JP2016214126A - Method for producing quorum sensing-controlling carrier, quorum sensing-controlling carrier, method for controlling quorum sensing - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微生物間情報伝達機構のひとつである、グラム陰性細菌のクオラムセンシングを制御するクオラムセンシング制御用担体の製造方法、クオラムセンシング制御用担体、及びクオラムセンシングの制御方法に関する。 The present invention relates to a quorum sensing control carrier manufacturing method for controlling quorum sensing of gram-negative bacteria, a quorum sensing control carrier, and a quorum sensing control method, which are one of the information transmission mechanisms between microorganisms.
クオラムセンシングは、細胞密度依存性の遺伝子発現機構である。クオラムセンシングは、例えば、バイオフィルム形成、日和見感染症の病原性因子の生産、活性汚泥菌叢における硝化過程や脱窒過程の促進等、同一のメカニズムで多様な微生物機能を制御する。したがって、多様な微生物機能を制御するためにクオラムセンシングを制御する方法が提案されている。例えば、非特許文献１，２及び特許文献１，２には、クオラムセンシングを阻害する方法が提案されている。 Quorum sensing is a cell density-dependent gene expression mechanism. Quorum sensing controls various microbial functions by the same mechanism, for example, biofilm formation, production of pathogenic factors for opportunistic infections, and promotion of nitrification and denitrification processes in activated sludge flora. Therefore, a method for controlling quorum sensing has been proposed to control various microbial functions. For example, Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Documents 1 and 2 propose methods for inhibiting quorum sensing.
非特許文献１には、グラム陰性細菌のクオラムセンシングにおいて、シグナル伝達物質として合成されるオートインデューサーであるＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を、ヒドロゲルによって固定化したシクロデキストリンに吸着させて、クオラムセンシングを抑制する方法が提案されている。シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等を用いている。 Non-Patent Document 1 adsorbs N-acyl-L-homoserine lactone (AHL), which is an autoinducer synthesized as a signal transmitter, in cyclodextrin immobilized by a hydrogel in quorum sensing of gram-negative bacteria. Thus, a method for suppressing quorum sensing has been proposed. As the cyclodextrin, α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin and the like are used.
特許文献１には、所定の置換基で修飾したシクロデキストリン誘導体によってＡＨＬを再現性よく、高い選択率でトラップし、クオラムセンシングを阻害する方法が提案されている。 Patent Document 1 proposes a method of inhibiting quorum sensing by trapping AHL with high reproducibility and high selectivity by a cyclodextrin derivative modified with a predetermined substituent.
特許文献２には、イタコン酸、架橋剤（ＥＧＤＭＡ）及び１，１−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）を含むイタコン酸系の高分子化合物によってＡＨＬを吸着させ、クオラムセンシングを阻害する方法が提案されている。 Patent Document 2 proposes a method of inhibiting quorum sensing by adsorbing AHL with an itaconic acid-based polymer compound containing itaconic acid, a crosslinking agent (EGDMA) and 1,1-azobis (cyclohexanecarbonitrile). ing.
非特許文献２には、ＡＨＬをトラップすることでクオラムセンシングを抑制する共重合ポリマーについて開示されている。 Non-Patent Document 2 discloses a copolymer that suppresses quorum sensing by trapping AHL.
非特許文献１，２及び特許文献１，２で提案された技術では、グラム陰性細菌のクオラムセンシングを効率よく阻害するために、高濃度の、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体、イタコン酸系の高分子化合物等の水溶液を用いて、グラム陰性細菌に阻害剤を効率よく接触又は作用させなければならないという課題がある。 In the technologies proposed in Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Documents 1 and 2, a high concentration of cyclodextrin, cyclodextrin derivative, itaconic acid-based high concentration is used to efficiently inhibit quorum sensing of gram-negative bacteria. There is a problem that an inhibitor must be efficiently contacted or acted on Gram-negative bacteria using an aqueous solution of a molecular compound or the like.
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的は、グラム陰性細菌等のクオラムセンシングを効率よく制御することができる担体、その製造方法及びクオラムセンシングの制御方法を提供することにある。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and its object is to provide a carrier capable of efficiently controlling quorum sensing such as gram-negative bacteria, a method for producing the same, and a method for controlling quorum sensing. Is to provide.
本発明は以下の特徴を有する。
（１）少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有し物理架橋可能な重合体を溶媒中に存在させる工程と、
前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程と、
を含む、クオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（２）さらに、前記重合体を物理架橋させる工程を含む、（１）に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（３）前記吸着部は、複数の前記疎水性部分が相互作用することにより形成される、（１）又は（２）に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（４）前記重合体は、前記疎水性部分を含むモノマーと前記親水性部分を含むモノマーとを共重合して得られるものであって、前記親水性部分を含むモノマーと前記疎水性部分を含むモノマーの共重合割合が、モル比において、９９／１〜５０／５０である、（１）〜（３）のいずれかに記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（５）前記疎水性部分を含むモノマーが、アクリル酸メチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ステアリル、Ｎ−ドデシルアクリルアミドからなる群から選択され、
前記親水性部分を含むモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（６）前記重合体はセルロース誘導体を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法により製造されたことを特徴とするクオラムセンシング制御用担体。
（８）微生物の周囲に（７）に記載のクオラムセンシング制御用担体を存在させることによってクオラムセンシングを制御することを特徴とするクオラムセンシングの制御方法。
（９）前記クオラムセンシングの制御が、前記クオラムセンシング制御用担体がオートインデューサーをトラップすることによって行われる、（８）に記載のクオラムセンシングの制御方法。
（１０）前記微生物がグラム陰性細菌であり、前記オートインデューサーがＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンであり、前記クオラムセンシング制御用担体を用いて前記グラム陰性細菌のクオラムセンシングを抑制する、（９）に記載のクオラムセンシングの制御方法。
The present invention has the following features.
(1) causing a polymer having at least one hydrophobic portion and at least one hydrophilic portion and capable of physical crosslinking to be present in a solvent;
Forming an adsorbing portion for adsorbing an autoinducer in the polymer;
A method for producing a quorum sensing control carrier.
(2) The method for producing a quorum sensing control carrier according to (1), further comprising a step of physically crosslinking the polymer.
(3) The method for producing a quorum sensing control support according to (1) or (2), wherein the adsorption part is formed by the interaction of a plurality of the hydrophobic parts.
(4) The polymer is obtained by copolymerizing a monomer containing the hydrophobic part and a monomer containing the hydrophilic part, and includes the monomer containing the hydrophilic part and the hydrophobic part. The method for producing a quorum sensing control support according to any one of (1) to (3), wherein the monomer copolymerization ratio is 99/1 to 50/50 in terms of molar ratio.
(5) the monomer containing the hydrophobic portion is selected from the group consisting of methyl acrylate, butyl acrylate, 2-ethylhexyl acrylate, stearyl acrylate, and N-dodecylacrylamide;
The quorum sensing control according to any one of (1) to (4), wherein the monomer including the hydrophilic portion is selected from the group consisting of acrylic acid, methacrylic acid, and 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid. A method for producing a carrier.
(6) The method for producing a quorum sensing control carrier according to any one of (1) to (3), wherein the polymer includes a cellulose derivative.
(7) A quorum sensing control carrier manufactured by the manufacturing method according to any one of (1) to (6).
(8) A quorum sensing control method comprising controlling quorum sensing by allowing the quorum sensing control carrier according to (7) to exist around a microorganism.
(9) The quorum sensing control method according to (8), wherein the quorum sensing control is performed by the quorum sensing control carrier trapping an auto inducer.
(10) The microorganism is a gram-negative bacterium, the autoinducer is N-acyl-L-homoserine lactone, and the quorum sensing control carrier is used to suppress quorum sensing of the gram-negative bacterium. The quorum sensing control method according to (9).
本発明に係るクオラムセンシング制御用担体の製造方法によれば、オートインデューサーを高い選択率でトラップし得るクオラムセンシング制御用担体を提供できる。また、本発明に係るクオラムセンシングの制御方法によれば、グラム陰性細菌等のクオラムセンシングを効率よく制御することができる。 According to the method for manufacturing a quorum sensing control carrier according to the present invention, it is possible to provide a quorum sensing control carrier capable of trapping the auto inducer with high selectivity. Moreover, according to the control method of quorum sensing which concerns on this invention, quorum sensing, such as gram-negative bacteria, can be controlled efficiently.
以下、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体、その製造方法、及びクオラムセンシングの制御方法について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実験例に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。 Hereinafter, the quorum sensing control carrier, the manufacturing method thereof, and the quorum sensing control method according to the present invention will be described in detail. In addition, this invention is not limited to the following embodiment and an experiment example, It can implement in various deformation | transformation within the range of the summary.
［クオラムセンシング制御用担体の製造方法］
本発明に係るクオラムセンシング制御用担体の製造方法は、少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有し物理架橋可能な重合体を溶媒に添加する工程と、前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程と、を含むことを特徴とする。
[Method of manufacturing carrier for quorum sensing control]
A method for producing a quorum sensing control carrier according to the present invention comprises adding a polymer having at least one hydrophobic part and at least one hydrophilic part and capable of physical cross-linking to a solvent; And a step of forming an adsorbing part for adsorbing the auto inducer.
ここで、「クオラムセンシング」について説明する。
微生物間情報伝達機構、いわゆるクオラムセンシングでは、微生物はオートインデューサーと呼ばれる化学物質を介して周囲の菌体密度を感知し、菌体密度がある一定値を超えたことを感知すると、様々な遺伝子の転写・発現が活性化される。
例えば、グラム陰性細菌はオートインデューサーとしてアシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）類を生産することが知られている。
Here, “quorum sensing” will be described.
