JP2016149942A - Method for screening molecule or substance which controls upstream signaling pathway regulating transcription factor and activity of transcription factor - Google Patents

Method for screening molecule or substance which controls upstream signaling pathway regulating transcription factor and activity of transcription factor Download PDF

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening a substance and/or molecule which controls an upstream signaling pathway regulating a transcription factor and/or activity of the transcription factor (including a transcription factor complex).SOLUTION: The method for screening a molecule and/or substance which controls an upstream signaling pathway regulating a transcription factor and/or activity of the transcription factor, comprises (a) introducing a test molecule or test substance into a cell where the transcription factor is expressing and, a nucleic acid including a reporter gene A to which a response sequence that the transcription factor positively regulates is functionally linked, and a nucleic acid including a reporter gene B to which a response sequence that the transcription factor negatively regulates is functionally linked, have been introduced, and (b) detecting expressions of the reporter gene A and reporter gene B and, when a change in a detected expression amount of the reporter gene A and a change in a detected expression amount of the reporter gene B are opposite, making the test molecule or test substance as a candidate molecule or candidate substance which controls activity of the transcription factor.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および転写因子の活性を制御する分子および物質のスクリーニング方法に関する。   The present invention relates to an upstream signal transduction pathway that regulates a transcription factor and a screening method for molecules and substances that control the activity of the transcription factor.

転写因子は単独で、あるいは、転写因子複合体の一員として、遺伝子の転写制御領域に結合し、その遺伝子の発現を調節しており、生体内における様々な現象を調節する役割を担っている。そのため、複雑な生体内の現象を紐解く上で、転写因子の活性制御機構の解析は極めて重要である。これまでにも、転写因子を制御する因子の同定およびその作用機序に関する研究がさかんに行われており、多くの知見が報告されている。
従来、転写因子（または転写複合体。以下、転写因子と記す）の機能解析、あるいは、転写因子の機能を制御する分子や物質の同定・解析を行う場合、その転写因子の活性の変化をモニターする方法として、転写因子が結合するゲノム上の転写制御領域の野生型配列と、転写因子が結合しない変異型配列を、それぞれレポーター遺伝子の上流にクローニングして、細胞の中でレポーター遺伝子の活性を測定する、いわゆる、レポーターアッセイが用いられてきた（非特許文献１を参照のこと）。 A transcription factor, alone or as a member of a transcription factor complex, binds to the transcriptional control region of a gene and regulates the expression of the gene, and plays a role in regulating various phenomena in the living body. Therefore, analysis of transcription factor activity control mechanisms is extremely important in unraveling complex in vivo phenomena. There have been many studies on the identification of factors that regulate transcription factors and their mechanism of action, and many findings have been reported.
Conventionally, when analyzing the function of a transcription factor (or transcription complex; hereinafter referred to as a transcription factor) or identifying and analyzing a molecule or substance that controls the function of a transcription factor, the change in the activity of the transcription factor is monitored. In this method, the wild-type sequence of the transcriptional regulatory region on the genome to which the transcription factor binds and the mutant sequence that does not bind to the transcription factor are cloned upstream of the reporter gene, so that the activity of the reporter gene in the cell is increased. A so-called reporter assay for measuring has been used (see Non-Patent Document 1).

転写制御領域の野生型配列をもつレポータープラスミド上のレポーター遺伝子の発現は、転写因子の転写活性に応じて変化する。これに対し、転写制御領域の変異型配列をもつレポータープラスミド上のレポーター遺伝子の発現は、転写因子が変異型配列である転写制御領域に結合しないため、レポーター遺伝子の発現が低く、しかも変化しないという特徴を有している。従来型のレポーターアッセイでは、これらの２種類のレポータープラスミドを組み合わせて使用しているが、アッセイコントロールとして使用している変異型配列に隣接するレポーター遺伝子の発現がもともと低いために、野生型配列に隣接するレポーター遺伝子の発現が下がったとしても、その発現の低下が、測定対象となる転写因子の活性の抑制によるものなのか、あるいは、それ以外の要因、例えば、基本転写因子複合体に対する影響、細胞内のRNA安定性の変化、翻訳効率低下などによるものなのか判別が困難である。従って、解析対象の転写因子の特異性等を検討するための他の解析方法を併用しなければ、対象としている転写因子の活性制御等の機能解析を正確に行うことは困難であった。   The expression of the reporter gene on the reporter plasmid having the wild type sequence of the transcription control region varies depending on the transcription activity of the transcription factor. In contrast, the expression of a reporter gene on a reporter plasmid having a mutated sequence of the transcription control region is low in the expression of the reporter gene because the transcription factor does not bind to the transcription control region that is the mutated sequence. It has characteristics. In conventional reporter assays, these two types of reporter plasmids are used in combination. Since the expression of the reporter gene adjacent to the mutant sequence used as the assay control is originally low, Even if the expression of the adjacent reporter gene is decreased, the decrease in the expression is due to the suppression of the activity of the transcription factor to be measured, or other factors such as the influence on the basic transcription factor complex, It is difficult to determine whether this is due to changes in intracellular RNA stability or a decrease in translation efficiency. Therefore, unless other analysis methods for examining the specificity of the transcription factor to be analyzed are used in combination, it is difficult to accurately perform functional analysis such as activity control of the transcription factor of interest.

上述のように、転写因子の制御因子の同定、解析は、非常に重要であるにも関わらず、現在までのところ、簡便かつ正確に転写因子の活性変化を検出できるスクリーニング方法は存在していなかった。   As mentioned above, despite the importance of identifying and analyzing transcription factor regulators, there is no screening method that can detect changes in transcription factor activity in a simple and accurate manner. It was.

Barker NおよびClevers H., Nat Rev Drug Discov. 2006 Dec;5(12):997-1014.Barker N and Clevers H., Nat Rev Drug Discov. 2006 Dec; 5 (12): 997-1014.

上記事情に鑑み、本発明は、標的とする転写因子（本明細書においては転写因子複合体も含む）の活性、およびその転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路を特異的に制御する分子や物質のスクリーニング方法の提供を目的とする。   In view of the above circumstances, the present invention provides a molecule that specifically controls the activity of a target transcription factor (including a transcription factor complex in the present specification) and an upstream signal transduction pathway that regulates the transcription factor. It aims at providing the screening method of a substance.

発明者らは、細胞内シグナル、あるいは、遺伝子発現を、転写レベルおよびその上流のシグナルで制御する分子や物質を、効果的に検出するために、目的とする転写因子が結合する野生型配列を用いたレポーターアッセイに、新たなアッセイを併用し、従来の非特異的要素を除外できるシステムを開発した。すなわち、転写因子が結合する野生型配列をもつレポータープラスミドに加えて、その転写因子が逆に転写制御する遺伝子発現調節領域を同定し（例えば、転写因子Ｘが正に制御する遺伝子発現調節領域を野生型配列としてレポータープラスミドＡを調製した場合には、転写因子Ｘが別の転写因子Ｙを介して負に制御される遺伝子調節領域を同定する）、その調節領域を有する別のレポータープラスミドを作製し、従来使用されていた変異型結合配列を有するレポータープラスミドの代わりに用いて、レポーターアッセイを行った。
従来のレポーターアッセイでは、１つのレポーター遺伝子の発現の変化のみを指標にしていたのに対し、発明者らの開発した方法によると、互いに発現量が逆に変化する２つのレポーター遺伝子を使用しているため、２つの指標に基づき判断をすることが可能となる。しかも、それぞれのレポーターアッセイで非特異的な変化を生じさせる分子や物質は、指標となるレポーター活性が逆に変化するものを選択するために除外される。
その結果、基本転写因子複合体に対する影響、細胞内のRNA安定性の変化、翻訳効率低下など、目的の転写複合体・転写因子以外の要因によって生じていた、いわゆる、偽陽性に基づく検出結果を除外することができ、転写因子の活性を特異的に制御する候補物質を正確、かつ、効率的に同定することができるようになった。
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。 In order to effectively detect molecules and substances that control intracellular signals or gene expression at the transcription level and upstream signals, the inventors have identified a wild-type sequence to which the target transcription factor binds. A new assay was used in combination with the reporter assay used to develop a system that can eliminate conventional non-specific elements. That is, in addition to a reporter plasmid having a wild-type sequence to which a transcription factor binds, a gene expression regulatory region that the transcription factor reversely controls transcription is identified (for example, a gene expression regulatory region that transcription factor X positively controls). When reporter plasmid A is prepared as a wild type sequence, a gene regulatory region in which transcription factor X is negatively controlled via another transcription factor Y is identified), and another reporter plasmid having the regulatory region is prepared. However, a reporter assay was carried out using a reporter plasmid having a mutated binding sequence conventionally used.
In the conventional reporter assay, only the change in the expression of one reporter gene was used as an index, but according to the method developed by the inventors, two reporter genes whose expression levels change in opposite directions are used. Therefore, it is possible to make a determination based on two indicators. Moreover, molecules and substances that cause non-specific changes in each reporter assay are excluded in order to select those that reversely change the reporter activity as an indicator.
As a result, detection results based on so-called false positives caused by factors other than the target transcription complex / transcription factor, such as effects on the basic transcription factor complex, changes in intracellular RNA stability, translation efficiency decline, etc. Candidate substances can be excluded, and candidate substances that specifically control the activity of transcription factors can be accurately and efficiently identified.
The present invention has been completed based on the above findings.

