JP2016197041A - Molecular imprinting film, manufacturing method of the same, mold compound, and detection method of steroid hormone compound - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ステロイドホルモン化合物に対する感度が極めて高い分子インプリンティング膜、当該分子インプリンティング膜の製造方法、当該分子インプリンティング膜の製造に用いる鋳型化合物、および、当該分子インプリンティング膜を用いてステロイドホルモン化合物を検出する方法に関するものである。 The present invention relates to a molecular imprinting film having extremely high sensitivity to a steroid hormone compound, a method for producing the molecular imprinting film, a template compound used for producing the molecular imprinting film, and a steroid hormone using the molecular imprinting film. The present invention relates to a method for detecting a compound.
生体内情報伝達物質は、細胞間における情報の伝達などを媒介し、生体の恒常性維持に寄与している。例えば、ステロイドホルモンであるコルチゾールは血圧や血糖値の調整において重要な役割を果たしており、ストレスに敏感に応答して分泌されることが知られている。そのため最近では、精神疾患の予防などのため、コルチゾールをストレスマーカーとして高感度で且つ簡便に検出するための研究が行われている。 In vivo information transmission substances mediate the transmission of information between cells and contribute to the maintenance of homeostasis. For example, cortisol, which is a steroid hormone, plays an important role in regulating blood pressure and blood glucose level, and is known to be secreted in response to stress. Therefore, recently, research for detecting cortisol with high sensitivity and ease as a stress marker has been conducted for the prevention of mental illness and the like.
生体内分子の主な検出法としてはELISA(Enzyme−linked immunosorbent assay)が挙げられる。ELISAは、検出すべき生体内分子に特異的な抗体を固定化し、試料を添加した後、抗体に結合した生体内分子に標識した二次抗体を結合させ、抗体−標的生体内分子−酵素標識抗体の複合体を検出する方法である。その他、金微小電極を自己組織化単分子膜(SAM)で修飾し、その表面に抗コルチゾール抗体を結合させたセンサーが開発されている(非特許文献1,2)。何れにせよ、従来は、生体内分子の検出にあたり抗体や酵素を用いるのが主流であった。 As a main method for detecting in vivo molecules, ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) can be mentioned. ELISA immobilizes an antibody specific to the in vivo molecule to be detected, adds a sample, then binds the labeled secondary antibody to the in vivo molecule bound to the antibody, and antibody-target in vivo molecule-enzyme label This is a method for detecting a complex of antibodies. In addition, a sensor in which a gold microelectrode is modified with a self-assembled monolayer (SAM) and an anti-cortisol antibody is bound to the surface has been developed (Non-patent Documents 1 and 2). In any case, conventionally, antibodies and enzymes have been mainly used for detecting in vivo molecules.
しかし抗体や酵素には、その製造や単離には高コストがかかり、また、不安定であることから保存が難しく、製品化に難があるといった問題がある。 However, antibodies and enzymes are expensive to produce and isolate, and are unstable, so that they are difficult to store and difficult to commercialize.
そこで、生体がもつ緻密な分子認識能を模倣した人工分子認識材料創製法である分子インプリンティング法(MI法)が注目を集めている。MI法は、検出すべき標的分子の存在下でモノマーを重合させ、得られたポリマーから標的分子を除去することにより、標的分子に特異的な認識空間を形成することを基本とする。 Therefore, a molecular imprinting method (MI method), which is a method for creating an artificial molecular recognition material that mimics the precise molecular recognition ability of a living body, has attracted attention. The MI method is based on forming a recognition space specific to a target molecule by polymerizing monomers in the presence of the target molecule to be detected and removing the target molecule from the obtained polymer.
例えば特許文献1には、ステロイドホルモンの存在下、イタコン酸など、当該ステロイドホルモンと相互作用する官能基を2つ以上有するモノマーを重合させた後、得られたポリマーからステロイドホルモンを除去することにより製造される分子インプリンティングポリマーが開示されており、特許文献2には、同様のポリマーからなる微粒子が開示されている。 For example, in Patent Document 1, by polymerizing a monomer having two or more functional groups that interact with the steroid hormone such as itaconic acid in the presence of the steroid hormone, the steroid hormone is removed from the obtained polymer. A molecular imprinting polymer to be produced is disclosed, and Patent Document 2 discloses fine particles made of the same polymer.
また、特許文献3には、検出すべき標的分子と同様の分子構造と比色指示薬を有する置換分子を選択的に受容して結合するための空間を有するコアを含む分子インプリンティングポリマーセンサー装置において、試料液と当該分子インプリンティングポリマーを接触させ、試料液における色の変化により試料液中の標的分子の存在を検出する方法が開示されている。 Patent Document 3 discloses a molecular imprinting polymer sensor device including a core having a space for selectively receiving and binding a substituted molecule having a molecular structure similar to a target molecule to be detected and a colorimetric indicator. Discloses a method of detecting the presence of a target molecule in a sample solution by bringing the sample solution into contact with the molecular imprinting polymer and changing the color of the sample solution.
特許文献4には、コルチゾールに結合した発色団を含む分子インプリンティングポリマーを有するコルチゾール分子検出用センサーが開示されている。当該ポリマーは、コルチゾールの存在下、コルチゾールに結合するリガンドであってビニル基を有するものを重合させることにより製造されている。 Patent Document 4 discloses a sensor for detecting a cortisol molecule having a molecular imprinting polymer containing a chromophore bonded to cortisol. The polymer is produced by polymerizing a ligand that binds to cortisol and has a vinyl group in the presence of cortisol.
上述したように、検出すべき標的分子に特異的な認識空間をポリマー中に形成し、標的分子の検出に用いるMI法は既に知られている。しかし、従来のMI法の選択性や感度は必ずしも十分ではなかった。 As described above, the MI method for forming a recognition space specific to the target molecule to be detected in the polymer and used for detecting the target molecule is already known. However, the selectivity and sensitivity of the conventional MI method are not always sufficient.
そこで本発明は、従来のMI法に比して高い感度でのステロイドホルモン化合物の検出が可能になる分子インプリンティング膜、当該分子インプリンティング膜の製造方法、当該分子インプリンティング膜の製造に用いる鋳型化合物、および、当該分子インプリンティング膜を用いてステロイドホルモン化合物を高い感度で検出できる方法を提供することを目的とする。 Accordingly, the present invention provides a molecular imprinting film that enables detection of a steroid hormone compound with higher sensitivity than the conventional MI method, a method for producing the molecular imprinting film, and a template used for producing the molecular imprinting film. It is an object of the present invention to provide a compound and a method capable of detecting a steroid hormone compound with high sensitivity using the molecular imprinting film.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、まず、検出すべき標的化合物であるステロイドホルモンへ、オキシム基を介してビニル基を導入し、さらにアダマンチル基を導入した鋳型化合物をデザインした。当該鋳型化合物のアダマンチル基を自己組織化単分子膜の表面に結合させたβ−シクロデキストリンと相互作用させることにより、自己組織化単分子膜上に当該鋳型化合物を配向させつつ、当該ビニル基とビニルモノマーとを共重合させてポリマー化した。次に、オキシム基を加水分解することにより鋳型化合物を除去することにより、標的化合物に対する特異的認識空間が配向した分子インプリンティング膜を得ることに成功した。 The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems. First, a template compound in which a vinyl group is introduced into a steroid hormone, which is a target compound to be detected, via an oxime group, and an adamantyl group is further introduced. Designed. By allowing the adamantyl group of the template compound to interact with β-cyclodextrin bound to the surface of the self-assembled monolayer, the template compound is oriented on the self-assembled monolayer, and the vinyl group and A vinyl monomer was copolymerized to form a polymer. Next, the template compound was removed by hydrolyzing the oxime group, thereby succeeding in obtaining a molecular imprinting film in which a specific recognition space for the target compound was oriented.
従来、分子インプリンティングポリマーは、標的化合物と、ビニル基を有し且つ当該標的化合物との親和性を有するリガンド化合物およびビニルモノマーの混合物を共重合させることにより製造されており、標的化合物や特異的認識空間を配向させることは全く考慮されていなかった。その結果、分子インプリンティングポリマーの特性を均一にすることは難しかった。詳しくは、ポリマー中に無秩序状態で存在する鋳型化合物の中には除去できないものもあり、その場合には部分的に特異的認識空間が形成されないことになる。また、形成された特異的認識空間もポリマー中に無秩序状態で形成されているため、ある特異的認識空間が標的化合物の他の特異的認識空間への相互作用を阻害したり、特異的認識空間の重複などにより標的化合物に対する選択性が損なわれるといったことが考えられる。 Conventionally, a molecular imprinting polymer is produced by copolymerizing a target compound, a mixture of a vinyl compound having a vinyl group and an affinity with the target compound, and a vinyl monomer. The orientation of the recognition space was not considered at all. As a result, it was difficult to make the characteristics of the molecular imprinting polymer uniform. Specifically, some template compounds existing in a disordered state in the polymer cannot be removed, and in this case, a specific recognition space is not partially formed. In addition, since the formed specific recognition space is also formed in a disordered state in the polymer, a specific recognition space inhibits the interaction of the target compound with another specific recognition space, or the specific recognition space. It is conceivable that the selectivity for the target compound is impaired due to the duplication of the number.
それに対して本発明に係る分子インプリンティング膜では、特異的認識空間が規則的に配向しているため、おそらくは個々の特異的認識空間が標的化合物に対して有効に作用し、従来の分子インプリンティングポリマーに対して感度が顕著に高まっており、また、その品質は均一である。 On the other hand, in the molecular imprinting film according to the present invention, the specific recognition spaces are regularly oriented, so that each specific recognition space probably acts effectively on the target compound, and the conventional molecular imprinting The sensitivity to the polymer is significantly increased and the quality is uniform.
以下、本発明を示す。 Hereinafter, the present invention will be described.
