JP2016140306A - Manufacturing method of granules and useful substance - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞を有する顆粒及び当該顆粒を用いた有用物質の製造方法に関する。 The present invention relates to a granule having a plurality of agglutinating enzymes or a plurality of aggregating cells and a method for producing a useful substance using the granule.
酵素もしくは細胞を固定化することによって、当該酵素もしくは細胞を繰り返し使用することが可能となる。工業的に有用物質を製造する場合、酵素もしくは細胞の固定化技術を使用することは有益である。 By immobilizing the enzyme or cell, the enzyme or cell can be used repeatedly. When producing industrially useful substances, it is beneficial to use enzyme or cell immobilization techniques.
酵素もしくは細胞の固定化技術として様々な方法が知られている。例えば、（１）担体に酵素もしくは細胞を結合させる方法、（２）酵素もしくは細胞を架橋させる方法、（３）酵素もしくは細胞を高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する包括法などである。 Various methods are known as enzyme or cell immobilization techniques. For example, (1) a method of binding an enzyme or cell to a carrier, (2) a method of crosslinking the enzyme or cell, (3) enveloping the enzyme or cell in a fine lattice of a polymer gel, or semi-permeable And a method of covering with a polymer film.
特許文献１には、酵素もしくは微生物菌体の固定化方法に係る発明が開示されている。具体的には、酵素もしくは微生物菌体を水溶性蛋白質とともにカチオン性合成高分子凝集剤の水溶液中で凝集させたのち、多官能性の架橋剤と反応させることを一特徴とする。当該発明によって、保形性に優れ、酵素もしくは微生物菌体の脱離が少なく、安定で活性の高い固定化酵素もしくは固定化微生物菌体が得られると記載されている。 Patent Document 1 discloses an invention relating to an enzyme or microbial cell immobilization method. Specifically, the method is characterized in that an enzyme or a microbial cell is aggregated in an aqueous solution of a cationic synthetic polymer flocculant together with a water-soluble protein and then reacted with a polyfunctional crosslinking agent. According to the invention, it is described that an immobilized enzyme or an immobilized microbial cell having excellent shape retention, little detachment of enzyme or microbial cell, and stable and high activity can be obtained.
しかしながら、特許文献１に係る発明を使用して顆粒を製造した場合、顆粒の酵素活性が不十分であり、更なる改善が求められていた。 また、特許文献１に係る発明によって得られた顆粒を反応液中で使用する場合、当該反応液中に当該顆粒が十分に沈降しない問題を有するものであった。これによって、例えば、当該顆粒を詰めたカラムに反応液を満たして使用した後、当該顆粒を洗浄する作業を行うと、浮遊している一部の顆粒がカラムの外に流出しやすくなる結果、当該顆粒を繰り返し使用することが困難であった。 However, when a granule is produced using the invention according to Patent Document 1, the enzyme activity of the granule is insufficient, and further improvement has been demanded. Moreover, when using the granule obtained by the invention which concerns on patent document 1 in a reaction liquid, it had the problem that the said granule does not fully settle in the said reaction liquid. As a result, for example, when the column packed with the granules is used after filling the reaction solution, and the operation of washing the granules, some floating granules are likely to flow out of the column. It was difficult to use the granules repeatedly.
本発明は、顆粒の酵素活性を向上させるとともに、反応液に十分に沈降させた顆粒を提供することを目的とする。 It is an object of the present invention to provide a granule that is sufficiently precipitated in a reaction solution while improving the enzyme activity of the granule.
本発明者らは、特許文献１に係る発明によって得られた顆粒が反応液に十分沈降しないことから、当該顆粒の内部に空隙が多数存在し、当該空隙に十分に反応液が浸透せず、結果として顆粒の酵素活性が不十分になっているのではないかと考えた。当該空隙を減少させるために鋭意検討してなされたのが本発明である。
本発明は以下の技術的構成を有することにより、本発明の課題を解決した。
Since the granule obtained by the invention according to Patent Document 1 does not sufficiently settle in the reaction solution, the present inventors have a large number of voids inside the granule, and the reaction solution does not sufficiently penetrate into the void. As a result, it was thought that the enzyme activity of the granule was insufficient. The present invention has been made in earnest to reduce the voids.
