する。

マイクロ流体イムノブロッティングデバイス、及びメンブレンとの接続の概略図を示す。各試料レーンに３つのマイクロ流体流路が重ね合わせられており、各試料レーンは１レーン当たり３つの異なるタンパク質をプローブするために使用することができる。 臨床ＰＭＢＣ試料中の抗体希釈を示す。（Ａ）１：５００及び１：５０００の抗体希釈を用いた、ＲｅｌＡ／ｐ６５に対する一次抗体での従来のイムノブロッティング。（Ｂ）同様のシグナル強度であることと、同じ試料に対して複数の希釈を行える柔軟性とを示すように同じ条件を用いた、ＲｅｌＡ／ｐ６５をプローブするマイクロ流体イムノブロッティング。 炎症刺激に応答するＳＴＡＴ３リン酸化反応の検出を示す。（Ａ）ＬＰＳ刺激に応答するＳＴＡＴ３のリン酸化反応を示す、ＲＡＷ２６４．７細胞溶解物の従来のイムノブロット。（Ｂ）（Ａ）と同じＲＡＷ２６４．７細胞溶解物のマクロ流体イムノブロット。マイクロ流体デバイスにより、ＰＶＤＦメンブレンの除去及びリプローブの必要なしに、同じ試料中のｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３とＳＴＡＴ３とを同時にモニタリングすることができる。 ２つの異なる化学発光検出法を用いたＭＡＰＫ経路のタンパク質イムノブロットを示す。（Ａ）４５分のＬＰＳあり、又はなしの、ＲＡＷ２６４．７細胞溶解物の従来のイムノブロット。装填コントロールとして総ＥＲＫを用いて、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ及びｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＥＲＫについて、メンブレンをプローブした。一次抗体はＨＲＰ化学発光法を用いて検出した。（Ｂ）（Ａ）の条件を反映させたマイクロ流体イムノブロット。（Ｃ）及び（Ｄ）は、一次抗体を検出するためにアルカリホスファターゼ化学発光二次抗体を用いて行った以外は（Ａ）及び（Ｂ）と同一である。

定義
本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、所望の生体活性を示す限り、特にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：４８５４−４８６１；この全内容は参照により本明細書に包含される）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラであってもよく、あるいは他の種由来であってもよい。抗体は、免疫システムによって生成し、特異抗原を認識して結合することが可能なタンパク質である（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；この全内容は参照により本明細書に包含される）。標的抗原は一般的に、複数の抗体上のＣＤＲによって認識される、エピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有している。異なるエピトープに特異的に結合するそれぞれの抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は２種以上の対応する抗体を有する場合がある。抗体には、全長免疫グロブリン分子、又は全長免疫グロブリン分子のうちの免疫活性な部分、すなわち対象とする標的の抗原又はその一部と免疫特異的に結合する抗原結合部位含む分子が含まれ、このような標的としては、これらに限定されるものではないが、がん細胞や、自己免疫疾患に関連する自己免疫性抗体が生成する細胞を含む。免疫グロブリンは、いずれの種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、いずれの分類（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はいずれのサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。免疫グロブリンは、ヒト由来、マウス由来、又はウサギ由来を含む、いずれの種由来であってもよい。

本明細書において、用語「抗体フラグメント」とは、全長抗体のうちの一部、一般的にはその抗原結合領域又は可変領域のことをいう。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、及びＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直鎖抗体；Ｆａｂ表現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及び免疫特異的に抗原に結合する上述のいずかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。

本明細書において、「多重」あるいは文法的に同義の表現は、対象とする２つ以上の標的配列の検出、分析、又は増幅のことをいう。１つの実施形態においては、多重は＞３、＞５、＞８、＞１０、＞２０、＞５０、＞１００等のことをいう。「多重化能」とは、多重方式で使用される、具体的なデバイス、試薬、システム、プラットフォーム、キット等の性質のことをいう。

本明細書において、用語「試料」は、その最も広い意味で使用される。ある意味では、これは、生体試料及び環境試料だけではなく、細胞（例えばヒト、細菌、酵母、菌類）、微生物、任意の供給源から得られる標本又は培養物を含むことを意味する。生体試料は、動物（ヒトを含む）から得てもよく、それらの中にみられる、骨髄、血液、血清、血小板、血漿、間質液、尿、脳脊髄液、核酸、ＤＮＡ、組織、及びこれらの精製した形態並びに濾過した形態を含む（ただしこれらに限定されない）、生体物質又は組成物のことをいう。環境試料には、表面物質、土、水、結晶、及び工業試料などの環境物質が含まれる。しかし、このような例は本発明に該当する試料の種類を限定するものとして解釈すべきではない。

本発明の実施形態の詳細な説明

本発明は、マイクロ流体デバイス、システム、及びイムノブロッティング用途での使用方法を提供する。特に、本発明で提供されるデバイス及び方法は、処理能力及び多重化能を向上させ、且つ時間を短縮し、試料及び試薬必要量を低減するとともに、従来のウエスタンブロッティングの利点を有する。

１９７９年の開始以降、分子生物学及び臨床診断において、タンパク質イムノブロッティングは、タンパク質をプロファイルするための標準技術になっている（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ． １９７９；この全内容は参照により本明細書に包含される）。従来のタンパク質イムノブロッティングは効果的な手法であり続けるものの、遅い処理速度、比較的多い試料量及び抗体量を必要とすること、及び複数のタンパク質を同時にプローブすることができないこと、を含む欠点を有している（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ２００７；この全内容は参照により本明細書に包含される）。

この初期の欠点のいくつかを克服するために、別のタンパク質を連続検出できるメンブレン除去及びリプロービング、および試料から検出される種々のタンパク質を増やすために使用することができる蛍光性二次抗体の導入を含む、複数のタンパク質イムノブロッティングの変法が展開されている。これらの変形例は、改良されてはいるものの、シグナルのロス及びシグナルの変動を含む、それら特有の欠点を有している。更に、これらの変形例のいずれもが従来のイムノブロッティングで必要とされる多量の試料及び抗体量に対処していない。