[1] ステロイドホルモン化合物の分子インプリンティング膜であって、
上記ステロイドホルモン化合物が下記式(I)で表されるものであり、
[1] A molecular imprinting film of a steroid hormone compound,
The steroid hormone compound is represented by the following formula (I):
[式中、
R1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
R3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R4は、1以上の置換基αで置換されているC1-10アルキル基、または水酸基を示し、
R5は、水素原子または水酸基を示し、
R4とR5は一緒になってオキソ基を形成してもよく、
置換基αは、水酸基およびオキソ基から選択される置換基を示す]
自己組織化単分子膜の上にポリマー層が積層されている積層構造を有し、
上記自己組織化単分子膜の表面にはβ−シクロデキストリンが結合しており、
上記ポリマー層には上記ステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間が形成されており、
上記特異的認識空間の一端には上記β−シクロデキストリンが存在し、且つ、上記特異的認識空間の他端にはアミノオキシ基が存在することを特徴とする分子インプリンティング膜。
[Where:
R 1 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a formyl group;
R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an oxo group,
R 3 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a formyl group,
R 4 represents a C 1-10 alkyl group substituted with one or more substituents α, or a hydroxyl group,
R 5 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group,
R 4 and R 5 together may form an oxo group,
The substituent α represents a substituent selected from a hydroxyl group and an oxo group.
Having a laminated structure in which a polymer layer is laminated on a self-assembled monolayer;
Β-cyclodextrin is bonded to the surface of the self-assembled monolayer,
A specific recognition space for the steroid hormone compound is formed in the polymer layer,
A molecular imprinting membrane, wherein the β-cyclodextrin is present at one end of the specific recognition space, and an aminooxy group is present at the other end of the specific recognition space.
[2] 分子インプリンティングポリマーの特異的認識空間を形成するための鋳型化合物であって、下記式(II)で表されることを特徴とする鋳型化合物。 [2] A template compound for forming a specific recognition space for a molecular imprinting polymer, which is represented by the following formula (II):
[式中、
XとYは、独立してリンカー基を示し、
R1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
R3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R5は、水素原子または水酸基を示し、
R6は、水素原子またはメチル基を示す]
[Where:
X and Y independently represent a linker group,
R 1 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a formyl group;
R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an oxo group,
R 3 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a formyl group,
R 5 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group,
R 6 represents a hydrogen atom or a methyl group]
[3] ステロイドホルモン化合物の分子インプリンティング膜を製造するための方法であって、
金属基板上に自己組織化単分子膜を形成する工程、
上記自己組織化単分子膜の表面にβ−シクロデキストリンを結合させる工程、
上記β−シクロデキストリンに、上記[2]に記載の鋳型化合物のアダマンチル基を相互作用させる工程、
ビニルモノマーを添加し、上記鋳型化合物のビニル基と共重合させる工程、
上記鋳型化合物のオキシム基を加水分解し、上記鋳型化合物のステロイド部分を除去する工程を含むことを特徴とする方法。
[3] A method for producing a molecularly imprinted film of a steroid hormone compound,
Forming a self-assembled monolayer on a metal substrate;
Binding β-cyclodextrin to the surface of the self-assembled monolayer;
A step of allowing the adamantyl group of the template compound according to [2] to interact with the β-cyclodextrin,
Adding a vinyl monomer and copolymerizing with the vinyl group of the template compound,
A method comprising hydrolyzing an oxime group of the template compound and removing a steroid moiety of the template compound.
[4] 試料中におけるステロイドホルモン化合物を検出する方法であって、
上記ステロイドホルモン化合物は、上記[1]で規定されている式(I)で表されるものであり、
溶媒中、上記[1]に記載の分子インプリンティング膜と上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリンティング膜と上記試料との接触による反応系の変化を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
[4] A method for detecting a steroid hormone compound in a sample,
The steroid hormone compound is represented by the formula (I) defined in [1] above,
Contacting the sample with the molecular imprinting film according to [1] in a solvent; and
A method comprising measuring a change in a reaction system due to contact between the molecular imprinting film and the sample.
[5] さらに、上記接触工程の前に、上記分子インプリンティング膜の特異的認識空間に、標識基を有する疑似ステロイドホルモン化合物を挿入する工程を含み、
上記測定工程において、反応系の溶液における標識基の濃度変化を測定する上記[4]に記載の方法。
[5] Furthermore, before the contacting step, including a step of inserting a pseudosteroid hormone compound having a labeling group into the specific recognition space of the molecular imprinting film,
The method according to [4] above, wherein in the measurement step, the concentration change of the labeling group in the solution of the reaction system is measured.
[6] 上記測定工程において、反応系の変化を、表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス法または電気化学インピーダンス法で測定する上記[4]に記載の方法。 [6] The method according to [4] above, wherein in the measurement step, the change in the reaction system is measured by a surface plasmon resonance measurement method, a quartz resonator microbalance method, or an electrochemical impedance method.
本発明において「C1-10アルキル基」とは、炭素数1以上、10以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、s−ブチル、t−ブチル、n−ペンチル、n−ヘキシル、n−ヘプチル、イソヘプチル、n−オクチル、イソオクチル、1,5−ジメチルヘキシル、n−ノナニル、n−デカニルなどである。 In the present invention, the “C 1-10 alkyl group” means a linear or branched monovalent saturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms. For example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, s-butyl, t-butyl, n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl, isoheptyl, n-octyl, isooctyl, 1,5- Dimethylhexyl, n-nonanyl, n-decanyl and the like.
「リンカー基」は、例えば上記化合物(II)においてビニル基やアダマンチル基の自由度を高めることによりそれらの反応性や相互作用能を改善したり、化合物(II)を合成し易くするといった機能を有し、比較的安定な構造をいう。例えば、C1-6アルキレン基、C6-12アリーレン基、アミノ基(−NH−)、エーテル基(−O−)、チオエーテル基(−S−)、カルボニル基(−C(=O)−)、チオニル基(−C(=S)−)、エステル基(−O−C(=O)−または−C(=O)−O−)、アミド基(−NH−C(=O)−または−C(=O)−NH−)、スルホキシド基(−S(=O)−)、スルホニル基(−S(=O)2−)、およびこれら2以上が結合した基を挙げることができる。但し、本発明に係るリンカー基はある程度安定である必要があるので、上記の「これら2以上が結合した基」には、例えばペルオキシド基(−O−O−)など不安定な構造は含まれない。このような不安定な構造や合成不可能な構造は、当業者に公知である。また、リンカー基が過剰に長くなると、検出対象であるステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間の選択性が低下するおそれがあり得るため、リンカー基が2以上の上記基が結合した基である場合、結合した基の数としては15以下が好ましく、10以下がより好ましく、8以下がさらに好ましく、5以下がよりさらに好ましい。 The “linker group” has functions such as improving the reactivity and interaction ability of the compound (II) by increasing the degree of freedom of the vinyl group and adamantyl group, and facilitating the synthesis of the compound (II). It has a relatively stable structure. For example, C 1-6 alkylene group, C 6-12 arylene group, amino group (—NH—), ether group (—O—), thioether group (—S—), carbonyl group (—C (═O) — ), Thionyl group (—C (═S) —), ester group (—O—C (═O) — or —C (═O) —O—), amide group (—NH—C (═O) — Or —C (═O) —NH—), a sulfoxide group (—S (═O) —), a sulfonyl group (—S (═O) 2 —), and a group in which two or more of these are bonded. . However, since the linker group according to the present invention needs to be stable to some extent, the above-mentioned “group having two or more bonded” includes unstable structures such as a peroxide group (—O—O—). Absent. Such unstable structures and structures that cannot be synthesized are known to those skilled in the art. In addition, if the linker group is excessively long, the selectivity of the specific recognition space for the steroid hormone compound to be detected may decrease, so when the linker group is a group in which two or more of the above groups are bound, The number of bonded groups is preferably 15 or less, more preferably 10 or less, further preferably 8 or less, and still more preferably 5 or less.
また、上記ステロイドホルモン化合物(I)および鋳型化合物(II)において、ステロイド骨格のA環における点線は、単結合または無結合を示す。即ち、当該A環は、シクロヘキサンまたは4,5−シクロヘキセンであってもよい。 In the steroid hormone compound (I) and the template compound (II), the dotted line in the A ring of the steroid skeleton indicates a single bond or no bond. That is, the A ring may be cyclohexane or 4,5-cyclohexene.
本発明に係る分子インプリンティング膜では、特定のステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間の方向と位置が揃っており、その配向性が高い。よって、個々の特異的認識空間の標的ステロイドホルモン化合物に対する選択性が均一であり、また、それぞれが有効に利用可能であると考えられる。その上、当該特異的認識空間には、ステロイドホルモン化合物のA環の第3位に存在するカルボニル基とオキシム基や水素結合を形成可能なアミノオキシ基があり、また、ステロイドホルモン化合物の基本骨格であるA〜D環と疎水性相互作用が可能なβ−シクロデキストリン構造も存在する。よって、本発明に係る分子インプリンティング膜は、従来の分子インプリンティングポリマーに比べて特定のステロイドホルモン化合物の検出感度が極めて高いという利点がある。 In the molecular imprinting film according to the present invention, the direction and position of the specific recognition space for a specific steroid hormone compound are aligned, and the orientation is high. Therefore, it is considered that the selectivity for the target steroid hormone compound in each specific recognition space is uniform, and each can be used effectively. In addition, the specific recognition space includes a carbonyl group present at the 3rd position of the A ring of the steroid hormone compound, an oxime group, and an aminooxy group capable of forming a hydrogen bond, and the basic skeleton of the steroid hormone compound. There is also a β-cyclodextrin structure capable of hydrophobic interaction with the A to D rings. Therefore, the molecular imprinting film according to the present invention has an advantage that the detection sensitivity of a specific steroid hormone compound is extremely high as compared with the conventional molecular imprinting polymer.
以下、先ず、本発明に係る分子インプリンティング膜の特異的認識空間を形成するために用いられる鋳型化合物(II)の製造方法につき説明する。 Hereinafter, a method for producing a template compound (II) used for forming a specific recognition space of the molecular imprinting film according to the present invention will be described first.
1.鋳型化合物(II)の製造方法
本発明に係る分子インプリンティング膜は、上記ステロイドホルモン化合物(I)に対して選択性を示すので、その特異的認識空間を形成するための鋳型化合物(II)は、ステロイドホルモン化合物(I)を原料化合物とすることができる。
1. Method for Producing Template Compound (II) Since the molecular imprinting membrane according to the present invention exhibits selectivity for the steroid hormone compound (I), the template compound (II) for forming the specific recognition space is The steroid hormone compound (I) can be used as a raw material compound.