The present invention has solved the problems of the present invention by having the following technical configuration.
（１）複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞を有する顆粒であって、当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の表面側に向けて存在する流路と、を有することを特徴とする顆粒。
（２）微粒子を有することを特徴とする前記（１）に記載の顆粒。
（３）前記複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間に前記微粒子が存在するもしくは前記複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に前記微粒子が存在することを特徴とする前記（２）に記載の顆粒。
（４）前記顆粒を反応液に浸したときにおいて、当該顆粒の表面側から前記間隙の少なくとも一部に反応液が浸透することを特徴とする前記（３）に記載の顆粒。
（５）前記微粒子が１つの凝集酵素もしくは１つの凝集細胞よりも小さいことを特徴とする前記（２）又は前記（３）に記載の顆粒。
（６）前記微粒子が前記凝集酵素を構成する個々の酵素もしくは前記凝集細胞を構成する個々の細胞よりも大きいことを特徴とする前記（２）、（３）又は（５）に記載の顆粒。
（７）前記微粒子を０．１％〜２０質量％含有することを特徴とする前記（２）、（３）、（５）又は６に記載の顆粒。
（８）隣接する凝集酵素もしくは隣接する凝集細胞が架橋していることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の顆粒。
（９）前記顆粒の浮遊度が０〜３０の範囲内にあることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載の顆粒。
（１０）複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞と、当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、該間隙から当該顆粒の内部もしくは外部の少なくとも一方に向けて存在する流路と、を有する顆粒に反応液を加え、有用物質を得ることを特徴とする有用物質の製造方法。
(1) A granule having a plurality of agglutinating enzymes or a plurality of aggregating cells, the gap existing between adjacent agglutinating enzymes among the plurality of aggregating enzymes or between adjacent aggregating cells among the plurality of aggregating cells. And a flow path that exists from the gap toward the surface side of the granule.
(2) The granule according to (1) above, comprising fine particles.
(3) The microparticles exist between adjacent aggregated enzymes among the plurality of aggregated enzymes, or the microparticles exist between adjacent aggregated cells among the plurality of aggregated cells (2) ) Granules.
(4) The granule according to (3), wherein when the granule is immersed in a reaction solution, the reaction solution penetrates into at least a part of the gap from the surface side of the granule.
(5) The granule according to (2) or (3) above, wherein the fine particles are smaller than one aggregating enzyme or one aggregating cell.
(6) The granule according to (2), (3) or (5), wherein the fine particles are larger than individual enzymes constituting the aggregating enzyme or individual cells constituting the aggregating cell.
(7) The granule according to (2), (3), (5) or 6, characterized by containing 0.1% to 20% by mass of the fine particles.
(8) The granule according to any one of (1) to (7), wherein adjacent agglutinating enzymes or adjacent aggregating cells are crosslinked.
(9) The granule according to any one of (1) to (6) above, wherein the floating degree of the granule is in the range of 0 to 30.
(10) A plurality of agglutinating enzymes or a plurality of aggregating cells, a gap existing between adjacent agglutinating enzymes among the plurality of agglutinating enzymes or between adjacent aggregating cells among the plurality of aggregating cells, and from the gaps A method for producing a useful substance, comprising: adding a reaction liquid to a granule having a flow path existing toward at least one of the inside and the outside of the granule to obtain a useful substance.
本発明の顆粒によれば、顆粒の酵素活性を向上させるとともに、反応液に十分に沈降させた顆粒を提供することができる。
本発明の有用物質の製造方法によれば、使用する顆粒が反応液に十分に沈降するため、当該顆粒を繰り返し使用することが可能であり、有用物質を連続的に製造することができる。
According to the granule of the present invention, it is possible to provide a granule that is sufficiently precipitated in the reaction solution while improving the enzyme activity of the granule.
According to the method for producing a useful substance of the present invention, since the granule to be used is sufficiently settled in the reaction solution, the granule can be repeatedly used, and the useful substance can be produced continuously.
