JP2016195565A - Method for detecting aromatic compound-decomposable bacteria belonging to family sphingomonadaceae and kit therefor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ(Sphingomonadaceae)科細菌の検出方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and kit for detecting an aromatic compound-degrading sphingomonadaceae bacterium.
化学や鉄鋼といった重化学工業等における排水は、有機物を除去し、ヒト及び環境生物に対する影響を十分に低下させた状態で自然環境中に排出することが望まれている。有機物を除去するための排水処理方法としては、燃焼処理又は化合物分解性微生物を利用した生物学的処理方法等が用いられている。 It is desired that wastewater from heavy chemical industries such as chemistry and steel is discharged into the natural environment in a state where organic substances are removed and the effects on humans and environmental organisms are sufficiently reduced. As a wastewater treatment method for removing organic substances, a biological treatment method using a combustion treatment or a compound-decomposable microorganism is used.
化合物分解性微生物を得る方法としては、対象とする化合物を分解する微生物を集積培養して、その分解微生物を特定、単離して純粋培養する方法(単離培養方法)が知られている。また、別の方法としては、活性汚泥の様な混合微生物系の場合、対象化合物を低濃度で栄養源として与え、徐々に濃度を高めていくことにより活性汚泥を対象化合物に馴れさせ、分解能を高める馴養と呼ばれる方法(馴養方法)が知られている。例えば、特許文献1には、有機物である1,4−ジオキサンを廃水から処理するために用いられる活性汚泥の馴養方法が記載されている。 As a method for obtaining a compound-degrading microorganism, a method (isolation culture method) is known in which microorganisms that degrade a target compound are accumulated and cultured, and the degrading microorganisms are identified, isolated, and purely cultured. As another method, in the case of a mixed microorganism system such as activated sludge, the target compound is given as a nutrient source at a low concentration, and the concentration is gradually increased to acclimate the activated sludge to the target compound, thereby reducing the resolution. There is a known method (acquisition method) called “acceleration”. For example, Patent Document 1 describes a method for acclimatizing activated sludge used for treating 1,4-dioxane, which is an organic substance, from wastewater.
排水に含まれる有機物としては、芳香族化合物がある。芳香族化合物を含む排水を処理するための方法としては、例えば、芳香族化合物を栄養源として用いて馴養された活性汚泥を用いる方法がある。このとき、排水中の芳香族化合物の量及び排水処理に要求されるスピードに応じて、活性汚泥中の芳香族化合物分解微生物の量をモニタリングし、調節することが望まれている。そのためには、複数の微生物種が存在する活性汚泥から芳香族化合物分解微生物のみを迅速に検出及び定量することが課題となる。 An organic compound contained in the wastewater is an aromatic compound. As a method for treating wastewater containing an aromatic compound, for example, there is a method using activated sludge conditioned using an aromatic compound as a nutrient source. At this time, it is desired to monitor and adjust the amount of aromatic compound-decomposing microorganisms in the activated sludge according to the amount of aromatic compound in the wastewater and the speed required for wastewater treatment. For that purpose, it becomes a problem to rapidly detect and quantify only the aromatic compound-decomposing microorganisms from the activated sludge in which a plurality of microbial species are present.
しかしながら、これまでは複数の微生物が存在する系から、芳香族化合物分解性微生物の特異的な検出及び定量ができなかったため、排水中の芳香族化合物除去反応を制御することが困難だった。 However, until now, it has been difficult to control the aromatic compound removal reaction in the wastewater because the specific detection and quantification of the aromatic compound-degrading microorganisms has not been possible from a system in which a plurality of microorganisms exist.
本発明は、上記事情に鑑み、複数の微生物種が存在する系においても芳香族化合物分解性微生物を特異的に検出し、定量することができる芳香族化合物分解性微生物の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することを目的とする。 In view of the above circumstances, the present invention provides a method for detecting an aromatic compound-degrading microorganism capable of specifically detecting and quantifying an aromatic compound-degrading microorganism even in a system in which a plurality of microorganism species exist, and therefore It aims at providing the kit used for.
本発明者らは、これまでの研究の結果から、芳香族化合物を分解するために用いられている活性汚泥には、芳香族化合物分解性を有する特定のSphingomonadaceae科細菌が存在していることを明らかにした。そして、本発明者らは、このSphingomonadaceae科細菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列(配列番号9)の特定の領域が、複数の微生物種が存在する系における芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の特異的検出及び定量に有用であることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。 Based on the results of previous studies, the present inventors have confirmed that there is a specific Sphingomonasaceae bacterium having aromatic compound degradability in the activated sludge used for decomposing aromatic compounds. Revealed. Then, the inventors of the present invention have identified a specific region of the base sequence (SEQ ID NO: 9) of the 16S rRNA gene of the Sphingomonasaceae bacterium as a specific compound of the aromatic compound-degrading Sphingomonasaceae bacterium in a system in which a plurality of microbial species are present. The inventors have newly found that it is useful for detection and quantification, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、例えば、以下の[1]から[7]に関する。
[1]芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ(Sphingomonadaceae)科細菌の検出方法であって、被検DNAを鋳型に、配列番号1に記載の塩基配列のうち、連続した140塩基以上176塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法。
[2]芳香族化合物が、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸である、[1]に記載の方法。
[3]第二工程において、配列番号2に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする15塩基以上30塩基以下の塩基配列を含むプローブを用いて、増幅産物を検出する、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]プローブが、配列番号3から6に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、[3]に記載の方法。
[5]第一工程において用いるプライマーが、配列番号7に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号8に記載の塩基配列を含む第二のプライマーである、[1]から[4]のいずれかに記載の方法。
[6]芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ(Sphingomonadaceae)科細菌の検出に用いられるキットであって、配列番号7に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号8に記載の塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットと、配列番号2に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする15塩基以上30塩基以下の塩基配列を含むプローブと、を含むキット。
[7]プローブが、配列番号3から6に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、[6]に記載のキット。
That is, the present invention relates to the following [1] to [7], for example.
[1] A method for detecting an aromatic compound-degrading sphingomonadaceae family bacterium, wherein the test DNA is used as a template, and the base sequence of SEQ ID NO: 1 is continuously 140 to 176 bases or less A method comprising a first step of amplifying nucleotides using a primer capable of amplifying the nucleotide sequence of, and obtaining an amplified product, and a second step of detecting the amplified product.
[2] The method according to [1], wherein the aromatic compound is (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid.