マイクロ流体技術は分子生物学及び臨床診断に応用されてきた。マイクロ流体工学によって小体積かつ正確な空間制御が得られ、これが既存の分子生物学技術を劇的に補っている。Ｈｅｒｒのグループは、従来のタンパク質のイムノブロッティングにマイクロ流体技術を組み込んだ（Ｈｅ ａｎｄ Ｈｅｒｒ ２００９；Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｈｅｒｒ ２０１２；この全内容は参照により本明細書に包含される）。改良されたものの、この手法は単一のタンパク質しか検出することができず、既存のイムノブロッティングプラットフォームと接続する柔軟性を有していなかった。つい最近、１つのデバイス中にイムノブロッティングの分離、転写、及び検出の構成要素を一体化するマイクロ流体デバイスが開発された（Ｔｉａ ｅｔ ａｌ．２０１１；この全内容は参照により本明細書に包含される）。このデバイスの速度及び多重化能は大幅に向上したものの、複雑な生体マトリックスの中から特定のタンパク質をプローブする能力は、このような一体化マイクロ流体デバイスでは未だ示されていない。Ｐａｎらは、複数のタンパク質を検出可能な、既存のイムノブロッティング法と適合する、蛍光ベースのマイクロ流体デバイスを導入することによって更に発展させた（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．２０１０；この全内容は参照により本明細書に包含される）。これらのマイクロ流体デバイスのいずれも複数のタンパク質を同時にプローブすることができず、既存のイムノブロッティング装置及び化学発光検出法と接続しない。

従来のウエスタンブロッティングは重要な情報（例えば生体システム（例えばヒト）と外部刺激（例えば抗炎症薬）との間の相互作用について）を得ることができるものの、これらは試薬及び時間の両方の観点から費用がかかる。ある実施形態では、本発明は、従来のウエスタンブロッティングと同様の及び／又はそれより多い情報量を提供するが、試薬と時間の消費量が減り、処理速度と多重化能が向上した、デバイス及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質含有メンブレン上に存在するレーンに重なるように配置されたマイクロ流体流路のセットを含む、マイクロ流体デバイスを提供する。様々な実施形態では、メンブレン上のタンパク質はマイクロ流体流路中の抗体によってプローブされる。いくつかの実施形態では、メンブレン上の１つのタンパク質レーンは、２つ以上のマイクロ流体流路（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０本、あるいはそれ以上）と重ね合わされており、それぞれの流路はタンパク質レーンをプローブするための異なる抗体を含んでいる。

いくつかの実施形態では、本発明は従来のイムノブロッティングと比べて数多くの利点をもたらす。例えば、メンブレン全体を１種類の一次抗体でインキュベーションする代わりに、１つのタンパク質レーン当たり１つのマイクロ流体流路中に、はるかに少ない量の抗体が提供される。１つのタンパク質レーン当たり、複数のマイクロ流体流路が提供される実施形態では、１つのタンパク質レーンを複数の異なる抗体によって同時にプローブすることができる。いくつかの実施形態では、本発明によって、従来のイムノブロッティングよりもより少ない試薬（例えばマイクロ流体流路対メンブレン全体のインキュベーション）、より少ない試料（例えばゲル上の１つのレーン対異なる抗体毎に異なるゲル）、及びより少ない時間（例えば１つのゲル及びメンブレン転写対異なるゲル及び転写）を用いて、より多くの種類の抗体（例えばゲルの１レーン当たり、２種…５種…１０種…２０種あるいはそれ以上）をプローブすることが可能になる。いくつかの実施形態では、本発明のデバイス及び方法は、時間の観点からは、従来のウエスタンブロット１回が完了する時間のうちに、３回、５回、１０回、２０回、あるいはそれ以上のイムノブロットを完了することが可能である。いくつかの実施形態では、本発明のデバイス及び方法は、コストの観点からは、従来のウエスタンブロットのコストの１％未満でイムノブロットを完了することができる。