＜顆粒＞
本発明に係る顆粒は、複数の凝集酵素もしくは複数の凝集細胞もしくはその両方を有する顆粒であって、当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の表面側に向けて存在する流路と、を有することを特徴とする。
本発明に係る顆粒内部において、間隙は複数形成される。本発明において、間隙とは顆粒内部に存在する、閉じられた空間及び開放された空間を意味する。閉じられた空間には、顆粒を反応液に浸したときに反応液が浸透しない。すなわち、閉じられた空間は、閉鎖系に相当する部分であって、上記特許文献１によって得られた顆粒における空隙に相当する。これに対して、開放された空間は、顆粒を反応液に浸した時に反応液が浸透する。すなわち、開放された空間は、開放系に相当する部分である。この開放系に相当する部分のことを本発明では流路という。顆粒内部に形成された流路は、少なくとも顆粒の最表面から顆粒内部の解放された空間の間に存在する。流路の少なくとも一部は、顆粒内部を縦断あるいは横断するように形成されていることが好ましい。顆粒内部を縦断あるいは横断するように形成されている流路としては、例えば、顆粒の最表面Ａ、開放された空間及び顆粒の最表面Ｂ（顆粒の最表面Ａと異なる部分）に形成されたものが挙げられる。
顆粒内部に形成された複数の間隙は、互いにつながっていてもよい。複数の間隙にわたって流路を形成することも可能である。
<Granule>
The granule according to the present invention is a granule having a plurality of agglutinating enzymes or a plurality of aggregating cells, or both, and aggregating between adjacent agglutinating enzymes among the aggregating enzymes or adjoining among the aggregating cells. It has the gap | interval which exists between cells, and the flow path which exists toward the surface side of the said granule from the said gap | interval.
A plurality of gaps are formed inside the granule according to the present invention. In the present invention, the gap means a closed space and an open space existing inside the granule. The reaction solution does not penetrate into the closed space when the granules are immersed in the reaction solution. That is, the closed space is a portion corresponding to a closed system, and corresponds to a void in the granule obtained by Patent Document 1. On the other hand, the reaction solution penetrates into the open space when the granules are immersed in the reaction solution. That is, the open space is a portion corresponding to an open system. In the present invention, the part corresponding to this open system is called a flow path. The flow path formed inside the granule exists between at least the outermost surface of the granule and the released space inside the granule. It is preferable that at least a part of the flow path is formed so as to longitudinally cross or cross the inside of the granule. As the flow path formed so as to cross or traverse the inside of the granule, for example, it was formed on the outermost surface A of the granule, the open space, and the outermost surface B of the granule (part different from the outermost surface A of the granule). Things.
The plurality of gaps formed inside the granule may be connected to each other. It is also possible to form a flow path over a plurality of gaps.
本発明に係る顆粒は、さらに微粒子を有させることが好ましい。
顆粒に微粒子を含有させると、当該顆粒に含まれる凝集酵素もしくは凝集細胞の固形分比率が下がることになる。当該微粒子自体には酵素活性がないため、顆粒に微粒子を含有させることによって酵素活性が減少すると考えるのが通常である。驚くべきことに、当該顆粒に微粒子を含有させることによって、酵素活性が向上するとともに、当該顆粒が反応液に十分に沈降することを見出した。酵素活性が向上する理由及び顆粒が反応液に十分に沈降する理由は以下のとおりである。
（１）顆粒内において、複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間に微粒子が存在するもしくは前記複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に微粒子が存在する。（２）隣接する凝集酵素の間もしくは前記隣接する凝集細胞の間に間隙が形成される。（３）当該間隙を有する顆粒を反応液に浸すと、当該顆粒の表面側から前記間隙の少なくとも一部（解放された空間）に反応液が浸透する。（４）顆粒内の酵素反応が生じる部分が増えるとともに、顆粒内に存在していた空気が追い出される。
The granule according to the present invention preferably further contains fine particles.
When fine particles are contained in the granules, the solid content ratio of the agglutinating enzyme or aggregated cells contained in the granules is lowered. Since the microparticles themselves do not have enzyme activity, it is usually considered that the enzyme activity is reduced by incorporating microparticles into the granules. Surprisingly, it has been found that the inclusion of fine particles in the granules improves the enzyme activity and allows the granules to settle sufficiently in the reaction solution. The reason why the enzyme activity is improved and the reason why the granules are sufficiently settled in the reaction solution are as follows.