なお、ステロイドホルモン化合物(I)は特に制限されず、その存在・不存在や濃度を測定することによりヒトの疾患、症状、状態などを評価できるものであればよい。例えば、17α−ヒドロキシプロゲステロン、21−デオキシコルチゾール、コルチゾール、コルチゾン、プロゲステロン、11−デオキシコルチコステロン、コルチコステロン、18−ヒドロキシコルチコステロン、アルドステロン、テストステロン、19−ヒドロキシテストステロン、19−オキソテストステロン、アンドロステンジオン、19−ヒドロキシアンドロステンジオン、19−オキソアンドロステンジオン、11β−ヒドロキシアンドロステンジオン、アドレノステロン、アンドロスタンジオン、アンドロステロンなどを挙げることができる。 The steroid hormone compound (I) is not particularly limited as long as it can evaluate a human disease, symptom, condition or the like by measuring the presence / absence or concentration thereof. For example, 17α-hydroxyprogesterone, 21-deoxycortisol, cortisol, cortisone, progesterone, 11-deoxycorticosterone, corticosterone, 18-hydroxycorticosterone, aldosterone, testosterone, 19-hydroxytestosterone, 19-oxotestosterone, Examples include androstenedione, 19-hydroxyandrostenedione, 19-oxoandrostenedione, 11β-hydroxyandrostenedione, adrenosterone, androstanedione, androsterone.
鋳型化合物(II)は、リンカー基であるXおよびYに応じて、ステロイドホルモン化合物(I)から合成することができる。 The template compound (II) can be synthesized from the steroid hormone compound (I) according to X and Y which are linker groups.
例えばアダマンチル基は、ステロイドホルモン化合物(I)のR4および/またはR5における水酸基やオキソ基を、さらに必要であればこれらを官能基変換した上で、リンカー基Yを形成するために、アダマンタン誘導体と反応させることにより導入できる。また、R4および/またはR5における官能基の反応選択性が他の官能基に対して同等または乏しい場合には、他の官能基を選択的に保護しておいてもよい。これら官能基変換、リンカー基Yの形成反応、選択的な保護反応や脱保護反応は、当業者であれば容易に実施できる。例えば、R4中の第一級水酸基と1−アダマンタンカルボン酸を脱水縮合剤により反応させた場合、エステル結合によりアダマンチル基を導入することができる。 For example, an adamantyl group is used to form a linker group Y after converting the hydroxyl group or oxo group in R 4 and / or R 5 of the steroid hormone compound (I) to a functional group if necessary. It can be introduced by reacting with a derivative. Further, when the reaction selectivity of the functional group in R 4 and / or R 5 is the same or poor with respect to the other functional group, the other functional group may be selectively protected. Those skilled in the art can easily perform these functional group conversion, linker group Y formation reaction, selective protection reaction and deprotection reaction. For example, when a primary hydroxyl group in R 4 and 1-adamantanecarboxylic acid are reacted with a dehydration condensing agent, an adamantyl group can be introduced by an ester bond.
また、ビニル基は、リンカー基Xを介してビニル基が導入されているヒドロキシアミン誘導体と、ステロイドホルモン化合物(I)のA環の第3位カルボニル基とを反応させてオキシム基を形成することにより導入することができる。或いは、リンカー基Xを形成するための官能基を有するヒドロキシアミン誘導体とステロイドホルモン化合物(I)のA環の第3位カルボニル基とを反応させてオキシム基を形成した後、ビニル基およびリンカー基Xを形成するための官能基を有する化合物をさらに反応させることにより、ビニル基を導入してもよい。 The vinyl group is formed by reacting a hydroxyamine derivative into which a vinyl group has been introduced via a linker group X with the 3-position carbonyl group of the A ring of the steroid hormone compound (I) to form an oxime group. Can be introduced. Alternatively, after reacting the hydroxylamine derivative having a functional group for forming the linker group X with the 3-position carbonyl group of the A ring of the steroid hormone compound (I) to form an oxime group, the vinyl group and the linker group A vinyl group may be introduced by further reacting a compound having a functional group for forming X.
次に、鋳型化合物(II)を用いて本発明に係る分子インプリンティング膜を製造する方法を説明する。なお、当該製造方法を模式的に示したスキームを図1として示す。 Next, a method for producing the molecular imprinting film according to the present invention using the template compound (II) will be described. In addition, the scheme which showed the said manufacturing method typically is shown as FIG.
2.分子インプリンティング膜の製造方法
(2−1) 自己組織化単分子膜の形成工程
本工程では、金属基板上に自己組織化単分子膜(SAM:Self−Assembled Monolayer)を形成する。SAMは、金属基板へ化学結合していると共に、金属基板上に分子が分子間力により密に且つ規則的に整列していることから、安定で均一である。
2. Manufacturing method of molecular imprinting film (2-1) Formation process of self-assembled monolayer In this step, a self-assembled monolayer (SAM) is formed on a metal substrate. The SAM is stable and uniform because it is chemically bonded to the metal substrate and molecules are closely and regularly aligned on the metal substrate by intermolecular forces.
金属基板を構成する金属としては、金が汎用されているが、銀、銅、白金、パラジウムなども用いることができる。また、ガラス基板やテフロン(登録商標)基板上にこれら金属の薄膜を形成したものも金属基板として利用可能である。 Gold is widely used as the metal constituting the metal substrate, but silver, copper, platinum, palladium, and the like can also be used. Moreover, what formed the thin film of these metals on the glass substrate and the Teflon (trademark) board | substrate can be utilized as a metal substrate.
SAMを形成するための分子としては、通常、炭素数8以上の直鎖アルキルチオール、ジスルフィド、酢酸チオールなどを用いることができ、チオール基などに対する他端には、アミノ基など、次工程でβ−シクロデキストリン基を導入するための官能基を有する化合物を用いる。また、強固なSAMを形成すべく長鎖部分が同一または類似するものである範囲で、β−シクロデキストリン基を導入するための官能基以外の官能基を有する分子を併用してもよい。他の官能基としては、例えば、ビニルモノマーの重合開始作用を有する基を挙げることができる。 As a molecule for forming SAM, linear alkyl thiol having 8 or more carbon atoms, disulfide, thiol acetate thiol and the like can be usually used. -A compound having a functional group for introducing a cyclodextrin group is used. In addition, molecules having a functional group other than the functional group for introducing the β-cyclodextrin group may be used in combination as long as the long chain portion is the same or similar to form a strong SAM. Examples of the other functional group include a group having a polymerization initiating action of a vinyl monomer.
SAMの形成は、常法に従えばよい。例えば、SAM形成分子をエタノールなどに溶解し、得られた溶液に金属基板を常温で30分間以上24時間程度浸漬すれば、当該分子がチオエーテル結合を介して金属基板表面に結合し、且つ分子間力により配向しつつ密に集合し、SAMが形成される。次いで、過剰のSAM形成分子を洗浄により除去した後、乾燥すればよい。 The formation of SAM may be according to a conventional method. For example, when a SAM-forming molecule is dissolved in ethanol or the like and the metal substrate is immersed in the obtained solution for 30 minutes to 24 hours at room temperature, the molecule binds to the surface of the metal substrate via a thioether bond, and the intermolecular The SAM is formed by densely gathering while being oriented by force. Next, excess SAM-forming molecules are removed by washing and then dried.
次工程ではSAMの表面にβ−シクロデキストリンを結合させるが、例えばSAMが非常に密である場合には、かかる結合が難しい場合があり得る。そのような場合には、β−シクロデキストリンの結合を容易にするため、図1に示すように、SAMの表面にいったんリンカー基を導入してもよい。 In the next step, β-cyclodextrin is bound to the surface of the SAM. For example, when the SAM is very dense, such binding may be difficult. In such a case, in order to facilitate the binding of β-cyclodextrin, a linker group may be once introduced on the surface of the SAM as shown in FIG.
(2−2) β−シクロデキストリンの結合工程
本工程では、上記工程(2−1)により金属基板上に形成されたSAM、または当該SAMの表面に導入されたリンカー基に、β−シクロデキストリン(以下、「β−CD」と略記する)を結合させる。
(2-2) β-cyclodextrin binding step In this step, β-cyclodextrin is bonded to the SAM formed on the metal substrate by the above step (2-1) or the linker group introduced on the surface of the SAM. (Hereinafter abbreviated as “β-CD”).
β−CDは、7個のD−グルコースがα(1→4)グルコシド結合により環状に結合した環状オリゴ糖であり、その空洞の大きさから、アダマンタンを選択的に包接するという特性を示す。本発明では、かかる特性を利用する。 β-CD is a cyclic oligosaccharide in which seven D-glucoses are cyclically bonded by α (1 → 4) glucoside bonds, and shows a characteristic that adamantane is selectively included due to the size of the cavity. In the present invention, such a characteristic is used.
β−CDの結合は常法に従えばよい。具体的には、SAM形成分子の末端官能基や、SAM表面に結合したリンカー基の末端官能基と、β−CDに導入した反応性官能基とを反応させればよい。 The binding of β-CD may be according to a conventional method. Specifically, the terminal functional group of the SAM-forming molecule or the terminal functional group of the linker group bonded to the SAM surface may be reacted with the reactive functional group introduced into β-CD.
(2−3) 鋳型化合物(II)の結合工程
本工程では、上記β−CDに鋳型化合物(II)のアダマンチル基を相互作用させる。この際、当該アダマンチル基はβ−CDに包接させるので、鋳型化合物(II)の向きは均一であり、上記SAMの表面に配向されることになる。
(2-3) Template Compound (II) Binding Step In this step, the adamantyl group of the template compound (II) is allowed to interact with the β-CD. In this case, since the adamantyl group is included in β-CD, the orientation of the template compound (II) is uniform and oriented on the surface of the SAM.
(2−4) 共重合工程
本工程では、ビニルモノマーを添加し、SAM表面に配向させた鋳型化合物(II)中のビニル基と共重合させることにより、鋳型化合物(II)を含むポリマー層を形成する。
(2-4) Copolymerization step In this step, a polymer layer containing the template compound (II) is added by adding a vinyl monomer and copolymerizing with a vinyl group in the template compound (II) oriented on the SAM surface. Form.
