JP2016222590A - Manufacturing method of isotope-labeled compound of aliphatic acid, isotope-labeled compound of aliphatic acid obtained by the method and diagnostic agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、脂肪酸の同位体標識化合物の製造方法およびその方法により得られた脂肪酸の同位体標識化合物、ならびに診断薬に関する。 The present invention relates to a method for producing an isotope-labeled compound of fatty acid, an isotope-labeled compound of fatty acid obtained by the method, and a diagnostic agent.
脂質は炭水化物、タンパク質と並び食品の３大栄養素の１つである。特に、エネルギー源として炭水化物とタンパク質が４ｋｃａｌ／ｇの熱量を有しているのに対し、脂質は９ｋｃａｌ／ｇと大きな熱量を有し、体内では貯蔵エネルギーとして大量の脂質が蓄えられている。また、脂質はエネルギー源のみだけでなく、細胞膜の構成成分、エイコサノイドの前駆体など生体の恒常性を維持する役割も担っている。しかし、脂質の代謝については未だに不明な点が多く、現在までに多くの研究が行われている。その代謝の研究方法の１つに、同位体でラベル化（標識）した化合物を用いたアイソトープトレーサー法がある。 Lipids are one of the three major nutrients of food, along with carbohydrates and proteins. In particular, carbohydrates and proteins have a calorific value of 4 kcal / g as energy sources, whereas lipids have a large caloric value of 9 kcal / g, and a large amount of lipid is stored as stored energy in the body. Lipids not only serve as energy sources but also play a role in maintaining the homeostasis of living organisms, such as cell membrane components and eicosanoid precursors. However, there are still many unclear points about lipid metabolism, and many studies have been conducted so far. One of the metabolic research methods is an isotope tracer method using an isotope-labeled compound.
アイソトープトレーサー法では、目的となる化合物を人為的に同位体でラベル化し、例えばマウスなどの生体に投与を行い、質量分析法（放射性同位体の場合は放射線測定）を用い検出することにより、元々マウスの体内に存在していた内因性の目的化合物と人為的に投与した目的化合物を別けて検出することができる。この様に同位体の導入された化合物をトレーサー（追跡子）として使うことができるため、生物科学分野では、アイソトープトレーサー法が生体内における種々の物質の代謝速度、体内移行、挙動追跡、代謝経路の解明に用いられている。 In the isotope tracer method, the target compound is artificially labeled with an isotope, administered to a living body such as a mouse, and detected using mass spectrometry (radiation measurement in the case of a radioisotope). The endogenous target compound that has been present in the mouse body can be detected separately from the artificially administered target compound. In this way, the isotope tracer method can be used as a tracer for a compound into which an isotope has been introduced. Therefore, in the biological science field, the metabolic rate, translocation, behavior tracking, and metabolic pathway of various substances in vivo It is used for elucidation.
脂肪酸の同位体標識化合物の合成方法は、アルキンをカップリングさせ炭素骨格に複数箇所の三重結合を導入したのちに、Ｌｉｎｄｌａｒ触媒により三重結合を重水素（２Ｈ）で還元する方法が知られている（非特許文献１、２および３）。天然に存在する脂肪酸はほとんどがｃｉｓ体として存在しており、実際の実験でもｔｒａｎｓ体よりｃｉｓ体の脂肪酸の同位体標識化合物を用いる方がより正確な結果を得られることが予想されるが、上記方法では、一部がｔｒａｎｓ体の形で得られてしまう。 As a method for synthesizing an isotope-labeled compound of fatty acid, a method is known in which alkyne is coupled to introduce multiple triple bonds into the carbon skeleton, and then the triple bond is reduced with deuterium ( 2 H) using a Lindlar catalyst. (Non-Patent Documents 1, 2 and 3). Most of the naturally occurring fatty acids exist as cis isomers, and in actual experiments, it is expected that more accurate results can be obtained by using isotope-labeled compounds of cis isomers than trans isomers. In the above method, a part is obtained in the form of trans body.
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、本発明者らは、今般、脂肪酸の減炭工程と、それに続く増炭工程とを含んでなる脂肪酸の同位体標識化合物の製造方法によれば、出発物質である脂肪酸中の二重結合の立体配置と同一の二重結合の立体配置を有する同位体標識化合物を得ることができるとの知見を得た。 The present invention has been made in view of the above problems, and the present inventors have now provided a method for producing a fatty acid isotope-labeled compound comprising a fatty acid reduction process and a subsequent increase process. Thus, it was found that an isotope-labeled compound having the same double bond configuration as that of the double bond in the starting fatty acid can be obtained.
したがって、本発明の目的は、出発物質である脂肪酸中の二重結合の立体配置と同一の二重結合の立体配置を有する同位体標識化合物を得ることができる製造方法を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a production method capable of obtaining an isotope-labeled compound having the same double bond configuration as that of a double bond in a fatty acid as a starting material.
本発明による脂肪酸の同位体標識化合物を製造する方法は、脂肪酸を出発物質とし、前記脂肪酸の減炭工程と、それに続く増炭工程とを含んでなることを特徴とする。 The method for producing an isotope-labeled compound of a fatty acid according to the present invention is characterized in that it comprises a fatty acid as a starting material, and comprises a reduction process of the fatty acid and a subsequent increase process.
本発明の態様においては、前記減炭工程が、前記脂肪酸を転移反応させることを含んでなることが好ましい。 In the aspect of this invention, it is preferable that the said carbon reduction process comprises making the said fatty acid transfer reaction.
本発明の態様においては、前記転移反応が、ホフマン転移反応、シュミット転移反応またはクルチウス転移反応を含んでなることが好ましい。 In the aspect of the present invention, the transfer reaction preferably comprises a Hoffman transfer reaction, a Schmitt transfer reaction, or a Curtius transfer reaction.