Ａ．デバイス
ある実施形態では、１つ以上のマイクロ流体流路（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０本あるいはそれ以上）の１つ以上のセット（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個あるいはそれ以上）を含むマイクロ流体デバイスが提供される。いくつかの実施形態では、流路の中に入っている液体がデバイスの表面に露出するように、流路はデバイスの平らな表面に沿って通っている。いくつかの実施形態では、各流路は、マイクロ流体流路の中に、リザーバー、又は、抗体溶液を導入するための他の液体導入手段を含んでいる。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、バルブ、ポンプ、混合チャンバー、及び／又は、マイクロ流体デバイスと共通するがデバイスのコストを上昇させると共にその使用を複雑にする他のより複雑な構成要素を必要としない。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスはイムノブロッティングを行うためのゲル電気泳動との一体化の必要がない。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは１つ以上の流路セットを含み、各セットは１つ以上の流路を含む。各セットはタンパク質ゲル上の１つのレーンをプローブするように構成される。いくつかの実施形態では、１つのセットの各流路は異なる抗体でタンパク質レーンをプローブするように構成される。各流路セットは、同じ数の流路を含んでいても異なる数の流路を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態では、デバイスは任意の好適な大きさ及び寸法であってよい。いくつかの実施形態では、デバイスは具体的なゲル又はメンブレンの寸法に合うよう構成される。いくつかの実施形態では、デバイスは様々な大きさ及び／又は寸法のゲル及びメンブレンで使用できるよう構成される。いくつかの実施形態では、デバイスは１ｃｍから５０ｃｍ、又はそれ以上（例えば１ｃｍ×１ｃｍ、４ｃｍ×６ｃｍ、８ｃｍ×６ｃｍ、５ｃｍ×２０ｃｍ、２０ｃｍ×４０ｃｍ等）の寸法のフットプリント（例えばメンブレン接触面）を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのメンブレン接触面の長さ及び／又は幅は、１ｃｍ…２ｃｍ…３ｃｍ…４ｃｍ…５ｃｍ…６ｃｍ…７ｃｍ…８ｃｍ…９ｃｍ…１０ｃｍ…１１ｃｍ…１２ｃｍ…１３ｃｍ…１４ｃｍ…１５ｃｍ…１６ｃｍ…１７ｃｍ…１８ｃｍ…１９ｃｍ…２０ｃｍ…２１ｃｍ…２２ｃｍ…２３ｃｍ…２４ｃｍ…２５ｃｍ…２６ｃｍ…２７ｃｍ…２８ｃｍ…２９ｃｍ…３０ｃｍ…３１ｃｍ…３２ｃｍ…３３ｃｍ…３４ｃｍ…３５ｃｍ…３６ｃｍ…３７ｃｍ…３８ｃｍ…３９ｃｍ…４０ｃｍ…４１ｃｍ…４２ｃｍ…４３ｃｍ…４４ｃｍ…４５ｃｍ…４６ｃｍ…４７ｃｍ…４８ｃｍ…４９ｃｍ…５０ｃｍである。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの流路は任意の好適な大きさ及び寸法であってよい。いくつかの実施形態では、流路は、適切な溶液がマイクロ流体流路を効率的に横断及び／又は占有できるような寸法とされる。いくつかの実施形態では、流路の長さはデバイスの長さに比例する。いくつかの実施形態では、流路の長さは使用するために構成されたメンブレン及び／又はゲルの長さに比例する。いくつかの実施形態では、流路は１ｃｍから５０ｃｍの間の長さ（例えば１ｃｍ…２ｃｍ…３ｃｍ…４ｃｍ…５ｃｍ…６ｃｍ…７ｃｍ…８ｃｍ…９ｃｍ…１０ｃｍ…１１ｃｍ…１２ｃｍ…１３ｃｍ…１４ｃｍ…１５ｃｍ…１６ｃｍ…１７ｃｍ…１８ｃｍ…１９ｃｍ…２０ｃｍ…２１ｃｍ…２２ｃｍ…２３ｃｍ…２４ｃｍ…２５ｃｍ…２６ｃｍ…２７ｃｍ…２８ｃｍ…２９ｃｍ…３０ｃｍ…３１ｃｍ…３２ｃｍ…３３ｃｍ…３４ｃｍ…３５ｃｍ…３６ｃｍ…３７ｃｍ…３８ｃｍ…３９ｃｍ…４０ｃｍ…４１ｃｍ…４２ｃｍ…４３ｃｍ…４４ｃｍ…４５ｃｍ…４６ｃｍ…４７ｃｍ…４８ｃｍ…４９ｃｍ…５０ｃｍ）である。いくつかの実施形態では、流路は必要な溶液（例えば抗体溶液）が流路を流れる／横断する、占有する、及び／又は満たすのに適切な幅及び／又は深さである。いくつかの実施形態では、流路の幅は特定の幅の１セット中に所望の数の流路が提供するように最適化される。いくつかの実施形態では、１セット当たりより多くのレーンを収容するために流路が狭められるので、流路は必要な流路容積を提供するために深くされる。いくつかの実施形態では、１つの流路セットは１ｍｍから５０ｃｍの範囲の幅（例えば１ｍｍ…２ｍｍ…３ｍｍ…４ｍｍ…５ｍｍ…６ｍｍ…７ｍｍ…８ｍ…９ｍｍ…１ｃｍ…２ｃｍ…３ｃｍ…４ｃｍ…５ｃｍ…６ｃｍ…７ｃｍ…８ｃｍ…９ｃｍ…１０ｃｍ…１１ｃｍ…１２ｃｍ…１３ｃｍ…１４ｃｍ…１５ｃｍ…１６ｃｍ…１７ｃｍ…１８ｃｍ…１９ｃｍ…２０ｃｍ…２１ｃｍ…２２ｃｍ…２３ｃｍ…２４ｃｍ…２５ｃｍ…２６ｃｍ…２７ｃｍ…２８ｃｍ…２９ｃｍ…３０ｃｍ…３１ｃｍ…３２ｃｍ…３３ｃｍ…３４ｃｍ…３５ｃｍ…３６ｃｍ…３７ｃｍ…３８ｃｍ…３９ｃｍ…４０ｃｍ…４１ｃｍ…４２ｃｍ…４３ｃｍ…４４ｃｍ…４５ｃｍ…４６ｃｍ…４７ｃｍ…４８ｃｍ…４９ｃｍ…５０ｃｍ）である。いくつかの実施形態では、セット幅はゲル及び／又はメンブレンのレーン幅と合うように構成される。いくつかの実施形態では、１つのマイクロ流路セットは１本以上の流路（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０…２０…３０…４０…５０…１００…５００本等）を含む。いくつかの実施形態では、１セット当たりの流路の本数は、セットの幅、流路間の間隔、及び流路の幅に依存する（例えば流路内で使用される溶液の種類に依存してもよい）。いくつかの実施形態では、流路の幅は５０μｍから５００μｍの範囲（例えば５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ…２５０μｍ…３００μｍ…３５０μｍ…４００μｍ…４５０μｍ…５００μｍ）である。いくつかの実施形態では、流路の幅は１００μｍから２００μｍの範囲（例えば１２５μｍ〜１７５μｍ、１４０μｍ〜１６０μｍ、約１５０μｍ、１５０μｍ）である。いくつかの実施形態では、流路の深さは２５μｍから２００μｍの範囲（例えば２５μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ）である。いくつかの実施形態では、流路の幅は７５μｍから１２５μｍの範囲（例えば９０μｍ〜１１０μｍ、約１００μｍ、１００μｍ）である。いくつかの実施形態では、流路は、１つの流路当たり０．１μＬから５μＬ（例えば０．１μＬ、０．２μＬ、０．３μＬ.、０．４μＬ、０．５μＬ、０．６μＬ、０．７μＬ、０．８μＬ、０．９μＬ、１．０μＬ、１．１μＬ、１．２μＬ、１．３μＬ、１．４μＬ、１．５μＬ、１．６μＬ、１．７μＬ、１．８μＬ、１．９μＬ、２μＬ…３μＬ…４μＬ…５μＬ）の溶液を収容する。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、１つ以上の適切な大きさのメンブレン、デバイスの流路と嵌合するよう構成されたレーンを有する適切な大きさのゲル、抗体溶液、緩衝液、活性化溶液、デバイスの流路と嵌合するよう構成されたレーンを有するゲルを注ぎ入れるためのコーム、及び使用説明書などと一緒に、キットの一部として提供される。いくつかの実施形態では、デバイス又はキットは、具体的な分析に最適化される。いくつかの実施形態では、キットは抗体と、特定の分析を行うためのレーン構成とを備えている。