[3] In the second step, an amplification product is detected using a probe comprising a base sequence of 15 to 30 bases that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 2. The method according to [1] or [2].
[4] The method according to [3], wherein the probe comprises one base sequence selected from the base sequences described in SEQ ID NOs: 3 to 6.
[5] The primers used in the first step are a first primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a second primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, [1] to [ 4].
[6] A kit used for detection of an aromatic compound-degrading sphingomonadaceae family bacterium, comprising a first primer comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and the sequence set forth in SEQ ID NO: 8 A primer set consisting of a second primer containing a base sequence, and a probe containing a base sequence of 15 to 30 bases that hybridizes with a nucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions kit.
[7] The kit according to [6], wherein the probe comprises one base sequence selected from the base sequences described in SEQ ID NOs: 3 to 6.
本発明によれば、複数の微生物種が存在する系においても芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌を特異的に検出し、定量することができる芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することができる。これにより、例えば、排水処理において、活性汚泥中の芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の検出量に基づき、排水中の芳香族化合物除去反応を制御することができる。 According to the present invention, a method for detecting an aromatic compound-degrading Sphingomonasaceae bacterium that can specifically detect and quantify an aromatic compound-degrading Sphingomonasaceae bacterium even in a system in which a plurality of microbial species are present, and Kits used for this purpose can be provided. Thereby, for example, in the waste water treatment, the aromatic compound removal reaction in the waste water can be controlled based on the detected amount of the aromatic compound-degrading Sphingomonasaceae family bacteria in the activated sludge.
以下、本発明を実施するための形態(以下、「本実施形態」という。)について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, a mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment”) will be described in detail. In addition, this invention is not limited to the following embodiment.
<芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の検出方法>
本実施形態の芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の検出方法は、被検DNAを鋳型に、配列番号1に記載の塩基配列のうち、連続した140塩基以上176塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、増幅産物を検出する第二工程と、を有する。
<Method for detecting aromatic compound-degrading sphingomonadaceae family bacteria>
The method for detecting an aromatic compound-degrading Sphingomonadaceae bacterium according to this embodiment can amplify a base sequence of 140 to 176 bases in a sequence of SEQ ID NO: 1 using a test DNA as a template. It has the 1st process of amplifying a nucleotide using a primer and obtaining an amplification product, and the 2nd process of detecting an amplification product.
本実施形態に係る芳香族化合物としては、例えば、式(1)又は式(2)で表される芳香族化合物が挙げられる。 As an aromatic compound which concerns on this embodiment, the aromatic compound represented by Formula (1) or Formula (2) is mentioned, for example.
式(1)中、R1は水素原子又は塩素原子を表し、R2は、炭素数1〜3のアルキル基又は水酸基を表す。アルキル基としては、直鎖状アルキル基であってもよく、分岐鎖アルキル基であってもよい。式(1)で表される芳香族化合物としては、例えば、(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸、2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸、2−フェニルブタン酸、2−ヒドロキシ−2−(4−クロロフェニル)酢酸、2−フェニル−3−メチルブタン酸が挙げられる。 In formula (1), R 1 represents a hydrogen atom or a chlorine atom, and R 2 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or a hydroxyl group. The alkyl group may be a linear alkyl group or a branched alkyl group. Examples of the aromatic compound represented by the formula (1) include (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid, 2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid, 2-phenylbutane. Examples include acid, 2-hydroxy-2- (4-chlorophenyl) acetic acid, and 2-phenyl-3-methylbutanoic acid.
式(2)中、R3は、水素原子、ヒドロキシメチル基、ホルミル基又はカルボキシル基を表し、R4及びR5は、それぞれ独立に、水素原子又は水酸基を表す。式(2)で表される芳香族化合物としては、例えば、カテコール、プロトカテキュ酸、プロトカテキュアルデヒド、安息香酸、ベンズアルデヒドが挙げられる。 In Formula (2), R 3 represents a hydrogen atom, a hydroxymethyl group, a formyl group, or a carboxyl group, and R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or a hydroxyl group. Examples of the aromatic compound represented by the formula (2) include catechol, protocatechuic acid, protocatechualdehyde, benzoic acid, and benzaldehyde.
本実施形態に係る被検DNAとしては、例えば、プラスミド、cDNA、ゲノムDNAが挙げられる。これらの被検DNAは、複数種類の微生物種由来のDNAを含むものであってもよく、活性汚泥から調製したDNAであってもよい。被検DNAとしては、排水中の芳香族化合物除去反応を制御する観点から、活性汚泥から調製したDNAが好ましい。これらの被検DNAの調製方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。活性汚泥からDNAを調製する方法としては、例えば、市販されているDNA抽出キット等を用いることができる。 Examples of the test DNA according to this embodiment include a plasmid, cDNA, and genomic DNA. These test DNAs may include DNA derived from a plurality of types of microorganisms, or may be DNA prepared from activated sludge. As the test DNA, DNA prepared from activated sludge is preferable from the viewpoint of controlling the aromatic compound removal reaction in the wastewater. As methods for preparing these test DNAs, methods well known to those skilled in the art can be used. As a method for preparing DNA from activated sludge, for example, a commercially available DNA extraction kit can be used.
[第一工程]
配列番号1は、配列番号9の495番目から670番目の塩基配列を示す。配列番号9は、芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列を示す。16S rRNA遺伝子には、遺伝子上に種間に共通な配列を含む保存領域、及び種・属等によって異なる配列を含む9つの可変領域(V1からV9)が存在する。配列番号9中、506番目から567番目の塩基配列がV4領域である。
[First step]
SEQ ID NO: 1 shows the 495th to 670th base sequence of SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 9 shows the base sequence of the 16S rRNA gene of the aromatic compound-degrading sphingomonadaceae family bacterium. In the 16S rRNA gene, there are a conserved region containing a sequence common between species on the gene and nine variable regions (V1 to V9) containing sequences that differ depending on the species / genus. In SEQ ID NO: 9, the base sequence from the 506th to 567th is the V4 region.