本発明の態様においては、前記転移反応が、クルチウス転移反応であることが好ましい。 In the aspect of the present invention, the transfer reaction is preferably a Curtius transfer reaction.
本発明の態様においては、前記同位体標識化合物は、前記脂肪酸のカルボキシル基中の炭素原子および／または前記カルボキシル基と結合するメチレン基中の水素が、１３炭素（１３Ｃ）または１４炭素（１４Ｃ）、および重水素（２Ｈ）または三重水素（３Ｈ）によりそれぞれ標識された化合物であることが好ましい。 In an aspect of the present invention, the isotope-labeled compound is such that the carbon atom in the carboxyl group of the fatty acid and / or the hydrogen in the methylene group bonded to the carboxyl group is 13 carbon ( 13 C) or 14 carbon ( 14 C) and a compound labeled with deuterium ( 2 H) or tritium ( 3 H), respectively.
本発明の態様においては、前記同位体標識化合物中の二重結合における立体配置と、前記脂肪酸中の二重結合における立体配置とが同一であることが好ましい。 In the aspect of the present invention, the configuration at the double bond in the isotope-labeled compound is preferably the same as the configuration at the double bond in the fatty acid.
本発明の態様においては、前記同位体標識化合物の分子量が、前記脂肪酸の分子量より２以上大きいことが好ましい。 In the aspect of the present invention, it is preferable that the molecular weight of the isotope-labeled compound is two or more larger than the molecular weight of the fatty acid.
本発明の態様においては、前記減炭工程により、前記脂肪酸より炭素数が１少ない脂肪酸が得られることが好ましい。 In the aspect of the present invention, it is preferable that a fatty acid having 1 fewer carbon atoms than the fatty acid is obtained by the carbon reduction step.
本発明の態様においては、前記脂肪酸が、天然物由来の脂肪酸であることが好ましい。 In the aspect of this invention, it is preferable that the said fatty acid is a fatty acid derived from a natural product.
本発明の態様においては、前記減炭工程が、転移反応により得られた化合物をアミノ化させる反応を含むことが好ましい。 In the aspect of this invention, it is preferable that the said carbon reduction process includes reaction which aminates the compound obtained by transfer reaction.
本発明の態様においては、前記減炭工程が、前記アミノ化反応により得られた化合物をアルデヒド化させる反応を含むことが好ましい。 In the aspect of this invention, it is preferable that the said carbon reduction process includes reaction which aldehyde-forms the compound obtained by the said amination reaction.
本発明の態様においては、前記減炭工程が、前記アルデヒド化反応により得られた化合物を酸化させる反応を含むことが好ましい。 In the aspect of this invention, it is preferable that the said carbon reduction process includes reaction which oxidizes the compound obtained by the said aldehyde-ized reaction.
本発明の態様においては、前記増炭工程が、前記酸化反応により得られた化合物をエステル化させる反応を含むことが好ましい。 In the aspect of this invention, it is preferable that the said carbon increase process includes reaction which esterifies the compound obtained by the said oxidation reaction.
本発明の態様においては、前記増炭工程が、前記エステル化反応により得られた化合物を還元剤により還元させる反応を含むことが好ましい。 In the aspect of this invention, it is preferable that the said carbon increase process includes reaction which reduces the compound obtained by the said esterification reaction with a reducing agent.
本発明の態様においては、前記還元剤が、重ヒドリドイオンが発生する還元剤であることが好ましい。 In the aspect of the present invention, the reducing agent is preferably a reducing agent that generates heavy hydride ions.
本発明の態様においては、前記還元剤が、重水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＤ）または重水素化ホウ酸ナトリウムであることが好ましい。 In the embodiment of the present invention, the reducing agent is preferably lithium aluminum deuteride (LAD) or sodium deuterated borate.
本発明の態様においては、前記増炭工程が、前記還元反応により得られた化合物をハロゲン化させる反応を含むことが好ましい。 In the aspect of this invention, it is preferable that the said carbon increase process includes reaction which halogenates the compound obtained by the said reduction reaction.
本発明の態様においては、前記増炭工程が、前記ハロゲン化反応により得られた化合物をマグネシウムおよび二酸化炭素と反応させることを含むことが好ましい。 In the aspect of the present invention, it is preferable that the carbon increasing step includes reacting the compound obtained by the halogenation reaction with magnesium and carbon dioxide.
本発明の態様においては、前記二酸化炭素が、１３ＣＯ２または１４ＣＯ２であることが好ましい。 In the embodiment of the present invention, the carbon dioxide is preferably 13 CO 2 or 14 CO 2 .
本発明による脂肪酸の同位体標識化合物は、上記方法により得られたことを特徴とする。 The isotope-labeled compound of fatty acid according to the present invention is obtained by the above method.
本発明による診断薬は、上記方法により得られた脂肪酸の同位体標識化合物を含んでなることを特徴とする。 The diagnostic agent according to the present invention comprises an isotope-labeled compound of a fatty acid obtained by the above method.
本発明によれば、出発物質である脂肪酸中の二重結合の立体配置と同一の二重結合の立体配置を有する同位体標識化合物を得ることができる。すなわち、出発物質として脂肪酸中の二重結合が全てｃｉｓ結合であるものを用いた場合、二重結合が全てｃｉｓ結合である脂肪酸の同位体標識化合物を得ることができ、二重結合の全部または一部がｔｒａｎｓ結合へ変化してしまうことを防止することができる。よって。本発明によれば、天然物由来の脂肪酸そのものへの同位体によるラベル（標識）化が可能となり、脂質ないし脂肪酸
代謝研究を含む診断技術、生化学ないし生理学分野においてすこぶる有用である。
According to the present invention, an isotope-labeled compound having the same double bond configuration as that of the double bond in the starting fatty acid can be obtained. That is, when the starting material used is one in which all the double bonds in the fatty acid are cis bonds, an isotope-labeled compound of the fatty acid in which all the double bonds are cis bonds can be obtained. It is possible to prevent a part from being changed to trans coupling. Therefore. According to the present invention, it is possible to label a natural product-derived fatty acid itself with an isotope, which is extremely useful in the field of diagnostic techniques, biochemistry and physiology including lipid or fatty acid metabolism research.