いくつかの実施形態では、流路セット及び／又はマイクロ流体流路は、デバイスの中で一貫して同じではない。１つのデバイス上の流路は、１つ以上のセット幅、１セット当たりのマイクロ流路の数、マイクロ流路の幅、間隔などによって１つのデバイス中で変化していてもよい。

Ｂ．方法
いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは任意の好適な技術及び試薬を使用するイムノブロット実験を行うために利用される。

本発明のデバイスを用いたイムノブロッティングの典型的な手順は以下の通りである。タンパク質含有試料をゲル（例えばポリアクリルアミドゲル）のウェルに装填し、試料中に存在するタンパク質をゲル電気泳動（例えば未変性ゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）によって分離する。メンブレン（例えばＰＶＤＦメンブレン）をゲルの上にのせ、タンパク質をメンブレンに転写する。次いで、メンブレンをスライドグラスの上に置く。マイクロ流体デバイスをメンブレンの上に置き、マイクロ流体流路をタンパク質レーンと一直線に揃える。任意選択的にはブロッキング緩衝液（例えばＴｗｅｅｎ−２０及びＢＳＡ）を各流路に注入してもよい。ブロッキング段階を有する実施形態では、流路の入口／出口はインキュベーション中の蒸発を最小限にするために覆われる（例えばテープで）。抗体は、適切な流路（例えば、１つのセット中の各マイクロ流路に異なる抗体）に注入される。入口／出口はインキュベーション中の蒸発を最小限にするために覆われる（例えばテープで）。インキュベーション（例えば１時間）の後、マイクロ流体デバイスを取り外し、メンブレンを適切な二次抗体の溶液に移す（例えばメンブレンを１時間あるいはメンブレンが完全に濡れるまでこの溶液中に入れたままにする）。メンブレンを二次抗体溶液から取り出し、用時調製したブロッキング緩衝液で洗浄する（例えば各３分、５回）。メンブレンを展開液に移し（例えば３０分）、メンブレンを取り出して脱イオン水で洗浄する。その後、メンブレンを乾燥させる。いくつかの実施形態では、上の段階のうちのいくつか又は全ては、代替手順に変えてもよいし、具体的な用途に合わせるために変えてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、デバイスは流路の中に予め抗体が装填されてメンブレンの上に置かれる。別の実施形態では、ブロッキング溶液、二次抗体溶液、洗浄溶液、及び展開液はマイクロ流体流路から添加される。いくつかの実施形態では、試料は直接メンブレンの上に直接載せられるか、ゲル以外の表面（例えばマイクロタイタープレート、アレイ等）から載せられる。

いくつかの実施形態では、同じ条件の同じ試料が、ゲルの複数のウェルで処理される。その場合、複数の流路セットのマイクロ流体流路は、同じ試料を調べるために全て異なる抗体が装填されてもよい。他の実施形態では、異なる試料（又は異なる条件の同じ試料）が、ゲルの２つ以上のレーンで処理される。その場合、抗体の同じセットで各試料をプローブするために、多様な流路セットに全く同じように装填されてもよい。

いくつかの実施形態では、デバイス及び／又はメンブレンは疎水性表面（例えばＰＤＭＳ及びＰＶＤＦ）を含む。本発明の実施形態の開発中に行われた実験から、デバイスとメンブレンの間を適切な密閉を達成することは難しいことが明らかになった。いくつかの実施形態では、この課題を克服するため、装置とメンブレンとの間の密閉性を高めるために、活性化段階（例えば装置の及び／又はメンブレンの）が行われる。いくつかの実施段階では、密閉はマイクロ流体流路を介して活性化される。いくつかの実施形態では、活性化溶液はデバイスの膜接触表面に塗布される。いくつかの実施形態では、活性化溶液はメンブレンに塗布される。いくつかの実施形態では、活性化はＰＤＭＳ／ＰＶＤＦ表面と使用する水溶液との間の疎水性／親水性の差を利用する。

いくつかの実施形態では、溶液は任意の好適な構造又は方法によってマイクロ流体流路に添加される。いくつかの実施形態では、溶液は流路に注入される。いくつかの実施形態では、溶液は流路の一端のリザーバーに注入される。いくつかの実施形態では、溶液の添加にポンプ及び／又はバルブは必要とされない。いくつかの実施形態では、流路に溶液（例えば抗体溶液）を導入するために、針（例えば１０〜４０ゲージ（例えば１２ゲージ…１６ゲージ…２０ゲージ…２４ゲージ…２７．５ゲージ…３０ゲージ…３６ゲージ…４０ゲージ））が使用される。いくつかの実施形態では、適切な大きさの針（例えば２７．５ゲージ）から適切な大きさのリザーバーへ溶液を導入することで針の周囲にタンポナーデ効果が生じ、これが密閉性を大幅に向上させ、マイクロ流体流路の充填が促進される。

Ｃ．製造
いくつかの実施例では、本発明のデバイスは当該分野で公知のマイクロ流体工学の製造技術を用いて製造される。様々な典型的な製造方法は、Ｆｉｏｒｉｎｉ ａｎｄ Ｃｈｉｕ，２００５，“Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ：ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８：４２９−４６；Ｂｅｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｔｅｃｔｏｎｉｃｓ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３４８８−１３４９３；Ｒｏｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，“Ｐｌａｓｍａ ｅｔｃｈｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２：１４５−１５０；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，“Ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ”Ｔａｌａｎｔａ ５６：２６７−２８７、Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００，“Ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：１２−２６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，７６７，７０６Ｂ２号，例えば６．８節“Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ”；Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ａ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａｉｒ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｏｎ ａ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｗａｆｅｒ，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．ｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ｖ．ＥＤ−２６，ｐｐ．１８８０−１８８６；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｋｌｕｗｅｒ；Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｔａｇｅ ｗｉｔｈ Ｏｎ−Ｃｈｉｐ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｉｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＥＭＳ ９６，ｐｐ．４９１４９６；及びＭａｓｔｒａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｖａｃｕｕｍ−Ｓｅａｌｅｄ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ Ｉｎｃａｎｄｅｓｃｅｎｔ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ，ｉｎ Ｉｎｔｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＩＤＥＭ ８９，ｐｐ．５０３−５０６に記載されている。これらの参考文献それぞれの全内容は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に包含される。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの製造に使用される方法は使用する材料によって変更することができ、ソフトリソグラフィー法、マイクロアセンブリ、バルクマイクロマシニング法、表面マイクロマシニング法、標準的なリソグラフィー法、ウエットエッチング、反応性イオンエッチング、プラズマエッチング、ステレオリソグラフィー、レーザー化学三次元書き込み法、モジュラーアセンブリ法、レプリカ成形法、射出成形法、熱成形法、レーザーアブレーション法、方法の組み合わせ、及び当該技術分野で公知あるいは将来開発されるであろう他の方法が含まれる。