In the microbial information transmission mechanism, so-called quorum sensing, microorganisms detect the density of surrounding cells via a chemical substance called an autoinducer, and when it detects that the cell density exceeds a certain value, Gene transcription / expression is activated.
For example, gram-negative bacteria are known to produce acylated homoserine lactones (AHL) as autoinducers.
グラム陰性細菌例であるセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ−１株は、２種類のＡＨＬ、すなわちＮ−ヘキサノイル、Ｎ−３−オキソ−ヘキサノイルホモセリンラクトンを、同一の細胞内で生産する。
セラチア・マルセッセンスＡＳ−１株が増殖し菌体密度が増大すると、ＡＨＬはそれぞれの菌から放出されるため、累積してセラチア・マルセッセンスＡＳ−１株の周囲のＡＨＬ濃度が増大する。
The Serratia marcescens AS-1 strain, which is an example of a gram-negative bacterium, produces two types of AHL, namely N-hexanoyl and N-3-oxo-hexanoyl homoserine lactone, in the same cell.
As the Serratia marcescens AS-1 strain grows and the cell density increases, AHL is released from each bacterium, and thus the AHL concentration around the Serratia marcescens AS-1 strain increases.
一方、菌の内部にはＡＨＬと複合体を形成するレセプタータンパク質が存在する。菌体数が定足数（ｑｕｏｒｕｍ）に達したとき、クオラムセンシング関連遺伝子が発現し、ＡＨＬ−レセプター複合体が形成され安定に存在できるようになる。このＡＨＬ−レセプター複合体は、クオラムセンシング関連遺伝子のプロモーター領域と相互作用し、その下流にある遺伝子の転写活性が増大する。 On the other hand, a receptor protein that forms a complex with AHL exists inside the bacterium. When the number of cells reaches a quorum, a quorum sensing-related gene is expressed, and an AHL-receptor complex is formed and can stably exist. This AHL-receptor complex interacts with the promoter region of a quorum sensing-related gene, increasing the transcriptional activity of the gene downstream thereof.
セラチア・マルセッセンスＡＳ−１株の場合、Ｎ−ヘキサノイル、Ｎ−３−オキソ−ヘキサノイルホモセリンラクトンのいずれか１種類又は２種類以上が、セラチア・マルセッセンスＡＳ−１株のレセプターと複合体を形成すると、プロディジオシン合成酵素が生産され、この酵素により赤色色素プロディジオシンが生産される。すなわち、赤色色素プロディジオシンにより、クオラムセンシングの活性化を確認することが可能となる。 In the case of Serratia marcescens AS-1 strain, any one or more of N-hexanoyl and N-3-oxo-hexanoyl homoserine lactone form a complex with the receptor of Serratia marcescens AS-1 strain. Prodigiosin synthase is produced, which produces the red pigment prodigiosin. That is, the activation of quorum sensing can be confirmed by the red dye prodigiosin.
なお、オートインデューサーとしては、グラム陰性細菌の反応においては主にアシル化ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）類が挙げられる。また、グラム陽性細菌の反応ではペプチドが、放線菌の反応ではＡ−ファクター等が挙げられる。 In addition, as an autoinducer, acylated homoserine lactone (AHL) is mainly mentioned in the reaction of Gram-negative bacteria. Moreover, a peptide is mentioned in the reaction of Gram positive bacteria, A-factor etc. are mentioned in the reaction of actinomycetes.
本実施形態においては、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成し得るクオラムセンシング制御用担体の製造方法、及び、クオラムセンシング制御用担体にオートインデューサーを吸着させ、微生物の周囲からオートインデューサーを排除することにより、クオラムセンシングを制御する方法を説明する。 In the present embodiment, a method for producing a quorum sensing control support capable of forming an adsorption part for adsorbing an auto inducer, and an auto inducer is adsorbed on a quorum sensing control support, A method for controlling quorum sensing by eliminating the auto inducer will be described.
本実施形態のクオラムセンシング制御用担体の製造方法においては、少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有し物理架橋可能な重合体を、溶媒中に存在させる工程を有する。
すなわち本実施形態において、少なくとも１つの疎水性部分と少なくとも１つの親水性部分とを有する重合体は、図１（ｂ）に示すような物理架橋による３次元網目構造を形成する。この３次元網目構造は、相互に連通する多数の空孔を構成する。前記物理架橋点は、溶媒中における疎水性部分の凝集又は集積や、親水性部分における水素結合が挙げられる。例えば、親水性部分における水素結合による物理架橋点の例として、二分子のカルボキシル基は水素結合により二量体を形成し物理架橋点となり得る。
The method for producing a quorum sensing control carrier of this embodiment includes a step of allowing a polymer having at least one hydrophobic part and at least one hydrophilic part, which can be physically crosslinked, to exist in a solvent.
That is, in this embodiment, the polymer having at least one hydrophobic portion and at least one hydrophilic portion forms a three-dimensional network structure by physical crosslinking as shown in FIG. This three-dimensional network structure forms a large number of holes communicating with each other. Examples of the physical crosslinking point include aggregation or accumulation of hydrophobic portions in a solvent and hydrogen bonding in hydrophilic portions. For example, as an example of a physical cross-linking point by hydrogen bonding in the hydrophilic portion, bimolecular carboxyl groups can form dimers by hydrogen bonding and become physical cross-linking points.
前記空孔は、親水性部分の接近により形成されたものであり、大きさとしても、化学構造としても、オートインデューサーの取り込みに適したものであることが本発明者らにより見いだされた。すなわち、本実施形態のクオラムセンシング制御用担体の製造方法はさらに、前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程を有する。この場合、前記空孔がオートインデューサーを吸着するための吸着部であることが好ましい。またこの場合、前記空孔の大きさは、前記オートインデューサーを収容し得る大きさであることが好ましい。 The present inventors have found that the pores are formed by the approach of the hydrophilic portion, and are suitable for taking up the auto inducer, both in size and in chemical structure. That is, the method for producing a quorum sensing control carrier of this embodiment further includes a step of forming an adsorption part for adsorbing an autoinducer in the polymer. In this case, it is preferable that the hole is an adsorption part for adsorbing the auto inducer. In this case, the size of the holes is preferably a size that can accommodate the auto inducer.
吸着部を形成させる工程として具体的な工程は、例えば、時間の付与、外部エネルギーの付与、等が挙げられる。すなわち、溶媒中に重合体を溶解した場合に、物理架橋が形成されるための時間を付与したり、溶媒中で共重合を行う場合には、重合体が形成されるまでの時間を付与したりすることが挙げられる。さらには、前記溶媒中において、攪拌・加熱・光照射等の外部エネルギーを付与することにより、前記吸着部が好適に形成されると考えられる。
本実施形態においては、この吸着部にオートインデューサーを吸着させることにより、菌体周囲からオートインデューサーを排除し、微生物間情報伝達機構であるクオラムセンシングを制御することが可能となる。
Specific steps for forming the adsorbing part include, for example, giving time, applying external energy, and the like. That is, when a polymer is dissolved in a solvent, a time for forming a physical crosslink is given, or when copolymerization is carried out in a solvent, a time until the polymer is formed is given. Can be mentioned. Furthermore, it is considered that the adsorbing portion is suitably formed by applying external energy such as stirring, heating, and light irradiation in the solvent.
In the present embodiment, the auto-inducer is adsorbed to the adsorbing part, thereby eliminating the auto-inducer from the surroundings of the cells and controlling quorum sensing that is an inter-microorganism information transmission mechanism.
なお、本実施形態において「オートインデューサーを吸着する」とは、例えば、前記吸着部にオートインデューサーが捕捉（トラップ）されることを意味する。言い換えると、オートインデューサーは、前記吸着部において、重合体のカルボキシル基等と、水素結合、疎水性相互作用、又は、イオン結合により結合し、保持されていると考えられる。
さらには、前記吸着部は、重合体の疎水性部分がオートインデューサーと、水素結合、疎水性相互作用、又は、イオン結合により結合し、保持されていると考えられる。
In the present embodiment, “adsorbing the auto inducer” means, for example, that the auto inducer is captured (trapped) by the adsorption unit. In other words, the auto-inducer is considered to be bonded and held in the adsorbing part by a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, or an ionic bond with the carboxyl group of the polymer.
Furthermore, it is considered that the adsorbing portion is held by the hydrophobic portion of the polymer being bonded to the autoinducer through hydrogen bonding, hydrophobic interaction, or ionic bonding.
本実施形態において、さらに前記重合体を物理架橋させる工程を含んでいてもよい。この場合、前記重合体を物理架橋させる工程として具体的には、上記吸着部を形成させる工程と同様、例えば、時間の付与、外部エネルギーの付与、等が挙げられる。
本実施形態において、物理架橋により形成された空孔がオートインデューサーを吸着するための吸着部として作用することが好ましいが、必ずしもこの形態に限定される必要はなく、例えば、重合体において、オートインデューサーが結合し得る官能基等を吸着部としてもよい。
In the present embodiment, the method may further include a step of physically crosslinking the polymer. In this case, specifically, the step of physically crosslinking the polymer includes, for example, application of time, application of external energy, and the like, similar to the step of forming the adsorption portion.