配列番号1に記載の塩基配列は、16S rRNA遺伝子のV4領域を含む領域である。本実施形態に係る第一工程において、増幅産物は、配列番号1の塩基配列内の連続した140塩基以上176塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製される。増幅産物は、連続した150塩基以上176塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製してもよく、連続した160塩基以上176塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製してもよい。このようなプライマーにより増幅して調製される増幅産物であれば、配列番号1に記載の塩基配列の対応領域に対して、1個から2個の相違するヌクレオチドを有する塩基配列であってもよく、同一のヌクレオチドを有する塩基配列であってもよい。上記塩基配列を含む増幅産物を用いることで、続く第二工程において、芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌を特異的に検出することができる。 The base sequence described in SEQ ID NO: 1 is a region including the V4 region of the 16S rRNA gene. In the first step according to this embodiment, an amplification product is prepared by amplifying nucleotides using a primer capable of amplifying a base sequence of 140 to 176 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1. The amplification product may be prepared by amplifying nucleotides using a primer capable of amplifying a continuous base sequence of 150 to 176 bases, and a primer capable of amplifying a continuous base sequence of 160 to 176 bases May be prepared by amplifying nucleotides using. As long as it is an amplification product prepared by amplification with such a primer, it may be a base sequence having 1 to 2 nucleotides different from the corresponding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1. Base sequences having the same nucleotide may be used. By using the amplification product containing the above base sequence, the aromatic compound-degrading Sphingomonasaceae bacterium can be specifically detected in the subsequent second step.
第一工程において、ヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)、リアルタイムPCR法、LAMP法が挙げられる。これらの方法の中でも、増幅と同時に、第二工程における検出を行えること、及び、増幅産物の定量を行えることから、リアルタイムPCR法が好ましい。 In the first step, the method for amplifying the nucleotide and obtaining the amplification product is not particularly limited, and methods well known to those skilled in the art can be used. Examples of such a method include a polymerase chain reaction method (PCR method), a real-time PCR method, and a LAMP method. Among these methods, the real-time PCR method is preferable because detection in the second step can be performed simultaneously with amplification, and amplification products can be quantified.
増幅産物を得るために用いるプライマーセットは、芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の16S rRNA遺伝子のV4領域を含む領域を増幅できるように設計することができる。プライマーセットとしては、16S rRNAをコードするDNAのアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマー(フォワードプライマー)及びセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマー(リバースプライマー)からなるセットがある。 The primer set used for obtaining the amplification product can be designed so that the region containing the V4 region of the 16S rRNA gene of the aromatic compound-degrading sphingomonadaceae bacterium can be amplified. The primer set includes a first primer (forward primer) that hybridizes to the antisense strand of DNA encoding 16S rRNA under stringent conditions and a second primer (reverse primer) that hybridizes to the sense strand under stringent conditions. There is a set consisting of primers.
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を含むヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びpHでの特定の配列についての熱融解温度(Tm)より約5℃低く選択される。Tmは、規定されたイオン強度、pH、及びDNA濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むプライマー又はプローブ」としては、例えば、目的とするヌクレオチドと高イオン濃度下[例えば、6×SSC(900mM塩化ナトリウム、90mMクエン酸ナトリウム)などが用いられる。]に65℃の温度条件でハイブリダイズすることにより、DNA−DNAハイブリッドを形成し、低イオン濃度下[例えば、0.1×SSC(15mM塩化ナトリウム、1.5mMクエン酸ナトリウム)などが用いられる。]に65℃の温度条件で30分間洗浄した後でも該ハイブリッドが維持されうるプライマー又はプローブをあげることができる。
In the present specification, “stringent conditions” means that a complementary strand of a nucleotide strand having homology to a target sequence preferentially hybridizes to the target sequence, and complementation of a nucleotide strand having no homology. It means conditions under which the strands do not substantially hybridize. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting temperature (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. Tm is the temperature at which 50% of the nucleotides complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in equilibrium under a defined ionic strength, pH, and DNA concentration.
As the “primer or probe containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions”, for example, a target nucleotide and a high ion concentration [for example, 6 × SSC (900 mM sodium chloride, 90 mM sodium citrate), etc. are used. It is done. ] At a temperature of 65 ° C. to form a DNA-DNA hybrid, and a low ion concentration [for example, 0.1 × SSC (15 mM sodium chloride, 1.5 mM sodium citrate) or the like is used. . ] Includes a primer or a probe that can maintain the hybrid even after washing at 65 ° C. for 30 minutes.
16S rRNAをコードするDNAのアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマーとしては、例えば、16S rRNAをコードするDNAの塩基配列中の連続した18塩基以上の塩基配列との相違塩基数が2である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、16S rRNAをコードするDNAの塩基配列中の連続した18塩基以上の塩基配列との相違塩基数が1である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、16S rRNAをコードするDNAの塩基配列中の連続した18塩基以上の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
16S rRNAをコードするDNAのセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマーとしては、例えば、16S rRNAをコードするDNAの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した18塩基以上の塩基配列との相違塩基数が2である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、16S rRNAをコードするDNAの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した18塩基以上の塩基配列との相違塩基数が1である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、16S rRNAをコードするDNAの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した18塩基以上の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
Examples of the first primer that hybridizes to the antisense strand of DNA encoding 16S rRNA under stringent conditions include, for example, differences from a base sequence of 18 or more bases in the DNA base sequence encoding 16S rRNA. A primer including a base sequence having 2 bases can be mentioned, and preferably a base sequence having a base number of 1 different from a continuous base sequence of 18 bases or more in the base sequence of DNA encoding 16S rRNA. More preferably, there can be mentioned a primer containing a base sequence of 18 or more bases in the base sequence of DNA encoding 16S rRNA.
Examples of the second primer that hybridizes under stringent conditions to the sense strand of DNA encoding 16S rRNA include, for example, consecutive 18 bases in a base sequence complementary to the base sequence of DNA encoding 16S rRNA. A primer including a base sequence having a base number of 2 different from the above base sequence can be mentioned, and preferably, 18 consecutive bases in a base sequence complementary to the base sequence of DNA encoding 16S rRNA A primer including a base sequence having a base number of 1 different from the above base sequence can be mentioned, and more preferably, a continuous 18 in the base sequence complementary to the base sequence of DNA encoding 16S rRNA. A primer including a base sequence of more than bases can be mentioned.