典型的なデバイスの製造方法は次のとおりである。デバイスの設計仕様（例えばデバイス寸法、流路寸法、流路間隔、１セット当たりの流路の数、流路セットの数、流路の形状、リザーバーの存在、リザーバーの形状／大きさ等）を提供するコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）書が作られる。ＣＡＤ仕様書から、デバイスの具体的構造を提供するマスク（例えばガラス、ポリマー等）が作られる。未硬化ポリマー（例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））を型に注ぎ込むことによって、マスクから型（例えばシリコンウエハー型）を製造し、引き続いてマスクとポリマーを加熱してポリマーを硬化させ（例えば重合、架橋等）、固形マイクロ流体デバイスを得る。いくつかの実施形態では、１つのマスクが複数の（例えば１０、１００、１０００、１０，０００、又はそれ以上）の型を製造するために再利用される。いくつかの実施形態では、１つの型が複数の（例えば１０、１００、１０００、１０，０００、又はそれ以上）デバイスを製造するために再利用される。

いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスはソフトリソグラフィー法を用いてポリメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から製造されるが；好適なポリマー（類）及び技術は本発明の範囲に含まれる。

Ｄ．抗体／試薬
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデバイスで使用するための溶液は、マイクロ流体流路を効率的かつ再現可能な様式で満たすよう構成される。この目的のためには、溶液は適切な粘度や親水性等を有する必要がある。本発明の実施形態を開発させる際に、本明細書に記載のデバイスのマイクロ流体流路中に配置させるのに好適な特性を有する溶液を開発するために実験が行われた。いくつかの実施形態では、溶液は、迅速かつ再現可能な様式でマイクロ流体流路の許容できる／最適な充填を提供するための、１種以上の界面活性剤、洗浄剤、乳化剤、可溶化剤等を含んでいる。いくつかの実施形態では、溶液は：ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム）、ラウレス硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、パーフルオロオクタンスルホン酸塩（ＰＦＯＳ）、パーフルオロブタンスルホン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＢ）、ステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、パーフルオロノナン酸塩、パーフルオロオクタン酸塩、アルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化セトリモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＢ）、ＣＨＡＰＳ、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、レシチン、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、グリセロールアルキルエステル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（例えばポリソルベート（例えばポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０等））、ソルビタンアルキルエステル、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマー、ポリエトキシ化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）のうちの１つ以上を含有する。

いくつかの実施形態では、溶液（例えば抗体溶液、活性化溶液、ブロッキング液、洗浄液等）は、目的に合わせた濃度のＴｗｅｅｎ（例えばＴｗｅｅｎ−２０）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、有益な濃度のＴｗｅｅｎ（例えばＴｗｅｅｎ−２０）及びＢＳＡが、マイクロ流体流路の全長に溶液を効率的に流すために利用される。いくつかの実施形態では、有益な濃度のＴｗｅｅｎ（例えばＴｗｅｅｎ−２０）及びＢＳＡが、マイクロ流体流路を介してメンブレンを活性化／濡れを提供するために利用される。いくつかの実施形態では、溶液は０．０１％から５％（例えば０．０１％…０．０２％…０．０５％…０．１％…０．２％…０．５％…１％…２％…５％）のＢＳＡを含有する。いくつかの実施形態では、溶液は０．０１％から５％（例えば０．０１％…０．０２％…０．０５％…０．１％…０．２％…０．５％…１％…２％…５％）のＴｗｅｅｎ（例えばＴｗｅｅｎ２０）を含む。いくつかの実施形態では、溶液は約０．１％のＢＳＡと約０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む。いくつかの実施形態では、溶液は０．１％のＢＳＡと０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む。

いくつかの実施形態では、溶液（例えばブロッキング、活性化、洗浄、抗体等）は、当業者によって理解されるであろうように、適切な塩、緩衝液、金属等を含む。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質と結合する抗体は、検出可能／観察可能部位及び／又は標識を使用することによって可視化及び／又は検出される。好適な標識及び／又は部位は、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、又は化学的手段で検出される。いくつかの実施形態では、一次抗体又は二次抗体は、検出部位に結合する。いくつかの実施形態では、検出は、例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシターゼなどを用いて酵素的に行われる。いくつかの実施形態では蛍光検出を利用する。本開示に有用であると見込まれる蛍光団としては、Ａｌｅｘａ色素（例えばＡｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４３０等）、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ等が挙げられる。当業者であれば、これら及び本明細書で述べられていない他の検出部位が、様々な実施形態でうまく使用できることを認識するであろう。

任意の抗体、抗体フラグメント、又は、特異的かつ安定に標的、検体、若しくは抗原と結合することが可能な他の分子は、本明細書に記載の一次抗体及び二次抗体としての使用を見出す（例えばデンドリマー、核酸、アフィニティータグ等）。本明細書に記載した実施形態は、試料のタンパク質成分を調べるために典型的には抗体（例えば一次抗体、二次抗体）を利用したが、本発明は抗体の使用に限定されない。実施形態は他の結合分子も包含すると広く解釈されるべきである。

