JP2016507726A - 造影剤としての、増加した表面増強ラマン散乱特性を有する封入色素コーティング貴金属ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
本発明の開示は、造影剤として使用するための純粋な材料の光学特性よりも優れた光学特性を有する半導体-金属複合体ナノ粒子を提供する。複合体は、貴金属ナノ粒子の表面に結合しているリンカー分子の層と、リンカー分子の層に結合している色素分子の層とを有する貴金属ナノ粒子を含む。色素分子が、貴金属ナノ粒子に結合した場合、個々の色素分子と比較して集団的吸収バンドシフトを示す規則構造を形成するように選択される。この構造は、規則構造ではない形で結合している色素分子を有するナノ粒子と比較して増強されたラマン散乱を示す、バイオセンシング及び他の検出用途に対して適切な特性を有するマルチシェル構造を形成する安定化コーティング層内に封入される。【選択図】図１Ｃ
Description
本発明は、造影剤としての、増加した表面増強ラマン散乱(SERS)特性を有する色素コーティング貴金属ナノ粒子のための方法、及び脂質二重層内に封入され、標的結合剤が脂質層の外面に結合している場合のこれらの造影剤としての使用に関する。
造影剤は、特色のある局所的状態の特性を有する分子及び超分子の標的又は領域の識別を補助するために使用される。標的とされる種の非限定的例は、タンパク質、多糖、ポリ核酸及び他の分析物、又は環境特性である。状態特性の非限定的例として、特徴的なpH、温度、及び溶媒品質が挙げられる。標的とされる分子又は状態は、他の物質のバックグラウンドで観察するのが困難なことがあり、造影剤はこの識別を容易にする。1つの例は、他の種類の細胞表面タンパク質の存在下での、ある特定の種類の細胞表面タンパク質である。多くの場合このようなタンパク質は、健康状態のマーカーであり、これらの識別は診断、治療の決定又は健康状態の進行のモニタリングを補助することができる。造影剤は、他の種、例えば、化学的脅威又は生物学兵器剤（biological warfare agents）及び化学兵器剤（chemical warfare agents）などを検出するために使用することができる。
光を使用して機能する光造影剤は、これらを利用する技術が、例えば、サンプリング装置と組み合わせた光学顕微鏡又は分光光度計など、比較的シンプルなものであってよいので興味深い。より明るい光造影剤は、明るくない光造影剤よりも容易に検出することができる。したがって、より明るい粒子を創製する方法は貴重である。簡単に多重化できる、これは同じ試料上で複数の種類の造影剤を使用することによって、複数の標的の存在及び数を同時に検出することができることを意味するが、このような造影剤を有することが有用である。例えば2種類以上のタンパク質の種類及び数を単細胞の表面上で検出することができ、これによって、細胞の状態及び個体の健康との関連性を識別することにおいて改善が生じ得る。他の異なる造影剤の存在下で使用することができる光造影剤を意味する、多重化できる光造影剤はしたがって貴重である。
プラズモンナノ材料、及び表面増強した化学的及び生物学的センサーにおけるこれらの有用性は、これらのサイズ依存性光学特性及び標的特異性造影剤としての可能性により、過去20年間多大な関心を集めてきた。表面増強ラマン分光法(SERS)は最も広く研究され、単一分子の検出の可能性を提供する。
ラマン散乱ナノ粒子は、例えば、大部分の蛍光性造影剤よりも鋭い光学的痕跡を示すことから、光造影剤として潜在的に有用である。これは、ラマン散乱ナノ粒子は、原則として、高度に多重化することができることを意味する。しかし、単離した分子によるラマン散乱は弱く、したがってより明るい又はさらに強く散乱するラマンの造影剤を創製する方法が有用である。
ラマン散乱ナノ粒子は、感受性の検出ラベルとして多大な有望性を有する。しかし、複雑な設計基準、例えば、結合特異性、生物学的環境における頑強なコロイド安定性、及び光学的感度などにより、この広範囲におよぶ研究の結果生成された商業的に実行可能なセンサーシステムはほとんどない。
活性のあるプラズモンとはプラズモンと相互作用できる物質とカップリングしたプラズモン構造として定義されるが、この活性のあるプラズモンは、より明るいSERS信号の必要性に対処するための次世代プラットフォームとして、特にこの数年間かなりの関心が集まっている。J凝集体、ローダミン6G、シトクロムc、ポルフィリン誘導体、及び宿主-ゲスト電荷移動複合体はすべてプラズモンナノ構造にカップリングすることによって、ずっと明るい表面増強共鳴ラマン(SERRS)信号を誘発することに成功している。分子状共鳴及びプラズモン共鳴を励起場と一緒にカップリングさせるために波長マッチング手法を利用した場合さらに大きな増強が達成された。複数の共鳴実体の適当な協調によって、より明るいSERSベースのセンシングプラットフォームのための強力なツールが提供される。しかし、これらの他の手法は光学的明るさに対するいくつかの改善を実証したが、頑強な及び安定した検出ラベル様式への取込みは達成されていない。
検出様式としてのナノ粒子の実用的な使用のため、様々な溶液中での安定性及び貯蔵寿命が最高に重要である。水中では、これらの粒子は望ましい特性を示し得るが、生物学的媒体又は緩衝液に入れた場合、これらは極めて急速に凝集する傾向があり、その結果光学特性が大きく減弱する。多くの場合、より小さな粒子は、静電により生じる、すなわち帯電した種又はタンパク質が溶液及び粒子の周りに導入された際の凝集に対してより強い耐性を有するため、複雑な表面の化学に利用される。しかし、より小さな粒子のプラズモン共鳴はずっと弱いので、複合粒子を造影剤として有用にするため、粒子安定性と有効な光学的明るさとの間に有効なトレードオフが生じる。
より大きな、SERS活性のあるナノ粒子の長期安定性を増加させるいくつかの方式が提案され、最も好評なものはラマン色素と共に粒子表面に様々なPEG鎖長を共吸着させることである。最近になって、粒子を取り囲む安定化コーティング層内へのラマン色素の封入が直径60nmの比較的大きな粒子に対して利用された。これらの安定化層は、無機酸化物、例えば、ケイ素若しくはチタンなど、又は有機の自己集合構造、例えば、脂質ベシクルなどからなることができる。これらの複合粒子は、この安定化コーティングが標的とする機能性及び他の表面化学反応に対する多目的プラットフォームを提供しながら、生物学的媒体内での粒子の凝集を防止することから、常温保存可能な(shelf-stable)、生物学的に適合性のあるバイオセンサーとして多大な有望性を示す。
本発明の開示は、増強ラマン散乱のための励起子半導体貴金属複合体（excitonic semiconductor noble metal composite）ナノ粒子であって、
表面を有する貴金属ナノ粒子と、
貴金属ナノ粒子の表面に結合しているリンカー剤の層と、
吸収バンドを有し、リンカー剤の層に結合している色素分子の層であり、前記色素分子が、貴金属ナノ粒子に結合した場合、集団的吸収バンドシフトを示す規則構造を形成するように選択される、色素分子の層と、
封入複合体ナノ粒子を生成するための、リンカー層及び色素分子の規則構造を有する、貴金属ナノ粒子を封入している安定化コーティング層と
を含み、
前記封入複合体ナノ粒子が、色素分子が前記規則構造ではない形で結合しているナノ粒子と比較して増強されたラマン散乱を示す、複合体ナノ粒子を提供する。
表面を有する貴金属ナノ粒子と、
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前記封入複合体ナノ粒子が、色素分子が前記規則構造ではない形で結合しているナノ粒子と比較して増強されたラマン散乱を示す、複合体ナノ粒子を提供する。
本発明の機能的及び有利な態様のさらなる理解は、以下の詳細な説明及び図を参照して実現することができる。
本発明の好ましい実施形態が、例としてのみ図を参照して、ここに記載される。
スキーム1は、マルチシェルのJ凝集したプラズモンナノ粒子の合成を示している。色素及びリンカーは、一段階でコンジュゲートされ、その後脂質はDEC221脂質製剤で封入される。次いで粒子は分析前に遠心分離を介して洗浄される。
一般的に言えば、本明細書に記載されている実施形態は、増加したSERS信号を示す規則構造を色素が形成する、脂質封入した色素をコーティングした貴金属複合体ナノ粒子を対象とする。必要に応じて、本発明の実施形態は本明細書で開示されている。しかし、開示された実施形態は単に例示にすぎず、本発明は多くの様々な及び代替の形態で実施されてもよいことを理解されたい。
図は正確な縮尺ではなく、特定の構成要素の詳細を示すために、いくつかの特徴が誇張され、又は最小化されていてもよい一方で、新規の態様が不明瞭とならないよう関連する構成要素が排除されていてもよい。したがって、本明細書で開示されている特定の方法、構造上及び機能的な詳細は、限定的ではなく、単に特許請求の範囲に対する根拠として、及び本発明を様々に利用するよう当業者に教示するための代表的な根拠として解釈されるものとする。
定義
本明細書で使用する場合、用語「約」及び「およそ」は、濃度、温度又は他の物理的若しくは化学的特性又は特徴の範囲と関連して使用する場合、特性/特徴の範囲の上限及び下限に存在し得るわずかな変動も包含することを意図する。
本明細書で使用する場合、用語「約」及び「およそ」は、濃度、温度又は他の物理的若しくは化学的特性又は特徴の範囲と関連して使用する場合、特性/特徴の範囲の上限及び下限に存在し得るわずかな変動も包含することを意図する。