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１４）である。
（１）転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該転写因子が発現しており、かつ、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ａを含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ｂを含む核酸が導入されている細胞に、試験分子または試験物質を導入し、
（ｂ）レポーター遺伝子Ａの発現とレポーター遺伝子Ｂの発現を検出し、
検出したレポーター遺伝子Ａの発現量の変化とレポーター遺伝子Ｂの発現量の変化が逆である場合に、該試験分子または試験物質を該転写因子の活性を制御する候補分子または候補物質として選択するスクリーニング方法。
（２）前記レポーター遺伝子Ａの発現量が減少し、前記レポーター遺伝子Ｂの発現量が増加した場合に、前記試験分子または試験物質が転写因子の活性を抑制する候補分子または候補物質として選択する、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）前記レポーター遺伝子Ａの発現量が増加し、前記レポーター遺伝子Ｂの発現量が減少した場合に、前記試験分子または試験物質が転写因子の活性を活性化する候補分子または候補物質として選択する、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（４）前記転写因子が、β−カテニン/TCF7L2複合体であることを特徴とする、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（５）前記転写因子が正に制御する応答配列が、TCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、上記（４）に記載のスクリーニング方法。
（６）前記転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、上記（４）に記載のスクリーニング方法。
（７）前記HAL遺伝子の転写調節領域が、HAL遺伝子の５’隣接領域の少なくとも、-90〜-44の領域を含むことを特徴とする上記（６）に記載のスクリーニング方法。
（８）前記PCK1遺伝子の転写調節領域が、PCK1遺伝子の５’隣接領域の少なくとも、-559〜-183の領域を含むことを特徴とする上記（６）に記載のスクリーニング方法。
（９）転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸を包含する、上記（１）乃至（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法を実施するためのキット。
（１０）前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が正に制御する応答配列がTCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、上記（９）に記載のキット。
（１１）前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、上記（９）に記載のキット。
（１２）転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が導入された細胞。
（１３）前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が正に制御する応答配列がTCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、上記（１２）に記載の細胞。
（１４）前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、上記（１２）に記載の細胞。 That is, this invention is the following (1)-(14).
(1) A screening method for molecules and / or substances that regulate upstream signaling pathways and / or transcription factor activities that regulate transcription factors,
(A) a nucleic acid containing reporter gene A in which the transcription factor is expressed and to which a response sequence positively controlled by the transcription factor is operatively linked, and a response sequence negatively controlled by the transcription factor A test molecule or a test substance is introduced into a cell into which a nucleic acid containing a reporter gene B operably linked is introduced,
(B) detecting the expression of reporter gene A and reporter gene B,
Screening for selecting the test molecule or test substance as a candidate molecule or candidate substance that controls the activity of the transcription factor when the detected change in the expression level of reporter gene A and the change in the expression level of reporter gene B are opposite Method.
(2) When the expression level of the reporter gene A decreases and the expression level of the reporter gene B increases, the test molecule or test substance is selected as a candidate molecule or candidate substance that suppresses transcription factor activity. The screening method according to (1) above.
(3) When the expression level of the reporter gene A increases and the expression level of the reporter gene B decreases, the test molecule or test substance is selected as a candidate molecule or candidate substance that activates the activity of a transcription factor The screening method according to (1) above.
(4) The screening method according to any one of (1) to (3) above, wherein the transcription factor is a β-catenin / TCF7L2 complex.
(5) The screening method according to (4) above, wherein the response element positively controlled by the transcription factor is a TCF / LEF binding element.
(6) The response elements negatively regulated by the transcription factors are HAL gene, PCK1 gene, PLEK2 gene, SLPI gene, OSTα gene, ITGB3 gene, CAPN5 gene, MUC20 gene, CREB3L3 gene, MFSD2B gene, CYP2C18 gene, TMEM229B gene The screening method according to (4) above, which is a transcriptional regulatory region of APOA4 gene, TIMD4 gene, FXYD3 gene, FAM65B gene, HAVCR1 gene, PDZD3 gene, SORCS2 gene or LGALS2 gene.
(7) The screening method according to (6) above, wherein the transcriptional regulatory region of the HAL gene includes at least a region of −90 to −44 of the 5 ′ adjacent region of the HAL gene.
(8) The screening method according to (6) above, wherein the transcriptional regulatory region of the PCK1 gene includes at least the region of −559 to −183 of the 5 ′ adjacent region of the PCK1 gene.
(9) including a nucleic acid containing a reporter gene operably linked to a response element positively regulated by a transcription factor, and a nucleic acid containing a reporter gene operatively linked to a response element negatively regulated by a transcription factor A kit for carrying out the screening method according to any one of (1) to (8) above.
(10) The kit according to (9) above, wherein the transcription factor is a β-catenin / TCF7L2 complex, and the response element positively regulated by the transcription factor is a TCF / LEF binding element.
(11) The transcription factor is β-catenin / TCF7L2 complex, and the response elements negatively regulated by the transcription factor are HAL gene, PCK1 gene, PLEK2 gene, SLPI gene, OSTα gene, ITGB3 gene, CAPN5 gene, MUC20 The transcription regulatory region of the gene, CREB3L3 gene, MFSD2B gene, CYP2C18 gene, TMEM229B gene, APOA4 gene, TIMD4 gene, FXYD3 gene, FAM65B gene, HAVCR1 gene, PDZD3 gene, SORCS2 gene or LGALS2 gene The kit according to (9).
(12) A nucleic acid comprising a reporter gene operably linked to a response element that is positively regulated by a transcription factor, and a nucleic acid comprising a reporter gene operably linked to a response element that is negatively regulated by the transcription factor Introduced cells.
(13) The cell according to (12) above, wherein the transcription factor is a β-catenin / TCF7L2 complex, and the response element positively regulated by the transcription factor is a TCF / LEF binding element.
(14) The transcription factor is β-catenin / TCF7L2 complex, and the response elements negatively regulated by the transcription factor are HAL gene, PCK1 gene, PLEK2 gene, SLPI gene, OSTα gene, ITGB3 gene, CAPN5 gene, MUC20 The transcription regulatory region of the gene, CREB3L3 gene, MFSD2B gene, CYP2C18 gene, TMEM229B gene, APOA4 gene, TIMD4 gene, FXYD3 gene, FAM65B gene, HAVCR1 gene, PDZD3 gene, SORCS2 gene or LGALS2 gene The cell according to (12).

本発明により、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の転写活性を特異的に制御する分子および／または物質の効率的な同定が可能となる。   The present invention enables efficient identification of upstream signal transduction pathways that regulate transcription factors and / or molecules and / or substances that specifically control transcription factor transcriptional activity.

大腸がん細胞株、肝がん細胞株におけるβ−カテニン/TCF7L2複合体の活性を比較した結果を示す。TOP-flash とpRL-null、または、FOP-flashとpRL-nullを一過的に導入し、48時間培養した細胞を用いて、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼ活性の相対値（TOP-flashまたはFOP-flashのホテルルシフェラーゼ活性の測定値をpRL-nullのウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定値で除した）を解析値として使用した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した（Ａ）。本解析に使用した大腸がん、肝がん細胞株におけるCTNNB1（β−カテニン）およびAPCの遺伝子型を示した（Ｂ）。The result of having compared the activity of (beta) -catenin / TCF7L2 complex in a colon cancer cell line and a liver cancer cell line is shown. A dual luciferase assay was performed using cells that had been transiently introduced with TOP-flash and pRL-null or FOP-flash and pRL-null and cultured for 48 hours. The relative value of luciferase activity (the measured value of TOP-flash or FOP-flash hotel luciferase activity divided by the measured value of Renilla luciferase activity of pRL-null) was used as the analysis value. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values (A). The genotypes of CTNNB1 (β-catenin) and APC in the colorectal cancer and liver cancer cell lines used in this analysis were shown (B). β−カテニンの発現を抑制するsiRNAの検討および評価結果を示す。HepG2細胞に、コントロールまたはβ−カテニンsiRNA（20 nM）を一過的に導入し、48時間後に細胞を回収した。細胞抽出物に対しウェスタンブロッティング解析を行った。Aの”β-アクチン”はサンプル量のコントロールである（Ａ）。HepG2細胞に、TOP-flash、pRL-nullおよび図に表示のsiRNA（20 nM）を導入し、48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。縦軸の値は、TOP-flashのホテルルシフェラーゼ活性の測定値をpRL-nullのウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定値で除した値を、コントロールsiRNA（Ctrl）を導入した場合の値で標準化して、示した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した（Ｂ）。Wt:野生型タンパク質 Mut:変異型タンパク質The examination and evaluation result of siRNA which suppresses expression of (beta) -catenin are shown. Control or β-catenin siRNA (20 nM) was transiently introduced into HepG2 cells, and the cells were collected after 48 hours. Western blot analysis was performed on cell extracts. “Β-actin” in A is a sample amount control (A). TOP-flash, pRL-null and siRNA (20 nM) shown in the figure were introduced into HepG2 cells, and luciferase activity was measured 48 hours later. The value on the vertical axis is a value obtained by dividing the measured value of hotel luciferase activity of TOP-flash by the measured value of Renilla luciferase activity of pRL-null, and standardized with the value when control siRNA (Ctrl) is introduced Indicated. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values (B). Wt: Wild type protein Mut: Mutant protein β−カテニン/TCF7L2によって負に制御される遺伝子群のプロモーター活性に対する、β−カテニンsiRNAの影響。β−カテニンsiRNAおよびdnTCF7L2（TCF7L2のドミナントネガティブ）によって顕著に発現上昇する５つの遺伝子、PCK1、HAL、OSTα、PLEK2およびSLPIの５’隣接領域を用いてレポータープラスミドを作成した。これらのプラスミド（pPCK1-1911/+63、pHAL-1726/+147、OSTα-1742/+36、pPLEK2-1426/+84またはpSLPI-1845/+31）をHepG2細胞へ導入し、コントロールsiRNA、またはβ−カテニンsiRNA（#09 または #10）で処理した。各レポータープラスミドのルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAで処理した場合のルシフェラーゼ活性の測定値をコントロールsiRNAで処理した場合の測定値で除した値を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Effect of β-catenin siRNA on the promoter activity of genes negatively regulated by β-catenin / TCF7L2. A reporter plasmid was prepared using 5 'flanking regions of five genes, PCK1, HAL, OSTα, PLEK2 and SLPI, whose expression was significantly increased by β-catenin siRNA and dnTCF7L2 (dominant negative of TCF7L2). These plasmids (pPCK1-1911 / + 63, pHAL-1726 / + 147, OSTα-1742 / + 36, pPLEK2-1426 / + 84 or pSLPI-1845 / + 31) are introduced into HepG2 cells, control siRNA, or Treated with β-catenin siRNA (# 09 or # 10). The luciferase activity of each reporter plasmid was measured 48 hours after siRNA treatment. The measured value of luciferase activity when treated with β-catenin siRNA is divided by the measured value when treated with control siRNA. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. β−カテニン/TCF7L2によって負に制御される遺伝子群のプロモーター活性に対する、dnTCF7L2（TCF7L2のドミナントネガティブ）の影響。HepG2細胞に対し、pGL4.14 (empty)、pPCK1-1911/+63、pHAL-1726/+147、pOSTα-1742/+36、pPLEK2-1426/+84またはpSLPI-1845/+31 と pCAGGSベクターもしくは pCAGGS-dnTCF7L2（TCF7L2のドミナントネガティブ発現ベクター）を組み合わせて、一過性に遺伝子導入した。各レポータープラスミドのルシフェラーゼ活性は、遺伝子導入から48時間後に測定した。pCAGGS-dnTCF7L2導入した場合のルシフェラーゼ活性の測定値を、pCAGGS導入した場合の測定値で除した値を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Effect of dnTCF7L2 (dominant negative of TCF7L2) on promoter activity of genes negatively regulated by β-catenin / TCF7L2. For HepG2 cells, pGL4.14 (empty), pPCK1-1911 / + 63, pHAL-1726 / + 147, pOSTα-1742 / + 36, pPLEK2-1426 / + 84 or pSLPI-1845 / + 31 and pCAGGS vector or pCAGGS-dnTCF7L2 (TCF7L2 dominant negative expression vector) was combined and transiently introduced. The luciferase activity of each reporter plasmid was measured 48 hours after gene introduction. The value obtained by dividing the measured value of luciferase activity when pCAGGS-dnTCF7L2 is introduced by the measured value when pCAGGS is introduced is shown. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. HepG2細胞内におけるAXIN2とHAL遺伝子の発現に対するβ−カテニンsiRNAの影響。β−カテニン/TCF7L2複合体が直接ターゲットにする遺伝子であるAXIN2の発現量（Ａ）と、HALの発現量（Ｂ）を、GADPHを内部コントロールとして定量PCRにより測定した。Effect of β-catenin siRNA on the expression of AXIN2 and HAL genes in HepG2 cells. The expression level (A) of AXIN2, which is a gene directly targeted by the β-catenin / TCF7L2 complex, and the expression level (B) of HAL were measured by quantitative PCR using GADPH as an internal control. β−カテニンsiRNAによってレポーター活性が促進されるために必要なHAL転写領域の検討。β−カテニンsiRNAによって誘導される転写活性に必要な領域を同定するために、レポータープラスミド（pHAL-1726/+147、pHAL-267/+147、pHAL-90/+147またはpHAL-44/+147）をHepG2細胞へ一過性に導入し、コントロールまたはβ−カテニンsiRNA（#09）で処理した。各レポータープラスミドのルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAで処理した場合のルシフェラーゼ活性の測定値をコントロールsiRNAで処理した場合の測定値で除した値を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Examination of HAL transcriptional region necessary for reporter activity to be promoted by β-catenin siRNA. To identify the region required for transcriptional activity induced by β-catenin siRNA, reporter plasmids (pHAL-1726 / + 147, pHAL-267 / + 147, pHAL-90 / + 147 or pHAL-44 / + 147 ) Was transiently introduced into HepG2 cells and treated with control or β-catenin siRNA (# 09). The luciferase activity of each reporter plasmid was measured 48 hours after siRNA treatment. The measured value of luciferase activity when treated with β-catenin siRNA is divided by the measured value when treated with control siRNA. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. 大腸がん細胞および肝がん細胞におけるHALプロモーター活性に対するβ−カテニンsiRNAの影響。β−カテニンsiRNA（#09）またはコントロールsiRNAの存在下において、pHAL-90/+147レポータープラスミドを大腸がん細胞（RKO、 HCT116およびSW480）および肝がん細胞（Huh-7、Huh-6およびHepG2）に一過性に導入した。ルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるHALプロモーター活性は、β−カテニンsiRNA存在下でのルシフェラーゼ活性をコントロールsiRNA存在下でのルシフェラーゼ活性で除した値で表示した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Effect of β-catenin siRNA on HAL promoter activity in colon cancer cells and liver cancer cells. In the presence of β-catenin siRNA (# 09) or control siRNA, pHAL-90 / + 147 reporter plasmids were treated with colon cancer cells (RKO, HCT116 and SW480) and liver cancer cells (Huh-7, Huh-6 and HepG2) was introduced transiently. Luciferase activity was measured 48 hours after siRNA treatment. The HAL promoter activity induced in response to β-catenin siRNA was expressed as a value obtained by dividing the luciferase activity in the presence of β-catenin siRNA by the luciferase activity in the presence of control siRNA. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. pHAL-90/+147の応答特異性の検討。HepG2細胞に、pHAL-90/+147ベクター（Ａ）またはpGL4.14 emptyベクター（HALのプロモーター配列を含まないベクター）（Ｂ）を導入し、次いで、コントロールまたはβ−カテニンsiRNA（20 nM）で処理した。ルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるルシフェラーゼ活性は、コントロールsiRNAのルシフェラーゼ活性で除した値を示した。グラフは、レポーター活性の倍率変化を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Examination of the response specificity of pHAL-90 / + 147. HepG2 cells were introduced with pHAL-90 / + 147 vector (A) or pGL4.14 empty vector (vector without HAL promoter sequence) (B) and then with control or β-catenin siRNA (20 nM) Processed. Luciferase activity was measured 48 hours after siRNA treatment. The luciferase activity induced in response to β-catenin siRNA showed a value divided by the luciferase activity of the control siRNA. The graph shows the fold change in reporter activity. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. pHAL-90/+147の応答特異性の検討。HepG2細胞にpHAL-90/+147ベクターまたはpGL4.14 Emptyベクター（HALのプロモーター配列を含まないベクター）を、pCAGGS-dnTCF7L2またはpCAGGSベクターと共に導入した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミド導入から48時間後に測定した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Examination of the response specificity of pHAL-90 / + 147. A pHAL-90 / + 147 vector or pGL4.14 Empty vector (a vector not containing the HAL promoter sequence) was introduced into HepG2 cells together with the pCAGGS-dnTCF7L2 or pCAGGS vector. Luciferase activity was measured 48 hours after plasmid introduction. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. β−カテニンの活性化に対するpHAL-90/+147の応答活性の検討。活性型のβ−カテニンを発現するプラスミドであるpcDNAβ-cateninまたはその空ベクターと共に、TOP-flashおよびpRL-null、または、FOP-flashおよびpRL-null を、HeLa細胞およびHuh-7細胞に導入した。Wnt活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性（pRL-null）で標準化したTOP/FOP活性として示した（左側の図）。また、pcDNAβ-cateninまたはその空ベクターと共に、pHAL-90/+147 およびpRL-null を、HeLa細胞およびHuh-7細胞に導入した（右側の図）。ルシフェラーゼ活性は、プラスミド導入から48時間後に測定した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Examination of the response activity of pHAL-90 / + 147 to the activation of β-catenin. TOP-flash and pRL-null, or FOP-flash and pRL-null, together with pcDNA β-catenin, a plasmid expressing active β-catenin or its empty vector, were introduced into HeLa and Huh-7 cells . Wnt activity was shown as TOP / FOP activity normalized by Renilla luciferase activity (pRL-null) (left figure). Moreover, pHAL-90 / + 147 and pRL-null were introduced into HeLa cells and Huh-7 cells together with pcDNAβ-catenin or its empty vector (right figure). Luciferase activity was measured 48 hours after plasmid introduction. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. 異なるコピー数（繰り返し数）のpHAL-90/+147領域をもつレポータープラスミドのルシフェラーゼ活性の検討。HALプロモーターの-90/+147 領域の1つ（x1） またはタンデムリピート（x2、x4およびx8）を、pGL4.14ベクターにクローニングした。β−カテニンsiRNA（#09）またはコントロールsiRNAと共に、作製したレポータープラスミドをHepG2細胞に一過性に導入した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミドおよびsiRNA導入から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるルシフェラーゼ活性は、コントロールsiRNAのルシフェラーゼ活性で除した値を示した。グラフは、レポーター活性の倍率変化を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Examination of luciferase activity of reporter plasmid having pHAL-90 / + 147 region with different copy number (repeat number). One of the -90 / + 147 regions of the HAL promoter (x1) or tandem repeats (x2, x4 and x8) were cloned into the pGL4.14 vector. The produced reporter plasmid was transiently introduced into HepG2 cells together with β-catenin siRNA (# 09) or control siRNA. Luciferase activity was measured 48 hours after plasmid and siRNA introduction. The luciferase activity induced in response to β-catenin siRNA showed a value divided by the luciferase activity of the control siRNA. The graph shows the fold change in reporter activity. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. pHAL-90/+147領域を組込んだレポーターベクターの評価。HAL-90/+147の8回のタンデムリピートを、pGL4.14、pGL4.22およびpGL4.24のベクターにクローニングした。β−カテニンsiRNA（#09）またはコントロールsiRNAと共に、これら３つのレポータープラスミドをHepG2細胞に一過性に導入した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミドおよびsiRNA導入から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるルシフェラーゼ活性は、コントロールsiRNAのルシフェラーゼ活性で除した値を示した。グラフは、レポーター活性の倍率変化を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Evaluation of a reporter vector incorporating the pHAL-90 / + 147 region. Eight tandem repeats of HAL-90 / + 147 were cloned into pGL4.14, pGL4.22 and pGL4.24 vectors. Together with β-catenin siRNA (# 09) or control siRNA, these three reporter plasmids were transiently introduced into HepG2 cells. Luciferase activity was measured 48 hours after plasmid and siRNA introduction. The luciferase activity induced in response to β-catenin siRNA showed a value divided by the luciferase activity of the control siRNA. The graph shows the fold change in reporter activity. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. pHAL-FlucおよびpTOP-Rlucの両方を安定に発現するHepG2 4-61細胞のルシフェラーゼ活性。HepG2 4-61細胞は、HepG2細胞を、ホタルルシフェラーゼ（Firefly luciferase）遺伝子の上流に8x HAL-90/+147のタンデムリピートを含むpHAL-Flucと、 6xTCF/LEF結合エレメントをウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子の上流に含む pTOP-Rlucを安定的に導入して樹立した。細胞を96-wellプレートに播種し、β−カテニンsiRNA（#09および#10）またはコントロールsiRNAで処理した。ルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Luciferase activity of HepG2 4-61 cells stably expressing both pHAL-Fluc and pTOP-Rluc. HepG2 4-61 cells were prepared by transforming HepG2 cells into pHAL-Fluc containing 8x HAL-90 / + 147 tandem repeats upstream of the firefly luciferase gene, and 6xTCF / LEF binding elements in Renilla luciferase. ) Established by stably introducing pTOP-Rluc contained upstream of the gene. Cells were seeded in 96-well plates and treated with β-catenin siRNA (# 09 and # 10) or control siRNA. Luciferase activity was measured 48 hours after siRNA treatment. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values. β−カテニンsiRNAに応答するPCK1レポーターの活性の検討。レポータープラスミド（pPCK1-1911/+63、pPCK1-559/+63または pPCK1-183/+63）を、HepG2細胞に一過性に導入し、β−カテニンsiRNA（#09）またはコントロールsiRNA、20 nMで処理した。ルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるルシフェラーゼ活性は、コントロールsiRNAのルシフェラーゼ活性で除した値を示した。グラフは、レポーター活性の倍率変化を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。Examination of PCK1 reporter activity in response to β-catenin siRNA. Reporter plasmid (pPCK1-1911 / + 63, pPCK1-559 / + 63 or pPCK1-183 / + 63) is transiently introduced into HepG2 cells, and β-catenin siRNA (# 09) or control siRNA, 20 nM Was processed. Luciferase activity was measured 48 hours after siRNA treatment. The luciferase activity induced in response to β-catenin siRNA showed a value divided by the luciferase activity of the control siRNA. The graph shows the fold change in reporter activity. Data are shown as the mean ± SD of three experimental values.