Ｅ．用途
本発明の実施形態は、従来のウエスタンブロッティングが従来使用されてきたいずれの用途にも使用を見出す。更に、ウエスタンブロッティングのコスト、時間、試薬、処理速度、及び多重化能の限界が取り除かれたことから、本明細書に記載のデバイス及び方法は、従来のウエスタンブロッティングでは不十分だった、追加的な研究、臨床、診断、及び疫学的な用途で使用を見出する。例えば、シグナル伝達経路の迅速な並行プロファイルは、生物科学及び臨床医学において長い間求められてきた目標であった。これらのシグナル伝達経路のダイナミクスを十分に理解するためには、これらのタンパク質成分をプロファイルしなければならない。これらの成分は、典型的にはタンパク質イムノブロッティングによってプロファイルされる。従来のタンパク質イムノブロッティングは有力な手法ではあるものの、多量の試料を必要とすること、多量の抗体、及び分析処理速度の限界、を含む複数の欠点を有している。本発明のマイクロ流体イムノブロッティングデバイスによって、シグナル伝達経路のタンパク質成分の迅速かつ並行なプロファイルが提供される。本発明のデバイス及び方法の有用性は、細胞モデル及び臨床試料中の一般的な炎症シグナル伝達経路（例えばＮＦκＢ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、及びＭＡＰＫ）をプロファイルすることによって示された。本発明の実施形態の開発中に行われた実験は、マイクロ流体イムノブロッティングデバイスが、２８００分の１の抗体を用いて、多重化能を有しつつ、従来のタンパク質イムノブロッティングと同じ正確さで内在タンパク質をプロファイルできることを示す。更に、本発明のマイクロ流体デバイスは、一般的に入手できるイムノブロッティング装置と接続し、既存のタンパク質検出法と適合性がある。

実験
ここ１０年で、炎症は癌及び心臓病を含む慢性疾患のドライバーとして認識されてきた（Ｓａｌｅｈ ａｎｄ Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ ２０１１；Ｈａｎｓｓｏｎ ２００５；この全内容は参照により本明細書に包含される）。多くの調節段階が含まれるものの、タンパク質の修飾は炎症反応の特徴を規定している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ２０１０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ２００８；Ａｋｉｒａ ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ ２００４；この全内容は参照により本明細書に包含される）。炎症反応におけるタンパク質活性化の重要性の認識が高まったことから、これらの動的応答をモニタリングするための、より堅牢な技法の需要が高まっている。

材料及び方法
マイクロ流体タンパク質イムノブロッティング
ゲル電気泳動の後、ゲルをＰＶＤＦメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上へ３０Ｖで１時間ブロットした。エレクトロブロットしたＰＶＤＦメンブレンを、マイクロ流体イムノブロッティングに進める前に一晩乾燥した。マイクロ流体アセンブリは、ガラス支持体とＰＤＭＳマイクロ流体デバイスとの間にエレクトロブロットしたＰＶＤＦメンブレンを挟むことによって作成した。ＰＤＭＳマイクロ流体デバイスは、試料レーンの上に正確に流路が配置されるように、ラダーに位置合わせされた。組付けを完了するために、更に支持するための２つのスライドガラスをＰＤＭＳデバイスの上に置いた。２つのスライドガラス間の隙間は約０．５ｍｍであり、注入部位として使用された。活性化溶液と抗体溶液を２７Ｇ１／２の針を有する１ｍＬシリンジを用いて注入した。ＰＶＤＦメンブレンを、０．１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ ＴＢＳの溶液を用いてマイクロ流体流路を介して活性化した。一次抗体をマイクロ流体流路から注入し、１時間インキュベートした。一次抗体と二次抗体の両方の希釈液は、０．１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ ＴＢＳの溶液で調製した。

一次抗体のインキュベーションの後、マイクロ流体デバイスを取り除き、メンブレンを洗浄し、０．１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ ＴＢＳ中で１時間ブロックし、その後、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシターゼのいずれかで化学発光検出をする前に、二次抗体で１時間染色した。

ゲル電気泳動及びタンパク質イムノブロッティング
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）については、この治験審査委員会の研究への参加に同意した健常者に書面による同意書が提供された。ＰＢＭＣは、クエン酸ナトリウムが入ったＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ細胞調製チューブを用いて分離した。分離後、ＰＢＭＣ細胞溶解物を、後述するＲＩＰＡ緩衝液を用いて集めた。マウスマクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４．７）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、及び１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、密度３．０×１０６で培養した。細胞を４〜６時間付着させた後、培地を０．５％のＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補ったＲＰＭＩ培地に交換し、一晩インキュベートした（１４〜１８時間）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ５５：Ｂ５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ；Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で含有する０．５％ＦＢＳ培地中で細胞をインキュベートすることによって、エンドトキシン刺激を開始した。その後、細胞を集め、緩衝液１ｍＬ当たり１０μＬのＨａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）添加したＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、および１０ｍＭ ＮａＦ（フォスファターゼ阻害剤）、及び０．１％ＳＤＳを含有）を使用して細胞を溶解させた。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。その後、ＰＶＤＦメンブレンを、ａｃｔｉｖｅ−ＪＮＫ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ１／２；Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ａｃｔｉｖｅ−ＭＡＰＫ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ；Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＥＲＫ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＮＦ−κＢ ｐ６５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＳＴＡＴ３（ｓｃ−４８３，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対するウサギ抗体でプローブした。ホースラディッシュペルオキシターゼ又はアルカリホスファターゼヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：２００００の希釈で使用した。

結果
マイクロ流体デバイスの設計及び接続
ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）マイクロ流体デバイスは、既存のイムノブロッティング装置と接続するように設計された。長さ約８ｃｍ、幅６ｃｍのこのデバイスは、既存のウエスタンブロットのタンパク質レーン間の間隔に相当する間隔で隔てられた５つのレーンから構成された。各レーンには３つのマイクロ流体流路（長さ約６ｃｍ、幅１５０μＭ、深さ１００μＭ）が設けられていた。

装置は標準的なソフトリソグラフィー法を用いて作られた（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２００３）。簡潔に述べると、マイクロ流体デバイスの設計図が入ったＣＡＤファイルを用いて透明マスクをプリントした（ＣＡＤ／Ａｒｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｎｄｏｎ，ＯＲ）。透明マスクからシリコンマスター型を作るために、ソフトリソグラフィー法を使用した。マイクロ流体デバイスは、質量比１２：１でプレポリマーと硬化剤とを混合し（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ Ｋｉｔ，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）、次いでシリコンマスターに混合物を注ぎ込むことで形成した。混合中に生じた気泡を除去するために未硬化のデバイスを脱気し、その後６０℃で１時間硬化した。