本明細書で使用する場合、用語「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(includes)」及び「含めた(including)」は、包含的であり、開放式であり、排他的ではないものと解釈される。具体的には、特許請求の範囲を含む本明細書の中で使用される場合、用語「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(includes)」及び「含めた(including)」並びにこれらの変化形は、特定された特徴、ステップ又は成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ又は成分の存在を排除すると解釈されてはならない。
本明細書で使用する場合、単語「リンカー」又は語句「リンカー分子」は、分子又は分子の凝集シェルを金属ナノ粒子に結合する種を指す。
本明細書で使用する場合、単語「結合している」は、共有結合又は非共有結合で結合していることを意味し、したがって、これらに限定されないが、電子が共有されている、又は静電している結合、及び電子が共有されていなくてもよいvan der Waals相互作用を含む。
本明細書で使用する場合、語句「自己集合」又は「超分子の自己組織」は、外部の指示なしに、予め存在する成分の無秩序なシステムが、成分自体の間での特定の、局所的相互作用の結果として、組織化した構造又はパターン形成するタイプのプロセスを指す。構成する成分が分子である場合、このプロセスを、超分子の自己組織又は分子の自己集合と呼ぶ。
本明細書で使用する場合、語句「J凝集体」は、個々の色素分子が凝集して規則構造を形成する場合、より鮮明な(すなわちより高い吸収係数)長い波長へシフトする(すなわち深色移動)吸収バンドを有する任意のタイプの色素を指す。凝集は、超分子の自己組織又は自己集合の結果、溶媒、添加剤又は濃度の影響により誘発され得る。
本明細書で使用する場合、語句「H凝集体」は、凝集の際により短い波長へシフトする(すなわち浅色移動)吸収バンドを有する任意のタイプの色素を指す。上述のように、凝集は、超分子の自己組織の結果、溶媒、添加剤又は濃度の影響により誘発される。
本発明は、マルチシェルナノ構造は、金属ナノ粒子の表面に結合した(又は金属ナノ粒子の表面に直接結合しているリンカー層に結合した)場合、個々の色素分子の吸収バンドに対して、集団的吸収バンドシフトを示す規則構造を形成する貴金属ナノ粒子及び色素で構成されるという発見に基づく。これらの多層構造は、比類なく安定した及び光学的に明るいセンシングプラットフォームとして利用することができる新規の非直線性の光学特性を示す。この秩序化した色素構造と関連して使用する場合、金属ナノ粒子のSERS応答を改善するために波長マッチング手法を利用することが可能である。
特に、発明者らは、適当な波長で照射された場合、ENZ現象の結果として、色素の規則構造(単分子膜)内に電界を強く閉じ込めることができることを示した。発明者らは、共鳴実体間の有効距離を変化させることによって、電界強度の結果として、SERS信号を実験的に検証した。粒子に対する距離の作用は、共振波長及び非共振波長の両方において実験により実証されている。
本発明の基礎は、例示的色素、すなわちJ凝集体を形成する色素を使用した、増強した作用のモデリングを示すことで、これより以下に提示される。J凝集体は、最もよく研究された利用可能な共鳴励起子の種のうちの1種である。十分に高濃度で、又はさもなければ適切な状態、例えば、適切に帯電した表面などで、特定のシアニン色素分子は自己集合してJ凝集体となる。J凝集体は、それぞれのモノマー性バンドから赤色移動し、これによって、凝集体内に集団的励起子を生成する集団的吸収応答を生成する。これらの色素がJ凝集体集合体内の貴金属ナノ粒子上に吸着した場合、集団的励起子は、表面プラズモンにカップリングし、これらの相対的なエネルギー準位の位置に応じて、破壊的及び建設的干渉を行うことができる。超高速の一過的な吸収状態の分光分析並びに理論量子の機械的処理により、励起子とプラズモンとの間に弱いタイプと強いタイプの両カップリング状態が存在することが検証された。様々なプラズモンナノ構造を有するこれらの分子の共鳴は、予想可能なスペクトルオーバーラップ及びエネルギーカップリングが可能であることが以前に実証され、示された。方向性及び吸着速度論はまた最近になって、チオール金属結合及び静電タイプの吸着の両方を用いて詳細に研究された。
イプシロンゼロ近傍(ENZ)作用は最近になって、様々な低波長の光学特性を調整するための方式として、メタマテリアルの分野において関心を集めてきた。この作用は、SERS生成ナノ粒子に対して極めて大きな増強要素を付与することが予測された。本開示において、発明者らは、SERS感応性プラットフォームを調製するために金属ナノ粒子と一体となって使用されるENZ J凝集体材料の最初の使用を提示する。
ここで、本発明者らは、慣習的には良好なラマンリポーターではないが、そのラマン散乱の大きな増加を生じるために開発された、他の独特な及び有用な光学特性及び電気特性を有する色素を利用している。
本発明の好ましい実施形態において使用される色素は3,3'-ジスルホプロピル-5,5'-ジクロロ-9-エチル-チアカルボシアニンナトリウム塩(TC)である。図1は、J凝集体形成色素、3,3'-ジスルホプロピル-5,5'-ジクロロ-9-エチル-チアカルボシアニンナトリウム塩(TC)の分子構造を示している。しかし、適切な条件下で、最も一般的には、高濃度において、多価カチオン性の塩の存在、又はカチオン性の表面は、色素の自己集合を促進させてJ凝集体にする。J凝集体が特別なのは、J凝集体は、凝集体内のΠスタックした環の間で集団的に共有された励起子の励起により生じる、それ自体の吸収バンドを有することである。この吸収は極めて鋭く、狭い。
色素を自己集合させて、プラズモンナノ粒子上でJ凝集体にすることができる場合、J凝集体からの励起子は、これらが互いに十分近くに存在する、すなわち、Fano共鳴として公知である状態にあることを前提として、貴金属ナノ粒子のプラズモンにカップリングすることができることが以前に示された。
実験法
材料
アセチルチオコリン、硝酸銀、クエン酸ナトリウム(99.0%)及びテトラクロロ金(III)酸(hydrogen tetracholoroaurate)をSIGMA-Aldrich Co.(Canada)から購入した。酢酸ウラニル無水物(Uranyl acetate dehydrate)をTed Pella, Inc.(USA)から購入した。N,N,N-トリメチル-(11-メルカプトウンデシル)アンモニウムクロリド(TMA)をProChimia Surfaces sp z o.o.(Poland)から購入した。TC、3,3'-ジスルホプロピル-5,5'-ジクロロ-9-エチル-チアカルボシアニンナトリウム塩(TC)を、Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.(Japan)から注文した。ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、卵のスフィンゴミエリン(ESM)、及びヒツジのコレステロール(Chol)を、Avanti Polar Lipids(USA)から入手した。すべての化学薬品は入手してそのまま使用した。水をMillipore Milli-Q waterシステムを用いて、18.2MΩ・cmに精製した。すべてのガラス器具は、ピランハ洗浄した。
材料
アセチルチオコリン、硝酸銀、クエン酸ナトリウム(99.0%)及びテトラクロロ金(III)酸(hydrogen tetracholoroaurate)をSIGMA-Aldrich Co.(Canada)から購入した。酢酸ウラニル無水物(Uranyl acetate dehydrate)をTed Pella, Inc.(USA)から購入した。N,N,N-トリメチル-(11-メルカプトウンデシル)アンモニウムクロリド(TMA)をProChimia Surfaces sp z o.o.(Poland)から購入した。TC、3,3'-ジスルホプロピル-5,5'-ジクロロ-9-エチル-チアカルボシアニンナトリウム塩(TC)を、Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.(Japan)から注文した。ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、卵のスフィンゴミエリン(ESM)、及びヒツジのコレステロール(Chol)を、Avanti Polar Lipids(USA)から入手した。すべての化学薬品は入手してそのまま使用した。水をMillipore Milli-Q waterシステムを用いて、18.2MΩ・cmに精製した。すべてのガラス器具は、ピランハ洗浄した。
銀ナノ粒子(NP)の合成
銀ナノ粒子(AgNP)の合成は、Meisel及びLee(Lee, P.C.; Meisel, D.J. Phys. Chem. 1982, 86, 3391-3395)により報告された手順に従った。簡単に説明すると、6mgのAgNO3を33.3mLのH2O中に溶解し、煮沸させ、この時点で666μLの1%クエン酸ナトリウムを加えた。溶液を1時間還流させてから、加熱をやめた。最終生成物は、不透明な緑がかった黄色であった。これらを水中1:3で希釈し、使用するまで4℃で保存した。