本発明、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法に関するものである。
本発明の実施形態の１つは、任意の転写因子および／またはその上流のシグナル伝達経路の活性を制御する、分子および／または物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該転写因子が発現し、かつ、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ａを含む核酸および該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ｂを含む核酸が導入されている細胞に、試験分子または試験物質を導入し、
（ｂ）レポーター遺伝子Ａの発現とレポーター遺伝子Ｂの発現を検出し、
検出したレポーター遺伝子Ａの発現量の変化とレポーター遺伝子Ｂの発現量の変化が逆である場合に、該試験分子または試験物質を該転写因子の活性を制御する候補分子または候補物質として選択するスクリーニング方法である。 The present invention relates to an upstream signal transduction pathway that regulates a transcription factor and / or a method for screening a molecule and / or substance that controls the activity of the transcription factor.
One embodiment of the present invention is a method of screening for molecules and / or substances that controls the activity of any transcription factor and / or upstream signaling pathway,
(A) Nucleic acid containing reporter gene A to which a transcription factor is expressed and a response sequence positively controlled by the transcription factor is operably linked, and a response sequence negatively regulated by the transcription factor can act Introducing a test molecule or a test substance into a cell into which a nucleic acid containing a linked reporter gene B has been introduced;
(B) detecting the expression of reporter gene A and reporter gene B,
Screening for selecting the test molecule or test substance as a candidate molecule or candidate substance that controls the activity of the transcription factor when the detected change in the expression level of reporter gene A and the change in the expression level of reporter gene B are opposite Is the method.

本発明において、転写因子とは、ある遺伝子の転写を制御（正、負、いずれの制御をも含む）するため、該遺伝子の転写調節領域のDNA配列を認識し、結合する因子のことである。本明細書では、転写調節領域のDNAに直接結合する因子の他、該因子を含む転写複合体についても、転写因子として表現する。また、転写因子は、本発明のスクリーニング方法で使用する細胞に内在するものであっても、あるいは、外来の転写因子を該細胞内で発現させたものであってもよい。
また、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路とは、特定の遺伝子の転写調節を行うために、細胞膜あるいは細胞質内の因子が次々と相互作用をして、転写因子に対して、転写調節の指令を伝達する経路のことである。このシグナル伝達経路が何らかの制御を受けると、その経路で機能する転写因子の活性に影響が及ぼされることになる。従って、本発明のスクリーニング方法は、転写因子を制御する分子や物質を対象とするのみならず、該転写因子調節する上流のシグナル伝達経路を制御する分子や物質のスクリーニング方法としても使用可能である。 In the present invention, a transcription factor is a factor that recognizes and binds to the DNA sequence of the transcriptional regulatory region of a gene in order to control transcription (including positive, negative, and any control) of a gene. . In the present specification, in addition to a factor that directly binds to DNA in the transcriptional regulatory region, a transcription complex containing the factor is also expressed as a transcription factor. Moreover, the transcription factor may be endogenous to the cell used in the screening method of the present invention, or may be a foreign expression factor expressed in the cell.
In addition, the upstream signal transduction pathway that regulates transcription factors refers to the transcriptional regulation of transcription factors by the interaction of factors in the cell membrane or cytoplasm one after another in order to regulate the transcription of specific genes. It is a route for transmitting commands. When this signal transduction pathway is subjected to some control, the activity of transcription factors functioning in the pathway is affected. Therefore, the screening method of the present invention can be used not only for molecules and substances that control transcription factors, but also as screening methods for molecules and substances that control upstream signaling pathways that regulate the transcription factors. .

本発明のスクリーニング方法においては、「転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸」、および、「転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸」が導入された細胞を使用する。
「転写因子が正に制御する応答配列」または「転写因子が負に制御する応答配列」とは、転写因子が転写調節を行っている遺伝子の発現を正または負に制御するために、該転写因子が直接的または間接的に制御する転写調節領域（転写プロモーターを含む領域）のことである。 In the screening method of the present invention, “a nucleic acid comprising a reporter gene operably linked to a response element positively regulated by a transcription factor” and “a response element negatively regulated by a transcription factor are operably linked. Cells into which a nucleic acid containing a reporter gene has been introduced.
“Transcription factor positively controlling response element” or “Transcription factor negatively controlling response element” means that the transcription factor regulates the expression of a gene whose transcription is regulated positively or negatively. It is a transcriptional regulatory region (region containing a transcriptional promoter) that is directly or indirectly controlled by a factor.