In the present embodiment, it is preferable that the pores formed by physical cross-linking act as an adsorbing part for adsorbing the auto inducer, but it is not necessarily limited to this form. For example, in the polymer, It is good also considering the functional group etc. which an inducer can couple | bond as an adsorption part.
本実施形態において、「親水性部分」は、水によって溶媒和されることによって安定的な分散状態を維持させることができる性質を有する部分をいい、「疎水性部分」はそのような性質を有さない部分をいう。
この場合、「親水性部分」としては例えば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、チオール基、スルホ基、アミド結合、リン酸基、イミダゾール基、グアニジノ基、エステル結合等が挙げられる。
また、「疎水性部分」としては例えば、炭素数１以上２０以下のアルキル基又はアルケニル基、フェニル基、フェノキシ基、コレステリル基、フタリル基、スクシニル基等が挙げられる。
In the present embodiment, the “hydrophilic portion” refers to a portion having a property capable of maintaining a stable dispersion state by being solvated with water, and the “hydrophobic portion” has such a property. The part not to be said.
In this case, examples of the “hydrophilic moiety” include a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, a cyano group, a thiol group, a sulfo group, an amide bond, a phosphoric acid group, an imidazole group, a guanidino group, and an ester bond.
Examples of the “hydrophobic moiety” include an alkyl group or an alkenyl group having 1 to 20 carbon atoms, a phenyl group, a phenoxy group, a cholesteryl group, a phthalyl group, and a succinyl group.
本実施形態における重合体は、例えば図２に示すような、疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させて得ることができる。 The polymer in the present embodiment can be obtained by copolymerizing a monomer having a hydrophobic portion and a monomer having a hydrophilic portion as shown in FIG.
又は、本実施形態における重合体は、多糖類であってもよい。多糖類としては、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、ＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）、ＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）、ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ＨＰＭＣＰ（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）等のセルロース誘導体；ヒドロキシプロピルグアーガム、キサンタンガム、スクレログルカンガム等のグアーガムおよびその誘導体；等を挙げることができる。
また、本実施形態における重合体は、一つの繰り返し単位中に疎水性部分と親水性部分を共に有する重合体であってもよい。この場合、例えば、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体；ポリビニルメチルエーテル類；等を挙げることができる。
Alternatively, the polymer in the present embodiment may be a polysaccharide. Examples of polysaccharides include cellulose derivatives such as CMC (carboxymethylcellulose), HEC (hydroxyethylcellulose), HPC (hydroxypropylcellulose), HPMC (hydroxypropylmethylcellulose), HPMCP (hydroxypropylmethylcellulose phthalate); hydroxypropyl guar gum, xanthan gum, Guar gum such as loglucan gum and derivatives thereof; and the like.
Further, the polymer in the present embodiment may be a polymer having both a hydrophobic portion and a hydrophilic portion in one repeating unit. In this case, for example, poly N-substituted acrylamide derivatives; polyvinyl methyl ethers;
上述した重合体において、疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させる場合、疎水性部分を有するモノマー（疎水性モノマー）は、例えば、メチルアクリレート（アクリル酸メチル、ＭＡ）、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、ブチルアクリレート（アクリル酸ブチル、ＢＡ）、ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート（アクリル酸２−エチルヘキシル、ＥＨＡ）、オクチルアクリレート、ラウリルアクリレート、ステアリルアクリレート（アクリル酸ステアリル、ＳＡ）等のアルキルアクリレート（アクリル酸アルキル）、フェニルアクリレート、フェノキシエチルアクリレート、アクリロニトリル、グリシジルアクリレート、ｐ−トリルアクリレート、ソルビルアクリレート、スチレン、α−メチルスチレン、置換スチレン、ベンジルメタクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、オクチルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルメタクリレート等のアルキルメタアクリレート（メタアクリル酸アルキル）、フェニルメタクリレート、フェノキシエチルメタクリレート、メタクリロニトリル、グリシジルメタクリレート、ｐ−トリルメタクリレート、ソルビルメタクリレート、Ｎ−ドデシルアクリルアミド等のＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、酢酸ビニル、酪酸ビニル、および安息香酸ビニル等が挙げられる。 In the above-described polymer, when a monomer having a hydrophobic portion and a monomer having a hydrophilic portion are copolymerized, the monomer having a hydrophobic portion (hydrophobic monomer) is, for example, methyl acrylate (methyl acrylate, MA ), Ethyl acrylate, propyl acrylate, butyl acrylate (butyl acrylate, BA), hexyl acrylate, 2-ethylhexyl acrylate (2-ethylhexyl acrylate, EHA), octyl acrylate, lauryl acrylate, stearyl acrylate (stearyl acrylate, SA) Alkyl acrylate (alkyl acrylate), phenyl acrylate, phenoxyethyl acrylate, acrylonitrile, glycidyl acrylate, p-tolyl acrylate, sorbyl acrylate , Alkyl methacrylates such as styrene, α-methylstyrene, substituted styrene, benzyl methacrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, propyl methacrylate, butyl methacrylate, hexyl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, octyl methacrylate, lauryl methacrylate, stearyl methacrylate (methacrylic) Acid alkyl), phenyl methacrylate, phenoxyethyl methacrylate, methacrylonitrile, glycidyl methacrylate, p-tolyl methacrylate, sorbyl methacrylate, N-alkyl acrylamide such as N-dodecyl acrylamide, N-alkyl methacrylamide, vinyl acetate, vinyl butyrate, And vinyl benzoate.
上記の場合、重合性、入手のし易さ、使用形態等の観点から、疎水性モノマーとしては、アクリル酸（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル又はＮ−アルキルアクリルアミドが好ましく、メチルアクリレート（アクリル酸メチル、ＭＡ）、ブチルアクリレート（アクリル酸ブチル、ＢＡ）、２−エチルヘキシルアクリレート（アクリル酸２−エチルヘキシル、ＥＨＡ）、ステアリルアクリレート（アクリル酸ステアリル、ＳＡ）、Ｎ−ドデシルアクリルアミド、がさらに好ましく使用される。 In the above case, from the viewpoints of polymerizability, availability, usage pattern, etc., the hydrophobic monomer is preferably an alkyl (C1-C18) acrylate or N-alkyl acrylamide, and methyl acrylate (methyl acrylate, MA ), Butyl acrylate (butyl acrylate, BA), 2-ethylhexyl acrylate (2-ethylhexyl acrylate, EHA), stearyl acrylate (stearyl acrylate, SA), and N-dodecylacrylamide are more preferably used.
上述した重合体において、疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させる場合、親水性部分を有するモノマー（親水性モノマー）としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ヒドロキシアルキルアクリレート、アルコキシアルキルアクリレート、アミノアルコキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタクリレート、アルコキシアルキルメタクリレートおよびアミノアルコキシアルキルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等が挙げられる。 In the above-described polymer, when a monomer having a hydrophobic portion and a monomer having a hydrophilic portion are copolymerized, examples of the monomer having a hydrophilic portion (hydrophilic monomer) include acrylic acid, methacrylic acid, and acrylonitrile. Methacrylonitrile, hydroxyalkyl acrylate, alkoxyalkyl acrylate, aminoalkoxyalkyl acrylate, hydroxyalkyl methacrylate, alkoxyalkyl methacrylate and aminoalkoxyalkyl methacrylate, 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid, and the like.
上記の場合、疎水性モノマーと同様の観点で、親水性モノマーとしてはアクリル酸、メタクリル酸、又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸が好ましく使用される。 In the above case, acrylic acid, methacrylic acid, or 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid is preferably used as the hydrophilic monomer from the same viewpoint as the hydrophobic monomer.
疎水性部分を有するモノマー（疎水性モノマー）と、親水性部分を有するモノマー（親水性モノマー）とを共重合させる場合、疎水性モノマーと親水性モノマーの種類の選択方法は特に制限されるものではない。疎水性モノマーの種類により、クオラムセンシング制御用担体へのオートインデューサーのトラップ性能が異なるため、所望のトラップ性能により適宜疎水性モノマーと親水性モノマーの種類を選択可能である。 When copolymerizing a monomer having a hydrophobic part (hydrophobic monomer) and a monomer having a hydrophilic part (hydrophilic monomer), the method for selecting the type of hydrophobic monomer and hydrophilic monomer is not particularly limited. Absent. Since the trap performance of the auto-inducer to the quorum sensing control carrier differs depending on the type of hydrophobic monomer, the type of hydrophobic monomer and hydrophilic monomer can be appropriately selected depending on the desired trap performance.
疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させる場合、共重合方法は特に限定されないが、共重合反応後の残存モノマーの量が少ないことから、本実施形態においてはラジカル重合法が特に好ましく使用される。当該方法では、疎水性モノマーと親水性モノマーを溶媒中で混合し、当該混合物を、緩衝作用を有する水溶液及び２５℃で水と任意の割合で混和する水性溶媒との混合溶媒中でラジカル重合する。 In the case of copolymerizing a monomer having a hydrophobic part and a monomer having a hydrophilic part, the copolymerization method is not particularly limited, but since the amount of residual monomer after the copolymerization reaction is small, in this embodiment, radicals are used. A polymerization method is particularly preferably used. In this method, a hydrophobic monomer and a hydrophilic monomer are mixed in a solvent, and the mixture is radically polymerized in a mixed solvent of an aqueous solution having a buffering action and an aqueous solvent mixed with water at an arbitrary ratio at 25 ° C. .