(1) Within a granule, there are fine particles between adjacent agglutinating enzymes among a plurality of agglutinating enzymes, or there are fine particles between adjacent aggregating cells among the plurality of aggregating cells. (2) A gap is formed between adjacent agglutinating enzymes or between the adjacent aggregating cells. (3) When the granule having the gap is immersed in the reaction liquid, the reaction liquid permeates into at least a part (open space) of the gap from the surface side of the granule. (4) As the part where the enzyme reaction occurs in the granule increases, the air present in the granule is expelled.
顆粒の浮遊度は０〜３０の範囲内にあることが好ましい。０に近くなるほど好ましい。
上限値超であると、カラムに充填した顆粒が流出しやすくなる傾向にある。
The floating degree of the granules is preferably in the range of 0-30. The closer to 0, the better.
If it exceeds the upper limit, the granules packed in the column tend to flow out easily.
浮遊度の測定方法は、５０℃に保温した５０ ％(ｗ／ｗ)グルコース水溶液に顆粒を加え、６０分間静置状態で保温後、３回撹拌を行った後、別容器に移して１５分間静置したときの全顆粒容量の内、浮遊する顆粒の割合を意味する。 The method for measuring buoyancy is to add granules to a 50% (w / w) glucose aqueous solution kept at 50 ° C., incubate for 60 minutes, and then stir three times, then transfer to a separate container for 15 minutes. It means the ratio of the floating granules in the total granule volume when left standing.
顆粒の大きさは、１０μｍ〜３０ｍｍの範囲内であることが好ましく、５０μｍ〜２０ｍｍの範囲内であることがより好ましく、１００μｍ〜１０ｍｍの範囲内であることがさらに好ましい。顆粒が小さくなるにつれカラムに充填した顆粒が流出しやすくなる傾向にあり、顆粒が大きくなるにつれ顆粒に含まれる酵素の反応性が減少しやすくなる傾向にある。顆粒の大きさは、使用する酵素又は細胞の種類、目的に応じて決定することができる。
顆粒の形状は特に限定されない。球状、楕円状、不定形状等、種々の形状を採用することができる。
The size of the granule is preferably in the range of 10 μm to 30 mm, more preferably in the range of 50 μm to 20 mm, and still more preferably in the range of 100 μm to 10 mm. As the granules become smaller, the granules packed in the column tend to flow out easily, and as the granules become larger, the reactivity of the enzyme contained in the granules tends to decrease. The size of the granule can be determined according to the type of enzyme or cell used and the purpose.
The shape of the granule is not particularly limited. Various shapes such as a spherical shape, an elliptical shape, and an indefinite shape can be adopted.
以下、本発明に係る顆粒を構成する材料について説明する。 Hereinafter, the material which comprises the granule which concerns on this invention is demonstrated.
（微粒子）
微粒子としては、有機微粒子や無機微粒子を使用することができる。有機微粒子と無機微粒子を組み合わせて使用してもよい。有機微粒子あるいは無機微粒子として、単独あるいは複数種類の微粒子を使用してもよい。
本発明においては、無機微粒子を使用することが好ましい。無機微粒子は有機微粒子に比べ比重（真比重）が大きいため、顆粒の浮遊度を減少させやすいからである。
(Fine particles)
As the fine particles, organic fine particles or inorganic fine particles can be used. Organic fine particles and inorganic fine particles may be used in combination. Single or plural kinds of fine particles may be used as the organic fine particles or inorganic fine particles.
In the present invention, it is preferable to use inorganic fine particles. This is because the inorganic fine particles have a higher specific gravity (true specific gravity) than the organic fine particles, so that the floating degree of the granules is easily reduced.
微粒子の比重（真比重）は、反応液の比重以上であることが好ましい。微粒子の比重が反応液の比重未満であると、反応液に微粒子が沈降しにくいからである。反応液として水（比重は１）を使用することが多いため、微粒子の比重は１．０以上であることが好ましく、１．５以上であることがより好ましく、２．０以上であることがさらに好ましい。上限は特に限定されないが、例えば１０である。 The specific gravity (true specific gravity) of the fine particles is preferably not less than the specific gravity of the reaction solution. This is because if the specific gravity of the fine particles is less than the specific gravity of the reaction solution, the fine particles are difficult to settle in the reaction solution. Since water (specific gravity is 1) is often used as the reaction liquid, the specific gravity of the fine particles is preferably 1.0 or more, more preferably 1.5 or more, and 2.0 or more. Further preferred. Although an upper limit is not specifically limited, For example, it is ten.