銀ナノ粒子(AgNP)の合成は、Meisel及びLee(Lee, P.C.; Meisel, D.J. Phys. Chem. 1982, 86, 3391-3395)により報告された手順に従った。簡単に説明すると、6mgのAgNO3を33.3mLのH2O中に溶解し、煮沸させ、この時点で666μLの1%クエン酸ナトリウムを加えた。溶液を1時間還流させてから、加熱をやめた。最終生成物は、不透明な緑がかった黄色であった。これらを水中1:3で希釈し、使用するまで4℃で保存した。
チオコリン(TMAT)の合成
Pengら(Peng, L.; Zhang, G.; Zhang, D.; Xiang, J.; Zhao, R.; Wang, Y.; Zhu, D. Org. Lett. 2009, 11, 4014-7)と同様の方式で、市販のアセチルチオコリンの単純な酸加水分解によりTMATを合成した。500mgのアセチルチオコリンを15mLの無水エタノール及び4mLの37%HCl中に溶解した。撹拌しながら、溶液を100℃で7時間還流させ、この後で、溶液を30分間冷却させた。過剰の溶媒を減圧下で回転蒸発により除去した。チオコリンの再結晶化をH2O/イソプロパノール/エーテル(0.5mL/5mL/25mL)の溶媒系の中で行った。その後、溶液を氷浴中で20分間冷やし、濾過で回収し、25mLのエーテルで洗浄し、次いで乾燥させておいた。生成した白色生成物(本明細書ではTMATと呼ぶ)をデシケーター内で一晩乾燥させ、アルゴン下、-20℃で保存した。生成物の構造を、およそ90%の純度でNMRにより確認した(提出データを参照されたい)。1H NMR(400MHz, D2O)δ3.76(t, J=8Hz、2H)3.23(m, 11H)。
Pengら(Peng, L.; Zhang, G.; Zhang, D.; Xiang, J.; Zhao, R.; Wang, Y.; Zhu, D. Org. Lett. 2009, 11, 4014-7)と同様の方式で、市販のアセチルチオコリンの単純な酸加水分解によりTMATを合成した。500mgのアセチルチオコリンを15mLの無水エタノール及び4mLの37%HCl中に溶解した。撹拌しながら、溶液を100℃で7時間還流させ、この後で、溶液を30分間冷却させた。過剰の溶媒を減圧下で回転蒸発により除去した。チオコリンの再結晶化をH2O/イソプロパノール/エーテル(0.5mL/5mL/25mL)の溶媒系の中で行った。その後、溶液を氷浴中で20分間冷やし、濾過で回収し、25mLのエーテルで洗浄し、次いで乾燥させておいた。生成した白色生成物(本明細書ではTMATと呼ぶ)をデシケーター内で一晩乾燥させ、アルゴン下、-20℃で保存した。生成物の構造を、およそ90%の純度でNMRにより確認した(提出データを参照されたい)。1H NMR(400MHz, D2O)δ3.76(t, J=8Hz、2H)3.23(m, 11H)。
Ag/リンカー/TCナノ粒子の調製
撹拌しながら、62.5μLの1mM TCを800μLのAgNPに加えた。別々に、62.5μLの1mM TMAT又はTMAを325μLの脱イオン水にそれぞれ加え、撹拌した。次いでリンカー溶液をAu/TC撹拌溶液に加え、一晩撹拌させておいた。
撹拌しながら、62.5μLの1mM TCを800μLのAgNPに加えた。別々に、62.5μLの1mM TMAT又はTMAを325μLの脱イオン水にそれぞれ加え、撹拌した。次いでリンカー溶液をAu/TC撹拌溶液に加え、一晩撹拌させておいた。
脂質の調製
Ipら(Ip, S.; Maclaughlin, C. M.; Gunari, N.; Walker, G. C. Langmuir 2011, 27, 7024-7033)により報告されたプロトコルの通り、脂質を調製した。簡単に説明すると、3:1のクロロホルム/メタノール溶液中で、DOPC、ESM及びCholを2:2:1モル比(DEC221)でそれぞれ混合し、最終質量10.7mgにした。1ミリグラム分注画分をガラスバイアル内に入れ、溶媒が蒸発するまでアルゴンガス流の下で乾燥させると、脂質の膜が各バイアルの底部で目視可能となった。バイアルを真空下で一晩放置して乾燥させることによって、残存するあらゆる溶媒を除去し、次いでアルゴンを充填し戻し、キャップをした。DEC221脂質は使用するまで-20℃で保存した。
Ipら(Ip, S.; Maclaughlin, C. M.; Gunari, N.; Walker, G. C. Langmuir 2011, 27, 7024-7033)により報告されたプロトコルの通り、脂質を調製した。簡単に説明すると、3:1のクロロホルム/メタノール溶液中で、DOPC、ESM及びCholを2:2:1モル比(DEC221)でそれぞれ混合し、最終質量10.7mgにした。1ミリグラム分注画分をガラスバイアル内に入れ、溶媒が蒸発するまでアルゴンガス流の下で乾燥させると、脂質の膜が各バイアルの底部で目視可能となった。バイアルを真空下で一晩放置して乾燥させることによって、残存するあらゆる溶媒を除去し、次いでアルゴンを充填し戻し、キャップをした。DEC221脂質は使用するまで-20℃で保存した。
脂質によるナノ粒子の封入は、DEC221の多層ベシクル(MLV)の懸濁液中でナノ粒子を50℃で45〜60分間超音波処理することによって達成した。
J凝集体/ナノ粒子複合体の脂質封入
封入前に、DEC221を解凍し、濃度1mg/mLに水で水和した。次いで脂質を50℃の水浴内で温めた。多層状のベシクル懸濁液が形成されるまで、10分間おきに30分間脂質をボルテックス混合により撹拌した。次いで、1mLの粒子を1mLのDEC221に添加し、50℃で60分間又は透明になるまで超音波処理することによって、機能化したナノ粒子を封入した。これらの条件下、粒子の不在下でMLVを超音波処理することにより、直径100nm未満の単層ベシクル(ULV)が生成することが示されている(Lapinski, M. M.; Castro-Forero, A.; Greiner, A. J.; Ofoli, R. Y.; Blanchard, G. J. Langmuir 2007, 23, 11677-11683及びMaulucci, G.; De Spirito, M.; Arcovito, G.; Boffi, F.; Castellano, A. C.; Briganti, G. Biophys. J. 2005, 88, 3545-3550を参照されたい)。この変換は、目視により観察することができる。ULV懸濁液中のベシクルのサイズが可視光の回折限界よりも小さくなり、結果的にMLV懸濁液よりも有意に少ない光が散乱することから、MLV懸濁液は濁っているようにみえるが、ULV懸濁液はほぼ透明にみえる。ここで、金属ナノ粒子の存在下でのMLV懸濁液の超音波処理により、脂質二重層で封入されているナノ粒子が生成することが実証される。
封入前に、DEC221を解凍し、濃度1mg/mLに水で水和した。次いで脂質を50℃の水浴内で温めた。多層状のベシクル懸濁液が形成されるまで、10分間おきに30分間脂質をボルテックス混合により撹拌した。次いで、1mLの粒子を1mLのDEC221に添加し、50℃で60分間又は透明になるまで超音波処理することによって、機能化したナノ粒子を封入した。これらの条件下、粒子の不在下でMLVを超音波処理することにより、直径100nm未満の単層ベシクル(ULV)が生成することが示されている(Lapinski, M. M.; Castro-Forero, A.; Greiner, A. J.; Ofoli, R. Y.; Blanchard, G. J. Langmuir 2007, 23, 11677-11683及びMaulucci, G.; De Spirito, M.; Arcovito, G.; Boffi, F.; Castellano, A. C.; Briganti, G. Biophys. J. 2005, 88, 3545-3550を参照されたい)。この変換は、目視により観察することができる。ULV懸濁液中のベシクルのサイズが可視光の回折限界よりも小さくなり、結果的にMLV懸濁液よりも有意に少ない光が散乱することから、MLV懸濁液は濁っているようにみえるが、ULV懸濁液はほぼ透明にみえる。ここで、金属ナノ粒子の存在下でのMLV懸濁液の超音波処理により、脂質二重層で封入されているナノ粒子が生成することが実証される。
あらゆる測定が行われる前に、すべての色素-脂質-粒子の生成物に2つの清浄ステップを施した。各清浄ステップは、デスクトップの微量遠心機を4500RPMで5分間使用した粒子/ベシクル懸濁液の遠心分離を含んだ。これによって粒子は微小遠心管の底部に沈降し、上清を除去し、別の容器内に保持した。次いで粒子を18MΩ-cmの同じ濃度の水中に再懸濁させた。
装置類及び測定
Varian Cary5000UV-Vis-NIR分光光度計でUV-Vis分光法を実施した。粒子を1cmの経路長の黒色壁のキュベット内に配置し、18.2MΩ・cmの水をブランクとして使用して、スキャン速度240nm/秒でスペクトルを採取した。スペクトルを使用して、銀ナノ粒子上でのプラズモンシフト及びJ凝集体のくぼみ又はピークをそれぞれ確認した。
Varian Cary5000UV-Vis-NIR分光光度計でUV-Vis分光法を実施した。粒子を1cmの経路長の黒色壁のキュベット内に配置し、18.2MΩ・cmの水をブランクとして使用して、スキャン速度240nm/秒でスペクトルを採取した。スペクトルを使用して、銀ナノ粒子上でのプラズモンシフト及びJ凝集体のくぼみ又はピークをそれぞれ確認した。
100kVで作動するHitachi H-7000TEM機器で、透過型電子顕微鏡法(TEM)を実施した。格子上に粒子を含有する水溶液の小滴を配置することによって、試料を調製した。2%酢酸ウラニル溶液の小滴を、格子上のより大きなものに加え、次いでこれを風乾させた。