この方法で用いる、前記緩衝作用を有する水溶液としては、通常使用される緩衝溶液であれば特に限定されないが、具体的には、塩化カリウム−塩酸溶液、フタル酸水素カリウム−塩酸溶液、リン酸二水素カリウム−リン酸水素二ナトリウム溶液、クエン酸水素カリウム−クエン酸溶液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム酸溶液等が例示できる。 The aqueous solution having a buffering action used in this method is not particularly limited as long as it is a commonly used buffer solution. Specifically, potassium chloride-hydrochloric acid solution, potassium hydrogen phthalate-hydrochloric acid solution, diphosphoric acid phosphate, and the like. Examples thereof include potassium hydrogen phosphate-disodium hydrogen phosphate solution, potassium hydrogen citrate-citric acid solution, and sodium carbonate-sodium hydrogen carbonate solution.
さらに、この方法で用いる、２５℃で水と任意の割合で混和する水性溶媒としては、具体的にはメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜３のアルコール、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール等のジオール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエチレングリコールモノアルキルエーテル、テトラヒドロフラン等が挙げられる。 Furthermore, as the aqueous solvent used in this method and miscible with water at an arbitrary ratio at 25 ° C., specifically, alcohols having 1 to 3 carbon atoms such as methyl alcohol, ethyl alcohol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, Examples thereof include ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, diols such as ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol and 1,3 butylene glycol, ethylene glycol monoalkyl ethers such as ethylene glycol monomethyl ether and ethylene glycol monoethyl ether, and tetrahydrofuran.
これらの水性溶媒の中では、重合反応が進行しやすいことから、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等の炭素数１〜３のアルコールが特に好ましい。 Among these aqueous solvents, alcohols having 1 to 3 carbon atoms such as methanol, ethanol, n-propanol, and isopropanol are particularly preferable because the polymerization reaction easily proceeds.
上述した重合体において、疎水性部分を有するモノマーと、親水性部分を有するモノマーとを共重合させる場合、共重合の割合は、クオラムセンシング制御用担体が有効なオートインデューサー吸着性能を有する観点から、モル比において、親水性モノマー／疎水性モノマー＝９９／１〜５０／５０であることが好ましい。
図３に示すように、共重合割合を変化させることにより本実施形態のクオラムセンシング制御用担体のオートインデューサーのトラップ性能を向上させることが可能となるが、使用形態等によって適宜共重合割合を選択することが可能である。
In the above-described polymer, when a monomer having a hydrophobic portion and a monomer having a hydrophilic portion are copolymerized, the copolymerization ratio is a viewpoint that the quorum sensing control carrier has effective auto-inducer adsorption performance. Therefore, it is preferable that the molar ratio is hydrophilic monomer / hydrophobic monomer = 99/1 to 50/50.
As shown in FIG. 3, it becomes possible to improve the trap performance of the autoinducer of the quorum sensing control carrier of this embodiment by changing the copolymerization ratio. Can be selected.
なお、疎水性モノマーが５０ｍｏｌ％を超えると、本実施形態のクオラムセンシング制御用担体が良好なオートインデューサーのトラップ性能を有しなくなるため、好ましくない。 If the hydrophobic monomer exceeds 50 mol%, the quorum sensing control carrier of this embodiment does not have a good auto-inducer trapping performance, which is not preferable.
本実施形態において、重合体として多糖類を使用する場合、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、ＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）、ＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）、ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ＨＰＭＣＰ（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）等のセルロース誘導体を使用することが好ましい。該セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピル基、メトキシ基、フタリル基、アセチル基、スクシニル基、ヘキサヒドロフタリル基、カルボキシベンゾイル基、テトラヒドロフタロイル基、マレイル基又はトリメリロイル基を有していてもよい。この場合、１グルコースあたりの置換された水酸基の平均数（平均置換度）は０．０１以上であることが好ましい。 In this embodiment, when a polysaccharide is used as the polymer, CMC (carboxymethylcellulose), HEC (hydroxyethylcellulose), HPC (hydroxypropylcellulose), HPMC (hydroxypropylmethylcellulose), HPMCP (hydroxypropylmethylcellulose phthalate), etc. It is preferable to use a cellulose derivative. The cellulose derivative may have a hydroxypropyl group, methoxy group, phthalyl group, acetyl group, succinyl group, hexahydrophthalyl group, carboxybenzoyl group, tetrahydrophthaloyl group, maleyl group or trimelliloyl group. In this case, the average number of substituted hydroxyl groups per glucose (average substitution degree) is preferably 0.01 or more.
本実施形態において、重合体として一つの繰り返し単位中に疎水性部分（疎水性官能基）と親水性部分（親水性官能基）を共に有する化合物を用いる場合、疎水性官能基と親水性官能基との割合は、樹脂粒子が、水溶液中において分散体として安定に存在する観点から、モル比において、親水性官能基／疎水性官能基＝９９．９／０．１〜０／１００であることが好ましい。 In this embodiment, when a compound having both a hydrophobic part (hydrophobic functional group) and a hydrophilic part (hydrophilic functional group) in one repeating unit is used as the polymer, the hydrophobic functional group and the hydrophilic functional group are used. From the viewpoint of stably presenting the resin particles as a dispersion in an aqueous solution, the ratio is: hydrophilic functional group / hydrophobic functional group = 99.9 / 0.1-0 / 100 Is preferred.
本実施形態において、疎水性モノマーと親水性モノマーとの共重合は、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、アゾビスイソブチロニトリル等のラジカル重合開始剤の存在下に行なわれる。 In the present embodiment, the copolymerization of the hydrophobic monomer and the hydrophilic monomer is performed in the presence of a radical polymerization initiator such as benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, or azobisisobutyronitrile.
その他、必要に応じて、酸化防止剤、紫外線安定剤、可塑剤、熱安定剤、滑剤、帯電防止剤、難燃剤、流滴剤、抗菌剤、防臭剤、充填材、着色剤等の添加剤を加えることもできる。 Other additives such as antioxidants, UV stabilizers, plasticizers, heat stabilizers, lubricants, antistatic agents, flame retardants, drips, antibacterial agents, deodorants, fillers, and coloring agents as necessary. Can also be added.
［クオラムセンシング制御用担体］
次に、本実施形態におけるクオラムセンシング制御用担体について以下に説明する。
本実施形態におけるクオラムセンシング制御用担体は、上述した重合体の組成物より得られる。
本実施形態において、クオラムセンシング制御用担体の形状は特に限定されないが、取り扱い易さの観点から、例えばビーズ状やフィルム状が挙げられる。
ビーズ状にする場合には、クオラムセンシング制御用担体用の重合体の種類によっては、ただ液体中に溶解するだけで数十ｎｍ程度以上のビーズが得られる。
また、スプレー等の液滴吐出装置を用いて重合体溶液を蒸留水等の液体中に噴霧・吐出することにより、ビーズ状とすることが可能である。
さらに、スプレードライヤー等を使用して重合体溶液を空気等の気体中に噴霧乾燥し、ビーズ状とすることも可能である。この場合、得られたビーズ状のクオラムセンシング制御用担体を水等の溶媒に分散させて使用することができる。
[Quorum sensing control carrier]
Next, the quorum sensing control carrier in this embodiment will be described below.
The quorum sensing control carrier in this embodiment is obtained from the polymer composition described above.
In the present embodiment, the shape of the quorum sensing control carrier is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of handling, examples thereof include a bead shape and a film shape.
In the case of using beads, depending on the type of polymer for the quorum sensing control carrier, beads of about several tens of nanometers or more can be obtained simply by dissolving in a liquid.
Moreover, it can be made into a bead shape by spraying and discharging the polymer solution into a liquid such as distilled water using a droplet discharge device such as a spray.
Further, the polymer solution can be spray-dried into a gas such as air using a spray dryer or the like to form beads. In this case, the obtained bead-like quorum sensing control carrier can be used by dispersing in a solvent such as water.
一方で、本実施形態のクオラムセンシング制御用担体をフィルム状とする場合の製造方法も特に限定されるものではないが、例えば重合体溶液をガラスシャーレ等の容器に注いだ後に溶媒を蒸発させ、キャストフィルムとしてもよいし、重合体溶液を押出機から押し出して、押し出しフィルムとしてもよい。 On the other hand, the production method in the case where the quorum sensing control carrier of the present embodiment is in the form of a film is not particularly limited. For example, after pouring the polymer solution into a container such as a glass petri dish, the solvent is evaporated. A cast film may be used, or the polymer solution may be extruded from an extruder to form an extruded film.
本実施形態のクオラムセンシング制御用担体は、少なくともその表面にオートインデューサーを吸着するための吸着部を含むことが好ましい。クオラムセンシング制御用担体の形状をビーズ状やフィルム状とした場合、少なくともその表面に吸着部が存在することにより、オートインデューサーがトラップされ易くなるためである。
本実施形態のクオラムセンシング制御用担体のオートインデューサーのトラップ性能の観点から、上記表面の厚さは、０．１μｍ以上であることが好ましい。
The quorum sensing control carrier of the present embodiment preferably includes an adsorption part for adsorbing the auto inducer on at least the surface thereof. This is because when the shape of the quorum sensing control support is a bead or film, the auto-inducer is easily trapped by the presence of an adsorbing portion at least on the surface thereof.
From the viewpoint of the trap performance of the auto inducer of the quorum sensing control carrier of the present embodiment, the thickness of the surface is preferably 0.1 μm or more.