有機微粒子を形成する材料としては、例えば、アクリル樹脂、ポリスチレン樹脂、スチレン−アクリル共重合樹脂、ポリエチレン樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリフッ化ビニリデン樹脂、ポリフッ化エチレン樹脂、活性炭、セルロース粉末、キチン粉末及びキトサン粉末等が挙げられる。 Examples of the material for forming the organic fine particles include acrylic resin, polystyrene resin, styrene-acrylic copolymer resin, polyethylene resin, epoxy resin, silicone resin, polyvinylidene fluoride resin, polyvinyl fluoride resin, activated carbon, cellulose powder, and chitin powder. And chitosan powder.
無機微粒子を形成する材料としては、例えば、炭酸カルシウム、硫酸バリウム、酸化チタン、水酸化アルミニウム、シリカ、ガラスビーズ、タルク、マイカ、ホワイトカーボン、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、珪藻土、パーライト、ゼオライト、活性白土及び酸性白土等が挙げられる。 Examples of materials that form inorganic fine particles include calcium carbonate, barium sulfate, titanium oxide, aluminum hydroxide, silica, glass beads, talc, mica, white carbon, magnesium oxide, zinc oxide, diatomaceous earth, perlite, zeolite, activated clay. And acid clay.
微粒子の形状としては、例えば、球状、楕円形状、多角形状、不定形状等、種々の形状をとることができる。微粒子の形状として多角形状あるいは不定形状のような表面積が大きいものを使用することが好ましい。これによって、凝集酵素と微粒子間あるいは凝集細胞と微粒子間、さらには微粒子と微粒子の間に間隙が生じやすくなることから、顆粒内部に反応液が浸透しやすくなる。 As the shape of the fine particles, for example, various shapes such as a spherical shape, an elliptical shape, a polygonal shape, and an indefinite shape can be taken. It is preferable to use a fine particle having a large surface area such as a polygonal shape or an indefinite shape. This facilitates the formation of a gap between the agglutinating enzyme and the fine particles, or between the aggregated cells and the fine particles, and between the fine particles and the fine particles, so that the reaction solution easily penetrates into the granules.
微粒子の大きさは、凝集酵素を構成する個々の酵素もしくは凝集細胞を構成する個々の細胞よりも大きく、１つの凝集酵素もしくは１つの凝集細胞よりも小さいことが好ましい。これによって隣接する凝集酵素同士の間もしくは隣接する凝集細胞同士の間に、微粒子が存在しやすくなる。 The size of the fine particles is preferably larger than the individual enzymes constituting the agglutinating enzyme or the individual cells constituting the agglutinating cell, and smaller than one agglutinating enzyme or one agglutinating cell. This makes it easier for fine particles to exist between adjacent agglutinating enzymes or between adjacent agglutinating cells.
凝集酵素を使用する場合の微粒子の平均粒径は、１ｎｍ以上２００μｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上１５０μｍ以下であることがより好ましく、０．１μｍ以上１００μｍ以下であることがさらに好ましい。
下限値未満であると、隣接する凝集酵素同士の間に微粒子が存在した場合であっても、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、隣接する凝集酵素同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
When using an agglutinating enzyme, the average particle size of the fine particles is preferably 1 nm or more and 200 μm or less, more preferably 10 nm or more and 150 μm or less, and further preferably 0.1 μm or more and 100 μm or less.
When the concentration is less than the lower limit, even when fine particles exist between adjacent agglutinating enzymes, it becomes difficult for the reaction liquid to penetrate into the granules, thereby increasing the enzyme activity and obtaining granules with low buoyancy. Is difficult.
If it exceeds the upper limit, it becomes difficult for fine particles to exist between adjacent agglutinating enzymes, making it difficult for the reaction liquid to penetrate into the granules, increasing the enzyme activity and obtaining granules with low buoyancy. difficult.