本明細書において、配合を示す「部」、「％」、「比」などは特に断らない限り重量基準である。 In the present specification, “part”, “%”, “ratio” and the like indicating the composition are based on weight unless otherwise specified.
本発明による脂肪酸の同位体標識化合物を製造する方法は、図１に示されるように脂肪酸を出発物質とし、脂肪酸の減炭工程と、それに続く増炭工程とを含んでなることを特徴とする。以下、本発明を構成する工程について説明する。 The method for producing an isotope-labeled compound of a fatty acid according to the present invention is characterized in that, as shown in FIG. 1, a fatty acid is used as a starting material and comprises a fatty acid decarbonization step and a subsequent carbon increase step. . Hereinafter, the process which comprises this invention is demonstrated.
＜減炭工程＞
減炭工程は、脂肪酸の転移反応を含んでなることが好ましい。より具体的には、ホフマン転移反応、シュミット転移反応またはクルチウス転移反応を含んでなることが好ましく、これらの中でも、短時間で反応が進行するという理由からクルチウス転移反応が好ましい。脂肪酸をクルチウス転移反応させることにより、下記化学式（１）に示されるように、出発物質である脂肪酸に比べ、炭素数が１少ないイソシアネート化合物を得ることができる。下記式（１）にも示される通り、クルチウス転移反応は、脂肪酸とジフェニルホスホリルアジドとを反応させ、加熱することにより、行うことができるが、このときの加熱温度としては、２０〜８０℃であることが好ましく、６０〜８０℃であることがより好ましい。加熱温度が上記数値範囲内であれば、不純物の生成が抑制される。なお、より高純度のイソシアネート化合物を得るため、クルチウス転移反応後、フラッシュカラムなどを用いて精製を行うことが好ましい。また、出発物質である脂肪酸は、天然物由来の脂肪酸であることが好ましい。
The carbon reduction process preferably includes a transfer reaction of fatty acids. More specifically, it preferably comprises a Hoffman rearrangement reaction, a Schmitt rearrangement reaction or a Curtius rearrangement reaction, and among these, the Curtius rearrangement reaction is preferred because the reaction proceeds in a short time. By causing the fatty acid to undergo a Curtius rearrangement reaction, as shown in the following chemical formula (1), an isocyanate compound having one fewer carbon atoms than the starting fatty acid can be obtained. As also shown in the following formula (1), the Curtius rearrangement reaction can be performed by reacting and heating a fatty acid and diphenylphosphoryl azide. The heating temperature at this time is 20 to 80 ° C. It is preferable that the temperature is 60 to 80 ° C. When the heating temperature is within the above numerical range, the generation of impurities is suppressed. In order to obtain a higher-purity isocyanate compound, it is preferable to perform purification using a flash column or the like after the Curtius rearrangement reaction. Moreover, it is preferable that the fatty acid which is a starting material is a fatty acid derived from a natural product.
減炭工程は、上記のようにして得られたイソシアネート化合物をアミノ化させる反応を含んでなることが好ましい。例えば、下記化学式（２）に示されるように、イソシアネート化合物を水と反応させ、加熱させることにより、イソシアネート化合物をアミノ化することができる。このときの加熱温度としては、２０〜８５℃であることが好ましく、６０〜８５℃であることがより好ましい。加熱温度が上記数値範囲内であれば、尿素化合物の生成を抑制し、アミン体の収率を向上させることができる。なお、クルチウス転移反応において水を介在させることにより、アミノ化させる反応をクルチウス転移反応と同時に行うことができるが、フラッシュカラムなどを用いた精製を行うことができなくなる。高純度なアミン化合物を得るため、クルチウス転移反応とアミノ化反応を分けて行うことが好ましい。
減炭工程は、上記のようにして得られたアミン化合物をアルデヒド化させる反応を含んでなることが好ましい。例えば、下記化学式（３）に示されるように、アミン化合物を４−ホルミル−１−メチルピリジニウムベンゼンスルホン酸塩（ＦＭＰＢＳ）と反応させ、シッフ塩基とした後、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）などの塩基を反応させ、シッフ塩基中の二重結合の位置を転移させた後、加水分解することにより、アミン化合物をアルデヒド化することができる。
減炭工程は、上記のようにして得られたアルデヒド化合物を酸化させる反応を含んでなることが好ましい。アルデヒド化合物の酸化は、クロムなどの重金属を利用して行うこともできるが、官能基選択性が高く、反応速度も高いことから、下記化学式（４）に示されるように、Ｐｉｎｎｉｃｋ酸化により酸化反応を行うことが好ましい。アルデヒド化合物を酸化することにより、出発物質である脂肪酸に比べ、炭素数が１少ない脂肪酸が得られる。このときの反応温度としては、室温で行い、反応終了を確認後、直ちに後処理（有機層の酸水洗や水洗）をすることが好ましい。反応終了後、直ちに後処理をすることにより副反応を抑制することができ、収率を向上することができる。
＜増炭工程＞
増炭工程は、上記のようにして出発物質である脂肪酸に比べ、炭素数が１少ない脂肪酸をエステル化させる反応を含んでなることが好ましい。脂肪酸のエステル化は、酸性触媒下、過剰のアルコール中において、脂肪酸を酸化することにより行うことができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール等の短鎖アルコールを使用することができ、これらの中でも、次工程の還元反応の後処理時に除去しやすいという理由から、メタノールが好ましい。例えば、下記化学式（５）に示されるように、脂肪酸を酸性触媒下、過剰のメタノール中において加熱することにより、脂肪酸をメチルエステル化することができる。このときの加熱温度としては、２０〜６５℃であることが好ましく、５０〜６５℃であることがより好ましい。加熱温度が上記数値範囲内であれば、エステル化反応が速やかに進行し、副反応が抑制することができ、収率を向上させることができる。また、この平衡反応のため加えるアルコールの量は、脂肪酸１重量部に対して、１０重量部であることが好ましい。
It is preferable that the carbon increasing step includes a reaction for esterifying a fatty acid having one carbon number less than that of the starting fatty acid as described above. The esterification of the fatty acid can be performed by oxidizing the fatty acid in excess alcohol under an acidic catalyst. As the alcohol, short-chain alcohols such as methanol and ethanol can be used, and among these, methanol is preferable because it is easy to remove during the post-treatment of the reduction reaction in the next step. For example, as shown in the following chemical formula (5), the fatty acid can be methyl esterified by heating the fatty acid in excess methanol under an acidic catalyst. As heating temperature at this time, it is preferable that it is 20-65 degreeC, and it is more preferable that it is 50-65 degreeC. If heating temperature is in the said numerical range, esterification will advance rapidly, a side reaction can be suppressed, and a yield can be improved. The amount of alcohol added for this equilibrium reaction is preferably 10 parts by weight with respect to 1 part by weight of fatty acid.