例えば、「転写因子が正に制御する応答配列」とは、ある遺伝子Ｍの発現を増加させるため、転写因子が直接結合するDNA領域（直接的に制御する転写領域）、または、該転写因子が他の転写因子を介して、遺伝子Ｍの発現を増加させる場合であって、他の転写因子が結合するDNA領域（間接的に制御する転写領域）のことである。また、「転写因子が負に制御する応答配列」とは、ある遺伝子Ｎの発現を減少させるために、転写因子が直接結合するDNA領域（直接的に制御する転写領域）、または、該転写因子が他の転写因子を介して、遺伝子Ｎの発現を減少させる場合であって、他の転写因子が結合するDNA領域（間接的に制御する転写領域）のことである。「間接的」な転写制御の場合には、対象の転写因子が応答配列を制御するまでに、複数の他の転写因子が機能してもよい。   For example, “a response element positively controlled by a transcription factor” refers to a DNA region (transcription region directly controlled) to which a transcription factor directly binds to increase the expression of a gene M, or This is a case where the expression of the gene M is increased via another transcription factor, and is a DNA region (transcription region controlled indirectly) to which the other transcription factor binds. In addition, the “response element negatively controlled by a transcription factor” means a DNA region (transcription region directly controlled) to which a transcription factor directly binds to reduce the expression of a gene N, or the transcription factor Is a case where the expression of the gene N is decreased through another transcription factor, and is a DNA region (transcription region controlled indirectly) to which the other transcription factor binds. In the case of “indirect” transcription control, a plurality of other transcription factors may function until the transcription factor of interest controls the response element.

本発明のスクリーニング方法の対象となる転写因子が、上述の通り、正または負に制御する応答配列は、直接的に制御する配列（該転写因子が直接結合する応答配列）、間接的に制御する配列（該転写因子が他の転写因子の活性を通じて制御する応答配列）、いずれの配列であってもよい。
「転写因子が正に制御する応答配列」は、その転写因子を細胞に導入した場合に、該細胞内において発現が増加する遺伝子の転写調節領域、あるいは、該転写因子の阻害因子を（ドミナントネガティブ、siRNAなど）細胞内に導入した場合に、該細胞内において発現が減少する遺伝子の転写調節領域などを使用してもよく、マイクロアレイやRNAシークエンシングなどを用いて網羅的に同定することができる。あるいは、当業者であれば、公開されている遺伝子発現解析データ（例えば、Gene Expression Omnibus、Expression Atlas、およびcBioPortal for Cancer Genomicsなどのデータベースを利用することができる）などを利用することもできる。さらに、発現変動する遺伝子の５’隣接領域やイントロン領域の転写因子結合モチーフを、公開されているプログラム（JASPAR CORE databaseなど）で検索することにより、どの転写因子がどの配列に結合または作用するか予測することができる。本発明の実施例にも示す通り、例えば、転写因子がβ−カテニン/TCF7L2の場合には、「転写因子が正に制御する応答配列」は、TCF binding element（TBE）などを例示することができる。その他、転写因子ATF、androgen receptor、NRF、C/EBP、CREB、E2F、p53、EGR1、CBF/NF-Y/YY1、estrogen receptor、GATA、glucocorticoid receptor、HSF、HNF、MTF1、GLI、HIF、IRF、STAT、KLF、LXRa、Elk-1、AP-1、MEF2、Myc、Nanog、NFκB、RBP-J、Oct4、Pax6、FOXO、NFAT、PPAR、progesterone receptor、RAR、RXR、Sox2、SP1、SMAD、vitamin D receptor、AhRなどはその特異的な応答配列が同定されている（http://www.sabiosciences.com/reporterassays.phpなどを参照のこと）。
また、「転写因子が負に制御する応答配列」は、その転写因子を細胞に導入した場合に、該細胞内において発現が減少する遺伝子の転写調節領域、あるいは、該転写因子の阻害因子（ドミナントネガティブ、siRNAなど）を細胞内に導入した場合に、該細胞内において発現が増加する遺伝子の転写調節領域などを使用してもよく、マイクロアレイやRNAシークエンシングなどを用いて網羅的に同定することができる。あるいは、当業者であれば、公開されている遺伝子発現解析データ（例えば、Gene Expression Omnibus、Expression Atlas、およびcBioPortal for Cancer Genomicsなどのデータベースを利用することができる）などを利用することもできる。さらに、発現変動する遺伝子の５’隣接領域やイントロン領域の転写因子結合モチーフを、公開されているプログラム（JASPAR CORE databaseなど）で検索することにより、どの転写因子がどの配列に結合または作用するか予測することができる。本発明の実施例にも示す通り、例えば、転写因子がβ−カテニン/TCF7L2の場合、「転写因子が負に制御する応答配列」としては、β−カテニン/TCF7L2が他の転写因子を介して間接的に制御する応答配列（つまり、当該他の転写因子が直接制御する応答配列）であるHAL遺伝子など、表４に示される遺伝子の転写調節領域の中でβ−カテニン/TCF7L2によって間接的にその転写が負に制御するDNA配列を例示することができる（なお、表４に示される遺伝子の転写調節領域の配列は、米国NCBIの遺伝子情報を統合したデータベース(Entrez Gene: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)などから容易に入手可能である）。 As described above, the response element that is positively or negatively controlled by the transcription factor that is the subject of the screening method of the present invention is directly controlled (sequence that the transcription factor binds directly), indirectly. The sequence may be any sequence (a response sequence that the transcription factor controls through the activity of other transcription factors).
“A response element that is positively regulated by a transcription factor” refers to a transcription regulatory region of a gene whose expression increases in the cell when the transcription factor is introduced into the cell, or an inhibitor of the transcription factor (dominant negative). , SiRNA, etc.) When introduced into a cell, a transcriptional regulatory region of a gene whose expression decreases in the cell may be used, and can be comprehensively identified using microarrays, RNA sequencing, etc. . Alternatively, those skilled in the art can use publicly available gene expression analysis data (for example, databases such as Gene Expression Omnibus, Expression Atlas, and cBioPortal for Cancer Genomics) can be used. Furthermore, by searching for transcription factor binding motifs in the 5 'flanking region and intron region of genes whose expression varies, using published programs (such as JASPAR CORE database), which transcription factor binds to or acts on which sequence Can be predicted. As shown in the examples of the present invention, for example, when the transcription factor is β-catenin / TCF7L2, the “response element positively regulated by the transcription factor” may be exemplified by TCF binding element (TBE) and the like. it can. Other transcription factors ATF, androgen receptor, NRF, C / EBP, CREB, E2F, p53, EGR1, CBF / NF-Y / YY1, estrogen receptor, GATA, glucocorticoid receptor, HSF, HNF, MTF1, GLI, HIF, IRF , STAT, KLF, LXRa, Elk-1, AP-1, MEF2, Myc, Nanog, NFκB, RBP-J, Oct4, Pax6, FOXO, NFAT, PPAR, progesterone receptor, RAR, RXR, Sox2, SP1, SMAD, Specific response elements of vitamin D receptor, AhR, etc. have been identified (see http://www.sabiosciences.com/reporterassays.php).
The “response element negatively regulated by a transcription factor” is a transcription regulatory region of a gene whose expression decreases in the cell when the transcription factor is introduced into the cell, or an inhibitor of the transcription factor (dominant factor). When a gene such as negative or siRNA is introduced into a cell, a transcriptional regulatory region of a gene whose expression increases in the cell may be used, and it is comprehensively identified using a microarray or RNA sequencing. Can do. Alternatively, those skilled in the art can use publicly available gene expression analysis data (for example, databases such as Gene Expression Omnibus, Expression Atlas, and cBioPortal for Cancer Genomics) can be used. Furthermore, by searching for transcription factor binding motifs in the 5 'flanking region and intron region of genes whose expression varies, using published programs (such as JASPAR CORE database), which transcription factor binds to or acts on which sequence Can be predicted. As shown in the examples of the present invention, for example, when the transcription factor is β-catenin / TCF7L2, as the “response element negatively regulated by the transcription factor”, β-catenin / TCF7L2 is mediated via other transcription factors. Indirectly regulated by β-catenin / TCF7L2 in the transcriptional regulatory regions of genes shown in Table 4, such as HAL genes that are response elements that are indirectly controlled (ie, response elements that are directly controlled by other transcription factors) Examples of DNA sequences whose transcription is negatively regulated can be exemplified (the transcriptional regulatory region sequences of the genes shown in Table 4 are databases integrated with US NCBI gene information (Entrez Gene: http: // www ncbi.nlm.nih.gov/gene) etc.).

本発明のスクリーニング方法においては、対象となる転写因子が正または負に制御する応答配列が「作用可能」に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が、スクリーニングに使用する細胞内に導入されている。ここで、「作用可能」とは、転写因子が制御する応答配列に、該転写因子または該転写因子が活性制御する他の転写因子が結合した場合に、該応答配列に隣接して結合されているレポーター遺伝子が発現し得るように、応答配列とレポーター遺伝子を連結することを意味する。   In the screening method of the present invention, a nucleic acid containing a reporter gene to which a response element controlled positively or negatively by a transcription factor of interest is operably linked is introduced into a cell used for screening. Here, “actable” means that when the transcription factor or another transcription factor whose activity is controlled by the transcription factor is bound to the response sequence controlled by the transcription factor, the transcription factor is bound adjacent to the response sequence. It means that a response element and a reporter gene are linked so that a reporter gene can be expressed.

レポーター遺伝子は、本発明のスクリーニング方法に使用される「応答配列」が機能していることを示す遺伝子、すなわち、応答配列によって転写が制御される遺伝子であれば、いかなる遺伝子であっても使用可能であり、例えば、緑色蛍光蛋白質（GFP）遺伝子およびその変異体、ルシフェラーゼ遺伝子などが利用可能であり、当業者であれば、容易に選択し、使用することが可能である。そして、レポーター遺伝子を含む「核酸」は、本発明のスクリーニング方法を実施する細胞内において、応答配列の制御を介して、レポーター遺伝子を発現させるものであれば、いかなるものであってもよく、プラスミドベクターのように、宿主細胞から独立して、自立的に発現制御されるものであってもよく、あるいは、宿主細胞の染色体に組み込まれレポーター遺伝子が転写制御されるように構築されたベクターであってもよい。   As the reporter gene, any gene can be used as long as it is a gene indicating that the “response element” used in the screening method of the present invention is functioning, that is, a gene whose transcription is controlled by the response element. For example, a green fluorescent protein (GFP) gene and a variant thereof, a luciferase gene, and the like are available, and those skilled in the art can easily select and use them. The “nucleic acid” containing the reporter gene may be any nucleic acid as long as it allows the reporter gene to be expressed through the control of the response element in the cell for performing the screening method of the present invention. The vector may be one that is independently expressed and controlled independently of the host cell, such as a vector, or a vector that is integrated into the host cell chromosome and is transcriptionally controlled by the reporter gene. May be.