凝集細胞を使用する場合の微粒子の平均粒径は、０．１μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましく、０．５μｍ以上１５０μｍ以下であることがより好ましく、１．０μｍ以上１００μｍ以下であることがさらに好ましい。
下限値未満であると、隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在した場合であっても、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
The average particle diameter of the fine particles when using the aggregated cells is preferably 0.1 μm or more and 200 μm or less, more preferably 0.5 μm or more and 150 μm or less, and further preferably 1.0 μm or more and 100 μm or less. preferable.
If it is less than the lower limit, even if fine particles are present between adjacent aggregated cells, the reaction solution is less likely to penetrate inside the granules, increasing the enzyme activity and obtaining granules with low buoyancy. Is difficult.
If it exceeds the upper limit value, it becomes difficult for microparticles to exist between adjacent aggregated cells, making it difficult for the reaction solution to penetrate into the granules, increasing the enzyme activity and obtaining granules with low buoyancy. difficult.
微粒子の含有量は、顆粒に含まれる固形分を１００質量％とした場合、０．１質量％〜２０質量％の範囲内にすることが好ましく、０．５質量％〜１５質量％の範囲内にすることがより好ましく、１．０質量％〜１０質量％の範囲内にすることがさらに好ましい。
微粒子の含有量が下限値未満であると、隣接する凝集酵素同士あるいは隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
微粒子の含有量が上限値超であると、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
ここで、本発明における顆粒に含まれる固形分は、顆粒を１０５℃で５時間乾燥させたものを１００質量％とした値を基準とする。
The content of the fine particles is preferably in the range of 0.1% by mass to 20% by mass, and in the range of 0.5% by mass to 15% by mass, where the solid content in the granule is 100% by mass. More preferably, it is more preferable to be in the range of 1.0 mass% to 10 mass%.
If the content of the fine particles is less than the lower limit value, it becomes difficult for the fine particles to exist between adjacent agglutinating enzymes or adjacent aggregating cells, making it difficult for the reaction solution to penetrate into the granule and increasing the enzyme activity. And it is difficult to obtain granules with low buoyancy.
If the content of the fine particles exceeds the upper limit, the strength of the granules tends to be insufficient, and the period of use of the granules tends to be shortened.
Here, the solid content contained in the granule according to the present invention is based on a value based on 100% by mass obtained by drying the granule at 105 ° C. for 5 hours.
（凝集酵素、凝集細胞）
個々の酵素を２個以上凝集させて得られたものが凝集酵素であり、個々の細胞を２個以上凝集させて得られたものが凝集細胞である。個々の酵素あるいは個々の細胞であると捕捉・収集が困難である場合が多いが、凝集酵素あるいは凝集細胞とすることによって、捕捉・収集が可能になる。凝集酵素あるいは凝集細胞を得る方法として、個々の酵素あるいは個々の細胞の表面における帯電状態を調節する方法が挙げられる。
個々の細胞は通常負に荷電しているため、カチオン系凝集剤を添加することによって凝集細胞を得ることができる。
個々の酵素は、個々の酵素を溶解した溶液のｐＨに依存して正や負に帯電している。酵素は、アミノ酸に由来するアミノ基やカルボキシル基等のイオン性の官能基を多数持っているためである。酵素が負に帯電している場合はカチオン系凝集剤、正に帯電している場合はアニオン系凝集剤を添加することによって、凝集酵素を得ることができる。両性凝集剤を使用することも可能である。
(Aggregating enzyme, aggregating cells)
A product obtained by aggregating two or more individual enzymes is an agglutinating enzyme, and a product obtained by aggregating two or more individual cells is an aggregated cell. Although it is often difficult to capture and collect individual enzymes or individual cells, capturing and collecting can be achieved by using an agglutinating enzyme or aggregated cells. Examples of a method for obtaining an agglutinating enzyme or an aggregated cell include a method of adjusting a charged state on the surface of each enzyme or individual cell.
Since individual cells are usually negatively charged, aggregated cells can be obtained by adding a cationic flocculant.
Each enzyme is positively or negatively charged depending on the pH of the solution in which the individual enzyme is dissolved. This is because the enzyme has many ionic functional groups such as amino groups and carboxyl groups derived from amino acids. An aggregating enzyme can be obtained by adding a cationic flocculant when the enzyme is negatively charged, and an anionic flocculant when the enzyme is positively charged. It is also possible to use amphoteric flocculants.