手法は、ゲル電気泳動、ＰＶＤＦメンブレンへの転写、及びマイクロ流体デバイス（図１）を使用した標的タンパク質のイムノブロッティングの３つの段階からなる。我々のマイクロ流体デバイスが既存の装置と容易に接続できるように、最初の２段階は従来のイムノブロッティングと同様である。

試料の分離及び転写の後、ＰＶＤＦを乾燥させた。その後、ＰＶＤＦメンブレンをガラス支持体とＰＤＭＳマイクロ流体デバイスとの間に挟んだ。マイクロ流体からブロッキング液を注入し、２０分間放置することでＰＶＤＦメンブレンを活性化した。ＰＶＤＦメンブレンを活性化した後、一次抗体をマイクロ流体流路から注入し、１時間インキュベートした。一次抗体でインキュベートした後、マイクロ流体デバイスを取り外し、検出段階に進む前に、ＰＶＤＦメンブレンを洗浄し、ブロックした。一次抗体を検出するために、ＰＶＤＦメンブレン全体を適切な二次抗体でインキュベートし、アルカリホスファターゼ化学発光法又はホースラディッシュペルオキシド化学発光法のいずれかで検出した。

従来のイムノブロッティングとマイクロ流体イムノブロッティングの比較
我々のマイクロ流体イムノブロッティングデバイスの、従来のイムノブロッティングと比較した正確性を直接評価するために、健康なボランティアから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を集め、前述のように細胞溶解物を分離した。ゲル電気泳動及びそれに続くＰＶＤＦメンブレンへの転写を用いて、５及び０．５マイクログラムのタンパク質を分離した。ＮＦ−κＢ転写ファミリーのメンバーであるＲｅｌＡ（ｐ６５）に対する一次抗体を用いて、２つの異なる一次抗体希釈度及びタンパク質装填量で、マイクロ流体イムノブロッティングと従来のイムノブロッティングの間でシグナルを比較した（図２）。２つの装填量及び抗体希釈について、両方の手法で同様のｐ６５のシグナルが示された。重要なことには、従来のイムノブロッティングで使用されるのと同じ抗体希釈度を用いても、マイクロ流体デバイスで同様のシグナル強度が得られた。これらの実験で使用されたＰＶＤＦメンブレンのサイズでは、従来のイムノブロッティング法は、１つのタンパク質のために約１０ｍＬの一次抗体溶液を必要とする。マイクロ流体流路の寸法（０．０１５ｃｍ、０．０１０ｃｍ、及び６．０００ｃｍ）に基づくと、各流路は約０．０００９ｍＬの一次抗体溶液を必要とする。マイクロ流体デバイスを用いると、１つのタンパク質のためのＰＶＤＦメンブレン分析に０．００３６ｍＬの一次抗体溶液が必要とされる（４レーン×０．０００９ｍＬの抗体／レーン＝１つのタンパク質当たり０．００３６ｍＬの抗体）。控えめに見積もり、多重化能力を無視しても、マイクロ流体イムノブロッティングは、従来のタンパク質イムノブロッティングと比較して抗体量を約２８００分の１に倍減らすことになる。

炎症経路活性化及びタンパク質修飾のモニタリング
炎症経路は、多くの場合、シグナル伝達タンパク質の翻訳後修飾によって制御される（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ ２００８，２０１０；この全内容は参照により本明細書に包含される）。これらのタンパク質修飾をモニタリングすることは、炎症反応のダイナミクスを理解するために必要不可欠である。ＮＦ−κＢ転写ファミリーと同様に、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）ファミリーも極めて重要な炎症反応の伝達物質である（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．２００９；この全内容は参照により本明細書に包含される）。ＳＴＡＴファミリーメンバーは、サイトカイン及び成長因子に応答して、受容体関連キナーゼによってリン酸化される（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．２００７；この全内容は参照により本明細書に包含される）。タンパク質のリン酸化は、典型的にはタンパク質イムノブロッティングでモニタリングされるが、総タンパク質レベルの並行モニタリングも必要とされる。ＳＴＡＴ３活性化の状況では、タンパク質イムノブロッティングは、同じ試料からリン酸化と総ＳＴＡＴ３レベルの両方をモニタリングするために使用されなければならない。マイクロ流体デバイスは、同じ試料レーンから、リン酸化とタンパク質総量を同時にプロファイル可能なことから、これらのタイプの実験はマイクロ流体イムノブロッティングにとても適している。この能力について我々のマイクロ流体デバイスを評価するために、ＲＡＷ２６４．７細胞、マクロファージ細胞株を、２４時間、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間後、細胞溶解物を集め、マイクロ流体デバイス及び従来のイムノブロッティングを用いてｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ３をプローブした。従来のイムノブロッティングと同様に、マイクロ流体イムノブロッティングは、ＳＴＡＴシグナル伝達の炎症活性化と整合する、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３を検出した（図３）。

これらの結果は、マイクロ流体デバイスを、刺激応答に関連する翻訳後修飾をモニタリングするために使用できることを示唆している。メンブレンを除去する必要なしに同じ試料から複数のタンパク質をモニタリングできる性能によって、分析処理速度が大幅に向上され、これらのタイプのイムノブロット実験から導き出すことができる結論が補強される。

多成分炎症経路のモニタリング
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＲＫ）経路は、炎症反応を調整するもう一つの経路である（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｋａｒｉｎ ２００１；この全内容は参照により本明細書に包含される）。より詳しくは、ＭＡＰＫは、細胞外のシグナルを伝達し、細胞の増殖、分化、及びアポトーシスを含む様々な細胞応答を調整する、セリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼである。この経路をモニタリングすることの難しさの一つは、これが異なる活性化パターンを有する複数のタンパク質成分を有することである。これらの複雑さのため、従来のイムノブロッティングでＭＡＰＫ経路をモニタリングすることは、時間及びリソースを要するものであった。