増炭工程は、上記のようにして得られたエステル化合物を還元剤により還元させる反応を含んでなることが好ましい。還元剤としては、例えば、重水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＤ）、重水素化ホウ酸ナトリウムなどのような重ヒドリドイオンが発生する還元剤が挙げられる。下記化学式（６）に示されるように、還元剤としてＬＡＤを使用した場合、メチレン基および水酸基中の水素が、重水素（２Ｈ）により標識されたアルコール化合物を得ることができる。
増炭工程は、上記のようにして得られたアルコール化合物をハロゲン化させる反応を含んでなることが好ましい。アルコール化合物のハロゲン化は、例えば、下記化学式（７）に示されるように、ジブロモトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３Ｂｒ２）を用いて行うことができ、この方法によれば、高収率で、臭化アルキル化合物を得ることができる。アルコール化合物のハロゲン化は、ＰＰｈ３Ｂｒ２以外にもＰＰｈ３／ＣＢｒ４や１，４−ジオキサン-臭素錯体などを用いて行うことができる。
増炭工程は、上記のようにして得られたハロゲン化アルキル化合物をマグネシウムと反応させることにより、有機金属化合物を合成すること、およびこの有機金属化合物を二酸化炭素と反応させることを含んでなることが好ましい（カルボキシル化反応）。ここで、二酸化炭素として、１２ＣＯ２だけでなく、１３ＣＯ２や１４ＣＯ２も使用することができ、例えば、１３ＣＯ２を使用した場合、下記化学式（８）に示されるように、脂肪酸のカルボキシル基中の炭素原子が、１３炭素（１３Ｃ）により標識された脂肪酸であって、出発物質の脂肪酸の同位体標識化合物である脂肪酸が得られる。
＜同位体標識化合物＞
上記減炭工程および増炭工程を含む方法により得られる同位体標識化合物は、出発物質として用いた脂肪酸と、二重結合における立体配置が同一である。同位体標識化合物の分子量は、出発物質である脂肪酸の分子量より２以上大きいことが好ましく、３以上大きいことがより好ましい。同位体標識化合物の分子量が、出発物質である脂肪酸の分子量より２以上大きいことにより、アイソトープトレーサー法におけるトレーサーとして好適に使用することができる。
<Isotope labeled compound>
The isotope-labeled compound obtained by the method including the carbon reduction step and the carbon increase step has the same steric configuration at the double bond as the fatty acid used as the starting material. The molecular weight of the isotope-labeled compound is preferably 2 or more, and more preferably 3 or more, higher than the molecular weight of the starting fatty acid. When the molecular weight of the isotope-labeled compound is 2 or more larger than the molecular weight of the starting fatty acid, it can be suitably used as a tracer in the isotope tracer method.
また、同位体標識化合物中が有するカルボキシル基中の炭素原子は、１３Ｃまたは１４Ｃにより標識されたものであることが好ましい。カルボキシル基中の炭素原子が標識されていることにより、診断薬として投与した後、体内における脂質代謝（β酸化）を容易に測定が可能となる。 Moreover, it is preferable that the carbon atom in the carboxyl group which the isotope labeled compound has is labeled with 13 C or 14 C. Since the carbon atom in the carboxyl group is labeled, lipid metabolism (β oxidation) in the body can be easily measured after administration as a diagnostic agent.
出発物質として用いた脂肪酸の二重結合の立体配置と、その脂肪酸より得られた同位体標識化合物の二重結合の立体配置とが同一であるか否かは、例えば、１３Ｃ−ＮＭＲにより測定することができる。 Whether the configuration of the double bond of the fatty acid used as the starting material is the same as the configuration of the double bond of the isotope-labeled compound obtained from the fatty acid is measured by, for example, 13 C-NMR. can do.
また、同位体標識化合物の分子量が、出発物質である脂肪酸の分子量よりどの程度大きいかということは、質量分析法と核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）分光法により測定することができる。 In addition, how much the molecular weight of the isotope-labeled compound is larger than the molecular weight of the starting fatty acid can be measured by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) spectroscopy.
＜診断薬＞
本発明による方法により得られた脂肪酸の同位体標識化合物は、診断薬に使用することができる。診断薬としては、例えば、脂質代謝診断薬、糖尿病診断薬またはペルオキシソーム病診断薬などが挙げられる。
<Diagnostics>
The fatty acid isotope-labeled compound obtained by the method according to the present invention can be used as a diagnostic agent. Examples of the diagnostic agent include a lipid metabolism diagnostic agent, a diabetes diagnostic agent, or a peroxisome disease diagnostic agent.
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these Examples.