研究等級のLeica顕微鏡及び50×長距離対物レンズを備えたRenishaw InVia共焦点ラマン分光計上でラマン測定を行った。コヒーレント407nm及び514nmレーザーを使用した。データをWiRe2.0で採取し、GRAMS Suiteソフトウエアで分析した。
理論的方法
FDTD溶液(Lumerical Inc)を使用した、有限差分時間領域計算を使用して、ハイブリッドナノ構造の光学的応答を調査した。J凝集体状態でのTC色素の減衰断面積を介してTC色素の誘電体関数を得た。これは二価のカチオン性塩を10μmのTC水溶液中で滴定することによって簡単に達成し、これによって、塩濃度が1mMに到達するとほぼ完全なJ凝集体の形成が生じた。
FDTD溶液(Lumerical Inc)を使用した、有限差分時間領域計算を使用して、ハイブリッドナノ構造の光学的応答を調査した。J凝集体状態でのTC色素の減衰断面積を介してTC色素の誘電体関数を得た。これは二価のカチオン性塩を10μmのTC水溶液中で滴定することによって簡単に達成し、これによって、塩濃度が1mMに到達するとほぼ完全なJ凝集体の形成が生じた。
薄いスペーサー及びJ凝集体層の正確なモデリングのため、0.3nmのメッシュサイズを使用する。最小の反射に対して完全にマッチさせた層(PML)によりシミュレーションドメインを終結した。ハイブリッド構造の吸収及び散乱断面を計算するために、全電磁場散乱場(TFSF)の形式を利用した。
結果及び考察
理論的結果
FDTD計算では、Palikの実験データ(Palik, E. D. Handbook of Optical Constants of Solids; Academic press, 1998; Vol.3)への適合により銀コアをモデル化する一方で、以下の通り与えられたLorentzライン形状を使用してJ凝集体の誘電定数、εjaggをモデル化する
理論的結果
FDTD計算では、Palikの実験データ(Palik, E. D. Handbook of Optical Constants of Solids; Academic press, 1998; Vol.3)への適合により銀コアをモデル化する一方で、以下の通り与えられたLorentzライン形状を使用してJ凝集体の誘電定数、εjaggをモデル化する
(式中、fは減衰した振動強度であり、ω0は共鳴角周波数を表し、γjaggは線幅である)。実験の減衰データに対して最良適合を生じるモデル化したJ凝集体層の誘電率が図1aに示されている。以下のパラメーターが、実験データへの最良適合をもたらした:f=0.33、ω0=4.023×1015、γjagg=2.4×1014及びε∞=1.769。J凝集体の応答の異方性は、この分析では無視している。これは厳密ではないが、挙動は準静的体制における半径方向誘電率成分により支配されている(裏付け情報を参照されたい)。これは、本発明の操作体制に近く、よって、完全な異方性モデルに対してこれらの計算からわずかなずれしか生じないことを期待する。
本開示において、発明者らは、イプシロンゼロ近傍(ENZ)現象を開発している。εjaggの実数部は435nmの波長でゼロに近いことが認められている。この作用は、境界条件ε1E1=ε2E2、(式中、εi及びEi(i=1.2)は、界面での電界の誘電率及び垂直成分である)により指示されているように、2種の異なる材料の間の界面に強い局所磁場の増強をもたらすことができる。したがって、1つの媒体の誘電率がゼロに近い場合、その媒体における電界の強さは、有意に増加することが予想される。しかし、達成可能な最大の増強は、εjaggの非ゼロ虚数部により制限されることに注目されたい。
SERS散乱強度は粒子の周りの電界により異なることを前提として、粒子に照射する波長は、金属と色素の間の誘電定数の比を最適化するよう慎重に選ばれた。最大電界強度に対して最適化した計算、及びその結果が図1aに示されている。銀粒子の周りのJ凝集体に対する最大電界強度は420nmであり、その波長の周りで鋭く共鳴しやすい。
実際には、ピークは狭すぎてTC色素に対するすべてのストークスシフトしたピークを受け入れることができない。発明者らは主にプラズモン粒子に関する注入電磁放射線の増強に興味を持っている。したがって、粒子を407nmの波長で照射することを選んだ。この407nmの波長は、約410nmに位置する、この粒径に対するプラズモン共鳴に極めて近い。次いで、より明るいストークスシフトしたピークは、電界強度ピークの極めて近くに収まる。この波長マッチング手法は、粒子の周りの電磁場という点から大きな増強要素を引き起こすものである。
要約すると、以下のステップに従い、増強されたSERS信号を得るためのナノ粒子を照射する最適の励起波長を求める:
・誘電定数、εは、その凝集状態での色素に対する吸収断面から計算するが(ここではUV-Visを使用)、計算は図1aの上部に示されている通りであり、吸収データは図4に示されている(上の図、赤色の曲線)。これは、いくつかの塩を添加することによって、いくつかの遊離の、モノマー性色素を凝集体(規則構造)へと誘導することによって行う。これらのスペクトルに粒子はない。自己集合した構造は粒子上に形成されるものと同じであると想定され、したがって計算/シミュレーションに対してそれをモデル誘電体として使用する。
・次いで、誘電定数の実数部分がゼロに近いところを観察する。誘電定数の虚数部分は、望ましくない吸収に関与しており、したがって最小限に抑えるべきである。これらの作用を最適化する波長は、図1aの上部に示されているように、標的波長として、上記の例に対して約425nmと識別される。
・この波長付近にプラズモン共鳴を有する粒子を生成する。これは、粒子の形状又は組成を調整することで行われる。
・次いで金属の誘電定数を文献データから得る(上記Palik基準を参照されたい)。
・境界条件ε1E1=ε2E2を利用してすべての波長に対するFDTDシミュレーションを介して色素-リンカー-金属複合体に対する電界強度を計算することによって、図1aの下の図と同様のプロットを作成する。
・最適な波長は、最も大きな電界(E-field)を有するものが選ばれる。これは、標的照射波長であり、粒子のプラズモン共鳴の近くに収まるべきである。
・最後に、溶液中の複合体ナノ粒子を励起させるために実用的なレーザーを選ぶ(明らかにすべての波長が可能とは限らない)。ラマン散乱からの、ストークシフトした光がそのピーク内に依然として収まり、増強されることも確実にしながら、図1aの上の図のこのピークのできるだけ近くに粒子を励起させるのが好ましい。
・誘電定数、εは、その凝集状態での色素に対する吸収断面から計算するが(ここではUV-Visを使用)、計算は図1aの上部に示されている通りであり、吸収データは図4に示されている(上の図、赤色の曲線)。これは、いくつかの塩を添加することによって、いくつかの遊離の、モノマー性色素を凝集体(規則構造)へと誘導することによって行う。これらのスペクトルに粒子はない。自己集合した構造は粒子上に形成されるものと同じであると想定され、したがって計算/シミュレーションに対してそれをモデル誘電体として使用する。
・次いで、誘電定数の実数部分がゼロに近いところを観察する。誘電定数の虚数部分は、望ましくない吸収に関与しており、したがって最小限に抑えるべきである。これらの作用を最適化する波長は、図1aの上部に示されているように、標的波長として、上記の例に対して約425nmと識別される。
・この波長付近にプラズモン共鳴を有する粒子を生成する。これは、粒子の形状又は組成を調整することで行われる。
・次いで金属の誘電定数を文献データから得る(上記Palik基準を参照されたい)。
・境界条件ε1E1=ε2E2を利用してすべての波長に対するFDTDシミュレーションを介して色素-リンカー-金属複合体に対する電界強度を計算することによって、図1aの下の図と同様のプロットを作成する。
・最適な波長は、最も大きな電界(E-field)を有するものが選ばれる。これは、標的照射波長であり、粒子のプラズモン共鳴の近くに収まるべきである。
・最後に、溶液中の複合体ナノ粒子を励起させるために実用的なレーザーを選ぶ(明らかにすべての波長が可能とは限らない)。ラマン散乱からの、ストークシフトした光がそのピーク内に依然として収まり、増強されることも確実にしながら、図1aの上の図のこのピークのできるだけ近くに粒子を励起させるのが好ましい。
図2は、粒子とJ凝集体色素層との間の相互作用距離が粒子及び色素層内の電界強度にどのように影響を及ぼすかを示している。予想されているように、層が粒子表面からさらに除去されるにつれて、電界の降下がほぼ指数的に生じる。しかし、粒子からの距離に対する電界の強さの関係は波長にひどく依存することを発見した。図3は、共鳴波長において、電界強度は表面からの距離に対して大きく減衰することを実証している。しかし、J凝集体色素の誘電定数は約450nmの赤色波長で比較的大きくなるので、非共鳴波長では、考慮された距離の全域にわたりこの差異はごくわずかである。
これによって、407nmで照射した場合、J凝集体色素内にかなりの電界の閉じ込めが生じ、800より上の|E|値が得られる。これは、色素層が存在しない粒子の表面により生成された電界のほぼ2倍である。しかし図3は、514nmの非共鳴波長においてごくわずかな電界の増強が存在することを示しており、この波長において、色素の誘電性は金属の誘電性と同等である。以下のセクションにおいて示されているように、SERS散乱強度の大きな増加を引き起こすのは、ENZ現象の結果生じる色素層内への強い閉じ込めである。