第一及び第二のプライマーは、配列番号1の塩基配列内の連続した140塩基以上176塩基以下の塩基配列を含むヌクレオチドを増幅することができるように設計されていれば、特に制限されるものではない。プライマーの長さは、より十分な特異性を得る観点から、18塩基以上が好ましく、20塩基以上が好ましい。プライマーの長さの上限としては、よりアニーリング効率を高める観点から、30塩基以下が好ましく、25塩基以下がより好ましく、21塩基以下が更に好ましい。第一のプライマーとして、例えば、配列番号7に記載の塩基配列を含むプライマーが挙げられる。第二のプライマーとして、例えば、配列番号8に記載の塩基配列を含むプライマーが挙げられる。 The first and second primers are particularly limited as long as they are designed so as to amplify nucleotides having a base sequence of 140 to 176 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1. is not. The length of the primer is preferably 18 bases or more, more preferably 20 bases or more, from the viewpoint of obtaining sufficient specificity. The upper limit of the primer length is preferably 30 bases or less, more preferably 25 bases or less, and even more preferably 21 bases or less from the viewpoint of further improving the annealing efficiency. As a 1st primer, the primer containing the base sequence of sequence number 7 is mentioned, for example. As a 2nd primer, the primer containing the base sequence of sequence number 8 is mentioned, for example.
[第二工程]
第二工程において、増幅産物を検出する方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。増幅産物を検出する方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法、リアルタイムPCR法、シークエンス解析法、サザンブロッティング法が挙げられる。これらの方法の中でも、特異性に優れるという観点から、プローブを用いる検出方法が好ましい。プローブを用いる検出方法としては、例えば、リアルタイムPCR法又はサザンブロッティング法が挙げられ、中でも、第一工程の増幅が同時に行え、且つ、特異的に検出でき、定量性にも優れるという観点から、リアルタイムPCR法が好ましい。
[Second step]
In the second step, the method for detecting the amplification product is not particularly limited, and methods well known to those skilled in the art can be used. Examples of the method for detecting the amplification product include an agarose gel electrophoresis method, a real-time PCR method, a sequence analysis method, and a Southern blotting method. Among these methods, a detection method using a probe is preferable from the viewpoint of excellent specificity. As a detection method using a probe, for example, a real-time PCR method or a Southern blotting method can be mentioned. Among them, a real-time PCR method or a Southern blotting method can be used. The PCR method is preferred.
検出に用いられるプローブは、第一工程で得られた増幅産物のセンス鎖又はアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが好ましい。プローブの長さとしては、より特異的に増幅産物を検出する観点から、15塩基以上30塩基以下が好ましく、15塩基以上25塩基以下がより好ましく、18塩基以上23塩基以下が更に好ましい。プローブとして、配列番号2に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするものが好ましい。このようなプローブとしては、例えば、配列番号3から6に記載の塩基配列を含むプローブが挙げられる。 The probe used for detection is preferably an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions to the sense strand or antisense strand of the amplification product obtained in the first step. The length of the probe is preferably from 15 to 30 bases, more preferably from 15 to 25 bases, and even more preferably from 18 to 23 bases from the viewpoint of more specifically detecting the amplification product. A probe that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is preferred. As such a probe, for example, a probe containing the base sequences described in SEQ ID NOs: 3 to 6 can be mentioned.
上記プローブをリアルタイムPCR法に用いる場合、プローブは、5’末端を蛍光物質で、3’末端を蛍光物質が発する蛍光を抑制するためのクエンチャーで、それぞれ修飾される。蛍光物質としては、例えば、FAM、TET、HEX、TAMRA、Cyanine5が挙げられる。クエンチャーとしては、例えば、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3が挙げられる。プローブの修飾に用いられる蛍光物質及びクエンチャーは、使用するリアルタイムPCR装置の励起波長及び測定波長に合わせて、適宜選択することができる。 When the probe is used in the real-time PCR method, the probe is modified with a fluorescent substance at the 5 'end and a quencher for suppressing fluorescence emitted from the fluorescent substance at the 3' end. Examples of the fluorescent substance include FAM, TET, HEX, TAMRA, and Cyanine 5. Examples of the quencher include TAMRA, BHQ1, BHQ2, and BHQ3. The fluorescent substance and quencher used for probe modification can be appropriately selected according to the excitation wavelength and measurement wavelength of the real-time PCR apparatus to be used.
リアルタイムPCR装置としては、DNAをPCRにより増幅することができるサーマルサイクラーと、増幅産物を検出するための分光蛍光光度計と、を備えていれば、特に制限されるものではない。リアルタイムPCR装置としては、例えば、StepOnePlus(Applied Biosystems社製)が挙げられる。 The real-time PCR apparatus is not particularly limited as long as it includes a thermal cycler capable of amplifying DNA by PCR and a spectrofluorometer for detecting an amplification product. An example of the real-time PCR apparatus is StepOnePlus (manufactured by Applied Biosystems).
第二工程で検出した増幅サンプルは定量することもできる。そのため、本実施形態の検出方法は、被検DNAから芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌を検出するだけでなく、被検DNAに含まれる芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌由来のDNA量を定量することもできる。例えば、第二工程で増幅産物の検出にリアルタイムPCRを用いた場合、スタンダードサンプルを用いて得られる検量線から、被検DNAの量を定量することができる。検量線は、増幅産物がある一定値に達した時のサイクル数を示すCt値及び初期鋳型量に基づき、作成することができる。 The amplified sample detected in the second step can also be quantified. Therefore, the detection method of the present embodiment not only detects the aromatic compound-degrading Sphingomonasaceae bacteria from the test DNA, but also quantifies the amount of DNA derived from the aromatic compound-degrading Sphingomonasaceae bacteria contained in the test DNA. You can also. For example, when real-time PCR is used for detection of amplification products in the second step, the amount of test DNA can be quantified from a calibration curve obtained using a standard sample. The calibration curve can be created based on the Ct value indicating the number of cycles when the amplification product reaches a certain value and the initial template amount.
本実施形態の検出方法において、第一工程で被検DNAから増幅産物が得られ、第二工程でその増幅産物を検出することができた場合、その被検DNAには、芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌由来のDNAが含まれると判定することができる。 In the detection method of this embodiment, when an amplification product is obtained from the test DNA in the first step and the amplification product can be detected in the second step, the test DNA has an aromatic compound degradability. It can be determined that DNA derived from bacteria belonging to the family Sphingomoadaceae is included.
<芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌のキット>
本実施形態の芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の検出に用いられるキットは、配列番号7に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号8に記載の塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットと、配列番号2に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする15塩基以上30塩基以下の塩基配列を含むプローブと、を含む。
<Aromatic Compound-Degrading Sphingomonasaceae Bacteria Kit>
The kit used for the detection of the aromatic compound-degrading Sphingomonasaceae bacteria of the present embodiment includes a first primer containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a second primer containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8. A primer set comprising primers, and a probe comprising a base sequence of 15 to 30 bases that hybridizes with a nucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions.