添加するビニルモノマーは、鋳型化合物(II)中のビニル基と共重合可能なビニル基構造を有するものであれば特に制限されず、適宜選択することができるが、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを好適に用いることができる。2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンはリン脂質と類似した構造を有し、そのポリマーは生体への親和性に優れるため、血液などの生体試料の分析に適しているという利点がある。 The vinyl monomer to be added is not particularly limited as long as it has a vinyl group structure copolymerizable with the vinyl group in the template compound (II), and can be appropriately selected, but 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is preferable. Can be used. Since 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine has a structure similar to that of phospholipid and the polymer is excellent in affinity to a living body, there is an advantage that it is suitable for analysis of biological samples such as blood.
重合条件は、常法に従って設定すればよい。例えば、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは水溶性であるので、水系溶媒に、少なくとも上記工程(2−1)〜(2−3)を経た基板と2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを添加し、重合開始剤(SAM表面に結合させたものでもよい)により重合を開始すればよい。反応液には、リビングラジカル重合を行うため、1価の銅化合物や、2価の銅化合物とアスコルビン酸などの還元剤との組み合わせを添加してもよい。重合温度は常温、さらには0℃以上120℃以下程度でよく、重合時間は10分間以上50時間以下程度とすることができる。具体的な重合条件は、重合が十分でないと形成された特異的認識空間の標的化合物への選択性が低下するおそれがあり得る一方で、過剰に重合させると次工程で鋳型化合物を除去できなくなるおそれがあり得るので、予備実験などで決定してもよい。 The polymerization conditions may be set according to a conventional method. For example, since 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is water-soluble, a polymerization initiator is added to an aqueous solvent by adding at least the substrate having undergone the above steps (2-1) to (2-3) and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. The polymerization may be started by (which may be bonded to the SAM surface). In order to perform living radical polymerization in the reaction solution, a monovalent copper compound or a combination of a divalent copper compound and a reducing agent such as ascorbic acid may be added. The polymerization temperature may be normal temperature, or about 0 ° C. to 120 ° C., and the polymerization time may be about 10 minutes to 50 hours. Specific polymerization conditions may reduce the selectivity of the specific recognition space formed to the target compound if the polymerization is not sufficient. On the other hand, if it is excessively polymerized, the template compound cannot be removed in the next step. Since there is a possibility of fear, it may be determined by a preliminary experiment or the like.
重合反応後は、余分な試薬を除去するため、使用した溶媒などでよく洗浄することが好ましい。 After the polymerization reaction, it is preferable to wash thoroughly with the solvent used in order to remove excess reagents.
(2−5) 鋳型化合物の除去工程
本工程では、ビニル基の共重合によりポリマー中に取り込まれている鋳型化合物(II)のオキシム基を加水分解し、鋳型化合物(II)のステロイド部分を除去する。その結果、ポリマー中には、除去されたステロイド部分に特異的な認識空間が形成される。なお、上記ステロイド部分とは、鋳型化合物(II)のうち、リンカー基を介してアダマンチル基が結合したステロイド骨格部分をいう。
(2-5) Template compound removal step In this step, the oxime group of the template compound (II) incorporated into the polymer is hydrolyzed by copolymerization of vinyl groups, and the steroid part of the template compound (II) is removed. To do. As a result, a recognition space specific to the removed steroid moiety is formed in the polymer. In addition, the said steroid part means the steroid frame | skeleton part which the adamantyl group couple | bonded through the linker group among template compound (II).
オキシム基の加水分解は、常法に従えばよい。例えば、20℃以上60℃以下程度の塩酸などの酸性水溶液に、上記工程(2−1)〜(2−4)を経た基板を2時間以上50時間以下程度浸漬すればよい。また、上記ステロイド部分を十分に除去するために、上記ステロイド部分を溶解できる溶媒で基板を十分に洗浄することが好ましい。 The hydrolysis of the oxime group may be performed according to a conventional method. For example, what is necessary is just to immerse the board | substrate which passed through the said process (2-1)-(2-4) for about 2 hours or more and about 50 hours or less in acidic aqueous solutions, such as hydrochloric acid about 20 to 60 degreeC. In order to sufficiently remove the steroid moiety, it is preferable to sufficiently wash the substrate with a solvent capable of dissolving the steroid moiety.
以上で得られる本発明に係る分子インプリンティング膜には、ステロイドホルモン化合物(I)と同様の三次元立体構造を有する特異的認識空間が形成されている。また、この特異的認識空間の方向と位置は均一であり、配向性が高い。また、当該特異的認識空間には、ステロイドホルモン化合物(I)のA環の第3位カルボニル基と相互作用可能なアミノオキシ基が存在し、その他端にはステロイドホルモン化合物(I)の基本骨格であるA〜D環と疎水性相互作用が可能なβ−シクロデキストリン構造も存在する。よって、本発明に係る分子インプリンティング膜は、ステロイドホルモン化合物(I)に対する親和性が極めて高く、その選択的な検出感度が極めて高い。 In the molecular imprinting film according to the present invention obtained as described above, a specific recognition space having the same three-dimensional structure as the steroid hormone compound (I) is formed. Moreover, the direction and position of this specific recognition space are uniform, and the orientation is high. The specific recognition space contains an aminooxy group capable of interacting with the 3-position carbonyl group of the A ring of the steroid hormone compound (I), and the other end of the basic skeleton of the steroid hormone compound (I). There is also a β-cyclodextrin structure capable of hydrophobic interaction with the A to D rings. Therefore, the molecular imprinting membrane according to the present invention has extremely high affinity for the steroid hormone compound (I), and its selective detection sensitivity is extremely high.
以下、本発明に係る分子インプリンティング膜を用いたステロイドホルモン化合物(I)の検出方法につき説明する。 Hereinafter, the detection method of the steroid hormone compound (I) using the molecular imprinting film according to the present invention will be described.
本発明に係るステロイドホルモン化合物(I)の検出方法は、溶媒中、本発明に係る分子インプリンティング膜と試料を接触させる工程(接触工程)、および、上記分子インプリンティング膜と上記試料との接触による反応系の変化を測定する工程(測定工程)を含む。 The method for detecting a steroid hormone compound (I) according to the present invention comprises a step of bringing the molecular imprinting membrane according to the present invention into contact with a sample in a solvent (contacting step), and a contact between the molecular imprinting membrane and the sample. Including a step of measuring a change in the reaction system due to (measurement step).
測定すべき試料は、ステロイドホルモン(I)の存在または不存在を確認すべきもの、また、ステロイドホルモン(I)の濃度を測定すべきものであれば、特に制限されない。例えば、ヒトまたは動物の血液、血清、血漿、尿、唾液などを挙げることができる。 The sample to be measured is not particularly limited as long as the presence or absence of steroid hormone (I) should be confirmed and the concentration of steroid hormone (I) should be measured. Examples thereof include human or animal blood, serum, plasma, urine, saliva and the like.
使用する溶媒は、試料中に含まれる程度の量のステロイドホルモン(I)を溶解できるものであれば特に制限されない。例えば、検出すべきステロイドホルモン(I)を適度に溶解できる緩衝液を用いることができる。また、試料が液体である場合は、試料自体を溶媒として用いてもよく、試料を希釈してもよい。 The solvent to be used is not particularly limited as long as it can dissolve the steroid hormone (I) in an amount contained in the sample. For example, a buffer solution that can appropriately dissolve the steroid hormone (I) to be detected can be used. When the sample is a liquid, the sample itself may be used as a solvent, or the sample may be diluted.
本発明の分子インプリンティング膜と試料とを接触させるには、試料、または溶媒と試料の混合物中に、分子インプリンティング膜を浸漬すればよい。その際の温度は、測定結果が温度により異なることがあり得るので、例えば20℃以上30℃以下、特に25℃など、一定にすることが好ましい。また、浸漬時間は、対象となるステロイドホルモン(I)が特異的認識空間へ十分に取り込まれるよう十分な時間とし、例えば、5分間以上、5時間以下程度とすることができる。 In order to bring the molecular imprinting film of the present invention into contact with the sample, the molecular imprinting film may be immersed in the sample or a mixture of the solvent and the sample. Since the measurement result may vary depending on the temperature, the temperature at that time is preferably constant, for example, 20 ° C. or higher and 30 ° C. or lower, particularly 25 ° C. In addition, the immersion time can be set to a time sufficient for the target steroid hormone (I) to be sufficiently taken into the specific recognition space, for example, about 5 minutes to 5 hours.
本発明に係るステロイドホルモン化合物(I)の検出方法では、分子インプリンティング膜と試料との接触による反応系の変化、即ち、特異的認識空間内に取り込まれたステロイドホルモン化合物(I)を測定することにより、対象であるステロイドホルモン化合物(I)の存在の有無や濃度を求める。 In the method for detecting a steroid hormone compound (I) according to the present invention, the reaction system changes due to contact between the molecular imprinting film and the sample, that is, the steroid hormone compound (I) incorporated into the specific recognition space is measured. Thus, the presence / absence and concentration of the target steroid hormone compound (I) are determined.
反応液の変化を測定する方法としては、例えば、表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス法、電気化学インピーダンス法を挙げることができる。 Examples of the method for measuring the change in the reaction solution include a surface plasmon resonance measurement method, a quartz resonator microbalance method, and an electrochemical impedance method.
本発明に係る分子インプリンティング膜を金属膜上に形成した場合には、そのまま表面プラズモン共鳴測定法で利用することができる。即ち、プリズムに分子インプリンティング膜を形成した金属膜を貼り付け、プリズム側から金属膜へ光を全反射する様に照射すると表面プラズモン共鳴(SPR)が生じることによって反射光強度が低下する入射角度がある。この際の角度は、金属上に形成された分子インプリンティング膜に取り込まれたステロイドホルモン化合物(I)の量、即ち質量変化により鋭敏に変化することから、SPR測定装置では、試料の添加前と添加後における質量変化を反射光強度から測定データ(レゾナンスユニット:1RU=1pg/mm2)として表示することができる。 When the molecular imprinting film according to the present invention is formed on a metal film, it can be used as it is in the surface plasmon resonance measurement method. In other words, when a metal film with a molecular imprinting film is attached to a prism and irradiated so that light is totally reflected from the prism side to the metal film, surface plasmon resonance (SPR) occurs, resulting in a decrease in reflected light intensity. There is. The angle at this time changes sharply according to the amount of steroid hormone compound (I) incorporated into the molecular imprinting film formed on the metal, that is, mass change. The mass change after the addition can be displayed as measurement data (resonance unit: 1 RU = 1 pg / mm 2 ) from the reflected light intensity.