実験結果
本発明者らは、この稀な光学的挙動を利用することができ、これを取り囲むJ凝集体色素単分子膜から強いラマン痕跡を生成する粒子を調製した。本発明者らは、直径およそ40+/-5nmである銀ナノ粒子を最初に合成し、TEMで確認した。次いでこれらをJ凝集体層で機能化した。この特定の色素を粒子の表面に結合させるために利用可能な化学反応がないことを受けて、本発明者らは、TC色素をJ凝集体状態で粒子の表面に自己集合させる、Kometaniらと同様のカチオン性リンカーを利用した(Yoshida, A.; Yonezawa, Y.; Kometani, N. Langmuir 2009, 25, 6683-9)。この戦略は任意のアニオン性J凝集体形成色素に適用可能である。次いで、粒子安定性を改善するために、機能化した粒子を脂質二重層内に封入した。これらの粒子を生成する合成経路の概要がスキーム1に示されている。図4に示されているように、プラズモンピーク及びJ凝集体の生成をUV-Visを介して確認した。2つの異なる長さのリンカーを使用して、電界増強と、銀粒子表面からのJ凝集体の距離との間の関係を検証した。
本発明者らは、この稀な光学的挙動を利用することができ、これを取り囲むJ凝集体色素単分子膜から強いラマン痕跡を生成する粒子を調製した。本発明者らは、直径およそ40+/-5nmである銀ナノ粒子を最初に合成し、TEMで確認した。次いでこれらをJ凝集体層で機能化した。この特定の色素を粒子の表面に結合させるために利用可能な化学反応がないことを受けて、本発明者らは、TC色素をJ凝集体状態で粒子の表面に自己集合させる、Kometaniらと同様のカチオン性リンカーを利用した(Yoshida, A.; Yonezawa, Y.; Kometani, N. Langmuir 2009, 25, 6683-9)。この戦略は任意のアニオン性J凝集体形成色素に適用可能である。次いで、粒子安定性を改善するために、機能化した粒子を脂質二重層内に封入した。これらの粒子を生成する合成経路の概要がスキーム1に示されている。図4に示されているように、プラズモンピーク及びJ凝集体の生成をUV-Visを介して確認した。2つの異なる長さのリンカーを使用して、電界増強と、銀粒子表面からのJ凝集体の距離との間の関係を検証した。
最も短いリンカー、TMATは、市販されておらず、代わりに、アセチルチオコリン前駆体の酸加水分解により合成した。多層粒子を、粒子の凝集なしで、色素及びスペーサー層により機能化した。UV-VisスペクトルにおけるJ凝集体の特徴的「ピーク」に加えて、その存在がζ-電位測定により確認され、HRTEMを介して目視により識別された。J凝集体は、カチオン性リンカーで機能化されていない、合成されたままの、クエン酸でキャップされた粒子上に形成しなかった。
TMAリンカーで機能化した粒子は、UV-Visスペクトルにおいて、TMAT機能化した粒子と比較していくぶんより鋭いJ凝集体ピークを有した。極めて短いTMAT分子と比較して、より長いTMA分子の脂肪族部分間のさらに好ましいエンタルピー相互作用があることを受けて、本発明者らは、より長いリンカーを使用した場合より大きなSAM密度が存在したと仮定する。リンカー分子1個につき別々の電荷があるとすると、TMA機能化したAgNPは、アニオン性TC色素のJ凝集体形成をより良く受け入れることができた。ひいてはこれが、これらの粒子に対するUV-Visスペクトルにおいてより大きなピークを生成する。
2種類の粒子のSERSスペクトルが図5に示されている。TCは、従来の注入波長においてむしろ弱いラマン痕跡を付与することが以前に示されており(Kitahama, Y.; Tanaka, Y.; Itoh, T.; Ishikawa, M.; Ozaki, Y. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2009, 82, 1126-1132)、色素励起が458nm波長付近のJ凝集体共鳴近くに増大するにつれていくらかの改善がある。400〜1000cm-1領域における強いピークは、粒子の近傍にJ凝集体が形成されていることを暗示している。これは、共鳴ラマン作用を介した、AlbrechtのA項の面外振動モードの増強による。図5は、407nmの共鳴波長においてSERRS信号は、共鳴波長から離れて照射された粒子と比較して、強度が一桁超上回り、458及び488nmの波長で照射された場合よりも有意に明るいことを実証している。
粒子の表面からの異なる分離距離の間のSERS強度の差はまたシミュレーションに密接に追随した。TMAT及びTMA分子の長さはそれぞれ0.5及び2nmであると概算され、J凝集体単分子膜厚さはおよそ1nmである。ラマン散乱強度Iと、電界強度|E|との間の関係は、多くの場合、I∝|E|4であると概算される。FDTDシミュレーションで計算した2つの距離における電界の強さの比は1.15である。以下の方程式を使用して、電界強度の比に対する実験値を計算することができる、
(ITMAT/ITMA)=(|E|TMAT/|E|TMA)4(2)
(ITMAT/ITMA)=(|E|TMAT/|E|TMA)4(2)
スペクトル全域にわたり8つの主要なピーク上で取った、2つの厚さの間のピーク高さの平均比を使用して、電界の強さの比はおよそ1.14であることが判明し、これは、理論により得た値と十分に一致する。しかし、514nmにおいて、2つのスペーサー層間の光学的明るさの点からごくわずかな差異が見られるが、これもまた実施したFDTDシミュレーションと合致している。
TMATと比較して、TMAで機能化した粒子の表面上により多量の色素が存在する一方で、407nmでTMAT機能化した粒子に対する有意に明るいSERSスペクトルにおいて見られるように、生じた信号は、色素層と粒子との間の距離により強く関係しているようにみえることは興味深い。
安定化コーティングでの封入
これらの粒子の封入は、スフィンゴ脂質とコレステロールの脂質混合物を用いて実施したが、この脂質混合物は数カ月の間にわたり機械的に安定していることが証明された頑強な粒子を生成した。粒子の周りに脂質二重層を有する、及び有さない粒子のTEM画像が図6において示されている。粒子は数週間の間にわたり、いくぶん沈降させたが、これらを含有するバイアルの簡単な振盪により容易に再懸濁させた。
これらの粒子の封入は、スフィンゴ脂質とコレステロールの脂質混合物を用いて実施したが、この脂質混合物は数カ月の間にわたり機械的に安定していることが証明された頑強な粒子を生成した。粒子の周りに脂質二重層を有する、及び有さない粒子のTEM画像が図6において示されている。粒子は数週間の間にわたり、いくぶん沈降させたが、これらを含有するバイアルの簡単な振盪により容易に再懸濁させた。
ベシクルは、「裸の」粒子よりもこのプラットフォームに対していくつかの利点を提供する。第一に、粒子は、洗浄することができ、過剰の色素を溶液から除去することができ、これは、J凝集体単分子膜の断裂を防止するベシクルの存在なしに行うのは不可能なことである。これによって、溶液からの過剰の色素の容易な除去が可能となり、生体系における毒性を減少させる。同様に、二重層の存在はまたJ凝集体色素をその中に「トラップ」し、マルチ-シェルナノ粒子構造の崩壊による光学特性の劣化を防止しながら、所望しない化学的又は生物学的作用を誘発し得る他の種との相互作用を防止する。
粒子を取り囲む脂質ベシクルは、それが他のラマン色素であっても、又は標的部分であっても、さらなる修飾に対して理想的プラットフォームとなる。これらは、脂質アンカーへの共有結合、又は二重層の脂肪族部分への物理的取込みのいずれかによりベシクル内に容易に収容することができる。
図7に示されているように、これらのJ凝集体機能化した粒子の脂質封入は、ベシクル内に色素単分子膜を封じ込め、粒子からの色素漏出を防止する。これによって、色素の、溶液中での他の種との限定された相互作用が可能となり、複合体の機械的安定性を同時に促進する。これらのモデルSERS粒子は、細胞表面マーカー検出及び他の用途のための溶液安定したバイオセンサーを生成するためのプラットフォームとしての役目を果たす。
上記の非限定的な例示的例は銀ナノ粒子を使用し、この銀ナノ粒子上にJ凝集体構造を形成する色素3,3'-ジスルホプロピル-5,5'-ジクロロ-9-エチル-チアカルボシアニンナトリウム塩(TC)、リンカーのチオコリン(TMAT)及びTMA並びにDOPC、ESM及びCholから調製する安定化コーティング層が2:2:1のモル比で混合された。当業者であれば、これらは単なる例にすぎず、それぞれの多くの代替形態が以下に考察されているように使用できることを理解されたい。
貴金属ナノ粒子
本発明のナノ粒子は、金ナノ粒子以外の材料で構成することができる。ナノ粒子は貴金属ナノ粒子であり、金、銀、銅、ニッケル、パラジウム、白金、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、又は前述の金属の任意の合金であってよい。インビボでの用途は、SERS部分が生体適合性である必要があり、このような用途では、好ましい金属は恐らく銀又は金であるが、金と銀、若しくは金と白金の合金、又はシェル金属が金である2種の金属のコア-シェル構造であってもよい。金コーティングを有する銀粒子が適切である可能性もある。