第一のプライマー、第二のプライマー及びプローブは、上述した検出方法で用いたものと同様のものを用いることができる。 As the first primer, the second primer, and the probe, the same primers as those used in the detection method described above can be used.
本実施形態のキットには、第一のプライマー、第二のプライマー及び配列番号11に記載の塩基配列を含むプローブ以外に、必要に応じて、その他の試薬等を含んでもよい。その他の試薬としては、例えば、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド混合物(dNTP Mix)、緩衝液、滅菌水、コントロール用DNAが挙げられる。 In addition to the first primer, the second primer, and the probe containing the base sequence described in SEQ ID NO: 11, the kit of this embodiment may contain other reagents and the like as necessary. Examples of other reagents include DNA polymerase, deoxyribonucleotide mixture (dNTP Mix), buffer solution, sterilized water, and control DNA.
本実施形態のキットに緩衝液が含まれる場合、緩衝液としては、例えば、一般的なPCR法で使用する緩衝液が挙げられる。 When a buffer solution is included in the kit of this embodiment, examples of the buffer solution include a buffer solution used in a general PCR method.
実施例1.芳香族化合物分解性Sphingomonadaceae科細菌の16S rRNA遺伝子のクローニング及び塩基配列決定
(材料)
・LB液体培地:500mLの超純水に対し、LB Broth,1.1G PER TABLET(SIGMA社製)を10個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をしたもの。
・LB寒天培地:LB Agar(SIGMA社製)を10個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌し、これをプラスチックシャーレに約25mLずつ分注したもの。
・(S)−2−(4−クロロフェニル)−3−メチルブタン酸(化合物1)の分解性を有する微生物群から抽出した鋳型DNA
・クローニング用フォワードプライマー(27f:配列番号10)
・クローニング用リバースプライマー(1492r:配列番号11)
・シークエンス解析用プライマー(M13F:配列番号12、M13R:配列番号13、339F:配列番号14、536R:配列番号15、907F:配列番号16)
Example 1. Cloning and sequencing of 16S rRNA gene of aromatic compound-degrading sphingomonadaceae bacteria
-LB liquid culture medium: 10 parts of LB Broth, 1.1G PER TABLE (manufactured by SIGMA) dissolved in 500 mL of ultrapure water and autoclaved.
-LB agar medium: LB Agar (manufactured by SIGMA) was dissolved at a ratio of 10 and sterilized by high-pressure steam, and dispensed into a plastic petri dish by about 25 mL each.
Template DNA extracted from a group of microorganisms having degradability of (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid (Compound 1)
-Forward primer for cloning (27f: SEQ ID NO: 10)
-Reverse primer for cloning (1492r: SEQ ID NO: 11)
Sequence analysis primer (M13F: SEQ ID NO: 12, M13R: SEQ ID NO: 13, 339F: SEQ ID NO: 14, 536R: SEQ ID NO: 15, 907F: SEQ ID NO: 16)
(方法)
25.0μLの2×PCR buffer for KOD FX(東洋紡社製)、10.0μLのdNTP mix(2mM)、1.5μLのクローニング用フォワードプライマー及びクローニング用リバースプライマー(それぞれ10pmol/μL)、0.58μLの鋳型DNA、10.4μLの滅菌水、1.0μLのDNAポリメラーゼ(KOD FX、1U/μL、東洋紡社製)を、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをPCR装置に供し、鋳型DNAの増幅反応を行った。反応は、(1)94℃、2分間、(2)98℃、10秒間、(3)50℃、30秒間、(4)68℃、1.5分間で行い、(2)から(4)の工程は35サイクル繰り返し行った。PCR後の増幅産物を精製し、クローニングに用いた。
(Method)
25.0 μL of 2 × PCR buffer for KOD FX (Toyobo), 10.0 μL of dNTP mix (2 mM), 1.5 μL of cloning forward primer and cloning reverse primer (each 10 pmol / μL), 0.58 μL Template DNA, 10.4 μL of sterilized water, and 1.0 μL of DNA polymerase (KOD FX, 1 U / μL, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were added to the microtube and mixed. The microtube was subjected to a PCR apparatus, and template DNA amplification reaction was performed. The reaction is carried out at (1) 94 ° C for 2 minutes, (2) 98 ° C for 10 seconds, (3) 50 ° C for 30 seconds, (4) 68 ° C for 1.5 minutes, (2) to (4) This process was repeated 35 cycles. The amplified product after PCR was purified and used for cloning.
増幅産物とZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen社製)を用いて、クローニングを行った。1μLのpCRII−Blunt−TOPO、1μLの増幅産物、1μLのSalt solution、3μLの滅菌超純水を加えた反応液を室温で5分間混合後し、これを氷中に保存した。2μLの上記反応液と50μLの大腸菌DH5α(Takara社製)とを混合し、これを氷中に30分間静置した。静置後、42℃で30秒間インキュベートし、これを氷中に保存した。この反応液にSOC培地を450μL加えた後、得られた混合物を37℃、200rpm、1時間振盪培養した。LBプレート(カナマイシン終濃度50μg/mL)に培養液を塗布し、これを培養(37℃、20時間)した。 Cloning was performed using the amplification product and Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (manufactured by Invitrogen). 1 μL of pCRII-Blunt-TOPO, 1 μL of amplification product, 1 μL of Salt solution, and 3 μL of sterilized ultrapure water were mixed for 5 minutes at room temperature, and this was stored in ice. 2 μL of the above reaction solution and 50 μL of E. coli DH5α (manufactured by Takara) were mixed and allowed to stand in ice for 30 minutes. After standing, it was incubated at 42 ° C. for 30 seconds and stored in ice. After 450 μL of SOC medium was added to this reaction solution, the resulting mixture was cultured with shaking at 37 ° C., 200 rpm for 1 hour. The culture solution was applied to an LB plate (final concentration of kanamycin 50 μg / mL) and cultured (37 ° C., 20 hours).
得られた大腸菌DH5αのコロニーを12株ピックアップし、ピックアップされた大腸菌DH5αを4mLのLB培地(カナマイシン終濃度50μg/mL)で37℃、16時間培養した。得られた大腸菌DH5αからプラスミド抽出装置(QIAcube、QIAGEN社製)を用いてプラスミドを抽出することにより、プラスミド溶液を得た。 Twelve strains of the obtained colonies of E. coli DH5α were picked up, and the picked-up E. coli DH5α was cultured in 4 mL of LB medium (final concentration of kanamycin 50 μg / mL) at 37 ° C. for 16 hours. A plasmid solution was obtained by extracting a plasmid from the obtained Escherichia coli DH5α using a plasmid extraction apparatus (QIAcube, manufactured by QIAGEN).