水晶振動子マイクロバランス法と電気化学インピーダンス法も、試料の添加により分子インプリンティング膜の特異的認識空間内に取り込まれたステロイドホルモン化合物(I)の有無や量を、それぞれ水晶振動子の共振周波数の変化とインピーダンスの変化により測定することができる。これら方法の具体的な条件は、常法を適用することができる。 The quartz crystal microbalance method and the electrochemical impedance method also determine the presence and amount of the steroid hormone compound (I) incorporated into the specific recognition space of the molecular imprinting film by adding the sample, respectively. And change in impedance. Conventional methods can be applied to the specific conditions of these methods.
或いは、試料の添加前後における反応系の変化は、反応溶液中における標識化合物の量の変化により測定することもできる。具体的には、試料の添加前、即ち上記接触工程の前に分子インプリンティング膜の特異的認識空間に、標識基を有する疑似ステロイドホルモン化合物を挿入しておく。当該特異的認識空間は測定対象であるステロイドホルモン化合物(I)に対する特異性が高いため、上記接触工程において、特異的認識空間中に存在する疑似ステロイドホルモン化合物は試料中に含まれるステロイドホルモン化合物(I)に追い出される形となり、反応溶液中における疑似ステロイドホルモン化合物の濃度が高まる。よって、上記測定工程において、反応系の溶液における標識基の濃度変化を測定することにより、試料中におけるステロイドホルモン化合物(I)の有無や濃度を求めることが可能になる。 Alternatively, the change in the reaction system before and after the addition of the sample can be measured by a change in the amount of the labeled compound in the reaction solution. Specifically, a pseudo steroid hormone compound having a labeling group is inserted into a specific recognition space of the molecular imprinting film before addition of the sample, that is, before the contact step. Since the specific recognition space has high specificity for the steroid hormone compound (I) to be measured, in the contact step, the pseudo steroid hormone compound existing in the specific recognition space is a steroid hormone compound ( I) is expelled and the concentration of the pseudosteroid hormone compound in the reaction solution increases. Therefore, in the measurement step, it is possible to determine the presence and concentration of the steroid hormone compound (I) in the sample by measuring the concentration change of the labeling group in the reaction system solution.
上記の疑似ステロイドホルモン化合物は、測定対象であるステロイドホルモン化合物(I)に類似する化学構造を有し、特異的認識空間に取り込まれ得るものである一方で、ステロイドホルモン化合物(I)に比べて特異的認識空間に対する親和性は低いものである必要がある。かかる疑似ステロイドホルモン化合物としては、ステロイド骨格と三次元立体構造が近いことが知られているビスフェノール化合物であって標識基を有するものを挙げることができる。 The pseudo steroid hormone compound has a chemical structure similar to that of the steroid hormone compound (I) to be measured and can be taken into a specific recognition space, but compared with the steroid hormone compound (I). The affinity for the specific recognition space needs to be low. Examples of such pseudosteroid hormone compounds include bisphenol compounds that are known to have a three-dimensional structure close to that of the steroid skeleton and have a labeling group.
疑似ステロイドホルモン化合物の標識基としては、例えば蛍光発色基を挙げることができる。 Examples of the labeling group of the pseudosteroid hormone compound include a fluorescent coloring group.
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited by the following examples, but may be appropriately modified within a range that can meet the purpose described above and below. Of course, it is possible to implement them, and they are all included in the technical scope of the present invention.
実施例1: モレキュラーインプリンティングポリマー(MIP)の製造
(1) templete化合物の調製
Example 1: Production of molecular imprinting polymer (MIP) (1) Preparation of a template compound
(1−1) アダマンタンカルボン酸エステルの調製
1−アダマンタンカルボン酸(270mg,1.5mmol)、EDC(285mg,1.5mmol)、およびDMAP(183mg,1.5mmol)をジクロロメタンに溶解させ、氷冷下で撹拌した。そこにコルチゾール(362mg,1.0mmol)を加え、一晩撹拌した。反応の初期には反応混合液は白濁していたが、一晩撹拌した後は淡黄色の溶液になっていた。薄層クロマトグラフィー(展開液−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)のスポットについて、DMAPのRf値は0、コルチゾールのRf値は0.125、目的化合物のRf値は0.375であり、一晩攪拌後でも原料化合物であるコルチゾールのスポットが消えていなかったので、新たに1−アダマンタンカルボン酸(135mg,0.75mmol)、EDC(143mg,0.75mmol)、およびDMAP(92mg,0.75mmol)を追加した。3時間後に薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認したが、原料スポットは依然として消えなかったので、反応を終了し、反応液を飽和クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)で精製した。その後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を白色固体として得た(収量:212mg,収率:40.3%)。
1H-NMR(300.40MHz,CDCl3):δ=5.68(s,1H,4位のH),2.03(s,3H,アダマンタン),1.91(s,6H,アダマンタン),1.72(t,6H,アダマンタン),2.8-1.4(m,コルチゾール)
MALDI-TOF-MS m/z=525.6[M+H+],547.7[M+Na+]
(1-1) Preparation of adamantanecarboxylic acid ester 1-adamantanecarboxylic acid (270 mg, 1.5 mmol), EDC (285 mg, 1.5 mmol), and DMAP (183 mg, 1.5 mmol) were dissolved in dichloromethane and ice-cooled. Stirred under. Cortisol (362 mg, 1.0 mmol) was added thereto and stirred overnight. The reaction mixture was cloudy at the beginning of the reaction, but after stirring overnight, it became a pale yellow solution. Regarding the spot of thin layer chromatography (developing solution-hexane: ethyl acetate = 1: 1), the Rf value of DMAP is 0, the Rf value of cortisol is 0.125, and the Rf value of the target compound is 0.375. Since the spot of cortisol, which is a raw material compound, did not disappear even after stirring overnight, 1-adamantanecarboxylic acid (135 mg, 0.75 mmol), EDC (143 mg, 0.75 mmol), and DMAP (92 mg, 0.75 mmol) were newly added. ) Was added. After 3 hours, the progress of the reaction was confirmed by thin layer chromatography. However, since the raw material spots still did not disappear, the reaction was terminated, and the reaction solution was washed with saturated citric acid, saturated sodium hydrogen carbonate and saturated brine, The residue was purified by column chromatography (eluent-hexane: ethyl acetate = 1: 1). Thereafter, dehydration was performed with anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure, and vacuum drying was performed to obtain the target compound as a white solid (yield: 212 mg, yield: 40.3%).
1 H-NMR (300.40 MHz, CDCl 3 ): δ = 5.68 (s, 1H, 4-position H), 2.03 (s, 3H, adamantane), 1.91 (s, 6H, adamantane), 1.72 (t, 6H, Adamantane), 2.8-1.4 (m, cortisol)
MALDI-TOF-MS m / z = 525.6 [M + H + ], 547.7 [M + Na + ]
(1−2) オキシム化
上記(1−1)で得た アダマンタンカルボン酸エステル(131mg,0.25mmol)を、メタノール:ジクロロメタン=1:1の混合溶媒に溶解させ、そこへピロリジン(124μL,1.5mmol)を加えた。20分後、溶液が黄色に変色したことを確認し、カルボキシメトキシアミン・0.5塩酸塩(54.5mg,0.5mmol)を加え、室温で5時間撹拌した。反応終了時における薄層クロマトグラフィー(展開液−酢酸エチル)のスポットについて、ピロリジンのRf値は0、目的化合物のRf値は0.1であり、原料化合物のRf値=0.725のスポットの消失を確認した。溶媒を減圧留去し、残渣に純水を加え、1M HClにてpH=2.0に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を淡黄色固体として得た(収量:149mg,収率:99.7%)。
1H-NMR(300.40MHz,DMSO-d6):δ=1.99(s,3H,アダマンタン),1.82(s,6H,アダマンタン),1.68(t,6H,アダマンタン),2.5-1.5(m,コルチゾール)
MALDI-TOF-MS m/z=598.8[M+H+],620.8[M+Na+]
(1-2) Oximation The adamantanecarboxylic acid ester (131 mg, 0.25 mmol) obtained in the above (1-1) was dissolved in a mixed solvent of methanol: dichloromethane = 1: 1, and pyrrolidine (124 μL, 1) was added thereto. 0.5 mmol) was added. After 20 minutes, it was confirmed that the solution had turned yellow, carboxymethoxyamine · 0.5 hydrochloride (54.5 mg, 0.5 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. Regarding the spot of thin layer chromatography (developing liquid-ethyl acetate) at the end of the reaction, the Rf value of pyrrolidine is 0, the Rf value of the target compound is 0.1, and the Rf value of the starting compound is 0.725. The disappearance was confirmed. The solvent was distilled off under reduced pressure, pure water was added to the residue, pH was adjusted to 2.0 with 1M HCl, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with brine and dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure, followed by vacuum drying to obtain the target compound as a pale yellow solid (yield: 149 mg, yield: 99.7). %).