本発明のナノ粒子は、金ナノ粒子以外の材料で構成することができる。ナノ粒子は貴金属ナノ粒子であり、金、銀、銅、ニッケル、パラジウム、白金、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、又は前述の金属の任意の合金であってよい。インビボでの用途は、SERS部分が生体適合性である必要があり、このような用途では、好ましい金属は恐らく銀又は金であるが、金と銀、若しくは金と白金の合金、又はシェル金属が金である2種の金属のコア-シェル構造であってもよい。金コーティングを有する銀粒子が適切である可能性もある。
サイズという点からは、本発明に対して適切なナノ粒子は、およそ2nm〜約1000nmの間であるが、恐らく5nmを超え、且つ900nm未満である。好ましくは、ナノ粒子は、約5nm〜約300nmの間、又は約5nm〜約100nmの間である。好ましい直径は、約20nm〜約100nmの間である可能性が最も高いと考えられている。極めて好ましい範囲は20nm〜約100nmである。球状のナノ粒子が好ましいが、他の形状、例えば、楕円形の形状、又はロッド形状のナノ粒子なども使用することができる。
リンカー及びリンカー長
上記例のリンカーは、色素分子とは別の分子であるが、特定の状況下では、リンカーは、例えば、色素が化学的性質、例えば、粒子への直接的な吸着を可能にするチオール基などを含有する場合、別の実体ではなくむしろ色素分子それ自体の一部であってよく、ただし、存在する場合、0.1nm〜10nmの範囲の長さとすることができることを理解されたい。使用される凝集体形成色素の化学的性質に応じて、リンカーの種類はアニオン性、カチオン性又は中性であってよい。潜在的に適切なリンカー剤として、チオコリン、トリメチルアンモニウムコンジュゲートアルカンチオール、アクリレート、NN-トリメチル(アルキル)アンモニウム、テトラブチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、クエン酸（シトレート）、ポリメタクリレート、アスコルビン酸、DNA、2-メルカプトプロピオン酸、16-メルカプトヘキサデカン酸、ドデシルスルフェート、アミノ酸、ホモシスチン、システイン、及びグルタチオンが挙げられる。
上記例のリンカーは、色素分子とは別の分子であるが、特定の状況下では、リンカーは、例えば、色素が化学的性質、例えば、粒子への直接的な吸着を可能にするチオール基などを含有する場合、別の実体ではなくむしろ色素分子それ自体の一部であってよく、ただし、存在する場合、0.1nm〜10nmの範囲の長さとすることができることを理解されたい。使用される凝集体形成色素の化学的性質に応じて、リンカーの種類はアニオン性、カチオン性又は中性であってよい。潜在的に適切なリンカー剤として、チオコリン、トリメチルアンモニウムコンジュゲートアルカンチオール、アクリレート、NN-トリメチル(アルキル)アンモニウム、テトラブチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、クエン酸（シトレート）、ポリメタクリレート、アスコルビン酸、DNA、2-メルカプトプロピオン酸、16-メルカプトヘキサデカン酸、ドデシルスルフェート、アミノ酸、ホモシスチン、システイン、及びグルタチオンが挙げられる。
本発明の系において使用される色素は、例えば、これらに限定されないが、脂質-分子への物理的結合を介して、又は脂質分子の間の疎水性の脂肪性領域への物理的取込みを介して(コレステロールと同様の方式で)などいくつかの方式により脂質二重層へ組み込むことができることにも注目されたい。多層構造、例えば、脂質二重層と同様の方式で粒子の周りに形成される二重層などを生じるJ凝集体形成色素を生成することもまた実行可能である。この場合、色素は、ベシクル系への自己集合を促進するはっきりと確定した疎水性及び親水性の領域を有するという点で、脂質分子との構造上の類似点を示す。
色素
本発明で使用される色素は、任意の種類のポリメチン色素で構成することができ、このポリメチン色素は、これらに限定されないが、シアニン色素、これらに限定されないが、メロシアニン、インドシアニン、アントシアニン、フィコシアニン、イソシアニン、シュードイソシアニン及びチアシアニンを含めたもの、スクアライン、ペリレンビスイミド、ナノ粒子の表面に直接吸着するチオール化凝集体形成色素(したがって、色素構造の一部として連結メンバーを含む)、上記の任意の組合せ、例えば、スクアラインとシアニンが一緒にコンジュゲートしたものなどであってよい。特に有用な色素は、J凝集体又はH凝集体、又は他の凝集体を形成する任意のクラスのシアニン色素を含み、この場合、凝集体の集団的吸収は、色素のモノマー種のものとは異なる。
本発明で使用される色素は、任意の種類のポリメチン色素で構成することができ、このポリメチン色素は、これらに限定されないが、シアニン色素、これらに限定されないが、メロシアニン、インドシアニン、アントシアニン、フィコシアニン、イソシアニン、シュードイソシアニン及びチアシアニンを含めたもの、スクアライン、ペリレンビスイミド、ナノ粒子の表面に直接吸着するチオール化凝集体形成色素(したがって、色素構造の一部として連結メンバーを含む)、上記の任意の組合せ、例えば、スクアラインとシアニンが一緒にコンジュゲートしたものなどであってよい。特に有用な色素は、J凝集体又はH凝集体、又は他の凝集体を形成する任意のクラスのシアニン色素を含み、この場合、凝集体の集団的吸収は、色素のモノマー種のものとは異なる。
安定化コーティング層
本発明の安定化コーティングは、自己集合した有機脂質ベシクルで構成することができる。これらの脂質ベシクルは、ステロール、グリセリド、スフィンゴ脂質及びリン脂質、並びにこれらの組合せからなることができる。
本発明の安定化コーティングは、自己集合した有機脂質ベシクルで構成することができる。これらの脂質ベシクルは、ステロール、グリセリド、スフィンゴ脂質及びリン脂質、並びにこれらの組合せからなることができる。
リン脂質は当業者に公知のクラスの化合物である。1つの種類のリン脂質はグリセロールベースであり、例えば、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスホチジルコリン(PC)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、及び誘導体化/機能化した形態のローダミン-PE又はPEG-PEなどであってよい頭部基を含む。尾部基は、水素、又はアシル鎖、例えば、パルミトイル、ミリストイル、オレオイル、ステアロイルなどで構成することができる。尾部基は、2つの等しい基又は2つの異なる基からなることができる。例えばDOPCは、グリセロール骨格によって結合している2つのオレオイルアシル鎖及びホスホコリン頭部基を有する。DOPGは同じアシル鎖ではあるが、ホスファチジルグリセロール頭部基を有する。POPCは、1つのパルミトイル及び1つのオレオイルアシル鎖及びホスファチジルコリン頭部基を有する。
同様に、本明細書に記載されている例において使用されているのは、スフィンゴミエリン、スフィンゴリン脂質であった。スフィンゴ脂質は、スフィンゴシン及びその誘導体を含み、スフィンゴミエリンが含まれる。
リン脂質は、スフィンゴリン脂質を含み、天然に生じることが知られている。この定義に含まれるのが、これらは両親媒性であり、金属ナノ粒子の封入に対して層を形成できるという意味で、天然の化合物の特定のものに構造的に関係している非天然のリン脂質である。リン脂質の定義の範囲内にあるのが、これらの頭部基にホスファチジルグリセロール(PG)、ホスホチジルコリン(PC)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、及びホスファチジルイノシトール(PI)を含有し、1つの又は2つの脂肪性アシル鎖へグリセロール部分を介して結合しているものである。各鎖は、6個から24個までの炭素を有することができ、分枝又は非分枝であってもよいが、ただし、これらは通常非分枝である。各鎖は、1つ以上の二重結合又は1つ以上の三重結合を含むことができる。12〜24個の炭素原子を有する鎖がさらに好ましい。
好ましい実施形態では、本発明のSERS複合体のリン脂質成分は二重層である。
本発明の特定のリン脂質の例として、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジアシルホスファチジルグリセロール、例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、及びジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)など、ジアシルホスファチジルコリン、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、及びジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)など、ジアシルホスファチジン酸、例えば、ジミリストイルホスファチジン酸(DPMA)、ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)、及びジステアロイルホスファチジン酸(DSPA)など、並びにジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-ポリエチレングリコール(DSPE-PEG)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン-ポリエチレングリコール(DPPE-PEG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン-ポリエチレングリコール(DOPE-PEG)などが挙げられ、PEG鎖は、200Da〜10000Da分子量の範囲、恐らく350Daを超え、5000Da未満の範囲であることができる。好ましくは、PEG鎖長は、1kDa〜5kDa分子量の範囲である。さらに、PEG鎖の一方の末端は、脂質種に結合しているが、封入粒子の外面に化学的機能性を付与するために、又は例えば、標的とする種を結合させるためのPEG鎖のさらなる化学的修飾を促進するために、PEG鎖の他方の末端は、他の基、例えば、メチル基、カルボン酸基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基、シアヌル基などにより官能化されていてもよい。