［クオラムセンシングの制御方法］
次に、本発明に係るクオラムセンシングの制御方法について説明する。
上記クオラムセンシング制御用担体を使用したクオラムセンシングの制御方法としては、微生物周囲に上記クオラムセンシング制御用担体を存在させることによって行う。これにより、上記クオラムセンシング制御用担体が微生物周囲のオートインデューサーを高い選択率でトラップするので、クオラムセンシング関連遺伝子の発現が抑制され、結果としてクオラムセンシングの制御を行うことが可能となる。
[Quorum sensing control method]
Next, a quorum sensing control method according to the present invention will be described.
The quorum sensing control method using the quorum sensing control carrier is performed by allowing the quorum sensing control carrier to exist around a microorganism. As a result, the quorum sensing control carrier traps autoinducers around microorganisms with a high selectivity, so that the expression of quorum sensing related genes is suppressed, and as a result, quorum sensing can be controlled. Become.
すなわち、微生物周囲に上記クオラムセンシング制御用担体を存在させる方法として、例えばクオラムセンシング制御用担体を微生物を含む液体中へ浸漬させてオートインデューサーをトラップさせることが可能である。
この場合、図４に示すように、クオラムセンシング制御用担体の添加濃度を変化させることによりオートインデューサーのトラップ性能を調節することが可能である。添加濃度としては、特に制限はされないが、好ましいトラップ性能を付与するためには、クオラムセンシング制御用担体の質量濃度（ｗｔ％）として、少なくとも０．０１ｗｔ％以上を添加することが好ましい。
That is, as a method for allowing the quorum sensing control carrier to exist around the microorganism, for example, the auto inducer can be trapped by immersing the quorum sensing control carrier in a liquid containing the microorganism.
In this case, as shown in FIG. 4, it is possible to adjust the trap performance of the auto inducer by changing the addition concentration of the quorum sensing control support. The concentration to be added is not particularly limited, but in order to give preferable trapping performance, it is preferable to add at least 0.01 wt% or more as the mass concentration (wt%) of the quorum sensing control support.
本実施形態のクオラムセンシングの制御方法においては、微生物がグラム陰性細菌であり、オートインデューサーがＡＨＬ（Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン）であることが好ましい。これにより、オートインデューサーのトラップがさらに高い効率で行われるようになり、その結果、本発明に係るクオラムセンシングの制御方法を適用する意義が大きくなる。 In the quorum sensing control method of this embodiment, it is preferable that the microorganism is a gram-negative bacterium and the autoinducer is AHL (N-acyl-L-homoserine lactone). As a result, the auto-inducer trap is performed with higher efficiency, and as a result, the significance of applying the quorum sensing control method according to the present invention is increased.
グラム陰性細菌としては、例えば、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属細菌、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌等を挙げることができる。 Examples of the Gram-negative bacteria include Serratia bacteria, Pseudomonas bacteria, Aeromonas bacteria, Chromobacterium bacteria, and Sinorhizobium bacteria. .
より具体的には、セラチア属細菌としては、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＳ−１株、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＵＵ−３株等のセラチア・マルセッセンス等を挙げることができる。 More specifically, examples of Serratia bacteria include Serratia marcescens such as Serratia marcescens AS-1 strain and Serratia marcescens UU-3 strain.
また、シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１株等のシュードモナス・エルギノーサや、シュードモナス・クロロラフィス・サブエスピー・オーランティアカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＵＵ−1５株等のシュードモナス・クロロラフィス等を挙げることができる。 Examples of the genus Pseudomonas include, for example, Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain and other Pseudomonas aeruginosa strains, Pseudomonas chlorolafis subsp. Pseudomonas chlorolafis etc. can be mentioned.
エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属細菌としては、例えば、エロモナス・エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＵＵ−６株、エロモナス・エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＵＵ−７株、等のエロモナス・エスピー等を挙げることができる。 Examples of the bacteria belonging to the genus Aeromonas include Aeromonas sp. Such as Aeromonas sp. UU-6, Aeromonas sp. UU-7, and the like.
クロモバクテリウム属細菌としては、例えば、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＡＴＣＣ１２４７２株等のクロモバクテリウム・ビオラセウム等を挙げることができる。 Examples of the genus Chromobacterium include Chromobacterium violaceum such as Chromobacterium violaceum ATCC 12472 strain.
シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌としては、シノリゾビウム・エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）ＵＵ−１２株、シノリゾビウム・エスピー（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）ＵＵ−１３株等のシノリゾビウム・エスピー等を挙げることができる。 Examples of bacteria belonging to the genus Sinorhizobium include Sinorizobium sp. Such as Sinorhizobium sp. UU-12 strain and Sinorhizobium sp. UU-13 strain.
グラム陰性細菌としてセラチア菌を用いる場合のクオラムセンシング制御の確認方法について図５を用いて説明する。
セラチア菌は、室温で培養すると鮮やかな赤色色素（Ｐｒｏｄｉｇｉｏｓｉｎ）を生産することが知られている。このため、赤色色素の生産量を測定することにより、クオラムセンシングの制御度合いを見積もることができる。
すなわち、セラチア菌のオートインデューサーであるＡＨＬを、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体でトラップすることにより、セラチア菌が各細胞間の情報伝達（クオラムセンシング）をすることができなくなり、その活性が落ちて、赤色色素の生産量が減少する。
A method for confirming quorum sensing control when Serratia bacteria is used as a gram-negative bacterium will be described with reference to FIG.
Serratia bacteria are known to produce a bright red pigment (Prodigiosin) when cultured at room temperature. For this reason, the control degree of quorum sensing can be estimated by measuring the production amount of a red pigment.
That is, by trapping AHL, which is an autoinducer of Serratia bacterium, with the quorum sensing control carrier according to the present invention, Serratia bacterium cannot transmit information between each cell (Quorum sensing), Its activity is reduced and the production of red pigment is reduced.
すなわち、クオラムセンシングの阻害度合いが大きければ大きいほど赤色色素の生産量が少なくなる。このため、セラチア菌を培養した場合に生産される赤色色素の量を測定することによりクオラムセンシングの阻害度合いを見積もることができる。そして、赤色色素の生産量は、所定の波長における吸光度を利用して測定することができる。 That is, the greater the degree of inhibition of quorum sensing, the less red pigment is produced. Therefore, the degree of inhibition of quorum sensing can be estimated by measuring the amount of red pigment produced when Serratia fungus is cultured. And the production amount of a red pigment | dye can be measured using the light absorbency in a predetermined wavelength.
また、グラム陰性細菌としてクロモバクテリウム菌を用いる場合、図６に示す方法でクオラムセンシング制御の確認を行うこともできる。
すなわち、クロモバクテリウム菌は、室温で培養すると鮮やかな紫色色素（ｖｉｏｌａｃｅｉｎ）を生産し、菌体外へ放出することが知られている。このため、紫色色素の生産量を測定することにより、クオラムセンシングの制御度合いを見積もることができる。
クロモバクテリウム菌のオートインデューサーであるＡＨＬを、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体でトラップすることにより、クロモバクテリウム菌が各細胞間の情報伝達（クオラムセンシング）をすることができなくなり、その活性が落ちて、紫色色素の生産量が減少する。
In addition, when chromobacteria are used as gram-negative bacteria, quorum sensing control can be confirmed by the method shown in FIG.
That is, it is known that chromobacteria produce a vivid violet pigment when cultured at room temperature, and release it outside the cell. For this reason, the degree of control of quorum sensing can be estimated by measuring the amount of purple pigment produced.
By trapping AHL, which is an autoinducer of chromobacterium, with the quorum sensing control carrier according to the present invention, chromobacterium can transmit information between cells (quorum sensing). Disappears, its activity drops and the production of purple pigment decreases.
この場合、クオラムセンシングの阻害度合いが大きければ大きいほど紫色色素の生産量が少なくなる。このため、クロモバクテリウム菌を培養した場合に生産される紫色色素の量を測定することによりクオラムセンシングの阻害度合いを見積もることができる。そして、紫色色素の生産量は、所定の波長における吸光度を利用して測定することができる。 In this case, the greater the degree of inhibition of quorum sensing, the less purple pigment is produced. Therefore, the degree of inhibition of quorum sensing can be estimated by measuring the amount of purple pigment produced when Chromobacterium is cultured. And the production amount of a purple pigment | dye can be measured using the light absorbency in a predetermined wavelength.
本発明に係るクオラムセンシングの制御方法の効果の一つは、微生物を殺菌することなく、病原性を抑制できる点にある。従来から使用されている抗生物質は、殺菌を行うことによって病原性の抑制を行うという手法を採用しているが、薬剤耐性菌の出現を避けることができないという問題がある。
本発明に係るクオラムセンシングの制御方法では、薬剤耐性菌の出現を考慮しなくてよい上、細菌毒性を低く抑えることが可能となる。
One of the effects of the quorum sensing control method according to the present invention is that pathogenicity can be suppressed without sterilizing microorganisms. Conventionally used antibiotics employ a technique of suppressing pathogenicity by sterilization, but there is a problem that the appearance of drug-resistant bacteria cannot be avoided.
In the quorum sensing control method according to the present invention, it is not necessary to consider the appearance of drug-resistant bacteria, and it is possible to keep bacterial toxicity low.