1 H-NMR (300.40 MHz, DMSO-d6): δ = 1.99 (s, 3H, adamantane), 1.82 (s, 6H, adamantane), 1.68 (t, 6H, adamantane), 2.5-1.5 (m, cortisol)
MALDI-TOF-MS m / z = 598.8 [M + H + ], 620.8 [M + Na + ]
(1−3) モノマーの結合
上記(1−2)で得たオキシム化合物(149mg,0.25mmol)をメタノールに溶解させ、氷冷下、4−アミノスチレン(44.5mg,0.375mmol)とDMT−MM(138mg,0.5mmol)を加えた。氷浴を外し、常温で一晩反応させた。反応終了時における薄層クロマトグラフィー(展開液−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)のスポットについて、目的化合物のRf値は0.35であり、原料化合物のRf値=0.725のスポットの消失を確認した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルに溶解させ、飽和クエン酸水溶液と食塩水にて洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−ヘキサン:酢酸エチル=1:2)で精製した。その後、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を白色固体として得た(収量:61.0mg,収率:34.9%)。
1H-NMR(300.40MHz,CDCl3):δ=8.02(d,1H,NH),7.50(d,2H,ベンゼン環),7.38(d,2H,ベンゼン環),2.02(s,3H,アダマンタン),1.97(s,6H,アダマンタン),1.73(t,6H,アダマンタン),2.8-1.5(m,コルチゾール)
MALDI-TOF-MS m/z=699.1[M+H+],721.3[M+Na+]
(1-3) Coupling of monomer The oxime compound (149 mg, 0.25 mmol) obtained in (1-2) above was dissolved in methanol, and 4-aminostyrene (44.5 mg, 0.375 mmol) and ice-cooled. DMT-MM (138 mg, 0.5 mmol) was added. The ice bath was removed and the reaction was allowed to proceed overnight at room temperature. Regarding the spot of thin layer chromatography (developing solution-hexane: ethyl acetate = 1: 1) at the end of the reaction, the Rf value of the target compound is 0.35, and the disappearance of the spot of Rf value = 0.725 of the raw material compound It was confirmed. The solvent was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in ethyl acetate, washed with saturated aqueous citric acid solution and brine, and purified by silica gel column chromatography (eluent-hexane: ethyl acetate = 1: 2). Then, after dehydrating with anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure, followed by vacuum drying to obtain the target compound as a white solid (yield: 61.0 mg, yield: 34.9%).
1 H-NMR (300.40 MHz, CDCl 3 ): δ = 8.02 (d, 1H, NH), 7.50 (d, 2H, benzene ring), 7.38 (d, 2H, benzene ring), 2.02 (s, 3H, adamantane ), 1.97 (s, 6H, adamantane), 1.73 (t, 6H, adamantane), 2.8-1.5 (m, cortisol)
MALDI-TOF-MS m / z = 699.1 [M + H + ], 721.3 [M + Na + ]
(2) モノアミノ−β−シクロデキストリンの調製 (2) Preparation of monoamino-β-cyclodextrin
(2−1) トシル化
氷冷下で0.4Mの水酸化ナトリウム水溶液(40mL)にβ−シクロデキストリン(2.0g,1.75mmol)を溶解し、p−トルエンスルホニルクロリド(2.0g,6eq)を加え4間撹拌した。薄層クロマトグラフィー(展開液 − 1−ブタノール:メタノール:水=5:4:3にて目的物のスポット(Rf値=0.6)および二置換体(Rf値=0.65)が確認されたことから、未反応のp−トルエンスルホニルクロリドをろ過で取り除き、ろ液を塩酸水溶液で中和した。その後一晩放置し、成長した結晶を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより目的化合物である6−トシル−β−シクロデキストリンを得た(収量:830mg,収率:36.8%)。
1H-NMR(300.40MHz,DMSO-d6):δ=7.76(d,2H,phenyl),7.43(d,2H,phenyl),5.89-5.57(m,14H,OH),4.91-4.73(m,7H,CD),4.52-4.31(m,7H,CD),3.77(m,42H,CD),2.43(s,3H,Methyl)
MALDI-TOF-MS m/z=1311[M+Na+]
(2-1) Tosylation β-cyclodextrin (2.0 g, 1.75 mmol) was dissolved in 0.4 M aqueous sodium hydroxide solution (40 mL) under ice cooling, and p-toluenesulfonyl chloride (2.0 g, 6 eq) was added and stirred for 4 hours. The target spot (Rf value = 0.6) and disubstituted product (Rf value = 0.65) were confirmed by thin layer chromatography (developing solution-1-butanol: methanol: water = 5: 4: 3). Thus, unreacted p-toluenesulfonyl chloride was removed by filtration, the filtrate was neutralized with an aqueous hydrochloric acid solution, and then allowed to stand overnight, and the grown crystals were collected by vacuum filtration and dried in vacuo. 6-tosyl-β-cyclodextrin was obtained (yield: 830 mg, yield: 36.8%).
1 H-NMR (300.40 MHz, DMSO-d6): δ = 7.76 (d, 2H, phenyl), 7.43 (d, 2H, phenyl), 5.89-5.57 (m, 14H, OH), 4.91-4.73 (m, 7H, CD), 4.52-4.31 (m, 7H, CD), 3.77 (m, 42H, CD), 2.43 (s, 3H, Methyl)
MALDI-TOF-MS m / z = 1311 [M + Na + ]
(2−2) アジド化
上記(2−1)で得た6−トシル−β−シクロデキストリン(830mg,0.644mmol)を80℃の水に懸濁し、アジ化ナトリウム(455mg,7mmol)を加え、80℃のオイルバス中で一晩反応させた。反応終了後、室温までゆっくり冷却した後、この溶液をアセトン(60mL)に注ぎ込み、生じた白色沈殿を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより、目的化合物である6−アジド−β−シクロデキストリンを得た(収量:548mg,収率:73.4%)。
1H-NMR(300.40MHz,DMSO-d6):δ=5.74-5.63(m,14H,OH),4.82(m,7H,CD),4.52-4.46(m,6H,CD),3.62-3.57(m,42H,CD)
MALDI-TOF-MS m/z=1182[M+Na+]
(2-2) Azide 6-tosyl-β-cyclodextrin (830 mg, 0.644 mmol) obtained in (2-1) above was suspended in water at 80 ° C., and sodium azide (455 mg, 7 mmol) was added. And allowed to react overnight in an oil bath at 80 ° C. After the completion of the reaction, the solution was slowly cooled to room temperature, and then this solution was poured into acetone (60 mL), and the resulting white precipitate was collected by vacuum filtration and vacuum-dried to obtain the target compound 6-azido-β-cyclodextrin. (Yield: 548 mg, Yield: 73.4%).
1 H-NMR (300.40 MHz, DMSO-d6): δ = 5.74-5.63 (m, 14H, OH), 4.82 (m, 7H, CD), 4.52-4.46 (m, 6H, CD), 3.62-3.57 ( m, 42H, CD)
MALDI-TOF-MS m / z = 1182 [M + Na + ]
(2−3) アミノ化
上記(2−2)で得た6−アジド−β−シクロデキストリン(548mg,0.472mmol)とトリフェニルホスフィン(262mg,1.0mmol)をDMFに溶解させ、室温で1時間撹拌後、反応液に超純水(Milli−Q水,1mL)を添加し、90℃のオイルバス中で一晩反応させた。薄層クロマトグラフィー(展開液 − 1−ブタノール:メタノール:水=5:4:3にて目的物のスポット(Rf値=0.075)が確認され、原料化合物のスポット(Rf値=0.55)の消失が確認されたことから、反応を終了した。室温までゆっくり冷却した後、この溶液をアセトン(60mL)に注ぎ込み、生じた白色沈殿を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより、目的化合物である6−アミノ−β−シクロデキストリンを得た(収量:430mg,収率:80.4%)。
1H-NMR(300.40MHz,DMSO-d6):δ=5.76-5.65(m,14H,OH),4.82(m,7H,CD),4.46(b,6H,CD),3.63-3.55(m,28H,CD)
MALDI-TOF-MS m/z=1156[M+Na+]
(2-3) Amination 6-Azido-β-cyclodextrin (548 mg, 0.472 mmol) and triphenylphosphine (262 mg, 1.0 mmol) obtained in (2-2) above were dissolved in DMF, and at room temperature. After stirring for 1 hour, ultrapure water (Milli-Q water, 1 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was reacted overnight in an oil bath at 90 ° C. Thin layer chromatography (developing solution-1-butanol: methanol: water = 5: 4: 3) confirmed the target spot (Rf value = 0.075), and the starting compound spot (Rf value = 0.55). The reaction was terminated after the reaction was completed, and after slowly cooling to room temperature, the solution was poured into acetone (60 mL), and the resulting white precipitate was collected by vacuum filtration and dried in vacuo. The compound 6-amino-β-cyclodextrin was obtained (yield: 430 mg, yield: 80.4%).
1 H-NMR (300.40 MHz, DMSO-d6): δ = 5.76-5.65 (m, 14H, OH), 4.82 (m, 7H, CD), 4.46 (b, 6H, CD), 3.63-3.55 (m, 28H, CD)
MALDI-TOF-MS m / z = 1156 [M + Na + ]
(3) モレキュラーインプリンティングポリマー(MIP)の製造
(3−1) 複合自己組織化単分子膜(複合SAM膜)の形成
金/ガラス基板(日本分光社製)を水とエタノールで十分に洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。乾燥した金表面をArエッチング処理した後、0.5mMビス[2−(2−ブロモイソブチリルオキシ)ウンデシル]ジスルフィド+0.5mM 11−アミノ−1−ウンデカンチオール塩酸塩を含むエタノール溶液(5mL)に、25℃で24時間浸漬した。なお、2−ブロモイソブチリル基は、重合開始作用を示す。
(3) Manufacture of molecular imprinting polymer (MIP) (3-1) Formation of composite self-assembled monolayer (composite SAM film) Gold / glass substrate (manufactured by JASCO Corporation) was thoroughly washed with water and ethanol Then, nitrogen gas was blown and dried. After the dried gold surface was subjected to Ar etching treatment, an ethanol solution containing 0.5 mM bis [2- (2-bromoisobutyryloxy) undecyl] disulfide + 0.5 mM 11-amino-1-undecanethiol hydrochloride (5 mL) For 24 hours at 25 ° C. The 2-bromoisobutyryl group exhibits a polymerization initiating action.
(3−2) 複合SAM膜の活性化
上記金/ガラス基板を、さらに5mM NHS−dPEG4−NHSエステルを含むDMF溶液(10mL)に、25℃で1時間浸漬することにより、上記複合SAM膜の末端アミノ基に、PEG鎖を介してNHS活性化カルボキシ基を導入した。
(3-2) Activation of Composite SAM Film The composite SAM film is immersed in a DMF solution (10 mL) containing 5 mM NHS-dPEG 4 -NHS ester for 1 hour at 25 ° C. An NHS-activated carboxy group was introduced into the terminal amino group of via an PEG chain.