本発明の転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法は、該転写因子が発現し、機能する細胞であって、該転写因子が正に制御する応答配列によって発現調節されるレポーター遺伝子（レポーター遺伝子Ａとする）を含む核酸（レポーター遺伝子の発現ベクターなど）、および、該転写因子が負に制御する応答配列によって発現調節されるレポーター遺伝子（レポーター遺伝子Ｂとする）を含む核酸（レポーター遺伝子の発現ベクターなど）が導入された細胞に、試験物質を導入して、レポーター遺伝子（ＡおよびＢ）の活性の変化を指標として、試験物質または試験分子が転写因子に及ぼす影響を評価することに基づいている。すなわち、レポーター遺伝子Ａとレポーター遺伝子Ｂの発現を確認し、Ａの発現とＢの発現が逆に制御される場合に、該試験物質または試験分子が、転写因子の活性を制御する候補物質または候補分子であると判断する。
例えば、試験物質が転写因子の活性を抑制する物質であった場合、転写因子によって正に制御されるレポーター遺伝子Ａの発現は減少し、転写因子によって負に制御されるレポーター遺伝子Ｂの発現は増加することになる。これとは逆に、試験物質が転写因子の活性を増強する物質であった場合、転写因子に正に制御されるレポーター遺伝子Ａの発現は増加し、転写因子に負に制御されるレポーター遺伝子Ｂの発現は減少することになる。
従って、本発明のスクリーニング方法においては、レポーター遺伝子Ａとレポーター遺伝子Ｂの発現が逆方向に変化する場合に、試験物質または試験分子は、転写因子の活性を抑制または増強するように作用する物質または分子であると判断することができる。このように、本発明のスクリーニング方法は、対象となる転写因子の活性の変化を２種類のレポーター遺伝子で評価し、しかも、それらのレポーター活性が逆に変化することを指標にしているため、偽陽性の結果を排除することができ、確度の高い、転写因子の制御物質または分子の検索を可能にするものである。 The screening method for molecules and / or substances that regulate upstream signaling pathways and / or transcription factor activities that regulate the transcription factor of the present invention is a cell in which the transcription factor is expressed and functioning. Is regulated by a nucleic acid (such as reporter gene expression vector) containing a reporter gene (referred to as reporter gene A) whose expression is regulated by a response element that is positively regulated, and a response element that is negatively regulated by the transcription factor A test substance is introduced into a cell into which a nucleic acid (reporter gene expression vector or the like) containing a reporter gene (reporter gene B) has been introduced, and the change in the activity of the reporter genes (A and B) is used as an index for testing. Based on evaluating the effect of a substance or test molecule on transcription factors. That is, when the expression of the reporter gene A and the reporter gene B is confirmed, and the expression of A and the expression of B are controlled in reverse, the test substance or test molecule controls the activity of the transcription factor. Judged to be a numerator.
For example, when the test substance is a substance that suppresses the activity of the transcription factor, the expression of the reporter gene A that is positively controlled by the transcription factor is decreased, and the expression of the reporter gene B that is negatively controlled by the transcription factor is increased. Will do. On the contrary, when the test substance is a substance that enhances the activity of the transcription factor, the expression of the reporter gene A positively controlled by the transcription factor increases, and the reporter gene B negatively controlled by the transcription factor Expression will be reduced.
Therefore, in the screening method of the present invention, when the expression of reporter gene A and reporter gene B changes in opposite directions, the test substance or test molecule acts as a substance or a substance that acts to suppress or enhance the activity of a transcription factor. It can be determined to be a molecule. As described above, the screening method of the present invention evaluates the change in the activity of the transcription factor of interest with two reporter genes, and uses the change in the reporter activity as an index. A positive result can be excluded, and it is possible to search for a transcription factor regulator or molecule with high accuracy.

レポーター遺伝子の発現の変化は、当業者であれば、容易に検出することが可能である。例えば、GFPやルシフェラーゼのように発光性の蛋白質の遺伝子をレポーター遺伝子として使用する場合には、細胞を培養後、細胞を溶解し、発光を測定するのに適したプレートに溶解物を移して、発光を測定してもよく、あるいは、培養した細胞からの発光を直接測定してもよい。   Changes in the expression of the reporter gene can be easily detected by those skilled in the art. For example, when using a gene of a luminescent protein such as GFP or luciferase as a reporter gene, after culturing the cells, the cells are lysed, and the lysate is transferred to a plate suitable for measuring luminescence, Luminescence may be measured, or luminescence from cultured cells may be measured directly.

本発明のスクリーニング方法において使用される細胞は、対象となる転写因子が機能し、転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が導入されている細胞であって、２つのレポーター遺伝子が発現可能な（機能し得る）細胞であれば、いかなる細胞であってもよく、いかなる種由来であってもよい。つまり、上記要件を満たす細胞であれば、例えば、哺乳類細胞（マウス、ラット、ヒトなど）や、目的によっては、鳥類の細胞などを使用してもよい。また、正常細胞であっても癌細胞であってもよく、限定はされない。
そして、本発明のスクリーニング方法の対象となる転写因子が内在的に存在し、発現し、機能している細胞であっても、あるいは、対象となる転写因子が元々は存在しないが、外来性の転写因子を導入することで、その転写因子が発現し、機能し得る細胞であっても、使用可能である。 The cell used in the screening method of the present invention has a nucleic acid comprising a reporter gene to which a target transcription factor functions and a response element positively regulated by the transcription factor is operably linked, and the transcription factor is negative. Any cell into which a nucleic acid containing a reporter gene to which a response element to be controlled is operably linked has been introduced, and which can express (function) two reporter genes. It can be from any species. In other words, for example, mammalian cells (mouse, rat, human, etc.) or avian cells may be used depending on the purpose as long as they satisfy the above requirements. Moreover, it may be a normal cell or a cancer cell, and is not limited.
And even if the transcription factor which is the target of the screening method of the present invention is endogenously present, expressed and functioning, or the target transcription factor originally does not exist, By introducing a transcription factor, even cells that can express and function can be used.

本発明の他の実施形態は、本発明のスクリーニング方法を実施するためのシステムあるいはキットである。本発明のシステムあるいはキットには、転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が含まれていてもよい。また、本発明のシステムあるいはキットには、スクリーニングの対象となる転写因子がすでに発現しているか、あるいは、発現し得る細胞であって、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸に挿入されているレポーター遺伝子が発現し、機能し得る細胞が含まれていてもよい。
さらに、本発明のシステムあるいはキットには、核酸、細胞以外にも、本発明のスクリーニングを実施するために必要な試薬類、細胞株、アッセイプレートなどが含まれていてもよい。 Another embodiment of the present invention is a system or kit for carrying out the screening method of the present invention. The system or kit of the present invention includes a nucleic acid containing a reporter gene operably linked to a response element positively regulated by a transcription factor, and a reporter operably linked to a response element negatively regulated by a transcription factor Nucleic acids containing genes may be included. In addition, the transcription factor to be screened is already expressed or can be expressed in the system or kit of the present invention, and the response element positively controlled by the transcription factor is operably linked. A cell capable of expressing and functioning a nucleic acid containing a reporter gene, and a reporter gene inserted into a nucleic acid containing a reporter gene operatively linked to a response element negatively regulated by a transcription factor. May be.
Furthermore, the system or kit of the present invention may contain reagents, cell lines, assay plates, etc. necessary for carrying out the screening of the present invention in addition to nucleic acids and cells.

転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体である場合には、例えば、限定はしないが、β−カテニン/TCF7L2複合体が正に制御する応答配列としTCF/LEF結合エレメントが作用可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子など）を含む核酸（レポ−ター遺伝子を発現する発現ベクターなど）、および、限定はしないが、β−カテニン/TCF7L2複合体が負に制御する応答配列としHAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域が作用可能に連結されたレポ−ター遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子など）を含む核酸（レポ−ター遺伝子を発現する発現ベクターなど）などが本発明のシステムあるいはキットに含まれていてもよい。   When the transcription factor is a β-catenin / TCF7L2 complex, for example, but not limited to, a TCF / LEF binding element is operably linked as a response element that the β-catenin / TCF7L2 complex positively controls. Nucleic acids including reporter genes (eg, firefly luciferase gene, Renilla luciferase gene, etc.), including but not limited to β-catenin / TCF7L2 complex are negatively regulated HAL gene, PCK1 gene, PLEK2 gene, SLPI gene, OSTα gene, ITGB3 gene, CAPN5 gene, MUC20 gene, CREB3L3 gene, MFSD2B gene, CYP2C18 gene, TMEM229B gene, APOA4 gene, TIMD4 gene, FXYD3 gene, FAM65B gene , Reporter inheritance in which the transcriptional regulatory regions of HAVCR1, PDZD3, SORCS2 or LGALS2 gene are operatively linked A nucleic acid (such as an expression vector that expresses a reporter gene) containing a child (for example, a firefly luciferase gene, a Renilla luciferase gene, or the like) may be included in the system or kit of the present invention.

以下に実施例を示し、本発明についてさらに詳細な説明を行うが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。以下の実施例では、転写因子複合体であるβ−カテニン/TCF7L2の活性を負に制御する物質をスクリーニングする方法の構築過程を一例として示した。
本実施例では、転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含むプラスミド、および、転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含むプラスミドの作製方法について、具体的な遺伝子を示して説明を行った。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples. In the following examples, the construction process of a method for screening a substance that negatively regulates the activity of β-catenin / TCF7L2 which is a transcription factor complex is shown as an example.
In this example, a plasmid containing a reporter gene operably linked to a response element that is positively regulated by a transcription factor, and a plasmid containing a reporter gene operatively linked to a response element that is negatively regulated by a transcription factor The production method was described by showing specific genes.

１．材料と方法
１−１．細胞株
ヒト大腸がん細胞株HCT116、SW480、RKOは、American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入した。ヒト肝細胞がんHuh-6、Huh-7は医薬基盤研究所・JCRB細胞バンク、肝芽腫HepG2細胞およびヒト子宮頸がん由来HeLa細胞はATCCより購入した。これらの細胞株は10 %ウシ胎児血清(FBS)と抗生物質を含む培地を用いて37℃、5%CO2条件下で継代培養した。HCT116細胞にはMcCoy’s 5A培地RKO、Huh-6およびHuh-7細胞にはDulbecco’s modified Eagle’s培地、HepG2およびHeLa細胞にはEagle’s Minimum Essential培地を用いた。SW480細胞に関しては10 %FBSと抗生物質を含むLeibovitz’s L-15培地を用いて37 ℃、CO2 free 条件下で継代培養を行った。 1. Materials and Methods 1-1. Cell lines Human colon cancer cell lines HCT116, SW480, and RKO were purchased from the American Tissue Culture Collection (ATCC). Human hepatocellular carcinoma Huh-6 and Huh-7 were purchased from ATCC for the Pharmaceutical Research Institute, JCRB cell bank, hepatoblastoma HepG2 cells and human cervical cancer-derived HeLa cells. These cell lines were subcultured in a medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics at 37 ° C. and 5% CO 2 . McCoy's 5A medium RKO was used for HCT116 cells, Dulbecco's modified Eagle's medium was used for Huh-6 and Huh-7 cells, and Eagle's Minimum Essential medium was used for HepG2 and HeLa cells. SW480 cells were subcultured using Leibovitz's L-15 medium containing 10% FBS and antibiotics at 37 ° C. under CO 2 free conditions.