＜減炭工程＞
（転移反応）
まず、４つ口フラスコに、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）１ｍｏｌを量り入れ、還流管および温度計を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内をアルゴンで置換した。アルゴンガス下で反応溶媒としてトルエンを加えた後、ジフェニルホスホリルアジド１．５ｍｏｌおよびトリエチルアミン２．５ｍｏｌを加え、８０℃まで加熱し３０分間の撹拌を行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて反応の進行を確認後、ロータリーエバポレーターにて反応溶媒の除去を行った。イソシアネート化合物の収率は６４．０％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図２に表す。なお、本実施例においては、いずれの反応においても、ＴＬＣプレートとして、膜厚０．２５ｍｍのＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ ＴＬＣ（５×１０ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ（株）製）、展開溶媒として、ヘキサン／酢酸エチル（９／１（ｖ／ｖ））、検出試薬として、１０％リンモリブデン酸エタノール溶液を用いた。
<Coal reduction process>
(Transition reaction)
First, 1 mol of eicosapentaenoic acid (EPA) was weighed into a four-necked flask, a reflux tube and a thermometer were attached, and the inside of the flask was replaced with argon using a vacuum pump. After adding toluene as a reaction solvent under argon gas, 1.5 mol of diphenylphosphoryl azide and 2.5 mol of triethylamine were added, and the mixture was heated to 80 ° C. and stirred for 30 minutes. After confirming the progress of the reaction using thin layer chromatography (TLC), the reaction solvent was removed using a rotary evaporator. The yield of the isocyanate compound was 64.0%. The result of the synthesis confirmation by TLC is shown in FIG. In this example, in any reaction, as a TLC plate, Silica gel 60 TLC (5 × 10 cm, manufactured by Merck Co., Ltd.) having a film thickness of 0.25 mm, and as a developing solvent, hexane / ethyl acetate (9 / 1 (v / v)), a 10% ethanol solution of phosphomolybdic acid was used as a detection reagent.
次いで、反応中に生じた副生成物や未反応物を除去し、目的物であるイソシアネート化合物のみを得るためにフラッシュカラムでの精製を行った。移動相となる有機溶媒にシリカゲルを分散させた状態でクロマトカラム管に詰め、その上部から反応生成物を充填した。移動相を流しながら、一定間隔で流出液を採取し、ＴＬＣを用いて目的物の有無を確認後、イソシアネート化合物のみが含まれる流出液を集め、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去することでイソシアネート化合物を得た。以下にフラッシュカラムの条件を示す。
（フラッシュカラム条件）
・充填剤：ワコーシルＣ−３００（４０〜６４μｍ）（和光純薬工業（株）製）
・充填量：溶媒除去後の反応生成物の重量の１０〜２０倍程度
・移動相：ヘキサン/酢酸エチル=３０／１〜７／３（ｖ／ｖ）
（低極性移動相から高極性移動相へのグラジエント溶出）
Then, by-products and unreacted products generated during the reaction were removed, and purification with a flash column was performed in order to obtain only the target isocyanate compound. The silica gel was dispersed in an organic solvent serving as a mobile phase and packed in a chromatography column tube, and the reaction product was packed from the top. While flowing the mobile phase, collect the effluent at regular intervals, confirm the presence or absence of the target product using TLC, collect the effluent containing only the isocyanate compound, and remove the solvent with a rotary evaporator to remove the isocyanate compound. Obtained. The flash column conditions are shown below.
(Flash column condition)
Filler: Wakosil C-300 (40 to 64 μm) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
-Filling amount: about 10 to 20 times the weight of the reaction product after removal of the solvent-Mobile phase: hexane / ethyl acetate = 30/1-7/3 (v / v)
(Gradient elution from low polarity mobile phase to high polarity mobile phase)
（アミノ化反応）
４つ口フラスコに転移反応により合成したイソシアネート化合物０．０２ｍｏｌを入れ、還流管および温度計を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で加えたイソシアネート化合物の重量の約１０倍程度の１０％硫酸水溶液を加え、８５℃で１時間の撹拌を行った。ＴＬＣを用いて反応の進行を確認後、室温まで冷却し、２８％アンモニア水溶液を加え、反応液の液性を塩基性にした。その後、反応液を分液漏斗に移し、ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。アミン化合物の収率は９７．７％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図３に表す。
(Amination reaction)
Into a four-necked flask, 0.02 mol of an isocyanate compound synthesized by a transfer reaction was added, and after a reflux tube and a thermometer were attached, the flask was purged with argon using a vacuum pump. A 10% sulfuric acid aqueous solution of about 10 times the weight of the isocyanate compound added under argon gas was added, and the mixture was stirred at 85 ° C. for 1 hour. After confirming the progress of the reaction using TLC, the reaction solution was cooled to room temperature, and 28% aqueous ammonia was added to make the reaction liquid basic. Thereafter, the reaction solution was transferred to a separatory funnel, extracted from the aqueous layer three times with hexane, and the organic layer was collected. The organic layer was washed with saturated saline until the liquid became neutral, the organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was removed with a rotary evaporator. The yield of amine compound was 97.7%. The result of the synthesis confirmation by TLC is shown in FIG.