本発明に係るクオラムセンシングの制御方法においては、クオラムセンシング制御用担体を液体中へ浸漬させてオートインデューサーをトラップさせることが可能である。
また、クオラムセンシング制御用担体がフィルム状の場合には、クオラムセンシングの制御が要求される箇所に上記フィルムを貼付して使用することも可能である。
さらには、クオラムセンシング制御用担体の重合体溶液を、クオラムセンシングの制御が要求される箇所に塗布して乾燥させ、クオラムセンシング制御用担体の層を形成させてもよい。例えば、医療用のチューブ内部等にクオラムセンシング制御用担体の層を形成させることにより、チューブ内部に細菌が混入した場合でも、細菌毒性を低く抑えることが可能となる。
In the quorum sensing control method according to the present invention, the quorum sensing control carrier can be immersed in a liquid to trap the auto inducer.
Further, when the quorum sensing control carrier is in the form of a film, it is possible to use the film with the film attached to a place where quorum sensing control is required.
Further, the polymer solution of the quorum sensing control carrier may be applied to a place where quorum sensing control is required and dried to form a quorum sensing control carrier layer. For example, by forming a quorum sensing control carrier layer inside a medical tube or the like, even when bacteria are mixed inside the tube, it is possible to keep bacterial toxicity low.
以上説明した、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体の製造方法、クオラムセンシング制御用担体、及びクオラムセンシング制御方法を用いることによって、ＡＨＬのようなオートインデューサーを、再現性よく高い選択率でトラップすることができるようになる。 By using the quorum sensing control carrier manufacturing method, the quorum sensing control carrier, and the quorum sensing control method according to the present invention described above, an auto inducer such as AHL can be selected with high reproducibility. You will be able to trap at a rate.
以下の実施例等によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
［実施例１］
（ＨＰＭＣＰキャストフィルムの調製）
ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステル（ＨＰＭＣＰ、アルドリッチ製）をアセトンに溶解し１０ｗｔ％溶液とした。この溶液１０ｇを直径９ｃｍのガラスシャーレに静かに注ぎ、２４時間かけて室温でアセトンを蒸発させると透明なキャストフィルムが形成した。ガラスシャーレから取り出し、縦１０ｍｍ・横１０ｍｍに切断した後に蒸留水に浸漬することで、未固定のＨＰＭＣＰを除去し洗浄した。
[Example 1]
(Preparation of HPMCP cast film)
Hydroxypropyl methylcellulose phthalate (HPMCP, manufactured by Aldrich) was dissolved in acetone to obtain a 10 wt% solution. 10 g of this solution was gently poured into a glass petri dish having a diameter of 9 cm, and acetone was evaporated at room temperature over 24 hours to form a transparent cast film. The unfixed HPMCP was removed and washed by immersing in distilled water after taking out from the glass petri dish and cutting into 10 mm length and 10 mm width.
（セラチア菌の培養）
ＬＢ寒天プレートで培養したセラチア マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＡＳ−１）をＬＢ液体培地４ｍＬに植菌し、３０℃で６時間前培養した。その４０μＬを分取し、ＬＢ液体培地と混合し全量を４ｍＬとなるように植菌し本培養した。
次いで、ＨＰＭＣＰキャストフィルム（縦１０ｍｍ・横１０ｍｍ）の１から４枚を、ただちに本培養液４ｍＬに添加した。振盪しながら２５℃で１５時間本培養した。添加するキャストフィルムはあらかじめ電子天秤で秤量し、添加量を質量濃度（ｗｔ％）として解析した。
(Cerratia bacteria culture)
Serratia marcescens AS-1 cultured on an LB agar plate was inoculated into 4 mL of LB liquid medium and pre-cultured at 30 ° C. for 6 hours. 40 μL of this was taken, mixed with LB liquid medium, inoculated to a total volume of 4 mL, and main culture was performed.
Subsequently, 1 to 4 HPMCP cast films (length 10 mm, width 10 mm) were immediately added to 4 mL of the main culture solution. The main culture was performed at 25 ° C. for 15 hours with shaking. The cast film to be added was weighed in advance with an electronic balance, and the added amount was analyzed as the mass concentration (wt%).
（ＡＨＬトラップ性能評価）
マイクロチューブに本培養液１００μＬを採取し蒸留水で１５倍希釈した。６００ｎｍにおける濁度を測定し、得られた値を１５倍することで培養液の菌体密度の指標である菌体濁度（ＯＤ６００）とした。
次に、遠心分離で得られた菌体ペレット全量に、４％の１Ｍ塩酸を含むエタノールを１ｍＬを加え、ボルテックスで菌体を破砕しプロディジオシンを抽出した。
再び１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、別のマイクロチューブに上清２００μＬ、蒸留水８００μＬを加えて５倍希釈した。この試料の５３４ｎｍにおける吸光度を上記と同様に測定し、得られた値を５倍してプロディジオシン量の指標（Ａ）とした。
単位菌体量当たりのプロディジオシン総生産量（Ｐ）をＰ＝Ａ／ＯＤ６００として求めた。ＨＰＭＣＰキャストフィルム未添加におけるプロディジオシン生産量（Ｐ０）で規格化し、それぞれのＨＰＭＣＰキャストフィルム添加条件における相対プロディジオシン生産量Ｐ／Ｐ０を求めた。結果を表１及び図７に示す。
(AHL trap performance evaluation)
100 μL of the main culture solution was collected in a microtube and diluted 15 times with distilled water. Turbidity at 600 nm was measured, and the obtained value was multiplied by 15 to obtain cell turbidity (OD 600 ), which is an index of cell density of the culture solution.
Next, 1 mL of ethanol containing 4% 1M hydrochloric acid was added to the total amount of the cell pellets obtained by centrifugation, and the cells were crushed by vortex to extract prodidiocin.
Centrifugation was again performed at 13,200 rpm for 5 minutes, and 200 μL of the supernatant and 800 μL of distilled water were added to another microtube to dilute 5 times. The absorbance at 534 nm of this sample was measured in the same manner as described above, and the obtained value was multiplied by 5 to obtain an index (A) for the amount of prodidiocin.
The total production amount (P) of prodidiocin per unit cell amount was determined as P = A / OD 600 . It was normalized by the production amount of prodidiocin (P 0 ) when no HPMCP cast film was added, and the relative prodigiosin production amount P / P 0 under each HPMCP cast film addition condition was determined. The results are shown in Table 1 and FIG.
（結果）
ＨＰＭＣＰキャストフィルムを０．９９ｗｔ％添加することで、プロディジオシン生産量は１３％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。また、表１における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ＨＰＭＣＰキャストフィルムの添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体がセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＡＳ−１株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
(result)
By adding 0.99 wt% of HPMCP cast film, the production amount of prodigiosin decreased to 13%. Thereby, it can be seen that the AHL trap is performed well and the control effect of quorum sensing is exhibited. Moreover, as can be seen from the cell turbidity (OD600) in Table 1, the number of cells is hardly changed by addition of the HPMCP cast film. From these results, it is understood that the quorum sensing control carrier according to the present invention does not sterilize Serratia marcescens AS-1 strain and is extremely low in toxicity.
［実施例２］
（ＨＰＭＣＰビーズの調製）
１０ｗｔ％となるようにヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステル（ＨＰＭＣＰ、アルドリッチ製）をアセトンに溶解した。ピペッターを用いてこの溶液１ｇをアセトン／水（５０／５０ｗｔ％）混合溶液１０ｇに一気に添加すると、ただちにＨＰＭＣＰの析出が起こり溶液は白濁した。透析膜(分画分子量１４，０００)を用いて蒸留水中で透析し、アセトンを除去しＨＰＭＣＰビーズを得た。凍結乾燥することで乾燥ＨＰＭＣＰビーズを得た。このＨＰＭＣＰビーズを蒸留水に懸濁させ、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン社製コールターＬＳ−２００）を用いて粒子径分布を評価したところ、平均粒径１μｍの粒子径が観測された。結果を図８に示す。
[Example 2]
(Preparation of HPMCP beads)
Hydroxypropyl methylcellulose phthalate (HPMCP, manufactured by Aldrich) was dissolved in acetone so as to be 10 wt%. When 1 g of this solution was added to 10 g of an acetone / water (50/50 wt%) mixed solution at once using a pipetter, HPMCP immediately precipitated and the solution became cloudy. Dialysis was performed in distilled water using a dialysis membrane (fraction molecular weight: 14,000), and acetone was removed to obtain HPMCP beads. Dry HPMCP beads were obtained by lyophilization. When these HPMCP beads were suspended in distilled water and the particle size distribution was evaluated using a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer (Beckman Coulter LS-200), a particle size with an average particle size of 1 μm was observed. . The results are shown in FIG.
（セラチア菌の培養）
クオラムセンシング制御用担体０．０１〜０．０４ｇを培養液４ｍＬに添加した以外は、上記実施例１と同様に行った。
(Cerratia bacteria culture)
The same procedure as in Example 1 was performed except that 0.01 to 0.04 g of the quorum sensing control carrier was added to 4 mL of the culture solution.
（ＡＨＬトラップ性能評価）
実施例１と同様に行った。結果を表２及び図９に示す。
(AHL trap performance evaluation)
The same operation as in Example 1 was performed. The results are shown in Table 2 and FIG.
（結果）
ＨＰＭＣＰビーズを０．９９ｗｔ％添加することで、プロディジオシン生産量は２８％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。
また、表２における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ＨＰＭＣＰビーズの添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体がセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＡＳ−１株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
(result)
By adding 0.99 wt% of HPMCP beads, the production amount of prodigiosin decreased to 28%. Thereby, it can be seen that the AHL trap is performed well and the control effect of quorum sensing is exhibited.