１−２．レポータープラスミドおよび発現プラスミドの作製
TOP-flashおよびFOP-flash はMillipore、pRL-nullはPromegaより購入した。
Histidine ammonia-lyase(HAL)、phosphoenolpyruvate carboxykinase 1(PCK1)、organic solute transporter alpha(OSTα)、pleckstrin 2(PLEK2)、およびsecretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI)の5’-flanking領域をPCRによって増幅し、それぞれに対応する制限酵素で消化し、pGL4.14ベクター(Promega)にクローニングした。
pHAL-Flucレポータープラスミドは、HAL遺伝子-90/+147領域をPCRで増幅した産物を精製し、制限酵素で消化した後、pGL4.24ベクター(Promega)にクローニングした。最終的に8個のHAL遺伝子-90/+147領域がタンデムに連結するクローン(pHAL-Fluc)を構築した。pTOP-Rlucレポータープラスミドは、pGL4.71ベクター(Promega)由来のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をPCRにより増幅して得られた産物を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を制限酵素で切断し除去しておいたTOP-flashに挿入した。これらのプラスミド作製に使用したプライマー配列を表１に示した。
発現プラスミドはpCAGGS-dnTCF7L2(TCF7L2のドミナントネガティブ変異型)およびpcDNA-mutβ-catenin(HCT116細胞株より得られたβ−カテニンの活性型変異体、p.S45del)を使用した（Cancer Res. 2002 Oct 15;62(20):5651-6. Isolation of a novel human gene, APCDD1, as a direct target of the beta-Catenin/T-cell factor 4 complex with probable involvement in colorectal carcinogenesis.Takahashi M, Fujita M, Furukawa Y, Hamamoto R, Shimokawa T, Miwa N, Ogawa M, Nakamura Y.および Cancer Res. 2001 Nov 1;61(21):7722-6. Up-regulation of the ectodermal-neural cortex 1 (ENC1) gene, a downstream target of the beta-catenin/T-cell factor complex, in colorectal carcinomas. Fujita M, Furukawa Y, Tsunoda T, Tanaka T, Ogawa M, Nakamura Y.を参照のこと）。作製したプラスミドの配列はシークエンシング（ABI PRISM3730、Thermo Fisher Scientific）によって確認した。 1-2. Preparation of reporter plasmid and expression plasmid
TOP-flash and FOP-flash were purchased from Millipore and pRL-null from Promega.
Histidine ammonia-lyase (HAL), phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1), organic solute transporter alpha (OSTα), pleckstrin 2 (PLEK2), and secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI) 5'-flanking regions were amplified by PCR, respectively. Was digested with restriction enzymes corresponding to and cloned into pGL4.14 vector (Promega).
The pHAL-Fluc reporter plasmid was cloned into the pGL4.24 vector (Promega) after purifying the product obtained by PCR amplification of the HAL gene-90 / + 147 region, digesting with restriction enzymes. Finally, a clone (pHAL-Fluc) in which 8 HAL gene-90 / + 147 regions were tandemly linked was constructed. The pTOP-Rluc reporter plasmid is a product obtained by amplifying the Renilla luciferase gene from the pGL4.71 vector (Promega) by PCR, and the TOP-flash that has been removed by cutting the firefly luciferase gene with a restriction enzyme. Inserted. Table 1 shows the primer sequences used for preparing these plasmids.
Expression plasmids used were pCAGGS-dnTCF7L2 (dominant negative mutant of TCF7L2) and pcDNA-mutβ-catenin (an active mutant of β-catenin obtained from HCT116 cell line, p.S45del) (Cancer Res. 2002 Oct 15; 62 (20): 5651-6. Isolation of a novel human gene, APCDD1, as a direct target of the beta-Catenin / T-cell factor 4 complex with probable involvement in colorectal carcinogenesis.Takahashi M, Fujita M, Furukawa Y, Hamamoto R, Shimokawa T, Miwa N, Ogawa M, Nakamura Y. and Cancer Res. 2001 Nov 1; 61 (21): 7722-6. Up-regulation of the ectodermal-neural cortex 1 (ENC1) gene, a downstream target of the beta-catenin / T-cell factor complex, in colorectal carcinomas. See Fujita M, Furukawa Y, Tsunoda T, Tanaka T, Ogawa M, Nakamura Y.). The sequence of the prepared plasmid was confirmed by sequencing (ABI PRISM3730, Thermo Fisher Scientific).

１−３．遺伝子サイレンシングおよび定量RT-PCR
異なる配列を標的とする3種類のβ-catenin siRNA（#09、#10、#12）あるいはコントロールsiRNA（siCtrl）をThermo Fisher Scientific およびSigmaより購入した。これらのsiRNAの標的配列を表２に示した。細胞にsiRNAをLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて導入し、48時間後に細胞を回収した。回収した細胞からRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いてtotal RNAを抽出し、1μgのtotal RNAよりTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche Diagnostics）を用いてcDNA合成を行った。リアルタイムPCRはStepOnePlus（Thermo Fisher Scientific）を用いてSYBR Green法により検出した。使用したプライマー配列を表３に示した。転写産物量はglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)を内部コントロールとしてrelative standard curve法を用いて決定した。 1-3. Gene silencing and quantitative RT-PCR
Three β-catenin siRNAs (# 09, # 10, # 12) or control siRNAs (siCtrl) targeting different sequences were purchased from Thermo Fisher Scientific and Sigma. The target sequences of these siRNAs are shown in Table 2. SiRNA was introduced into the cells using Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific), and the cells were collected after 48 hours. Total RNA was extracted from the collected cells using RNeasy Mini Kit (Qiagen), and cDNA was synthesized from 1 μg of total RNA using Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics). Real-time PCR was detected by SYBR Green method using StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). The primer sequences used are shown in Table 3. The amount of transcript was determined using the relative standard curve method with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as an internal control.

１−４．レポーターアッセイ
細胞を12ウェルに播種し、FuGENE6（Promega）を用いて、解析を目的とするホタルルシフェラーゼレポータープラスミド(0.2〜0.3μg)をpRL-null(0.05μg)プラスミドと共に、一過性に細胞に導入した。RNAiによるβ−カテニンノックダウンの影響についての検討では、レポータープラスミドおよびsiRNAをLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を用いて導入した。48時間インキュベートした後、細胞を溶解し、ピッカジーンデュアル (TOYO B-Net)を用いて発光測定を行った(Lumat LB9507、Berthold Technologies)。一部のデータについては、ウミシイタケルシフェラーゼ(pRL-null)の値で標準化したホタルルシフェラーゼの活性データを用いた。
pHAL-Fluc、pTOP-Rlucを含む安定細胞株を樹立するために用いたアッセイでは、細胞を96ウェルプレートに播種し、20 nMのβ−カテニンあるいはコントロール siRNAをLipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)を用いて導入した。導入後48時間に細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を、ルシフェラーゼ発光試薬（PromegaおよびTOYO B-Net）と発光プレートリーダー(FLUOstar OPTIMA、BMG Labtech）を用いて測定した。 1-4. Reporter assay Cells are seeded in 12 wells, and using FuGENE6 (Promega), the firefly luciferase reporter plasmid (0.2-0.3 μg) for analysis is transiently transferred to the cells together with the pRL-null (0.05 μg) plasmid. Introduced. In the examination of the effect of β-catenin knockdown by RNAi, a reporter plasmid and siRNA were introduced using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). After 48 hours of incubation, the cells were lysed and luminescence was measured using Picker Gene Dual (TOYO B-Net) (Lumat LB9507, Berthold Technologies). For some data, firefly luciferase activity data normalized with the value of Renilla luciferase (pRL-null) was used.
In the assay used to establish stable cell lines containing pHAL-Fluc and pTOP-Rluc, cells were seeded in 96-well plates and 20 nM β-catenin or control siRNA was used using Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific). Introduced. Cells were lysed 48 hours after introduction, and firefly luciferase and Renilla luciferase activities were measured using a luciferase luminescence reagent (Promega and TOYO B-Net) and a luminescence plate reader (FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech).

１−５．ウェスタンブロッティング
細胞をPBSで洗浄後、プロテアーゼ阻害剤(Protease inhibitor cocktail set III、Calbiochem)を加えたRadio Immunoprecipitation Assayバッファー(50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、1% NP40、0.1% SDS、0.5% sodium deoxycholate)で可溶化した。この細胞溶解液をBCAプロテインアッセイ（Thermo Fisher Scientific）を用いてタンパク質濃度を測定した。細胞タンパク質溶液はSDS-PAGEで分離後ニトロセルロースメンブレン(GE Healthcare)に転写し、一次抗体には抗β-catenin抗体(#9582, Cell Signaling Technology)および抗β-actin抗体(Sigma)を用いてハイブリダイゼーションを行った。それぞれに対応するHRP標識二次抗体を反応させた後、ECLウェスタンブロッティングシステム（GE Healthcare）を用いてシグナルの検出を行った。 1-5. Western blotting After washing cells with PBS, Radio Immunoprecipitation Assay buffer (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 0.5% sodium) with protease inhibitor (Protease inhibitor cocktail set III, Calbiochem) added deoxycholate). The cell concentration of this cell lysate was measured using BCA protein assay (Thermo Fisher Scientific). Cell protein solution is separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane (GE Healthcare), and anti-β-catenin antibody (# 9582, Cell Signaling Technology) and anti-β-actin antibody (Sigma) are used as primary antibodies. Hybridization was performed. After the corresponding HRP-labeled secondary antibodies were reacted, signals were detected using an ECL western blotting system (GE Healthcare).

１−６．網羅的な遺伝子発現解析
HepG2細胞に20 nMのβ−カテニンsiRNA（siβ-catenin #09、siβ-catenin #10）あるいは20 nMのコントロールsiRNA（siCtrl）をLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて導入した。各siRNA処理はduplicateで行った。siRNA導入から48時間後に細胞を回収し、RNeasy Mini Kitを用いてtotal RNAを抽出し、RNA 6000 Nano Lab-On-chipを用いてAgilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies）により、RNAの品質確認を行った。200 ngのRNAはLow Input Quick Amp Labeling Kit, One-Color（Agilent Technologies）を用いてCy3ラベル化を行い、マイクロアレイ（SurePrint G3 Human GE マイクロアレイ 8x60K v1、Agilent Technologies）に65℃で17時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズ後にはバッファー洗浄を行い、直ちにスキャンした。シグナルの検出にはAgilent DNA マイクロアレイスキャナ（G2505、Agilent Technologies）を用いた。その後、得られた画像ファイルはAgilent Future Extraction Software9.5.3.1を用いて数値化を行った。 1-6. Comprehensive gene expression analysis
20 nM β-catenin siRNA (siβ-catenin # 09, siβ-catenin # 10) or 20 nM control siRNA (siCtrl) was introduced into HepG2 cells using Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific). Each siRNA treatment was performed in duplicate. 48 hours after siRNA introduction, cells are collected, total RNA is extracted using RNeasy Mini Kit, and RNA quality is confirmed using Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) using RNA 6000 Nano Lab-On-chip. It was. 200 ng of RNA was Cy3 labeled using Low Input Quick Amp Labeling Kit, One-Color (Agilent Technologies) and hybridized to microarray (SurePrint G3 Human GE microarray 8x60K v1, Agilent Technologies) at 65 ° C for 17 hours . After hybridization, the buffer was washed and scanned immediately. An Agilent DNA microarray scanner (G2505, Agilent Technologies) was used for signal detection. Thereafter, the obtained image file was digitized using Agilent Future Extraction Software 9.5.3.1.

１−７．マイクロアレイデータ解析
マイクロアレイ解析により得られた数値データに加えて、米国NCBIの遺伝子発現情報データベース(Gene Expression Omnibus; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に公開されているデータ(GSE46465)（Mol Cell. 2013 Jul 25;51(2):211-25. TRIB2 acts downstream of Wnt/TCF in liver cancer cells to regulate YAP and C/EBPα function. Wang J, Park JS, Wei Y, Rajurkar M, Cotton JL, Fan Q, Lewis BC, Ji H, Mao J.）を用いた。GeneSping GX11.5 software package（Agilent Technologies）にインポートし、siβ-catenin(#09)群、siβ-catenin(#10)群およびdnTCF7L2群(GSE46465)において、それぞれの対照群と比較して2倍以上発現上昇する遺伝子群を抽出した。その後、3つの群間に共通して存在する遺伝子群を抽出し、遺伝子リストを作成した。 1-7. Microarray data analysis In addition to numerical data obtained by microarray analysis, data published in the NCBI gene expression information database (Gene Expression Omnibus; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) (GSE46465) (Mol Cell. 2013 Jul 25; 51 (2): 211-25. TRIB2 acts downstream of Wnt / TCF in liver cancer cells to regulate YAP and C / EBPα function.Wang J, Park JS, Wei Y, Rajurkar M, Cotton JL, Fan Q, Lewis BC, Ji H, Mao J.). Imported into GeneSping GX11.5 software package (Agilent Technologies) and more than doubled in siβ-catenin (# 09) group, siβ-catenin (# 10) group and dnTCF7L2 group (GSE46465) compared to each control group A group of genes with increased expression was extracted. After that, gene groups that existed in common among the three groups were extracted and a gene list was created.

１−８．安定細胞株の樹立
HepG2細胞にpTOP-Rlucを導入し、抗生物質(G418、Roche Diagnostics)を培地に添加して安定にプラスミドが導入された細胞の選択を行った。さらに、この細胞にpHAL-Flucを導入し、抗生物質Puromycin(Sigma)による選択を行った。このようにして得られた約280種類のクローンの中から、レポーターアッセイにより、β−カテニンsiRNA処置によってホタルルシフェラーゼ活性が顕著に増加し、しかもウミシイタケルシフェラーゼ活性が顕著に減少するクローンを選択し、HepG2 4-61細胞を得た。 1-8. Establishment of stable cell lines
PTOP-Rluc was introduced into HepG2 cells, and antibiotics (G418, Roche Diagnostics) were added to the medium to select cells stably transfected with the plasmid. Furthermore, pHAL-Fluc was introduced into the cells, and selection with the antibiotic Puromycin (Sigma) was performed. Among the approximately 280 clones obtained in this way, a reporter assay was used to select a clone that significantly increased firefly luciferase activity and significantly decreased Renilla luciferase activity due to treatment with β-catenin siRNA. HepG2 4-61 cells were obtained.