（アルデヒド化反応）
４つ口フラスコに、アミノ化反応により合成したアミン化合物１ｍｏｌを量り入れ、還流管および温度計を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で反応溶媒としてジクロロメタン（ＤＣＭ）とＦＭＰＢＳ１．２ｍｏｌを加えた後、５０℃で２．５時間の還流を行った。その後、ＤＢＵ１．０５ｍｏｌを加え、４０℃で３０分の還流を行った後、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物１．７ｍｏｌを加え、４０℃で３０分間の還流を行った。この還流中にＴＬＣを用いて反応の進行の確認を行った。続いてロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、フラッシュカラムによる精製を行った。なお、精製条件は上記したものと同様とした。ＴＬＣによる合成確認の結果を図４に表す。
(Aldehydation reaction)
Into a four-necked flask, 1 mol of an amine compound synthesized by an amination reaction was weighed, a reflux tube and a thermometer were attached, and then the argon in the flask was replaced using a vacuum pump. Dichloromethane (DCM) and 1.2 PBS FMPBS were added as reaction solvents under argon gas, and then refluxed at 50 ° C. for 2.5 hours. Thereafter, 1.05 mol of DBU was added and refluxed at 40 ° C. for 30 minutes, and 1.7 mol of p-toluenesulfonic acid monohydrate was added and refluxed at 40 ° C. for 30 minutes. During this reflux, the progress of the reaction was confirmed using TLC. Subsequently, the solvent was removed using a rotary evaporator, and purification using a flash column was performed. The purification conditions were the same as described above. The result of the synthesis confirmation by TLC is shown in FIG.
（酸化反応）
４つ口フラスコに、アルデヒド化反応により合成したアルデヒド化合物１ｍｏｌを量り入れ、還流管を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で反応溶媒として、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４／３（ｖ／ｖ））を加えた後、２−メチル−２−ブテン３０ｍｏｌを加えた。その後、若干量の水に溶解させたリン酸二水素ナトリウム２ｍｏｌおよび亜塩素酸ナトリウム４ｍｏｌを加え、室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣを用いて反応の進行を確認後、１０％硫酸水溶液を加え、反応液の液性を酸性にした。次に、反応液を分液漏斗に移し、ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。最後に上記した条件と同様の条件にてフラッシュカラムによる精製を行った。このようにして得られた脂肪酸はＥＰＡと比べ、炭素数が１少ない脂肪酸であり、その収率は８０．３％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図５に表す。
(Oxidation reaction)
Into a four-necked flask, 1 mol of an aldehyde compound synthesized by an aldehyde reaction was weighed, and after a reflux tube was attached, argon substitution in the flask was performed using a vacuum pump. After adding tert-butyl alcohol / water (4/3 (v / v)) as a reaction solvent under argon gas, 30 mol of 2-methyl-2-butene was added. Thereafter, 2 mol of sodium dihydrogen phosphate and 4 mol of sodium chlorite dissolved in a small amount of water were added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. After confirming the progress of the reaction using TLC, a 10% aqueous sulfuric acid solution was added to make the reaction liquid acidic. Next, the reaction solution was transferred to a separatory funnel, extracted from the aqueous layer three times with hexane, and the organic layers were combined. The organic layer was washed with saturated saline until the liquid became neutral, the organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was removed with a rotary evaporator. Finally, purification using a flash column was performed under the same conditions as described above. The fatty acid thus obtained was a fatty acid having 1 fewer carbon atoms than EPA, and the yield was 80.3%. The result of the synthesis confirmation by TLC is shown in FIG.
＜増炭工程＞
（エステル化反応）
４つ口フラスコに、酸化反応で合成した脂肪酸２．９ｍｍｏｌを量り入れ、温度計および還流管を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下でメタノール／硫酸（１００／１）を脂肪酸の重量の１０倍程度加え、６５℃で１時間の加熱還流を行い、ＴＬＣを用いて反応の進行およびメチルエステル化合物の合成を確認した。
<Coal addition process>
(Esterification reaction)
Into a four-necked flask, 2.9 mmol of a fatty acid synthesized by an oxidation reaction was weighed, a thermometer and a reflux tube were attached, and then the argon in the flask was replaced using a vacuum pump. Under argon gas, methanol / sulfuric acid (100/1) was added about 10 times the weight of the fatty acid, heated under reflux at 65 ° C. for 1 hour, and the progress of the reaction and synthesis of the methyl ester compound were confirmed using TLC.
その後、室温まで冷却を行い、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、反応液の液性を中性にした。次に、反応液を分液漏斗に移し、ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。最後に上記した条件と同様の条件にてフラッシュカラムによる精製を行った。メチルエステル化合物の収率は９１．１％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図６に表す。 Then, it cooled to room temperature and added saturated sodium hydrogencarbonate aqueous solution, and made the liquid nature of the reaction liquid neutral. Next, the reaction solution was transferred to a separatory funnel, extracted from the aqueous layer three times with hexane, and the organic layers were combined. The organic layer was washed with saturated saline until the liquid became neutral, the organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was removed with a rotary evaporator. Finally, purification using a flash column was performed under the same conditions as described above. The yield of methyl ester compound was 91.1%. The result of the synthesis confirmation by TLC is shown in FIG.
また、ガスクロマトグラフ−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）によるメチルエステル化合物の合成確認を行った（図７参照）。図７からも明らかなように、脂肪酸から合成したメチルエステル化合物に相当する分子イオンピークが確認された。
（ＧＣ−ＭＳ分析条件）
・分析機器：ＴＲＡＣＥ ＧＣ Ｕｌｔｒａ
（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）
・質量分析計：ＩＴＱ １１００
（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）
・カラム：ＩｎｅｒｔＣａｐ Ｐｕｒｅ−ＷＡＸ（３０ｍ×０．２５ｍｍｉ．ｄ．、膜厚０．２５μｍ）（ジーエルサイエンス（株）製）
・キャリアーガス：Ｈｅ（１．０ｍｌ／ｍｉｎ）
・試薬ガス：メタン
・カラム温度：１５０〜２５０℃
（８０℃で３分間保持、昇温１０℃／ｍｉｎで１５０℃まで、昇温２０／ｍｉｎで２５０℃まで、２５０℃で１５分間保持）
・注入口温度：２５０℃
・注入方法：スプリットモード（スプリット比１００：１）
・注入量：１μｌ
・イオン化方法：化学イオン化法
Moreover, the synthesis | combination confirmation of the methyl ester compound was performed by the gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS) (refer FIG. 7). As is clear from FIG. 7, a molecular ion peak corresponding to a methyl ester compound synthesized from a fatty acid was confirmed.