得られたプラスミド溶液3.0μLと、EcoRIを5U相当量と、10×H buffer 1μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を10.0μLとした混合液を調製した。この混合液を、37℃にて2時間インキュベーションした。インキュベーションを行った後、EcoRI処理したサンプルを1.0%アガロースゲル電気泳動に供し、16S rRNA遺伝子断片がEcoRIにより切り出されていることを確認した。 3.0 μL of the obtained plasmid solution, 5 U equivalent of EcoRI and 1 μL of 10 × H buffer were mixed, and a sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a mixed solution with a volume of 10.0 μL. This mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours. After incubation, the EcoRI-treated sample was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, and it was confirmed that the 16S rRNA gene fragment was excised by EcoRI.
プラスミド溶液150ng相当量と、シークエンス解析用プライマー(10μM)0.32μLと、BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems社製)8.0μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を20.0μLとした反応液を調製した。この反応液をPCR装置に供し、増幅反応を行った。反応は、(1)96℃、1分間、(2)96℃、10秒間、(3)50℃、5秒間、(4)60℃、4分間で行い、(2)から(4)の工程は25サイクル繰り返し行った。得られた反応液をDNAシーケンス解析に供して、化合物1の分解性を有する微生物群から抽出した鋳型DNAの塩基配列を決定した。決定した塩基配列はRDP Classifierを用いて属レベルで由来を決定した。 A plasmid solution equivalent to 150 ng, a sequence analysis primer (10 μM) 0.32 μL, and BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) 8.0 μL were mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to make the volume. A reaction solution of 20.0 μL was prepared. This reaction solution was subjected to an amplification reaction using a PCR apparatus. The reaction is carried out at (1) 96 ° C. for 1 minute, (2) 96 ° C. for 10 seconds, (3) 50 ° C. for 5 seconds, (4) 60 ° C. for 4 minutes, and steps (2) to (4) Was repeated 25 cycles. The obtained reaction solution was subjected to DNA sequence analysis, and the base sequence of the template DNA extracted from the group of microorganisms capable of decomposing Compound 1 was determined. The determined nucleotide sequence was determined at the genus level using RDP Classifier.
(結果)
シークエンス解析で決定された12例中、7例がSphingomonadaceae科細菌由来の16S rRNA遺伝子であることが示された。このときの16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号9に示す。この塩基配列を有するSphingomonadaceae科細菌を、以下Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022と示す。この結果から、Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022は化合物1分解能を持つことが示唆された。
(result)
Of the 12 cases determined by sequence analysis, 7 cases were shown to be 16S rRNA genes derived from bacteria belonging to the family Sphingomonasaceae. The base sequence of the 16S rRNA gene at this time is shown in SEQ ID NO: 9. The Sphingomonasaceae bacterium having this base sequence is hereinafter referred to as Sphingomoadaceae bacterium NITE BP-02022. From these results, it was suggested that Sphingomoadaceae family bacteria NITE BP-02022 have a compound 1 resolution.
実施例2.Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022の化合物1分解能の測定
(方法)
Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022のグリセロールストックを4.0mLのLB液体培地に植菌し、30℃で2日間前培養した。前培養液4.0mLを100mLのLB培地に添加し、30℃で2日間培養後、化合物1(終濃度100ppm)を添加し、更に1日間培養した。
Example 2 Determination of the resolution of Compound 1 of the sphingomoadaceae family bacterium NITE BP-02022 (Method)
A glycerol stock of the sphingomonadaceae family NITE BP-0202 was inoculated into 4.0 mL of LB liquid medium and pre-cultured at 30 ° C. for 2 days. 4.0 mL of the preculture solution was added to 100 mL of LB medium, cultured at 30 ° C. for 2 days, then Compound 1 (final concentration 100 ppm) was added, and further cultured for 1 day.
培養終了後、培養液を6,000×g、4℃で5分間遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を生理食塩液20mLで洗浄後、湿菌体濃度が100mg/mLとなるように50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に懸濁した。懸濁液1.0mLと2000ppmの化合物1を含むリン酸緩衝液1.0mLとをねじ口試験管に添加して、30℃、200rpmにて3日間反応させた。 After completion of the culture, the culture solution was centrifuged at 6,000 × g and 4 ° C. for 5 minutes to recover the cells. The collected cells were washed with 20 mL of physiological saline, and then suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) so that the wet cell concentration was 100 mg / mL. 1.0 mL of the suspension and 1.0 mL of a phosphate buffer containing 2000 ppm of Compound 1 were added to a screw mouth test tube and reacted at 30 ° C. and 200 rpm for 3 days.
反応液200μLをサンプリングし、遠心分離により沈殿物を除去し、上清を回収した。回収した上清をAmicon Ultra−0.5 Centrifugal Filter Device 100 K(MILLIPORE社製)に添加し、14,000×gで10分間遠心分離することにより、限外ろ過を行った。得られたろ液100μLを、下記の条件による液体クロマトグラフィーを用いて、化合物1の残存量を検出した。 200 μL of the reaction solution was sampled, the precipitate was removed by centrifugation, and the supernatant was collected. The collected supernatant was added to Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Device 100 K (manufactured by MILLIPORE), and ultrafiltration was performed by centrifuging at 14,000 × g for 10 minutes. The remaining amount of Compound 1 was detected from 100 μL of the obtained filtrate using liquid chromatography under the following conditions.
HPLC条件
カラム:SUMIPAX ODS A−211(4.6mmφ×25cm、5μm、住化分析センター社製)
移動相:A液0.01%TFA、B液アセトニトリル
溶出方法:アイソクラティック
溶出条件:A液(%):B液(%)
0分、40:60
20分、40:60
流量:1.0mL/分
カラム温度:40℃
検出:220nm
HPLC condition column: SUMPAX ODS A-211 (4.6 mmφ × 25 cm, 5 μm, manufactured by Sumika Chemical Analysis Co., Ltd.)