(3−3) β−シクロデキストリンの固定化
上記(2)で調製したモノアミノ−β−シクロデキストリン(20.4mg,18μmol)をDMF(6mL)に溶解し、3mM溶液を調製した。次いで、NHS活性化カルボキシ基が導入された上記金/ガラス基板を当該溶液に25℃で3時間浸漬することにより、β−シクロデキストリンを固定化した。
(3-3) Immobilization of β-cyclodextrin Monoamino-β-cyclodextrin (20.4 mg, 18 μmol) prepared in (2) above was dissolved in DMF (6 mL) to prepare a 3 mM solution. Next, β-cyclodextrin was immobilized by immersing the gold / glass substrate into which the NHS-activated carboxy group had been introduced in the solution at 25 ° C. for 3 hours.
(3−4) templete化合物の固定化
上記(1)で調製したtemplete化合物(3.5mg,5μmol)を少量のDMSOに溶解した後、水(5mL)を加えて1mM溶液を調製した。β−シクロデキストリンを固定化した上記金/ガラス基板を当該溶液に25℃で24時間浸漬することにより、templete化合物を固定化した。
(3-4) Immobilization of template compound After dissolving the template compound (3.5 mg, 5 μmol) prepared in (1) above in a small amount of DMSO, water (5 mL) was added to prepare a 1 mM solution. The above-mentioned gold / glass substrate on which β-cyclodextrin was immobilized was immersed in the solution at 25 ° C. for 24 hours to immobilize the template compound.
(3−5) 重合反応
反応容器中に、水(5mL)、templete化合物が固定化された上記金/ガラス基板、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC,88.6mg,300μmol)、臭化銅(II)(1.34mg,6μmol)、N,N,N’,N”,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA,1.25μL,6μmol)を加え、反応容器中の気相を窒素ガスで置換した。次いで、アスコルビン酸(0.52mg,3μmol)を水(1mL)に溶解した0.5mM溶液を反応容器中に注入し、25℃で30分間重合反応を行った。
(3-5) Polymerization reaction In a reaction vessel, water (5 mL), the above-mentioned gold / glass substrate on which a template compound is immobilized, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC, 88.6 mg, 300 μmol), copper bromide ( II) (1.34 mg, 6 μmol), N, N, N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetriamine (PMDETA, 1.25 μL, 6 μmol) was added, and the gas phase in the reaction vessel was replaced with nitrogen gas. . Next, a 0.5 mM solution in which ascorbic acid (0.52 mg, 3 μmol) was dissolved in water (1 mL) was poured into the reaction vessel, and a polymerization reaction was performed at 25 ° C. for 30 minutes.
(3−6) templete化合物の除去
重合反応後、上記金/ガラス基板を分離し、水で洗浄した。次いで、残留している銅イオン(II)を除去するため、1M EDTA−4Na水溶液に、25℃で12時間浸漬した。
(3-6) Removal of template compound After the polymerization reaction, the gold / glass substrate was separated and washed with water. Subsequently, in order to remove the remaining copper ion (II), it was immersed in 1M EDTA-4Na aqueous solution at 25 ° C. for 12 hours.
次に、オキシム基を加水分解することによりtemplete化合物を除去するため、上記金/ガラス基板を100mM塩酸に40℃で24時間浸漬し、次いで、純水およびエタノールで十分に洗浄することにより、コルチゾールの特異的認識空間を有するMPC薄膜が形成された金/ガラス基板を得た。 Next, in order to remove the template compound by hydrolyzing the oxime group, the gold / glass substrate was immersed in 100 mM hydrochloric acid at 40 ° C. for 24 hours, and then thoroughly washed with pure water and ethanol, thereby cortisol. A gold / glass substrate on which an MPC thin film having a specific recognition space was formed was obtained.
比較例1: β−シクロデキストリンのみが固定化された基板の作製
上記実施例1(3−4)〜(3−6)の「templete化合物の固定化」と「templete化合物の除去」を行わない以外は上記実施例1を同様にして、β−シクロデキストリンのみが固定化された高分子薄膜が形成された金/ガラス基板を作製した。
Comparative Example 1: Preparation of a substrate on which only β-cyclodextrin was immobilized The “immobilization of a temple compound” and “removal of a template compound” in Examples 1 (3-4) to (3-6) were not performed. Except for the above, a gold / glass substrate was prepared in the same manner as in Example 1 except that a polymer thin film in which only β-cyclodextrin was immobilized was formed.
比較例2: オキシム結合部位のみを有する基板の作製
(1) 自己組織化単分子膜(SAM膜)の形成
金/ガラス基板(日本分光社製)を水とエタノールで十分に洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。乾燥した金表面をArエッチング処理した。別途、ビス[2−(2−ブロモイソブチリルオキシ)ウンデシル]ジスルフィド(1.8μL,3μmol)をエタノール(6mL)に溶解し、0.5mM溶液を調製した。上記金/ガラス基板を当該溶液に25℃で24時間浸漬した。
Comparative Example 2: Preparation of substrate having only oxime binding site (1) Formation of self-assembled monolayer (SAM film) Gold / glass substrate (manufactured by JASCO) was thoroughly washed with water and ethanol, and then nitrogen Gas was blown to dry. The dried gold surface was subjected to Ar etching treatment. Separately, bis [2- (2-bromoisobutyryloxy) undecyl] disulfide (1.8 μL, 3 μmol) was dissolved in ethanol (6 mL) to prepare a 0.5 mM solution. The gold / glass substrate was immersed in the solution at 25 ° C. for 24 hours.
(2) 重合反応
反応容器中に、水(3.00mL)、DMSO(1mL)、上記(1)で得た金/ガラス基板、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC,66.5mg,225μmol)、上記実施例1(1)で得たtemplete化合物(3.15mg,4.5μmol)、臭化銅(II)(1.00mg,4.5μmol)、N,N,N’,N”,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA,0.94μL,4.5μmol)を加え、反応容器中の気相を窒素ガスで置換した。次いで、アスコルビン酸(0.39mg,2.25μmol)を水(0.5mL)に溶解した0.5mM溶液を反応容器中に注入し、25℃で30分間重合反応を行った。
(2) Polymerization reaction In a reaction vessel, water (3.00 mL), DMSO (1 mL), the gold / glass substrate obtained in (1) above, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC, 66.5 mg, 225 μmol), The template compound obtained in Example 1 (1) (3.15 mg, 4.5 μmol), copper (II) bromide (1.00 mg, 4.5 μmol), N, N, N ′, N ″, N ″ -Pentamethyldiethylenetriamine (PMDETA, 0.94 μL, 4.5 μmol) was added, and the gas phase in the reaction vessel was replaced with nitrogen gas. Next, a 0.5 mM solution in which ascorbic acid (0.39 mg, 2.25 μmol) was dissolved in water (0.5 mL) was injected into the reaction vessel, and a polymerization reaction was performed at 25 ° C. for 30 minutes.
(3) templete化合物の除去
重合反応後、上記金/ガラス基板を分離し、水で洗浄した。次いで、残留している銅イオン(II)を除去するため、1M EDTA−4Na水溶液に、25℃で12時間浸漬した。
(3) Removal of template compound After the polymerization reaction, the gold / glass substrate was separated and washed with water. Subsequently, in order to remove the remaining copper ion (II), it was immersed in 1M EDTA-4Na aqueous solution at 25 ° C. for 12 hours.
次に、オキシム基を加水分解することによりtemplete化合物を除去するため、上記金/ガラス基板を100mM塩酸に40℃で24時間浸漬することにより、コルチゾールの特異的認識空間を有するMPC薄膜が形成された金/ガラス基板を得た。但し、実施例1とは異なりβ−シクロデキストリンを固定化していないため、特異的認識空間の方向はランダムである。 Next, in order to remove the template compound by hydrolyzing the oxime group, the gold / glass substrate is immersed in 100 mM hydrochloric acid at 40 ° C. for 24 hours to form an MPC thin film having a specific recognition space for cortisol. A metal / glass substrate was obtained. However, since β-cyclodextrin is not immobilized unlike Example 1, the direction of the specific recognition space is random.
実施例2: 蛍光測定によるコルチゾールの検出
フルオレセインイソチオシアネート−ビスフェノールA(FITC−BPA)を10mMリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解し、100nM FITC−BPA溶液を調製した。当該溶液に、コルチゾールに対するMIP膜が形成された金/ガラス基板(実施例1)を25℃で1時間浸漬した後、コルチゾールを10mMリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解した溶液を加えていき、上澄み液の蛍光を測定した。この際、コルチゾールとビスフェノールAは立体コンフォメーションが似ているので、ビスフェノールAはコルチゾールに対するMIP膜に捕捉される一方で、MIP膜に対する親和性がより高いコルチゾールの添加により置換されて溶液中に漏出する。なお、蛍光測定における励起波長は495nmとし、測定蛍光波長は515nmとした。相対蛍光強度変化量[(I−I0)/I0]と、MIP金/ガラス基板が浸漬されている溶液に添加したコルチゾール濃度との関係を図2に示す。また、測定結果をグラフ作成ソフト(日本ポラデジタル「DeltaGraph」)で処理し、MIP金/ガラス基板とコルチゾールとの結合定数Kを算出した。結果を表1に示す。
Example 2: Detection of Cortisol by Fluorescence Measurement Fluorescein isothiocyanate-bisphenol A (FITC-BPA) was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to prepare a 100 nM FITC-BPA solution. A gold / glass substrate (Example 1) on which a MIP film for cortisol was formed was immersed in the solution at 25 ° C. for 1 hour, and then a solution in which cortisol was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) was added. Then, the fluorescence of the supernatant was measured. At this time, since steric conformation of cortisol and bisphenol A is similar, bisphenol A is trapped by the MIP membrane for cortisol, but is replaced by the addition of cortisol having higher affinity for the MIP membrane and leaks into the solution. To do. The excitation wavelength in the fluorescence measurement was 495 nm, and the measurement fluorescence wavelength was 515 nm. FIG. 2 shows the relationship between the relative fluorescence intensity variation [(I−I 0 ) / I 0 ] and the concentration of cortisol added to the solution in which the MIP gold / glass substrate is immersed. Moreover, the measurement result was processed with the graph preparation software (Nippon Pola digital "DeltaGraph"), and the coupling constant K of MIP gold / glass substrate and cortisol was calculated. The results are shown in Table 1.