２．結果
２−１．β−カテニン（β-catenin）/TCF7L2複合体によって発現抑制される遺伝子の同定
HepG2は、β−カテニン/TCF7L2複合体の活性が高い肝がん(hepatoblastoma)由来の細胞株である。この細胞に2種類のβ−カテニン特異的siRNA (#09、#10)を導入し、発現が増加する遺伝子を、DNAマイクロアレイを用いて解析した。その結果、発現が有意に誘導されるDNAマイクロアレイ上にスポットされたオリゴヌクレオタイドプローブ（entity）を、それぞれ2660（#09）、2465（#10）種類同定した。また、β−カテニン/TCF7L2複合体の活性を抑制するドミナントネガティブ（dominant negative）TCF7L2（dnTCF7L2）をHepG2細胞に導入した細胞の遺伝子発現解析のデータが公開されている。そのデータから、dnTCF7L2発現が誘導される810 種類のentityを同定した。これらの結果から、β−カテニン siRNA (#09、#10)、dnTCF7L2全てにより発現増加する遺伝子群を探索し、86のentityを同定した。これら86 種類のentityの中で、もっとも発現が上昇したトップ20 entityに相当する遺伝子を表４に示す。 2. Result 2-1. Identification of genes whose expression is suppressed by β-catenin / TCF7L2 complex
HepG2 is a cell line derived from hepatoblastoma having high β-catenin / TCF7L2 complex activity. Two types of β-catenin-specific siRNA (# 09, # 10) were introduced into the cells, and genes whose expression was increased were analyzed using a DNA microarray. As a result, 2660 (# 09) and 2465 (# 10) kinds of oligonucleotide probes (entity) spotted on the DNA microarray in which expression was significantly induced were identified. In addition, data on gene expression analysis of cells in which dominant negative TCF7L2 (dnTCF7L2), which suppresses the activity of β-catenin / TCF7L2 complex, has been introduced into HepG2 cells, has been released. From the data, we identified 810 entities that induced dnTCF7L2 expression. From these results, a group of genes whose expression was increased by β-catenin siRNA (# 09, # 10) and dnTCF7L2 were all searched, and 86 entities were identified. Among these 86 types of entities, the genes corresponding to the top 20 entities with the highest expression are shown in Table 4.

２−２．大腸がん、肝がん細胞株におけるβ−カテニン/TCF7L2複合体の活性比較
β−カテニン/TCF7L2複合体の機能を制御する分子や物質の探索のために、がん細胞株でその複合体の活性を調べた（図１）。大腸がんや肝がんではAPC遺伝子やβ−カテニン(CTNNB1)遺伝子の異常のために、高頻度にβ−カテニン/TCF7L2の活性が上昇していることが知られている。そこで大腸がん細胞株(RKO、HCT116、SW480)、肝がん細胞株(Huh-7、Huh-6、HepG2)計6種類の細胞で、TOP-flash（TCF/LEFのレポータープラスミド）、FOP-flashレポータープラスミド（TCF/LEF結合配列に変異をもつレポータープラスミド；ネガティブコントロール）を用いて、β−カテニン/TCF7L2の活性を測定した。その結果、HepG2細胞で最も高い活性が認められた（図１Ａ）。各細胞株のAPC、 CTNNB1の遺伝子型は図１Ｂの通りである。 2-2. Comparison of activity of β-catenin / TCF7L2 complex in colorectal cancer and liver cancer cell lines To explore molecules and substances that control the function of β-catenin / TCF7L2 complex, The activity was examined (FIG. 1). In colorectal cancer and liver cancer, it is known that the activity of β-catenin / TCF7L2 is frequently increased due to abnormalities in the APC gene and β-catenin (CTNNB1) gene. Therefore, colon cancer cell lines (RKO, HCT116, SW480), liver cancer cell lines (Huh-7, Huh-6, HepG2), total of 6 types of cells, TOP-flash (TCF / LEF reporter plasmid), FOP The activity of β-catenin / TCF7L2 was measured using a -flash reporter plasmid (reporter plasmid having a mutation in the TCF / LEF binding sequence; negative control). As a result, the highest activity was observed in HepG2 cells (FIG. 1A). The genotypes of APC and CTNNB1 of each cell line are as shown in FIG. 1B.

２−３．β−カテニンの発現を抑制するsiRNAの検討と評価
β−カテニンを特異的にノックダウンするために、3種類のβ−カテニンsiRNA (#09、#10、#12)の影響を、ウエスタンブロット法で調べた（図２Ａ）。その結果、HepG2細胞の野生型β−カテニン（Wt）の発現は、この3種類のsiRNAにより抑制されるが、変異型β−カテニン（Mut）の発現は、β−カテニン siRNA #09、およびsiRNA #10でのみ抑制された。この結果に一致して、TOP-flashの活性は、β−カテニンsiRNA (#09、#10)で抑制されるが、β−カテニン siRNA (#12)では抑制されなかった（図２Ｂ）。そこで以後の解析には、siRNA (#09、#10)を用いた。 2-3. Examination and evaluation of siRNA that suppresses the expression of β-catenin In order to knock down β-catenin specifically, the effect of three types of β-catenin siRNA (# 09, # 10, # 12) (FIG. 2A). As a result, the expression of wild-type β-catenin (Wt) in HepG2 cells is suppressed by these three types of siRNA, but the expression of mutant β-catenin (Mut) is expressed by β-catenin siRNA # 09 and siRNA. Only suppressed at # 10. Consistent with this result, TOP-flash activity was inhibited by β-catenin siRNA (# 09, # 10) but not by β-catenin siRNA (# 12) (FIG. 2B). Therefore, siRNA (# 09, # 10) was used for the subsequent analysis.

２−４．β−カテニン/TCF7L2により負に発現制御される遺伝子群のプロモーター解析
β−カテニン/TCF7L2により負に発現制御されるトップ20遺伝子の中で、5種類の遺伝子(PCK1、HAL、OSTα、PLEK2、SLPI)の５’隣接領域を用いたレポータープラスミドを作製した。これらのレポータープラスミドを用いて、β−カテニン/TCF7L2の活性抑制により、レポーター活性が増加するかどうか解析を行った（図３）。β−カテニンsiRNA処理の結果、PCK1、HAL、OSTαの３種類の遺伝子領域が有意に転写活性化されることが明らかとなった。これに対し、dnTCF7L2の共発現では、PCK1、HAL、PLEK2、SLPI の4種類の領域が転写活性化された（図４）。共通して活性化された領域の中で、最も活性化の高いHAL遺伝子に関して、細胞内での発現がβ−カテニン/TCF7L2により負に調節されるか定量RT-PCRにより解析した（図５）。その結果、β−カテニン/TCF7L2で制御される既知の下流遺伝子AXIN2の発現は、β−カテニンsiRNA (#09、#10)で低下するのに対して（図５Ａ）、HAL遺伝子の発現は増加した（図５Ｂ）。
これらの結果は、HAL遺伝子はβ−カテニン/TCF7L2により発現抑制されているとともに、HAL遺伝子の５’隣接領域にその調節領域があることを示唆している。そこでレポータープラスミドにクローニングした-1726から+147ついて、詳細な調節領域の解析を進めることにした。 2-4. Promoter analysis of genes negatively regulated by β-catenin / TCF7L2 Among the top 20 genes negatively regulated by β-catenin / TCF7L2, five types of genes (PCK1, HAL, OSTα, PLEK2, SLPI A reporter plasmid using the 5 ′ flanking region of FIG. Using these reporter plasmids, it was analyzed whether the reporter activity was increased by suppressing the activity of β-catenin / TCF7L2 (FIG. 3). As a result of β-catenin siRNA treatment, it was revealed that three types of gene regions of PCK1, HAL, and OSTα are significantly transcriptionally activated. In contrast, coexpression of dnTCF7L2 resulted in transcriptional activation of four types of regions, PCK1, HAL, PLEK2, and SLPI (FIG. 4). Among the commonly activated regions, the most activated HAL gene was analyzed by quantitative RT-PCR to determine whether its intracellular expression was negatively regulated by β-catenin / TCF7L2 (FIG. 5). . As a result, the expression of the known downstream gene AXIN2 controlled by β-catenin / TCF7L2 is decreased by β-catenin siRNA (# 09, # 10) (FIG. 5A), whereas the expression of the HAL gene is increased. (FIG. 5B).
These results suggest that the expression of the HAL gene is suppressed by β-catenin / TCF7L2, and that the regulatory region is in the 5 ′ adjacent region of the HAL gene. Therefore, we decided to proceed with a detailed analysis of the regulatory region of -172 to +147 cloned into the reporter plasmid.

２−５．HAL遺伝子の調節領域解析
HAL遺伝子の様々な５’隣接領域の欠失レポータープラスミドを作製し、そのレポーター活性がβ−カテニンsiRNAにより誘導されるかどうか調べたところ、-90から-44に重要な領域があることが示された（図６）。そこで、この領域（-90〜-44の領域）をもつレポータープラスミドの活性が、大腸がんや肝がん細胞でβ−カテニンsiRNA処置により誘導されるかどうか調べたところ、肝がん細胞ではCTNNB1に遺伝子変異のある細胞株で顕著に増加した。大腸がん細胞株でもAPCまたは CTNNB1に遺伝子変異のある細胞株で有意に増加したが、その増加は肝がんと比較すると限られていた（図７）。APCまたは CTNNB1に変異のない細胞株では増加しなかった（RKO、Huh-7）。
次に、その活性上昇がβ−カテニン/TCF7L2活性に特異的かどうかを、3種類のβ−カテニンsiRNA (#09、#10、#12)でHepG2細胞を処理して検討したところ、β−カテニン/TCF7L2の活性を抑制する#09、#10のみで上昇し、#12では変化がなかった（図８）。また、dnTCF7L2によっても顕著に増加した（図９）。さらに、本来β−カテニン/TCF7L2活性の低いHeLa細胞やHuh-7細胞に、活性型のβ−カテニンを発現させたところ、HALのレポーター活性は減少した（図１０）。
これらの結果から、HALの５’隣接領域の-90から-44に、β−カテニン/TCF7L2活性特異的に、HAL遺伝子の発現が負に制御を受ける領域が存在することが明らかとなった。
従って、HALの５’隣接領域の-90から-44を基本転写因子の結合部分とつなげてプロモーターとして使用すること、あるいは、他のプロモーターとつなげてエンハンサーとして使用することが可能である。 2-5. Regulatory region analysis of HAL gene
Deletion reporter plasmids of various 5 'flanking regions of the HAL gene were prepared, and whether or not the reporter activity was induced by β-catenin siRNA revealed that there was an important region from -90 to -44. (FIG. 6). Therefore, when it was examined whether the activity of a reporter plasmid having this region (the region of -90 to -44) was induced by treatment with β-catenin siRNA in colon cancer or liver cancer cells, Remarkably increased in cell lines with genetic mutations in CTNNB1. The colorectal cancer cell line also showed a significant increase in cell lines with gene mutations in APC or CTNNB1, but the increase was limited compared to liver cancer (Figure 7). There was no increase in cell lines without mutations in APC or CTNNB1 (RKO, Huh-7).
Next, whether the increase in activity was specific to β-catenin / TCF7L2 activity was examined by treating HepG2 cells with three types of β-catenin siRNA (# 09, # 10, # 12). It increased only with # 09 and # 10 that suppressed the activity of catenin / TCF7L2, and there was no change with # 12 (FIG. 8). It was also significantly increased by dnTCF7L2 (FIG. 9). Furthermore, when active β-catenin was expressed in HeLa cells and Huh-7 cells, which originally had low β-catenin / TCF7L2 activity, the reporter activity of HAL decreased (FIG. 10).
From these results, it has been clarified that there is a region in which the expression of the HAL gene is negatively regulated in the β-catenin / TCF7L2 activity-specific region from −90 to −44 of the 5 ′ adjacent region of HAL.
Therefore, it is possible to use -90 to -44 in the 5 'flanking region of HAL as a promoter by connecting to the binding part of the basic transcription factor, or as an enhancer by connecting to other promoters.