スフィンゴ脂質は、脂肪性アシル鎖及び頭部基が結合しているスフィンゴイド塩基(それ自体アシル鎖を含有する)からなる骨格を有する脂質分子である。脂肪性アシル鎖は、6〜24個の炭素を含有することができ、分枝又は非分枝であってよい。この鎖は、1つ以上の二重結合及び/又は1つ以上の三重結合を含有することができ、cis又はtrans異性体であることができる。12〜24個の炭素の鎖が好ましい。頭部基は、例えば、水素を生成するセラミド、又はホスホコリンを生成するスフィンゴミエリンであることができる。本発明の好ましい実施形態はスフィンゴミエリンを含む。
本発明の安定化コーティングは無機酸化物からなることができる。このような無機酸化物は半導体酸化物及び遷移金属の酸化物を含んでもよい。このような酸化物の2つの例はケイ素又はチタンである。これらの酸化物は核形成し、1〜100nmの厚さ、恐らく5〜20nmの範囲の厚さで、シェル内の色素コーティングしたナノ粒子の表面上に堆積する。いかなる理論又は推測にも制約されることなく、色素凝集体を金属ナノ粒子の近くに閉じ込めることによって、凝集体及び金属ナノ粒子内で色素分子が互いにつながり合い続けると考えられている。凝集体を金属ナノ粒子と接触させて閉じ込め、維持することによって、有利なことに蛍光が抑制されることになる。
安定化コーティング層に結合したリガンド
本発明のSERS複合体は、追加のリガンド、すなわち、リガンドパートナーを認識し、これに結合する能力を有するリガンドを含むことができる。したがって、このようなリガンドを有するSERS複合体は、リガンドパートナーに結合することができる。このようなリガンドの例は、本明細書に記載されている結果により例示されている例であるが、抗原(標的)に結合した抗体(SERS複合体リガンド)である。
本発明のSERS複合体は、追加のリガンド、すなわち、リガンドパートナーを認識し、これに結合する能力を有するリガンドを含むことができる。したがって、このようなリガンドを有するSERS複合体は、リガンドパートナーに結合することができる。このようなリガンドの例は、本明細書に記載されている結果により例示されている例であるが、抗原(標的)に結合した抗体(SERS複合体リガンド)である。
実施されて、本明細書に記載されている実験室の実施例により例示された結果において、リガンドをすでに調製したSERS複合体に組み込んだ。1つの実施例では、リガンドが共有結合により連結することができる官能基を含有するリン脂質を用いてSERS複合体を調製した。次いで、リガンドをSERS複合体の封入層内のリン脂質の官能基に連結させた。別の実施例では、現存するSERS複合体の封入層にその後組み込まれたリン脂質にリガンドを連結した。さらに別の実施例は、現存するSERS複合体を封入するシリカシェルに結合しているリガンドを使用している。各手法は、これらのターゲットを認識することができるリガンドを有するSERS複合体を生成することに成功した。リガンドに共有結合により連結したアンカーは必ずしもリン脂質でなくてもよいが、例えば、前記層内に安定的に組み込むことができる、又は前記層上にコンジュゲートできるように、SERS複合体の封入層と相容性のある分子でなければならないことを当業者であればここで認識されたい。
SERS複合体の封入層の成分と共有結合により連結した場合、リガンドとして作用することができる様々な種類の部分は、ヌクレオチド、核酸分子、DNA分子、RNA分子、アプタマー、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、脂質、炭水化物、薬物、薬物前駆体、薬物候補分子、薬物代謝物、ビタミン、合成ポリマー、受容体リガンド、代謝物、イムノグロブリン、イムノグロブリンの断片、ドメイン抗体、モノクローナル抗体、VHドメイン、VLドメイン、一本鎖抗体、ナノボディ、ユニボディ、モノボディ、アフィボディ、DARPin、アンチカリン、10Fn3ドメイン、バーサボディ（versabody）、Fab断片、Fab'断片、Fd断片、Fv断片、F(ab')2断片、及びFc断片、抗体同様の機能を有するタンパク質結合分子、グルボディ、アンキリンスカホールド又は結晶性スカホールドに基づくタンパク質、アドネクチン(AdNectin)、テトラネクチン、アヴィマー（avimer）、ペプトイド、又は細胞表面マーカーである。
代わりにリガンドは、これが結合する、又はこれが選択的に獲得する部分又は標的の点から定義することもできる。したがって、リガンドは、細胞、ウイルス、細菌、胞子、毒素、タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸、抗原、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、薬物、又は爆発物に選択的に結合するものであることができる。
例えば、1つの文脈では、抗体は、抗原を標的とするために、SERS複合体と連結することができ、その一方で別の文脈では、抗原は抗体を標的とするリガンドとしてSERS複合体と連結することができることを当業者であれば認識されよう。
本発明のSERS複合体の封入層のリン脂質は両親媒性である。リン脂質の親水性部分は層の外部に向かって位置し、リガンドは、そのパートナーを効果的に認識できるように連結されている。本明細書に記載されている実施例の1つにおいて、SERS複合体の生成中にCOOH-PEG-DSPE(DSPE=ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン)を封入リン脂質層に組み込んだ。次いでカルボキシル基を活性化し、従来の方式で抗体に共有結合でカップリングした。別の実施例では、F(ab')2断片を生成し、断片のシステイン残基のチオール基を介してマレイミド-PEG-DSPEに共有結合で連結させた。次いでF(ab)-PEG-DSPEをSERS複合体と共にインキュベートし、その封入層に組み込んだ。したがって、これらの場合リガンドは外向きに位置した脂質頭部基に連結し、SERS複合体のリン脂質層の外向きに方向づけることによって、リガンドの標的との結合を可能にすることを当業者であれば理解されよう。
脂質二重層によるナノ粒子複合体の封入
前述の結果を考慮すると、当業者は、以下に記載されている変化形を含めて、その様々な態様で本発明を実行することが可能である。
前述の結果を考慮すると、当業者は、以下に記載されている変化形を含めて、その様々な態様で本発明を実行することが可能である。
本発明の好ましい実施形態の前述の記載は、本発明の原理を例示するように提示されており、本発明を例示された特定の実施形態に限定するものではない。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲及びこれらの同等物の範囲内に包含された実施形態のすべてにより定義されることを意図している。
Claims (39)
- 増強ラマン散乱のための励起子半導体貴金属複合体ナノ粒子であって、
表面を有する貴金属ナノ粒子と、
貴金属ナノ粒子の表面に結合しているリンカー剤の層と、
吸収バンドを有し、リンカー剤の層に結合している色素分子の層であって、前記色素分子が、貴金属ナノ粒子に結合した場合、集団的吸収バンドシフトを示す規則構造を形成するように選択される、色素分子の層と、
封入複合体ナノ粒子を生成するための、リンカー層及び色素分子の規則構造を有する、貴金属ナノ粒子を封入している安定化コーティングと
を含み、
前記封入複合体ナノ粒子が、色素分子が前記規則構造ではない形で結合しているナノ粒子と比較して増強されたラマン散乱を示す、貴金属複合体ナノ粒子。 - 前記貴金属ナノ粒子が、金、銀、銅、ニッケル、パラジウム、白金、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、又は前述の金属のいずれかの合金のうちのいずれかである、請求項1に記載の複合体。
- 前記リンカー剤が、約0.1nm〜約10nmの範囲の長さを有する、請求項1又は2に記載の複合体。
- 前記リンカー分子が、前記色素分子とは別の分子であり、チオコリン、トリメチルアンモニウムコンジュゲートアルカンチオール、アクリレート、NN-トリメチル(アルキル)アンモニウム、テトラブチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、シトレート、ポリメタクリレート、アスコルビン酸、DNA、2-メルカプトプロピオン酸、16-メルカプトヘキサデカン酸、ドデシルスルフェート、アミノ酸、ホモシステイン、ホモシスチン、システイン、システイン、システイン、及びグルタチオン並びにこれらの誘導体の1種又は組合せのうちのいずれか1つを含む、請求項1、2又は3に記載の複合体。
- 前記リンカー剤が、色素分子の分子部分であり、前記分子部分が、貴金属ナノ粒子の表面に結合している部分を含む、請求項1、2又は3に記載の複合体。