凝集酵素を構成する酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、インベルターゼ、グルコースイソメラーゼ、ガラクトースイソメラーゼ、キモトリプシン、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ペプシン、パパイン、ウロキナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、アミノアシラーゼ、ペニシリンアミダーゼ、その他の各種グリコシダーゼ等を使用することができる。 Examples of the enzyme constituting the agglutinating enzyme include α-amylase, β-amylase, glucoamylase, isoamylase, α-galactosidase, β-galactosidase, lactase, invertase, glucose isomerase, galactose isomerase, chymotrypsin, acidic protease, neutral Protease, alkaline protease, pepsin, papain, urokinase, cellulase, hemicellulase, lipase, aminoacylase, penicillin amidase, and other various glycosidases can be used.
凝集細胞を構成する細胞としては、例えば、細菌類、放線菌類、カビ類、酵母類等の微生物に加え、動物類、植物類の細胞を使用することができる。細胞の表面の荷電状態が重要であることから、細胞の形状は限定されない。いずれの形状であっても凝集細胞を得ることが可能である。例えば、球菌、桿菌、糸状菌を使用することができる。放線菌にカチオン系凝集剤を添加すると、フロック状となった凝集細胞を得ることができる。 As cells constituting the aggregated cells, for example, cells of animals and plants can be used in addition to microorganisms such as bacteria, actinomycetes, molds and yeasts. Since the charged state of the cell surface is important, the shape of the cell is not limited. In any shape, aggregated cells can be obtained. For example, cocci, bacilli and filamentous fungi can be used. When a cationic flocculant is added to actinomycetes, flocculent aggregated cells can be obtained.
個々の凝集酵素の大きさは、０．０１μｍ〜１０ｍｍの範囲内にあることが好ましい。
下限値未満であると、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、顆粒内部に間隙が多くなり、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
The size of each aggregating enzyme is preferably in the range of 0.01 μm to 10 mm.
If it is less than the lower limit, the reaction solution is less likely to penetrate into the granules, and it is difficult to increase the enzyme activity and to obtain granules with low buoyancy.
If it exceeds the upper limit, gaps increase inside the granules, the strength of the granules tends to be insufficient, and the period of use of the granules tends to be shortened.
個々の凝集細胞の平均径は、０．０１μｍ〜１０ｍｍの範囲内にあることが好ましい。
下限値未満であると、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、顆粒内部に間隙が多くなり、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
The average diameter of each aggregated cell is preferably in the range of 0.01 μm to 10 mm.
If it is less than the lower limit, the reaction solution is less likely to penetrate into the granules, and it is difficult to increase the enzyme activity and to obtain granules with low buoyancy.
If it exceeds the upper limit, gaps increase inside the granules, the strength of the granules tends to be insufficient, and the period of use of the granules tends to be shortened.
個々の酵素あるいは個々の細胞の含有量の合計は、顆粒に含まれる固形分を１００質量％とした場合、１０質量％〜９９．９質量％の範囲内にすることが好ましく、１５〜９９．８質量％の範囲内にすることがより好ましく、３０質量％〜９９．５質量％の範囲内にすることがさらに好ましく、５０質量％〜９９質量％の範囲内にすることが特に好ましい。
個々の酵素あるいは個々の細胞の合計の含有量が下限値未満であると、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。これは個々の酵素あるいは個々の細胞が、顆粒を構成する各種材料のバインダーとして作用する側面があるからである。
個々の酵素あるいは個々の細胞の合計の含有量が上限値超であると、隣接する凝集酵素同士あるいは隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
The total content of individual enzymes or individual cells is preferably in the range of 10% to 99.9% by mass, where the solid content in the granules is 100% by mass. More preferably, it is within the range of 8% by mass, even more preferably within the range of 30% by mass to 99.5% by mass, and particularly preferably within the range of 50% by mass to 99% by mass.
If the total content of individual enzymes or individual cells is less than the lower limit, the strength of the granules tends to be insufficient, and the period of use of the granules tends to be shortened. This is because individual enzymes or individual cells have an aspect that acts as a binder for various materials constituting the granules.
If the total content of individual enzymes or individual cells exceeds the upper limit, it will be difficult for fine particles to exist between adjacent agglutinating enzymes or between adjacent agglutinated cells, and the reaction solution will penetrate into the granules. It is difficult to increase the enzyme activity and to obtain granules with low floatability.