Further, as can be seen from the turbidity of cells (OD 600 ) in Table 2, the number of cells is hardly changed by addition of HPMCP beads. From these results, it is understood that the quorum sensing control carrier according to the present invention does not sterilize Serratia marcescens AS-1 strain and is extremely low in toxicity.
［実施例３］
（ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズの調製）
アクリル酸（ＡＡｃ）、ドデシルアクリルアミド（ＤＡＡｍ）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）をエタノールに溶解し、それぞれの濃度が１．６ｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｏｌ／Ｌとなる混合溶液を１０ｍＬ調製した。５５℃で２４時間反応し共重合ポリマーｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）を得た。得られたポリマー溶液の全量をエタノール／水[エタノール／水＝５０／５０ｗｔ％]混合溶液１００ｍＬに、激しく撹拌しながら一気に混合すると、ただちにｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）の析出が起こり溶液は白濁した。透析膜(分画分子量１４，０００)を用いて蒸留水中で透析し、エタノールを除去しｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを得た。凍結乾燥することで乾燥ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを得た。このｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを蒸留水に懸濁させ、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン社製コールターＬＳ−２００）を用いて粒子径分布を評価したところ、平均粒径１μｍの粒子径が観測された。結果を図１０に示す。
[Example 3]
(Preparation of poly (AAc / DAAm) beads)
Acrylic acid (AAc), dodecylacrylamide (DAAm), 2,2′-azobis (2-methylpropionitrile) (AIBN) are dissolved in ethanol, and the respective concentrations are 1.6 mol / L, 0.4 mol / L. 10 mL of a mixed solution of 0.02 mol / L was prepared. The mixture was reacted at 55 ° C. for 24 hours to obtain a copolymer polymer poly (AAc / DAAm). When the total amount of the obtained polymer solution was mixed into 100 mL of a mixed solution of ethanol / water [ethanol / water = 50/50 wt%] with vigorous stirring, poly (AAc / DAAm) was immediately precipitated and the solution became cloudy. Dialysis was performed in distilled water using a dialysis membrane (fractionated molecular weight: 14,000), ethanol was removed, and poly (AAc / DAAm) beads were obtained. Dry poly (AAc / DAAm) beads were obtained by lyophilization. The poly (AAc / DAAm) beads were suspended in distilled water, and the particle size distribution was evaluated using a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer (Beckman Coulter LS-200). A diameter was observed. The results are shown in FIG.
（セラチア菌の培養）
クオラムセンシング制御用担体を０．０５〜０．２０ｗｔ％となるように培養液へ添加した以外は、上記実施例１と同様に行った。
(Cerratia bacteria culture)
The same procedure as in Example 1 was performed, except that the quorum sensing control support was added to the culture solution so as to be 0.05 to 0.20 wt%.
（ＡＨＬトラップ性能評価）
実施例１と同様に行った。結果を表３及び図１１に示す。
(AHL trap performance evaluation)
The same operation as in Example 1 was performed. The results are shown in Table 3 and FIG.
（結果）
ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズを０．１５ｗｔ％添加することで、プロディジオシン総生産量は３％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。
また、表３における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズの添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体がセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＡＳ−１株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
(result)
By adding 0.15 wt% of poly (AAc / DAAm) beads, the total production amount of prodigiosin decreased to 3%. Thereby, it can be seen that the AHL trap is performed well and the control effect of quorum sensing is exhibited.
Further, as can be seen from the turbidity of cells (OD 600 ) in Table 3, the number of cells is hardly changed by addition of poly (AAc / DAAm) beads. From these results, it is understood that the quorum sensing control carrier according to the present invention does not sterilize Serratia marcescens AS-1 strain and is extremely low in toxicity.
［実施例４］
（ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズの調製）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、アクリル酸ステアリル（ＳＡ）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）をエタノールに溶解し、それぞれの濃度が０．８ｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．０１ｍｏｌ／Ｌとなる混合溶液を１０ｍＬ調製した。５５℃で２４時間反応し共重合ポリマーｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）を得た。得られたポリマー溶液の全量を蒸留水１００ｍＬに、激しく撹拌しながら一気に混合すると、ただちにｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡの析出が起こり溶液は白濁した。透析膜(分画分子量１４，０００)を用いて蒸留水中で透析し、エタノールを除去しｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを得た。凍結乾燥することで乾燥ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを得た。このｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを蒸留水に懸濁させ、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン社製コールターＬＳ−２００）を用いて粒子径分布を評価したところ、平均粒径０．８μｍの粒子径が観測された。結果を図１２に示す。
[Example 4]
(Preparation of poly (AMPS / SA) beads)
2-Acrylamide-2-methylpropanesulfonic acid (AMPS), stearyl acrylate (SA), and 2,2′-azobis (2-methylpropionitrile) (AIBN) were dissolved in ethanol, and the respective concentrations were set to 0.00. 10 mL of a mixed solution of 8 mol / L, 0.2 mol / L, and 0.01 mol / L was prepared. The mixture was reacted at 55 ° C. for 24 hours to obtain a copolymer polymer poly (AMPS / SA). When the entire amount of the resulting polymer solution was mixed with 100 mL of distilled water all at once with vigorous stirring, poly (AMPS / SA precipitated and the solution became cloudy immediately. Distilled using a dialysis membrane (molecular weight cut off 14,000). Dialysis was performed in water to remove ethanol to obtain poly (AMPS / SA) beads, which were freeze-dried to obtain dried poly (AMPS / SA) beads, which were suspended in distilled water. When the particle size distribution was evaluated using a laser diffraction scattering type particle size distribution analyzer (Beckman Coulter LS-200), an average particle size of 0.8 μm was observed, and the results are shown in FIG. Show.
（セラチア菌の培養）
クオラムセンシング制御用担体を０．０２５〜０．１５ｗｔ％となるように培養液へ添加した以外は、上記実施例１と同様に行った。
(Cerratia bacteria culture)
The same procedure as in Example 1 was performed, except that the quorum sensing control support was added to the culture solution so as to be 0.025 to 0.15 wt%.
（ＡＨＬトラップ性能評価）
実施例１と同様に行った。結果を表４及び図１３に示す。
(AHL trap performance evaluation)
The same operation as in Example 1 was performed. The results are shown in Table 4 and FIG.
（結果）
ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズを０．１５ｗｔ％添加することで、プロディジオシン総生産量は８％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。
また、表４における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズの添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用担体がセラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＡＳ−１株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
(result)
By adding 0.15 wt% of poly (AMPS / SA) beads, the total production amount of prodigiosin decreased to 8%. Thereby, it can be seen that the AHL trap is performed well and the control effect of quorum sensing is exhibited.
In addition, as can be seen from the turbidity (OD 600 ) in Table 4, the number of cells is hardly changed by addition of poly (AMPS / SA) beads. From these results, it is understood that the quorum sensing control carrier according to the present invention does not sterilize Serratia marcescens AS-1 strain and is extremely low in toxicity.
［実施例５］
（ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズの調製）
上記実施例４と同様に行った。
[Example 5]
(Preparation of poly (AMPS / SA) beads)
The same operation as in Example 4 was performed.
（クロモバクテリウム菌の培養）
ＬＢ寒天プレートで培養したクロモバクテリウム ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＡＴＣＣ１２４７２）をＬＢ液体培地４ｍＬに植菌し、３０℃で７時間前培養した。この培養液にＬＢ液体培地を添加して６００ｎｍの濁度を紫外可視分光光度計（日本分光株式会社製Ｖ−５５０）で計測した値を０．７に調整した後に、その４０μＬを分取し、ＬＢ液体培地と混合し全量を４ｍＬとなるように植菌し本培養した。
次いで、クオラムセンシング制御用担体を０．０２５〜０．１５ｗｔ％となるように培養液へ添加し、振盪しながら３０℃で１１時間本培養した。
(Cultivation of Chromobacterium)
Chromobacterium violaceum (Chromobacterium violaceum ATCC12472) cultured on LB agar plates was inoculated into 4 mL of LB liquid medium and pre-cultured at 30 ° C. for 7 hours. After adding LB liquid culture medium to this culture liquid and adjusting the value which measured the turbidity of 600 nm with the ultraviolet visible spectrophotometer (JASCO Corporation V-550) to 0.7, 40 microliters was fractionated. Then, it was mixed with LB liquid medium and inoculated to a total volume of 4 mL, followed by main culture.
Subsequently, the quorum sensing control carrier was added to the culture solution so as to be 0.025 to 0.15 wt%, and main culture was performed at 30 ° C. for 11 hours while shaking.
（ＡＨＬトラップ性能評価）
マイクロチューブに本培養液１００μＬを採取し蒸留水で１５倍希釈した。６００ｎｍにおける濁度を測定し、得られた値を１５倍することで培養液の菌体密度の指標である菌体濁度（ＯＤ６００）とした。
マイクロチューブに培養液２００μＬを採取し、１０ｗｔ％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を１００μＬ加え、さらに水飽和ブタノール９００μＬ添加して混合した。マイクロタイタープレートに上層１５０μＬを採取し、ビオラセインの極大吸収波長である５８５ｎｍにおける吸光度（Ａ）を、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ＰＬＵＳ）を用いて測定した。
単位菌体量当たりのビオラセイン生産量（Ｐ）をＰ＝Ａ／ＯＤ６００として求めた。ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズ未添加におけるビオラセイン総生産量（Ｐ０）で規格化し、それぞれのｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズ添加条件における相対ビオラセイン生産量Ｐ／Ｐ０を求めた。結果を表５及び図１４に示す。
(AHL trap performance evaluation)
100 μL of the main culture solution was collected in a microtube and diluted 15 times with distilled water. Turbidity at 600 nm was measured, and the obtained value was multiplied by 15 to obtain cell turbidity (OD 600 ), which is an index of cell density of the culture solution.