２−６．β−カテニン/TCF7L2により負に制御されるレポータープラスミドの作製
HALの５’隣接領域の-90から-44に、β−カテニン/TCF7L2により、その発現が調節される領域があることから、基本転写因子の結合部位も含む-90から+147を1個、またはタンデムに複数（2個、4個、8個）もつレポータープラスミドを、pGL4.14ベクターを用いて作製した。これらのレポータープラスミド活性を、HepG2細胞で調べたところ、-90から+147の領域を8個もつプラスミドが最も高い活性を示した（図１１）。このプラスミドのインサートである8回繰り返しの調節領域を、他のレポーターベクター（pGL4.22、pGL4.24）のレポーター遺伝子の上流に組み込み、解析を行ったところ、pGL4.24ベクターに組み込んだレポータープラスミドが、最も高くβ−カテニンsiRNAにより活性誘導された（図１２）。そこで、このレポータープラスミドを「pHAL-Fluc」として、レポーターアッセイのための細胞株の樹立を行った。 2-6. Construction of reporter plasmid negatively regulated by β-catenin / TCF7L2
Since there is a region whose expression is regulated by β-catenin / TCF7L2 in -90 to -44 of the 5 'flanking region of HAL, one -90 to +147 including the binding site of basic transcription factor, Alternatively, a reporter plasmid having a plurality (2, 4, 8) in tandem was prepared using the pGL4.14 vector. When these reporter plasmid activities were examined in HepG2 cells, a plasmid having 8 regions from −90 to +147 showed the highest activity (FIG. 11). The insertion of this plasmid, the 8 repeat regulatory region, was inserted upstream of the reporter gene of other reporter vectors (pGL4.22, pGL4.24) and analyzed, and the reporter plasmid incorporated into the pGL4.24 vector Was most highly induced by β-catenin siRNA (FIG. 12). Accordingly, a cell line for reporter assay was established using this reporter plasmid as “pHAL-Fluc”.

２−７．β−カテニン/TCF7L2により、正と負の両方向に制御されるレポータープラスミドを発現する細胞株の樹立
β−カテニン/TCF7L2活性によって、負に調節される領域をホタルルシフェラーゼ（Firefly luciferase）遺伝子の上流に含むレポータープラスミド「pHAL-Fluc」を作製した。次に、TOP-flashのホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を異なるレポーター遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子に交換し、β−カテニン/TCF7L2活性によって、正に制御されるレポータープラスミド「pTOP-Rluc」を作製した。これら2種類のレポータープラスミドを、HepG2細胞に薬剤耐性遺伝子と共に導入し、約280種類のクローンの中から、β−カテニン/TCF7L2活性の低下によりホタルルシフェラーゼの活性が上昇するとともに、ウミシイタケルシフェラーゼの活性が低下するクローン、HepG2 4-61細胞株を樹立した。この細胞株では、β−カテニンsiRNAによりホタルルシフェラーゼ活性が約20倍誘導され、ウミシイタケルシフェラーゼ活性が約4分の1に低下した（図１３）。
この細胞は、HALのβ−カテニン/TCF7L2活性に調節される領域を複数個もっているが、他の発現抑制される遺伝子、例えば、PCK1の５’隣接領域-559から-183を含む領域を用いても、同様な細胞株の樹立が可能である（図１４）。図１４からは、PCK1の５’隣接領域-559から-183に、β−カテニン/TCF7L2活性特異的に、PCK1遺伝子の発現が負に制御を受ける領域が存在することがわかる。つまり、PCK1の５’隣接領域の-559から-183を基本転写因子の結合部分とつなげてプロモーターとして使用すること、あるいは、他のプロモーターとつなげてエンハンサーとして使用することが可能である。
また、他の発現抑制遺伝子の中から、β−カテニン/TCF7L2活性により負に制御される領域を同定すれば、同様に、β−カテニン/TCF7L2活性を効率良く検出することが可能であり、当業者において容易に行うことができる。 2-7. Establishment of a cell line expressing a reporter plasmid that is regulated in both positive and negative directions by β-catenin / TCF7L2 A region that is negatively regulated by β-catenin / TCF7L2 activity is upstream of the firefly luciferase gene. A reporter plasmid “pHAL-Fluc” was prepared. Next, replace the TOP-flash firefly luciferase reporter gene with a different reporter gene, Renilla luciferase gene, to create a reporter plasmid “pTOP-Rluc” that is positively controlled by β-catenin / TCF7L2 activity. did. These two types of reporter plasmids were introduced into HepG2 cells together with drug resistance genes, and firefly luciferase activity was increased by reducing β-catenin / TCF7L2 activity from about 280 clones, and Renilla luciferase activity. Clone, HepG2 4-61 cell line was established. In this cell line, firefly luciferase activity was induced about 20-fold by β-catenin siRNA, and Renilla luciferase activity was reduced to about a quarter (FIG. 13).
This cell has a plurality of regions regulated by β-catenin / TCF7L2 activity of HAL, but other genes whose expression is suppressed, for example, a region containing 5'-flanking region -559 to -183 of PCK1 are used. However, a similar cell line can be established (FIG. 14). FIG. 14 shows that there is a region in which PCK1 gene expression is negatively regulated specifically in the β-catenin / TCF7L2 activity in the 5′-flanking region −559 to −183 of PCK1. That is, it is possible to use -559 to -183 of the 5'-flanking region of PCK1 as a promoter by connecting it to the basic transcription factor binding moiety, or use it as an enhancer by connecting it to other promoters.
Similarly, by identifying a region that is negatively regulated by β-catenin / TCF7L2 activity from other expression-suppressing genes, it is possible to detect β-catenin / TCF7L2 activity efficiently in the same manner. It can be easily performed by a trader.

本発明のスクリーニング方法を使用することで、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および、転写因子または転写因子複合体、の活性を特異的に制御する分子や物質を簡便、かつ、効率的に検出することが可能となる。従って、本発明は、生命現象の解明を目的とするあらゆる分野において、利用することが可能である。   By using the screening method of the present invention, molecules and substances that specifically control the activity of upstream signaling pathways that regulate transcription factors and transcription factors or transcription factor complexes can be easily and efficiently produced. It becomes possible to detect. Therefore, the present invention can be used in all fields aimed at elucidating life phenomena.

Claims (14)

転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該転写因子が発現しており、かつ、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ａを含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ｂを含む核酸が導入されている細胞に、試験分子または試験物質を導入し、
（ｂ）レポーター遺伝子Ａの発現とレポーター遺伝子Ｂの発現を検出し、
検出したレポーター遺伝子Ａの発現量の変化とレポーター遺伝子Ｂの発現量の変化が逆である場合に、該試験分子または試験物質を該転写因子の活性を制御する候補分子または候補物質として選択するスクリーニング方法。 A screening method for molecules and / or substances that regulate upstream signaling pathways and / or transcription factor activity that regulate transcription factors,
(A) a nucleic acid containing reporter gene A in which the transcription factor is expressed and to which a response sequence positively controlled by the transcription factor is operatively linked, and a response sequence negatively controlled by the transcription factor A test molecule or a test substance is introduced into a cell into which a nucleic acid containing a reporter gene B operably linked is introduced,
(B) detecting the expression of reporter gene A and reporter gene B,
Screening for selecting the test molecule or test substance as a candidate molecule or candidate substance that controls the activity of the transcription factor when the detected change in the expression level of reporter gene A and the change in the expression level of reporter gene B are opposite Method. 前記レポーター遺伝子Ａの発現量が減少し、前記レポーター遺伝子Ｂの発現量が増加した場合に、前記試験分子または試験物質が転写因子の活性を抑制する候補分子または候補物質として選択する、請求項１に記載のスクリーニング方法。   The test molecule or test substance is selected as a candidate molecule or candidate substance that suppresses the activity of a transcription factor when the expression level of the reporter gene A decreases and the expression level of the reporter gene B increases. A screening method according to 1. 前記レポーター遺伝子Ａの発現量が増加し、前記レポーター遺伝子Ｂの発現量が減少した場合に、前記試験分子または試験物質が転写因子の活性を活性化する候補分子または候補物質として選択する、請求項１に記載のスクリーニング方法。   The test molecule or test substance is selected as a candidate molecule or candidate substance that activates the activity of a transcription factor when the expression level of the reporter gene A increases and the expression level of the reporter gene B decreases. 2. The screening method according to 1. 前記転写因子が、β−カテニン/TCF7L2複合体であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 1, wherein the transcription factor is a β-catenin / TCF7L2 complex. 前記転写因子が正に制御する応答配列が、TCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、請求項４に記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 4, wherein the response element positively controlled by the transcription factor is a TCF / LEF binding element. 前記転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、請求項４に記載のスクリーニング方法。   Response elements negatively regulated by the transcription factor are HAL gene, PCK1 gene, PLEK2 gene, SLPI gene, OSTα gene, ITGB3 gene, CAPN5 gene, MUC20 gene, CREB3L3 gene, MFSD2B gene, CYP2C18 gene, TMEM229B gene, APOA4 gene The screening method according to claim 4, which is a transcriptional regulatory region of TIMD4 gene, FXYD3 gene, FAM65B gene, HAVCR1 gene, PDZD3 gene, SORCS2 gene or LGALS2 gene. 前記HAL遺伝子の転写調節領域が、HAL遺伝子の５’隣接領域の少なくとも、-90〜-44の領域を含むことを特徴とする請求項６に記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 6, wherein the transcriptional regulatory region of the HAL gene includes at least a region of -90 to -44 of the 5 'adjacent region of the HAL gene. 前記PCK1遺伝子の転写調節領域が、PCK1遺伝子の５’隣接領域の少なくとも、-559〜-183の領域を含むことを特徴とする請求項６に記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 6, wherein the transcriptional regulatory region of the PCK1 gene includes at least a region of -559 to -183 of the 5 'adjacent region of the PCK1 gene. 転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸を包含する、請求項１乃至８のいずれかに記載のスクリーニング方法を実施するためのキット。   A nucleic acid comprising a reporter gene operatively linked to a response element positively regulated by a transcription factor and a nucleic acid comprising a reporter gene operably linked to a response element negatively regulated by a transcription factor A kit for performing the screening method according to any one of 1 to 8. 前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が正に制御する応答配列がTCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、請求項９に記載のキット。   The kit according to claim 9, wherein the transcription factor is β-catenin / TCF7L2 complex, and the response element positively regulated by the transcription factor is a TCF / LEF binding element. 前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、請求項９に記載のキット。   The transcription factor is β-catenin / TCF7L2 complex, and the response element negatively regulated by the transcription factor is HAL gene, PCK1 gene, PLEK2 gene, SLPI gene, OSTα gene, ITGB3 gene, CAPN5 gene, MUC20 gene, CREB3L3 The transcription regulatory region of the gene, MFSD2B gene, CYP2C18 gene, TMEM229B gene, APOA4 gene, TIMD4 gene, FXYD3 gene, FAM65B gene, HAVCR1 gene, PDZD3 gene, SORCS2 gene or LGALS2 gene The described kit. 転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が導入された細胞。   A nucleic acid containing a reporter gene operably linked to a response element positively regulated by a transcription factor and a nucleic acid containing a reporter gene operably linked to a response element negatively regulated by the transcription factor were introduced cell. 前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が正に制御する応答配列がTCF結合エレメントであることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞。   The cell according to claim 12, wherein the transcription factor is β-catenin / TCF7L2 complex, and a response element positively regulated by the transcription factor is a TCF binding element. 前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞。   The transcription factor is β-catenin / TCF7L2 complex, and the response element negatively regulated by the transcription factor is HAL gene, PCK1 gene, PLEK2 gene, SLPI gene, OSTα gene, ITGB3 gene, CAPN5 gene, MUC20 gene, CREB3L3 The transcription regulatory region of the gene, MFSD2B gene, CYP2C18 gene, TMEM229B gene, APOA4 gene, TIMD4 gene, FXYD3 gene, FAM65B gene, HAVCR1 gene, PDZD3 gene, SORCS2 gene or LGALS2 gene The cell described.
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