本発明のマイクロ流体イムノブロッティング法の特有な態様の１つは、ＰＤＭＳマイクロ流体デバイスとＰＶＤＦメンブレンとの間の接続である。効果的接続を達成するためには、活性化溶液の組成と持続時間が重要なパラメータである。ＰＤＭＳデバイスとＰＶＤＦメンブレンとの間に効果的な密閉を維持するためには、従来のイムノブロッティングで使用される最初のブロッキング段階が省かれる。しかし、いくつかの抗体の交差反応性とブロッキング段階省略のため、マイクロ流体イムノブロッティングでは、従来のイムノブロッティングに比べて、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の複雑さのため悪化するであろう非特異的シグナルがより多くなる可能性があった。我々のマイクロ流体デバイスの多成分をモニタリングする能力を評価するために、ＭＡＰＫ経路、ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で４５分間インキュベートし、上述のように細胞溶解物を集めた。試料をｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ、及び総ＥＲＫについて、従来のイムノブロッティング及びマイクロ流体タンパク質イムノブロッティングでプローブした（図４）。３つの異なるＰＶＤＦメンブレンを必要とする従来のイムノブロッティングとは対照的に、マイクロ流体法は、半分のＰＶＤＦメンブレンからの２つの試料レーンのみを用いて、これらのタンパク質成分の同時モニタリングをすることが可能であった。同じ試料から総ＥＲＫを同時にプローブすることによって、従来のイムノブロッティングと比較して時間、リソース、及びばらつきが最小限にされた。重要なことには、マイクロ流体イムノブロッティング法中のブロッキング段階を取り除いても、両方の手法で等しいバックグラウンドであった。

マイクロ流体イムノブロッティング法の柔軟性は、他の一般的に使用されている化学発光検出法を用いて評価された。ホースラディッシュペルオキシターゼ及びアルカリホスファターゼ共に優れた感度を有している。しかし、この高い感度がこれらをバックグラウンドノイズに影響され易くもしている。上と同じ細胞溶解物及びＭＡＰＫ抗体を用いてマイクロ流体イムノブロットを処理した。その後、一次抗体を検出するためにホースラディッシュペルオキシターゼ二次抗体を使用した。ＨＲＰ検出の有効性は、マイクロ流体イムノブロッティングデバイス（図４）を用いたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）検出と同等であり、この手法の有用性を更に拡げるものであった。

本出願で述べた及び／又は以下に列挙する全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に包含される。記載されている特徴及び実施形態の様々な修正、組み換え、および変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなしに当業者に明らかであろう。特定の実施形態について記載してきたが、請求される発明はこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際は、関連分野の当業者に自明な、述べられている様式及び実施形態の様々な修正が以下の請求項の範囲に含まれることが意図される。

参考文献
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Claims (25)

1. 平らなメンブレン接触表面と、複数の非接続の平行なマイクロ流体流路とを含むマイクロ流体イムノブロッティングデバイスであって、前記マイクロ流体流路の全長は前記メンブレン接触表面に開口している、前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
2. 前記マイクロ流体流路が、２つ以上の流路セットに空間的にグループ化されている、請求項１に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
3. 前記２つ以上の流路セットのそれぞれが２〜２０個のマイクロ流体流路を含む、請求項２に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
4. １つの流路セットでマイクロ流体流路を隔てる距離が、前記流路セット間の距離よりも小さい、請求項３に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
5. 前記マイクロ流体流路のそれぞれが前記マイクロ流体流路の一端にリザーバーを含む、請求項１に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
6. 前記マイクロ流体流路のそれぞれが幅１００〜２００μｍである、請求項１に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
7. 前記マイクロ流体流路のそれぞれが幅１４０〜１６０μｍである、請求項６に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
8. 前記マイクロ流体流路のそれぞれが深さ５０〜１５０μｍである、請求項１に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
9. 前記マイクロ流体流路のそれぞれが深さ９０〜１１０μｍである、請求項１に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
10. 前記デバイスがポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む、請求項１に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
11. 前記デバイスが本質的にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる、請求項１に記載の前記マイクロ流体イムノブロッティングデバイス。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のデバイスを用いてメンブレンに抗体溶液を塗布することを含む、イムノブロッティング方法。
13. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のデバイスと、メンブレンとを含むシステム。
14. 前記デバイスと前記メンブレンとの間に更に活性化溶液を含む、請求項１３に記載の前記システム。
15. 前記活性化溶液がＴｗｅｅｎ−２０及びＢＳＡを含有する、請求項１４に記載の前記システム。
16. 前記活性化溶液が０．０５〜０．１５％のＴｗｅｅｎ−２０と０．０５〜０．１５％のＢＳＡとを含有する、請求項１５に記載の前記システム。
17. 前記活性化溶液が０．１％のＴｗｅｅｎ−２０と０．１％のＢＳＡとを含有する、請求項１６に記載の前記システム。
18. 前記メンブレンがニトロセルロースメンブレン又はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンを含む、請求項１３に記載の前記システム。
19. 前記メンブレンが、その上又はその中に、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含む、請求項１３に記載の前記システム。
20. 前記マイクロ流体流路の中に１種以上の抗体含有溶液を更に含む、請求項１３に記載の前記システム。
21. １つの流路セットの各マイクロ流体流路が異なる抗体含有溶液を含む、請求項２０に記載の前記システム。
22. 各流路セットが同じ組み合わせの抗体含有溶液を含む、請求項２１に記載の前記システム。
23. 各マイクロ流体流路が異なる抗体含有溶液を含む、請求項２０に記載の前記システム。
24. 請求項１３〜２３のいずれか１項に記載のシステムを使用してメンブレンに抗体溶液を塗布することを含む、イムノブロッティング方法。
25. （ａ）タンパク質を試料からメンブレン上に転写することと；
    （ｂ）マイクロ流体イムノブロッティングデバイスのメンブレン接触面を前記メンブレン上に置くことと；
    （ｃ）前記デバイスのマイクロ流体流路に活性化緩衝液を注入することと；
    （ｄ）前記デバイスの前記マイクロ流体流路に一次抗体溶液を注入することと；
    （ｅ）前記抗体溶液での抗体の前記タンパク質との結合を検出することと
    を含む、イムノブロッティング方法。