Mobile phase: A solution 0.01% TFA, B solution acetonitrile Elution method: Isocratic elution conditions: A solution (%): B solution (%)
0 min, 40:60
20 minutes, 40:60
Flow rate: 1.0 mL / min Column temperature: 40 ° C
Detection: 220nm
(結果)
湿菌体濃度50mg/mLで1000ppmの化合物1を分解することが可能であった。このことから、Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022は化合物1分解能を有することが示された。
(result)
It was possible to decompose 1000 ppm of Compound 1 at a wet cell concentration of 50 mg / mL. From this, it was shown that Sphingomonadaceae family bacteria NITE BP-02022 has compound 1 resolution.
実施例3.プライマー及びプローブの選抜
(材料)
・表1に示すフォワードプライマー
・表2に示すリバースプライマー
・表3に示すプローブ
・鋳型DNA(配列番号9の塩基配列を有する16S rRNA遺伝子を含むプラスミド)
Example 3 Selection of primers and probes (materials)
-Forward primer shown in Table 1-Reverse primer shown in Table 2-Probe shown in Table 3-Template DNA (plasmid containing 16S rRNA gene having the base sequence of SEQ ID NO: 9)
(方法)
表1から3に記載のプライマー及びプローブを組み合わせた19組のプライマー/プローブセットを用いて、配列番号9で示される塩基配列を有する16S rRNA遺伝子を含むプラスミドを鋳型DNAとしたリアルタイムPCRを行い、目的とする遺伝子断片を検出可能であるか否かを検討した。
(Method)
Using 19 primer / probe sets obtained by combining the primers and probes described in Tables 1 to 3, real-time PCR was performed using a plasmid containing a 16S rRNA gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 as a template DNA, It was examined whether or not the target gene fragment could be detected.
10μLの2×TaqMan fast Advanced Master Mix、0.36μLのフォワードプライマー(50pmol/μL)及びリバースプライマー(50pmol/μL)、0.50μLのプローブ、6.78μLの滅菌水、2.00μLの鋳型DNAをマイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをリアルタイムPCR装置(StepOnePlus、Applied Biosystems社製)に供し、鋳型DNAの増幅反応を行った。反応は、(1)95℃、20秒間、(2)95℃、1秒間、(3)60℃、20秒間で行い、(1)から(3)の工程は50サイクル繰り返し行った。 10 μL of 2 × TaqMan fast Advanced Master Mix, 0.36 μL of forward primer (50 pmol / μL) and reverse primer (50 pmol / μL), 0.50 μL probe, 6.78 μL of sterile water, 2.00 μL of template DNA Added to the microtube and mixed. The microtube was subjected to a real-time PCR apparatus (StepOnePlus, Applied Biosystems) to carry out template DNA amplification reaction. The reaction was carried out at (1) 95 ° C. for 20 seconds, (2) 95 ° C. for 1 second, (3) 60 ° C. for 20 seconds, and steps (1) to (3) were repeated 50 cycles.
(結果)
表4に結果を示す。配列番号9で示される塩基配列を有する16S rRNA遺伝子を含むプラスミド(1pg/μL)を検出可能であったものを○、検出不可能であったものを×と記した。19組のプライマー/プローブセット中、10組のプライマー/プローブセット(10から19番)が、配列番号9で示される塩基配列を有する16S rRNA遺伝子含むプラスミド1pg/μLを検出することができた。
(result)
Table 4 shows the results. A plasmid (1 pg / μL) containing a 16S rRNA gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 was detected as ◯, and a plasmid that could not be detected as ×. Among the 19 primer / probe sets, 10 primer / probe sets (Nos. 10 to 19) were able to detect 1 pg / μL of the plasmid containing the 16S rRNA gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9.
実施例4.プライマー/プローブセットを用いた定量性の確認
(材料)
・表4における12から15番のプライマー/プローブセット
Example 4 Quantitative confirmation using primer / probe set (material)
・ Primer / probe sets 12 to 15 in Table 4
(方法)
配列番号9で示される塩基配列を有する16S rRNA遺伝子を含むプラスミド(終濃度1、0.1、0.01、0.001pg/μL)を鋳型DNAとしたこと以外は、実施例3に記載の方法で、リアルタイムPCRを行い、検量線のR2値を算出した。
(Method)
As described in Example 3, except that a plasmid (final concentration 1, 0.1, 0.01, 0.001 pg / μL) containing a 16S rRNA gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 was used as a template DNA. The method was used for real-time PCR, and the R 2 value of the calibration curve was calculated.
(結果)
表5に結果を示す。いずれのプライマー/プローブセットを用いても、R2値は0.99以上であり、12から15番のプライマー/プローブセットは、1、0.1、0.01、0.001pg/μLの範囲で定量性が良好であることが示された。
(result)
Table 5 shows the results. Regardless of which primer / probe set is used, the R 2 value is 0.99 or more, and the primer / probe set of Nos. 12 to 15 is in the range of 1, 0.1, 0.01, 0.001 pg / μL. Showed that the quantitative property was good.
実施例5.一種類のプラスミドを用いた特異性試験及び定量性試験
(材料)
・表4における12番のプライマー/プローブセット
・表6に記載の微生物由来の16S rRNA遺伝子を含むプラスミド
Example 5 FIG. Specificity test and quantitative test using one kind of plasmid (material)
-No. 12 primer / probe set in Table 4-Plasmid containing 16S rRNA gene derived from microorganisms described in Table 6
(方法)
種々の細菌由来の16S rRNA遺伝子を含むプラスミド(終濃度1pg/μL)を鋳型DNAとしたこと以外は、実施例3に記載の方法で、リアルタイムPCRを行い、増幅産物を定量した。
(Method)
Real-time PCR was performed by the method described in Example 3 to quantify amplification products, except that plasmid DNA containing 16S rRNA genes derived from various bacteria (final concentration 1 pg / μL) was used as template DNA.
(結果)
リアルタイムPCRによる定量の結果を、表6に示す。この結果から、12番のプライマー/プローブセットは、Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022由来の16S rRNA遺伝子を含むプラスミドを特異的に検出することが示された。なお、検出限界以下とは、配列番号9で示される塩基配列を有する16S rRNA遺伝子を含むプラスミド(1、0.1、0.01、0.001pg/μL)を用いて作成した検量線から濃度を算出した結果、0.001pg/μL以下のものである。
(result)
Table 6 shows the results of quantification by real-time PCR. From this result, it was shown that the No. 12 primer / probe set specifically detects a plasmid containing a 16S rRNA gene derived from the sphingomodaaceae bacterium NITE BP-02022. The detection limit or lower is a concentration based on a calibration curve prepared using a plasmid (1, 0.1, 0.01, 0.001 pg / μL) containing a 16S rRNA gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9. As a result, the value is 0.001 pg / μL or less.