また、比較のために、β−シクロデキストリンのみが固定化されたMIP金/ガラス基板(比較例1)とオキシム結合部位のみを有するMIP金/ガラス基板(比較例2)を用い、同様に測定を行った。結果を図2と表1に示す。 For comparison, measurement was similarly performed using a MIP gold / glass substrate (Comparative Example 1) on which only β-cyclodextrin was immobilized and a MIP gold / glass substrate having only an oxime binding site (Comparative Example 2). Went. The results are shown in FIG.
図2と表1に示す結果のとおり、β−シクロデキストリンとオキシム結合部位の両方を有するコルチゾール特異的認識空間を有するMIP膜は、これら何れか一方のみを有するMIP膜に比べて、コルチゾールに対する選択的親和性が高いことが実証された。 As shown in FIG. 2 and Table 1, the MIP membrane having a cortisol-specific recognition space having both β-cyclodextrin and an oxime binding site is more selective for cortisol than the MIP membrane having only one of these. It has been proved that the affinity is high.
実施例3: コルチゾールに対する選択性試験
上記実施例2において、コルチゾールに加え、構造が類似する17−β−エストラジオール、コレステロール、テストステロンおよびプロゲステロンを用いた以外は同様にして、本発明に係るMIP膜の親和性を測定した。各化合物の構造を以下に示し、測定結果を図3に示す。なお、図3中、コルチゾールの測定結果を「◆」で示し、その他の化合物の測定結果を「■」で示す。
Example 3 Selectivity Test for Cortisol In Example 2 above, in addition to cortisol, 17-β-estradiol, cholesterol, testosterone and progesterone having similar structures were used in the same manner as in the MIP membrane according to the present invention. Affinity was measured. The structure of each compound is shown below, and the measurement results are shown in FIG. In FIG. 3, the measurement results for cortisol are indicated by “♦”, and the measurement results for other compounds are indicated by “■”.
図3に示す結果のとおり、本発明に係るMIP膜は、コルチゾールと構造が非常に似ているその他のステロイド化合物に比べても、コルチゾールに対する選択的な親和性を有することが明らかとなった。 As shown in the results shown in FIG. 3, the MIP membrane according to the present invention was found to have selective affinity for cortisol even compared to other steroid compounds having a structure very similar to that of cortisol.
実施例4: 架橋MIP膜の作製と選択的親和性試験
上記実施例1(3−5)において、水(6mL)、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC,70.9mg,240μmol)、架橋剤であるN,N’−メチレンビスアクリルアミド(MBAAm,9.25mg,60μmol)、臭化銅(I)(1.34mg,6μmol)、N,N,N’,N”,N”−ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA,1.25μL,6μmol)およびアスコルビン酸(0.52mg,3μmol)を用いた以外は上記実施例1と同様にして、金/ガラス基板上に架橋MIP膜を形成した。
Example 4: Production of cross-linked MIP membrane and selective affinity test In Example 1 (3-5) above, water (6 mL), 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC, 70.9 mg, 240 μmol), and cross-linking agent N, N′-methylenebisacrylamide (MBAAm, 9.25 mg, 60 μmol), copper (I) bromide (1.34 mg, 6 μmol), N, N, N ′, N ″, N ″ -pentamethyldiethylenetriamine ( A crosslinked MIP film was formed on a gold / glass substrate in the same manner as in Example 1 except that PMDETA, 1.25 μL, 6 μmol) and ascorbic acid (0.52 mg, 3 μmol) were used.
得られた架橋MIP膜と上記実施例1で得た未架橋MIP膜を用い、上記実施例2と同様の条件で、コルチゾールに対する選択的親和性を試験した。結果を図4に示す。また、得られた測定結果より当該架橋MIP膜のコルチゾールに対する結合定数Kを算出したところ、結合定数Kは2.30×1011M-1であった。これらの結果より、架橋MIP膜は未架橋MIP膜に比べると、相対蛍光強度変化量は小さくなったが、コルチゾールに対する結合定数は大きくなったことが読み取れる。よって、架橋により、コルチゾールに対する特異的な認識空間がより堅固に構築されることにより結合定数が大きくなり、また、非特異的な吸着サイトが減少したために相対蛍光強度変化量が小さくなったと考えられる。 Using the obtained crosslinked MIP membrane and the uncrosslinked MIP membrane obtained in Example 1, selective affinity for cortisol was tested under the same conditions as in Example 2. The results are shown in FIG. Moreover, when the binding constant K with respect to the cortisol of the said bridge | crosslinking MIP film | membrane was computed from the obtained measurement result, the binding constant K was 2.30 * 10 < 11 > M < -1 >. From these results, it can be seen that the cross-linked MIP film has a smaller amount of relative fluorescence intensity change than the non-cross-linked MIP film, but has a larger binding constant to cortisol. Therefore, it is considered that a specific recognition space for cortisol is more firmly constructed by cross-linking, so that the binding constant increases, and the non-specific adsorption site decreases, so that the amount of change in relative fluorescence intensity decreases. .
さらに、コルチゾールに加えて17−β−エストラジオール、コレステロール、テストステロンおよびプロゲステロンを用いて、相対蛍光強度変化量を測定した。結果を図5に示す。なお、図5中、コルチゾールの測定結果を「◆」で示し、その他の化合物の測定結果を「■」で示す。 Furthermore, in addition to cortisol, the amount of change in relative fluorescence intensity was measured using 17-β-estradiol, cholesterol, testosterone and progesterone. The results are shown in FIG. In FIG. 5, the measurement results for cortisol are indicated by “♦”, and the measurement results for other compounds are indicated by “■”.
図5に示す結果のとおり、架橋MIP膜を用いた場合、未架橋MIP膜を用いた場合に比べ、コルチゾールとその他のステロイド化合物のとの相対蛍光強度変化量の差はより大きくなっており、架橋MIP膜のコルチゾールに対する選択的親和性はより一層高いといえる。 As shown in FIG. 5, when the cross-linked MIP film is used, the difference in relative fluorescence intensity change between cortisol and other steroid compounds is larger than when the non-cross-linked MIP film is used. It can be said that the selective affinity of the crosslinked MIP membrane for cortisol is even higher.
Claims (6)
上記ステロイドホルモン化合物が下記式(I)で表されるものであり、
[式中、
R1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
R3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R4は、1以上の置換基αで置換されているC1-10アルキル基、または水酸基を示し、
R5は、水素原子または水酸基を示し、
R4とR5は一緒になってオキソ基を形成してもよく、
置換基αは、水酸基およびオキソ基から選択される置換基を示す]
自己組織化単分子膜の上にポリマー層が積層されている積層構造を有し、
上記自己組織化単分子膜の表面にはβ−シクロデキストリンが結合しており、
上記ポリマー層には上記ステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間が形成されており、
上記特異的認識空間の一端には上記β−シクロデキストリンが存在し、且つ、上記特異的認識空間の他端にはアミノオキシ基が存在することを特徴とする分子インプリンティング膜。 A molecular imprinting film of a steroid hormone compound,
The steroid hormone compound is represented by the following formula (I):
[Where:
R 1 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a formyl group;
R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an oxo group,
R 3 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a formyl group,
R 4 represents a C 1-10 alkyl group substituted with one or more substituents α, or a hydroxyl group,
R 5 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group,
R 4 and R 5 together may form an oxo group,
The substituent α represents a substituent selected from a hydroxyl group and an oxo group.
Having a laminated structure in which a polymer layer is laminated on a self-assembled monolayer;
Β-cyclodextrin is bonded to the surface of the self-assembled monolayer,
A specific recognition space for the steroid hormone compound is formed in the polymer layer,
A molecular imprinting membrane, wherein the β-cyclodextrin is present at one end of the specific recognition space, and an aminooxy group is present at the other end of the specific recognition space.
[式中、
XとYは、独立してリンカー基を示し、
R1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
R3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
R5は、水素原子または水酸基を示し、
R6は、水素原子またはメチル基を示す] A template compound for forming a specific recognition space for a molecular imprinting polymer, which is represented by the following formula (II):
[Where:
X and Y independently represent a linker group,
R 1 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a formyl group;
R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group or an oxo group,
R 3 represents a methyl group, a hydroxymethyl group or a formyl group,
R 5 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group,
R 6 represents a hydrogen atom or a methyl group]
金属基板上に自己組織化単分子膜を形成する工程、
上記自己組織化単分子膜の表面にβ−シクロデキストリンを結合させる工程、
上記β−シクロデキストリンに、請求項2に記載の鋳型化合物のアダマンチル基を相互作用させる工程、
ビニルモノマーを添加し、上記鋳型化合物のビニル基と共重合させる工程、
上記鋳型化合物のオキシム基を加水分解し、上記鋳型化合物のステロイド部分を除去する工程を含むことを特徴とする方法。 A method for producing a molecularly imprinted membrane of a steroid hormone compound comprising:
Forming a self-assembled monolayer on a metal substrate;
Binding β-cyclodextrin to the surface of the self-assembled monolayer;
A step of causing the adamantyl group of the template compound according to claim 2 to interact with the β-cyclodextrin,
Adding a vinyl monomer and copolymerizing with the vinyl group of the template compound,
A method comprising hydrolyzing an oxime group of the template compound and removing a steroid moiety of the template compound.
上記ステロイドホルモン化合物は、請求項1で規定されている式(I)で表されるものであり、
溶媒中、請求項1に記載の分子インプリンティング膜と上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリンティング膜と上記試料との接触による反応系の変化を測定する工程を含むことを特徴とする方法。 A method for detecting a steroid hormone compound in a sample, comprising:
The steroid hormone compound is represented by the formula (I) defined in claim 1,
Contacting the molecular imprinting film according to claim 1 with the sample in a solvent; and
A method comprising measuring a change in a reaction system due to contact between the molecular imprinting film and the sample.
上記測定工程において、反応系の溶液における標識基の濃度変化を測定する請求項4に記載の方法。 Furthermore, before the contacting step, including a step of inserting a pseudosteroid hormone compound having a labeling group into the specific recognition space of the molecular imprinting film,
The method according to claim 4, wherein in the measurement step, a change in the concentration of the labeling group in the reaction system solution is measured.
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