200 μL of the culture solution was collected in a microtube, 100 μL of 10 wt% aqueous sodium dodecyl sulfate was added, and 900 μL of water-saturated butanol was further added and mixed. 150 μL of the upper layer was collected on a microtiter plate, and the absorbance (A) at 585 nm, which is the maximum absorption wavelength of violacein, was measured using a plate reader (SpectraMAX PLUS manufactured by Molecular Devices).
The violacein production amount (P) per unit cell amount was determined as P = A / OD 600 . The violacein total production amount (P 0 ) in the absence of poly (AMPS / SA) beads was normalized, and the relative violacein production amount P / P 0 in each poly (AMPS / SA) bead addition condition was determined. The results are shown in Table 5 and FIG.
（結果）
ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）を０．１５ｗｔ％添加することで、ビオラセイン総生産量は２２％まで低下した。これにより、ＡＨＬのトラップが良好に行われ、クオラムセンシングの制御効果が発揮されることがわかる。
また、表５における菌体濁度（ＯＤ６００）をみてわかるように、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）の添加によっても菌体数はほとんど変わっていない。これらの結果から、本発明に係るクオラムセンシング制御用樹脂粒子がクロモバクテリウム菌（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＡＴＣＣ１２４７２株）を殺菌することがなく、きわめて毒性が低いことがわかる。
(result)
By adding 0.15 wt% of poly (AMPS / SA), the total production of violacein was reduced to 22%. Thereby, it can be seen that the AHL trap is performed well and the control effect of quorum sensing is exhibited.
Moreover, as can be seen from the cell turbidity (OD 600 ) in Table 5, the number of cells is hardly changed by addition of poly (AMPS / SA). From these results, it can be seen that the resin particles for quorum sensing control according to the present invention do not sterilize the bacterium Bacterium virolaceum ATCC12472, and are extremely low in toxicity.
［実施例６］
（ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）キャストフィルム、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）キャストフィルムの調製）
実施例３に示す方法で、エタノールを溶媒としてｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）をラジカル重合した。スライドガラスにポリエチレンテレフタレートフィルム（東レ製ルミラー１０Ｓ）を密着させその上にシリコンゴム製ガスケット（４×６×０．５ｃｍ）を重ね、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）エタノール溶液で満たした。これを恒温乾燥機の内部に静置し６０℃で保持し溶媒を除去すると、透明なキャストフィルムが得られた。実施例４に示す方法で、エタノールを溶媒としてｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）をラジカル重合した。上記ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）と同様に、透明なｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）キャストフィルムを調製した。
[Example 6]
(Preparation of poly (AAc / DAAm) cast film, poly (AMPS / SA) cast film)
By the method shown in Example 3, poly (AAc / DAAm) was radically polymerized using ethanol as a solvent. A polyethylene terephthalate film (Lumirror 10S manufactured by Toray Industries, Inc.) was placed in close contact with the slide glass, and a silicone rubber gasket (4 × 6 × 0.5 cm) was overlaid thereon, which was filled with a poly (AAc / DAAm) ethanol solution. When this was left still in the constant temperature dryer and kept at 60 ° C. to remove the solvent, a transparent cast film was obtained. By the method shown in Example 4, poly (AMPS / SA) was radically polymerized using ethanol as a solvent. A transparent poly (AMPS / SA) cast film was prepared in the same manner as the above poly (AAc / DAAm).
（フロイントリッヒ吸着等温式による解析）
１．２５、０．６２７、０.３１４、０．１５７、０．０７８４ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（Ｃ６ＨＳＬ）水溶液それぞれに、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）キャストフィルム又はｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）キャストフィルム０．０１ｇを浸漬し、２５℃で２４時間静置した。
同様に、実施例３で調製したｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）ビーズ、又は実施例４で調製したｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）ビーズ０．０１ｇを上記濃度のＣ６ＨＳＬ水溶液に添加し、２５℃で２４時間撹拌した。
それぞれの試料のＣ６ＨＳＬ濃度を高速液体クロマトグラフィーシステム（日本分光製ポンプＰＵ−２０８０ｐｌｕｓ、島津製作所製示差屈折率検出器ＲＩＤ６Ａ、島津製作所製クロマトパックＣ−Ｒ８Ａ）にサイズ排除カラム（島津製作所製Ｄｉｏｌ−１５０）を接続し定量した。
(Analysis by Freundlich adsorption isotherm)
1.25, 0.627, 0.314, 0.157, 0.0784 mmol / L N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6HSL) aqueous solution, respectively, poly (AAc / DAAm) cast film or poly (AMPS / SA) ) 0.01 g of cast film was immersed and allowed to stand at 25 ° C. for 24 hours.
Similarly, 0.01 g of the poly (AAc / DAAm) beads prepared in Example 3 or the poly (AMPS / SA) beads prepared in Example 4 was added to the C6HSL aqueous solution having the above concentration and stirred at 25 ° C. for 24 hours. did.
The C6HSL concentration of each sample was measured with a high-performance liquid chromatography system (Nippon Bunko pump PU-2080plus, Shimadzu differential refractive index detector RID6A, Shimadzu chromatographic pack C-R8A) and a size exclusion column (Shimadzu Diol- 150) was connected and quantified.
図１５に示すフロイントリッヒ吸着等温式により、Ｃ６ＨＳＬの吸着量ｑ（μｍｏｌ／ｇ−ｐｏｌｙｍｅｒ）を溶液中のＣ６ＨＳＬ平衡濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対しプロットすると、どの試料でも直線が得られたことがわかる。得られた直線の傾きと切片から求めた吸着容量（Ｋｆ）と親和力（１／ｎ）を表６に示す。 When the adsorption amount q (μmol / g-polymer) of C6HSL is plotted against the C6HSL equilibrium concentration (μmol / L) in the solution by the Freundlich adsorption isotherm shown in FIG. 15, a straight line was obtained in any sample. Recognize. Table 6 shows the adsorption capacity (Kf) and affinity (1 / n) obtained from the slope and intercept of the obtained straight line.
ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）とＣ６ＨＳＬの親和力は０．６〜０．７程度、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）とＣ６ＨＳＬの親和力は０．６〜０．７程度と求まり、担体の形状やポリマーの組成に依存しないことが明らかとなった。
吸着容量は、ｐｏｌｙ（ＡＡｃ／ＤＡＡｍ）で約０．２〜０．７、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）で約１〜２と求まることから、ｐｏｌｙ（ＡＭＰＳ／ＳＡ）担体には、Ｃ６ＨＳＬの吸着サイトが多いことが示された。
The affinity between poly (AAc / DAAm) and C6HSL is about 0.6 to 0.7, and the affinity between poly (AMPS / SA) and C6HSL is about 0.6 to 0.7. It became clear that it was not dependent.
Since the adsorption capacity is about 0.2 to 0.7 for poly (AAc / DAAm) and about 1 to 2 for poly (AMPS / SA), the poly (AMPS / SA) carrier has an adsorption site for C6HSL. It was shown that there are many.
Claims (10)
前記重合体内に、オートインデューサーを吸着するための吸着部を形成させる工程と、
を含む、クオラムセンシング制御用担体の製造方法。 Presenting a physically crosslinkable polymer in a solvent having at least one hydrophobic portion and at least one hydrophilic portion;
Forming an adsorbing portion for adsorbing an autoinducer in the polymer;
A method for producing a quorum sensing control carrier.
前記親水性部分を含むモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のクオラムセンシング制御用担体の製造方法。 The monomer containing the hydrophobic moiety is selected from the group consisting of methyl acrylate, butyl acrylate, 2-ethylhexyl acrylate, stearyl acrylate, N-dodecylacrylamide;
The quorum sensing control according to any one of claims 1 to 4, wherein the monomer including the hydrophilic portion is selected from the group consisting of acrylic acid, methacrylic acid, and 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid. A method for producing a carrier.
The microorganism is a gram-negative bacterium, the autoinducer is N-acyl-L-homoserine lactone, and suppresses quorum sensing of the gram-negative bacterium using the quorum sensing control carrier. The quorum sensing control method described in 1.
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2019159864A1 (en) * | 2018-02-13 | 2019-08-22 | 住友化学株式会社 | Composition and molded body |
| CN115896089A (en) * | 2022-11-29 | 2023-04-04 | 江南大学 | Preparation and application of high-salinity-resistant quorum sensing quenching bacteria gel carrier |
-
2015
- 2015-05-19 JP JP2015101665A patent/JP2016214126A/en active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019159864A1 (en) * | 2018-02-13 | 2019-08-22 | 住友化学株式会社 | Composition and molded body |
| CN111684019A (en) * | 2018-02-13 | 2020-09-18 | 住友化学株式会社 | Composition and molded article |
| US11459445B2 (en) | 2018-02-13 | 2022-10-04 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Composition and molded body |
| CN115896089A (en) * | 2022-11-29 | 2023-04-04 | 江南大学 | Preparation and application of high-salinity-resistant quorum sensing quenching bacteria gel carrier |
| CN115896089B (en) * | 2022-11-29 | 2023-11-07 | 江南大学 | Preparation and application of high-salinity-resistant quorum sensing quenching sterilization gel carrier |
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