実施例6.複数種の混合プラスミドを用いた特異性試験及び定量性試験
(材料)
・表4における12又は15番のプライマー/プローブセット
・表6に記載の微生物由来の16S rRNA遺伝子を含むプラスミド
Example 6 Specificity test and quantitative test using mixed plasmids (materials)
-Primer / probe set No. 12 or 15 in Table 4-Plasmid containing 16S rRNA gene derived from microorganisms described in Table 6
(方法)
Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022由来の16S rRNA遺伝子を含むプラスミド(終濃度1pg/μL、0.1pg/μL、0.01pg/μL又は0.001pg/μL)、と種々の細菌由来の16S rRNA遺伝子を含むプラスミドの混合物(それぞれ終濃度1pg/μL)とを混合したプラスミド混合液を鋳型DNAとしたこと以外は、実施例3に記載の方法で、リアルタイムPCRを行い、増幅産物を定量した。
(Method)
Plasmids containing 16S rRNA gene from Sphingomoadaceae family bacteria NITE BP-02022 (final concentration 1 pg / μL, 0.1 pg / μL, 0.01 pg / μL or 0.001 pg / μL), and 16S rRNA genes derived from various bacteria Real-time PCR was performed by the method described in Example 3 to quantify the amplification products, except that the plasmid mixture was mixed with a mixture of plasmids containing each (final concentration of 1 pg / μL each) as template DNA.
(結果)
リアルタイムPCRによる定量の結果を、表7に示す。この結果から、12又は15番のプライマー/プローブセットは、複数種のプラスミドが存在する系においても、Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022由来の16S rRNA遺伝子を含むプラスミドを特異的に検出及び定量できることが示された。
(result)
Table 7 shows the results of quantification by real-time PCR. From this result, the primer / probe set of No. 12 or 15 can specifically detect and quantify a plasmid containing 16S rRNA gene derived from Sphingomonasaceae family bacteria NITE BP-02022 even in a system in which plural types of plasmids exist. Indicated.
実施例7.一種類のゲノムDNAを用いた特異性試験
(材料)
・表4における12番のプライマー/プローブセット
・表8に記載の微生物由来ゲノムDNA
Example 7 Specificity test using one type of genomic DNA (material)
-No. 12 primer / probe set in Table 4-Microorganism-derived genomic DNA described in Table 8
(方法)
種々の細菌由来のゲノムDNA(終濃度1ng/μL)を鋳型DNAとしたこと以外は、実施例3に記載の方法で、リアルタイムPCRを行った。
(Method)
Real-time PCR was performed by the method described in Example 3 except that genomic DNA derived from various bacteria (final concentration 1 ng / μL) was used as the template DNA.
(結果)
表8には、試験に用いたゲノムDNAの由来となる細菌と、それらのゲノムDNAの検出結果を示す。12番のプライマー/プローブセットによれば、Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022のゲノムDNAを0.001ng/μLの濃度まで検出することができた。一方で、それ以外の細菌由来のゲノムDNAは検出限界(0.001ng/μL)以下であった。この結果から、12番のプライマー/プローブセットは、ゲノムDNAを用いたとしても、Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022の16S rRNA遺伝子を特異的に検出することができることが示された。
(result)
Table 8 shows the bacteria from which the genomic DNA used in the test was derived and the detection results of those genomic DNA. According to the No. 12 primer / probe set, genomic DNA of the sphingomodaceae family bacterium NITE BP-02022 could be detected to a concentration of 0.001 ng / μL. On the other hand, genomic DNA derived from other bacteria was below the detection limit (0.001 ng / μL). From this result, it was shown that the primer / probe set of No. 12 can specifically detect the 16S rRNA gene of the Sphingomoadaceae family bacterium NITE BP-02022 even when genomic DNA is used.
実施例8.複数種のゲノムDNAを用いた特異性試験及び定量性試験
(材料)
・表4における12番のプライマー/プローブセット
・表9に記載の微生物由来ゲノムDNA
Example 8 FIG. Specificity test and quantitative test using multiple types of genomic DNA (materials)
-No. 12 primer / probe set in Table 4-Microorganism-derived genomic DNA described in Table 9
(方法)
Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022由来のゲノムDNA(終濃度100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL又は0.1pg/μL)、と種々の細菌由来のゲノムDNAの混合物(それぞれ終濃度100pg/μL)とを混合したゲノムDNA混合液を鋳型DNAとしたこと以外は、実施例3に記載の方法で、リアルタイムPCRを行い、増幅産物を定量した。
(Method)
A mixture of genomic DNA (final concentration 100 pg / μL, 10 pg / μL, 1 pg / μL, or 0.1 pg / μL) derived from the sphingomonadaceae bacterium NITE BP-0202 and a mixture of genomic DNAs derived from various bacteria (final concentrations of 100 pg / μL, respectively) ) Was used as a template DNA, and real-time PCR was performed by the method described in Example 3 to quantify amplification products.
(結果)
リアルタイムPCRによる定量の結果を、表10に示す。12番のプライマー/プローブセットは、複数種のゲノムDNAが存在する系においても、Sphingomonadaceae科細菌NITE BP−02022由来のゲノムDNAを特異的に検出及び定量できることが示された。
(result)
Table 10 shows the results of quantification by real-time PCR. It was shown that the No. 12 primer / probe set can specifically detect and quantify genomic DNA derived from the sphingomonadaceae family bacterium NITE BP-02022 even in a system in which multiple types of genomic DNA exist.
Claims (7)
被検DNAを鋳型に、配列番号1に記載の塩基配列のうち、連続した140塩基以上176塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、
増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法。 A method for detecting an aromatic compound-degrading sphingomonadaceae bacterium, comprising:
A first step of amplifying a nucleotide using a test DNA as a template and a primer capable of amplifying a continuous base sequence of 140 to 176 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 1 to obtain an amplified product; ,
A second step of detecting an amplification product.
配列番号7に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号8に記載の塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットと、
配列番号2に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする15塩基以上30塩基以下の塩基配列を含むプローブと、を含むキット。 A kit used for the detection of an aromatic compound-degrading sphingomonadaceae family bacterium,
A primer set consisting of a first primer containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a second primer containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8;
A kit comprising a nucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a probe comprising a nucleotide sequence of 15 to 30 bases that hybridizes under stringent conditions.
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