- 前記色素が、ナノ粒子の表面に直接吸着している前記分子薬剤を含有するチオール化した凝集体形成色素を含む、請求項5に記載の複合体。
- 前記色素が、ポリメチン色素のいずれか1種を含み、前記ポリメチン色素が、これらに限定されないが、シアニン色素、これらに限定されないがメロシアニン、インドシアニン、アントシアニン、フィコシアニン、イソシアニン、シュードイソシアニン及びチアシアニンを含めたもの、スクアライン、ペリレンビスイミド、上記の組合せのいずれか、例えば、スクアライン及びシアニンが一緒にコンジュゲートされたものであってよい、請求項1、2、3又は4に記載の複合体。
- 前記色素が、J凝集体、H凝集体、凝集体の集団吸収がその色素のモノマー種のものとは異なる凝集体を形成するすべてのクラスのシアニン色素を含む、請求項1、2、3又は4に記載の複合体。
- 前記安定化コーティングが脂質二重層であり、前記脂質二重層が、リン脂質単独、スフィンゴ脂質単独、リン脂質とスフィンゴ脂質、リン脂質とステロール、スフィンゴ脂質とステロール、リン脂質とスフィンゴ脂質とステロールのうちのいずれか1つであり、前記リン脂質がリン脂質の1つの種類又は混合物であり、前記スフィンゴ脂質が、スフィンゴ脂質の1つの種類又は混合物であり、前記ステロールがステロールの1つの種類又は混合物であることによって、混合物を形成する、請求項1から8のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記リン脂質が1つ以上の炭化水素鎖を有し、この炭化水素鎖が、飽和、一不飽和、及び多価不飽和のうちのいずれか1つ又は組合せである、請求項9に記載の複合体。
- 前記スフィンゴ脂質が、1つ以上の炭化水素鎖を有し、この炭化水素鎖が、飽和、一不飽和、及び多価不飽和のうちのいずれか1つ又は組合せである、請求項9に記載の複合体。
- 前記リン脂質及びスフィンゴ脂質が、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PA)、ホスファチジルイノシトール(PI)、及びホスファチジルグリセロール(PG)からなる群から選択される頭部基を有する、請求項9に記載の複合体。
- 頭部基を有する前記リン脂質、スフィンゴ脂質及びステロールが、正に帯電している、負に帯電している、両性イオンである、又は中性であることができる、請求項9に記載の複合体。
- 前記リン脂質、スフィンゴ脂質及びステロールが、化学的に修飾された尾部基及び/又は化学的に修飾された頭部基を含む、請求項9に記載の複合体。
- 前記リン脂質が、天然又は合成のうちのいずれか1つ又は組合せであり、前記スフィンゴ脂質が、天然又は合成のうちのいずれか1つ又は組合せであり、前記ステロールが、天然又は合成のうちのいずれか1つ又は組合せである、請求項9に記載の複合体。
- ナノ粒子の周りに脂質二重層を形成するために前記ナノ粒子を浸す脂質の懸濁液中に存在する界面活性剤分子を含む、請求項9から15のいずれか一項に記載の複合体。
- ナノ粒子の周りに脂質二重層を形成するために前記ナノ粒子を浸す脂質の懸濁液に酸及び/又は塩を添加することによって、前記脂質二重層中の帯電した脂質の分布を制御することを含む、請求項9に記載の複合体。
- 脂質封入した色素の凝集体をコーティングした貴金属ナノ粒子が、未結合のリン脂質及び有機色素分子から遠心分離により分離される、請求項9に記載の複合体。
- 前記色素凝集体をコーティングした貴金属ナノ粒子が、脂質のいずれか及びすべての組合せを有する正又は負に帯電したリガンドによりキャッピングされている、請求項9のいずれか一項に記載の複合体。
- ナノ粒子を封入している安定化コーティングに共有結合で連結しているリガンドを含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の複合体。
- リガンドが抗体又は抗体断片である、請求項20に記載の複合体。
- リガンドが、細胞表面受容体及び細胞内マーカーを選択的に標的とするモノクローナル抗体及び他の標的リガンドのうちのいずれか1つ又は組合せである、請求項20に記載の複合体。
- 前記他の標的リガンドが、抗体断片、ペプチド、DNA、RNA、タンパク質、アフィボディ、モノボディ、薬物、細胞表面マーカー、及び細胞内マーカーのうちのいずれか1つ又は組合せを含む、請求項22に記載の複合体。
- 前記封入色素凝集体をコーティングした貴金属ナノ粒子が、これらを金粒子コア、又は前記金ナノ粒子を封入しているリン脂質のいずれかと結合させる物理的及び化学的手段のうちの1つ又は両方を使用して、モノクローナル抗体及び他の標的リガンドにコンジュゲートされている、請求項1から20のいずれか一項に記載の複合体。
- バイオセンサー又は化学センサーとしての使用のための、請求項1から24のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の使用。
- 単独で、又は色素、タンパク質、誘電性媒体若しくは他の電荷移動剤と併用した、集光性様式としての使用のための、請求項1から24のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の使用。
- 振動分光法に対する使用のための、及び近接場IR分光法に対する使用のための、請求項1から24のいずれか一項に記載の複合体ナノ粒子の使用。
- 安定化コーティングが脂質二重層であり、規則構造形成色素が二重層構造自体内の二重層のいずれかの表面上に収納されているか、又は規則構造形成色素の使用が脂質成分に物理的にコンジュゲートするよう修飾されている、請求項1に記載の複合体。
- 前記規則構造が、
ほぼ等しく、
所与の波長においてゼロに近く、波長依存性実数部分及び虚数部分の値を有する誘電定数を有し、
所与の波長付近の波長を有するレーザー励起源による前記複合体の励起によって、シフトした吸収スペクトルを有する規則構造を色素が形成しない同じナノ粒子の励起と比較して増強したSERS信号が生じる、請求項1から24のいずれか一項に記載の複合体。 - 安定化コーティングが約0.1nm〜約100nmの範囲の厚さを有する、請求項9から19のいずれか一項に記載の複合体。
- 安定化コーティングが、約0.1nm〜約10nmの範囲の厚さを有する、請求項9から19のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記安定化コーティングが無機酸化物である、請求項1から8のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記無機酸化物が半導体酸化物である、請求項32に記載の複合体。
- 前記無機酸化物が遷移金属の酸化物である、請求項32に記載の複合体。
- 前記安定化コーティングがケイ素、チタン及びこれらの混合物のうちのいずれか1種の酸化物である、請求項1から8のいずれか一項に記載の複合体。
- 安定化コーティングが、約0.1nm〜約100nmの範囲の厚さを有する、請求項32から35のいずれか一項に記載の複合体。
- 安定化コーティングが、約5nm〜約20nmの範囲の厚さを有する、請求項32から35のいずれか一項に記載の複合体。
- 異なる波長での励起を用いてラマン散乱強度を測定することによって電界の増強を実証するために、励起子半導体貴金属複合体ナノ粒子で増強ラマン散乱を生成する方法であって、
色素分子及びリンカー分子の溶液を調製するステップと、
色素及びリンカー分子の前記溶液に、前記リンカー及び色素分子の自己集合を誘発するよう選択された条件下で貴金属ナノ粒子の溶液を添加することによって、前記貴金属ナノ粒子の表面に結合している前記リンカー分子の層と、前記リンカー分子の層に結合している前記色素分子の層とを有する複合粒子を生成するステップであり、前記色素分子が、前記リンカー層に結合した場合、協同して互いに及び表面と相互作用するよう選択されて、単一の色素分子の吸収スペクトルに対して波長がシフトした光学的吸収スペクトルを生成するステップと、
前記複合粒子を脂質二重層に封入するステップと、
前記封入複合粒子を洗浄するステップと、
前記金属及び前記分子凝集体の複合体誘電定数を含む理論的シミュレーションを介して、電界増強に対する最適な励起波長を識別するステップであり、前記プラズモンが観察された付近の波長が、励起波長(又はストークシフトした波長)とマッチし、実数及び虚数の成分εjaggがほぼ等しく、ゼロ付近の波長が、ストークシフト(又は励起波長)とマッチするステップと、
理論的シミュレーション及び実験の測定の組合せを介して、金属ナノ粒子のサイズ、形状、組成及び環境に応じて、プラズモンを識別するステップと
を含む方法。 - 増強ラマン散乱のための励起子半導体貴金属複合体ナノ粒子を生成する方法であって、
色素分子及びリンカー分子の溶液を調製するステップと、
色素及びリンカー分子の前記溶液に、前記リンカー及び色素分子の自己集合を誘発するよう選択された条件下で貴金属ナノ粒子の溶液を添加することによって、前記貴金属ナノ粒子の表面に結合している前記リンカー分子の層と、前記リンカー分子の層に結合している前記色素分子の層とを有する複合粒子を生成するステップであり、前記色素分子が、前記リンカー層に結合した場合、協同して互いに及び表面と相互作用するよう選択されて、単一の色素分子の吸収スペクトルに対して波長がシフトした光学的吸収スペクトルを生成するステップと、
安定化コーティング層内に前記複合粒子を封入するステップと、
前記封入複合粒子を洗浄するステップと
を含む方法。
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