(GC-MS analysis conditions)
・ Analytical instrument: TRACE GC Ultra
(Manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.)
Mass spectrometer: ITQ 1100
(Manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.)
Column: InertCap Pure-WAX (30 m × 0.25 mm, film thickness 0.25 μm) (manufactured by GL Sciences Inc.)
Carrier gas: He (1.0 ml / min)
-Reagent gas: Methane-Column temperature: 150-250 ° C
(Retained at 80 ° C for 3 minutes, heated to 10 ° C / min to 150 ° C, heated to 20 ° C / 250 ° C, held at 250 ° C for 15 minutes)
・ Inlet temperature: 250 ° C
Injection method: split mode (split ratio 100: 1)
・ Injection volume: 1 μl
・ Ionization method: Chemical ionization method
（還元反応）
４つ口フラスコにＬＡＤ１．０５ｍｏｌを量り入れ、温度計および還流管を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で反応溶媒としてテトラヒドラフラン（ＴＨＦ）を加えた後、滴下漏斗を用いて、エステル化反応で合成しメチルエステル化合物１ｍｏｌを加えた。室温で２時間の撹拌を行い、反応の進行をＴＬＣにて確認した後、酢酸エチルを加え、反応を終息させた。次に１０％硫酸水溶液を加え、反応液を分液漏斗に移した。ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。最後にフラッシュカラムによる精製を行った。アルコール化合物の収率は９６．８％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図８に表す。
(Reduction reaction)
LAD 1.05 mol was weighed into a four-necked flask, a thermometer and a reflux tube were attached, and the flask was purged with argon using a vacuum pump. Tetrahydrafuran (THF) was added as a reaction solvent under argon gas, and then synthesized by an esterification reaction using a dropping funnel, and 1 mol of a methyl ester compound was added. After stirring at room temperature for 2 hours and confirming the progress of the reaction by TLC, ethyl acetate was added to terminate the reaction. Next, 10% sulfuric acid aqueous solution was added, and the reaction solution was transferred to a separatory funnel. Extraction was performed three times from the aqueous layer with hexane, and the organic layers were combined. The organic layer was washed with saturated saline until the liquid became neutral, the organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was removed with a rotary evaporator. Finally, purification using a flash column was performed. The yield of alcohol compound was 96.8%. The result of the synthesis confirmation by TLC is shown in FIG.
（ハロゲン化反応）
４つ口フラスコにトリフェニルホスフィン１．５ｍｏｌを量り入れ、温度計および還流管を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で反応溶媒としてＤＣＭを加え後、臭素１．３ｍｏｌを加え、１時間室温で撹拌を行った。次に、ピリジン１．６ｍｏｌおよびアセトニトリル１．６ｍｏｌを加えた後、アルコール化反応で合成したアルコール化合物１ｍｏｌを滴下漏斗を用いて加えた。その後、２時間室温で撹拌した後、ＴＬＣにて反応の進行を確認し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒の除去を行った。最後に上記した条件と同様の条件にてフラッシュカラムによる精製を行った。臭化アルキル化合物の収率は６４．０％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図９に表す。
(Halogenation reaction)
After 1.5 mol of triphenylphosphine was weighed into a four-necked flask and a thermometer and a reflux tube were attached, the flask was purged with argon using a vacuum pump. DCM was added as a reaction solvent under argon gas, 1.3 mol of bromine was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Next, 1.6 mol of pyridine and 1.6 mol of acetonitrile were added, and then 1 mol of the alcohol compound synthesized by the alcoholation reaction was added using a dropping funnel. Then, after stirring at room temperature for 2 hours, the progress of the reaction was confirmed by TLC, and the solvent was removed using a rotary evaporator. Finally, purification using a flash column was performed under the same conditions as described above. The yield of the alkyl bromide compound was 64.0%. The result of the synthesis confirmation by TLC is shown in FIG.
（カルボキシル化反応）
４つ口フラスコにマグネシウム１．３ｍｏｌを量り入れ、温度計および還流管を取り付けた。真空ポンプを利用し、フラスコ内を減圧状態にするとともに、ヒートガンを用いてフラスコを加熱し、マグネシウムおよびフラスコ内の乾燥を行った。マグネシウム片が乾燥し、フラスコの壁面に付着しないようになったら、フラスコ内のアルゴン置換を行い、アルゴンガス下で反応溶媒としてＴＨＦ、マグネシウムの活性剤としてヨウ素１片、１，２−ジブロモエタン０．１５ｍｏｌを加えた。ヨウ素の色が消えるまで１０分程度室温で撹拌した後、滴下漏斗を用いて、ハロゲン化反応で合成した臭化アルキル化合物１ｍｏｌを加え、室温で２時間撹拌した。
(Carboxylation reaction)
1.3 mol of magnesium was weighed into a four-necked flask, and a thermometer and a reflux tube were attached. A vacuum pump was used to reduce the pressure in the flask, and the flask was heated using a heat gun to dry magnesium and the flask. When the magnesium piece dries and does not adhere to the wall of the flask, the inside of the flask is purged with argon, THF as the reaction solvent under argon gas, iodine 1 piece as the magnesium activator, 1,2-dibromoethane 0 .15 mol was added. After stirring at room temperature for about 10 minutes until the color of iodine disappeared, 1 mol of the alkyl bromide compound synthesized by the halogenation reaction was added using a dropping funnel, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
その後、反応液を１０℃程度まで冷却し、１３ＣＯ２を反応液中に吹き込み、室温で２時間の撹拌を行った。次に１０％硫酸水溶液を加え、反応液を分液漏斗に移した。次いで、ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。最後に上記した条件と同様の条件にてフラッシュカラムによる精製を行った。脂肪酸の収率は４１．７％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図１０に表す。 Thereafter, the reaction solution was cooled to about 10 ° C., 13 CO 2 was blown into the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Next, 10% sulfuric acid aqueous solution was added, and the reaction solution was transferred to a separatory funnel. Subsequently, extraction was performed three times from the aqueous layer with hexane, and the organic layers were combined. The organic layer was washed with saturated saline until the liquid became neutral, the organic layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was removed with a rotary evaporator. Finally, purification using a flash column was performed under the same conditions as described above. The yield of fatty acid was 41.7%. The result of the synthesis confirmation by TLC is shown in FIG.
得られた脂肪酸の構造を質量分析法と核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）分光法により確認した。 The structure of the obtained fatty acid was confirmed by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance ( 13 C-NMR) spectroscopy.
（質量分析法）
カルボキシル化反応により得られた脂肪酸約１０ｍｇをねじ口試験管に量り入れ、１４％ ３フッ化ホウ素／メタノール溶液２ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで激しく混ぜた。１００℃で３０秒間加熱し、室温に戻るまで静置した。そして、ヘキサン１ｍＬ及び飽和食塩水５ｍＬを加えてボルテックスミキサーで激しく混ぜ、有機層を分析用試料としてＧＣ−ＭＳに供した。また、比較用として、出発物質として用いたＥＰＡの分析も行った。その結果を、クロマトグラムおよびマススペクトルにてそれぞれ図１１および１２に表す。図１１から、脂肪酸と、出発物質であるＥＰＡは同じ保持時間でピークが出現しており、これらは同様の構造を有していることが確認された。また、図１２から、脂肪酸では、ＥＰＡより３大きい分子イオンピークが確認され、また、両者のフラグメンテーションパターンが同様であること確認された。これらの結果から、ＥＰＡより分子量が３大きい同位体標識化合物が製造されたことが確認できた。なお、ＧＣ−ＭＳ分析条件は上記したものと同様の条件とした。
(Mass spectrometry)
About 10 mg of the fatty acid obtained by the carboxylation reaction was weighed into a screw test tube, 2 mL of 14% boron trifluoride / methanol solution was added, and the mixture was vigorously mixed with a vortex mixer. The mixture was heated at 100 ° C. for 30 seconds and left to return to room temperature. Then, 1 mL of hexane and 5 mL of saturated saline were added and mixed vigorously with a vortex mixer, and the organic layer was subjected to GC-MS as a sample for analysis. For comparison, EPA used as a starting material was also analyzed. The results are shown in FIGS. 11 and 12 as chromatograms and mass spectra, respectively. From FIG. 11, it was confirmed that the fatty acid and the starting material EPA had peaks with the same retention time, and they had the same structure. Moreover, from FIG. 12, in the fatty acid, the molecular ion peak 3 larger than EPA was confirmed, and it was confirmed that both fragmentation patterns are the same. From these results, it was confirmed that an isotope-labeled compound having a molecular weight 3 larger than that of EPA was produced. The GC-MS analysis conditions were the same as those described above.
（１３Ｃ−ＮＭＲ分光法）
カルボキシル化反応により得られた脂肪酸２０ｍＬ、出発物質であるＥＰＡ２０ｍＬを、それぞれ別の重クロロホルム溶液に溶解させ、ＮＭＲ分析計に供し、吸収スペクトルを下記条件にて測定した。測定結果をそれぞれ図１３および１４に表す。図１３と図１４を比較すると、ほぼ同様のＮＭＲスペクトルとなっているものの、図１３では、重水素（２Ｈ）の導入に起因すると考えられる、３３ｐｐｍ付近のシグナルスピリット、および１３炭素（１３Ｃ）の導入に起因すると考えられる１８０ｐｐｍ付近のシグナル強度の増加が確認された。このことから、脂肪酸のカルボキシル基中の炭素原子が、１３炭素（１３Ｃ）により、カルボキシル基と結合するメチレン基中の水素が重水素（２Ｈ）により標識されたＥＰＡより分子量が３大きい同位体標識化合物が製造されたことが確認できた。また、ＣＨ＝ＣＨ由来の9本のシグナル近傍にトランス由来のシグナルが観察されなかったために全ての二重結合がシス体であることが確認された。
（ＮＭＲ分析条件）
・機器名：ＥＣＡ ５００ＭＨｚ ＦＴ−ＮＭＲ（日本電子株式会社製）
・ＮＭＲデータ処理ソフトウエアー：Ｄｅｌｔａ ＮＭＲ ｓｏｆｔｗａｒｅ
・測定方法：１３Ｃ−ＮＭＲ（標準設定値）
・使用溶媒：重クロロホルム
( 13C -NMR spectroscopy)
20 mL of the fatty acid obtained by the carboxylation reaction and 20 mL of EPA, which is the starting material, were dissolved in separate heavy chloroform solutions, each subjected to an NMR analyzer, and the absorption spectrum was measured under the following conditions. The measurement results are shown in FIGS. 13 and 14, respectively. Comparing FIG. 13 and FIG. 14, although the NMR spectra are almost the same, in FIG. 13, the signal spirit around 33 ppm and 13 carbon ( 13 C), which are considered to be caused by the introduction of deuterium ( 2 H), are obtained. ) Increase in signal intensity around 180 ppm, which is considered to be caused by the introduction. From this fact, the carbon atom in the carboxyl group of the fatty acid is 13 carbon ( 13 C), and the hydrogen in the methylene group bonded to the carboxyl group is an isotope having a molecular weight 3 larger than that of EPA labeled with deuterium ( 2 H). It was confirmed that the body-labeled compound was produced. Moreover, since no signal derived from trans was observed in the vicinity of nine signals derived from CH = CH, it was confirmed that all double bonds were cis-isomers.
(NMR analysis conditions)
-Device name: ECA 500 MHz FT-NMR (manufactured by JEOL Ltd.)
・ NMR data processing software: Delta NMR software
Measurement method: 13 C-NMR (standard setting value)
・ Solvent: Deuterated chloroform
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