個々の酵素あるいは個々の細胞の含有量の合計に対する微粒子の含有量の比は、１：０．００１〜１：０．４の範囲内にあることが好ましい。
下限値未満であると、隣接する凝集酵素同士あるいは隣接する凝集細胞同士の間に微粒子が存在しにくくなってしまい、顆粒内部に反応液が浸透しにくくなり、酵素活性を高めること及び浮遊度の低い顆粒を得ることが難しい。
上限値超であると、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
The ratio of the content of microparticles to the total content of individual enzymes or individual cells is preferably in the range of 1: 0.001 to 1: 0.4.
If it is less than the lower limit, it becomes difficult for microparticles to exist between adjacent agglutinating enzymes or between adjacent agglutinating cells, making it difficult for the reaction solution to penetrate into the granules, increasing the enzyme activity and It is difficult to obtain low granules.
If it exceeds the upper limit, the strength of the granules tends to be insufficient, and the period of use of the granules tends to be shortened.
凝集細胞を使用する場合、凝集細胞を形成する個々の細胞内あるいは細胞表面に存在する酵素が活性を有する状態であればよく、細胞の生死に制限はない。 When using aggregated cells, it is sufficient that the enzyme present in the individual cells forming the aggregated cells or on the cell surface is active, and there is no limitation on the viability of the cells.
カチオン系凝集剤としては、ポリカチオン系凝集剤であれば種類を選ばず、例えばポリエチレンイミン、ポリリジン、エチレンジアミンエピクロルヒドリン重縮合物、ポリアルキレンポリアミン、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドやジメチルアミノエチル（メタ）アクリレートの四級アンモニウム塩を構成モノマーとする重合体、キトサン等を使用することができる。 The cationic aggregating agent is not particularly limited as long as it is a polycationic aggregating agent. A polymer having a quaternary ammonium salt as a constituent monomer, chitosan, or the like can be used.
アニオン系凝集剤としては、ポリアニオン系凝集剤であれば種類を選ばず、例えばポリ（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸と（メタ）アクリルアミドの共重合物、（メタ）アクリルアミド・２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸共重合体、及びそれらのアルカリ金属塩等を使用することができる。 The anionic flocculant is not limited as long as it is a polyanionic flocculant. For example, poly (meth) acrylic acid, a copolymer of (meth) acrylic acid and (meth) acrylamide, (meth) acrylamide 2- ( A (meth) acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid copolymer and alkali metal salts thereof can be used.
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量は、顆粒に含まれる固形分を１００質量％とした場合、０．１質量％〜３０質量％の範囲内にすることが好ましく、０．５質量％〜２５質量％の範囲内にすることがより好ましく、１質量％〜２０質量％の範囲内にすることがさらに好ましい。
下限値未満であると、十分な数量の凝集酵素あるいは凝集細胞を得られにくい。顆粒の酵素活性を高めにくい問題もある。
上限値超であると、得られる凝集酵素あるいは凝集細胞の数量はほとんど変わらないため不経済である。また、顆粒内部に間隙が多くなり、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
The content of the cationic flocculant or the anionic flocculant is preferably in the range of 0.1% by mass to 30% by mass when the solid content in the granule is 100% by mass, and 0.5% by mass. It is more preferable to set it in the range of 25% by mass to 25% by mass, and it is more preferable to set it in the range of 1% by mass to 20% by mass.
When the amount is less than the lower limit, it is difficult to obtain a sufficient amount of agglutinating enzyme or aggregated cells. There is also a problem that it is difficult to increase the enzyme activity of granules.
If the value exceeds the upper limit, the quantity of the obtained agglutinating enzyme or aggregated cell is hardly changed, which is uneconomical. In addition, the gap inside the granule increases, the strength of the granule tends to be insufficient, and the period of use of the granule tends to be shortened.
個々の酵素あるいは個々の細胞の含有量の合計に対するカチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量の比は、１：０・００１〜１：０．６の範囲内にあることが好ましく、１：０．００４〜１：０．１５の範囲内にあることがより好ましい。
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤が下限値未満であると、十分な数量の凝集酵素あるいは凝集細胞を得られにくい。顆粒の酵素活性を高めにくい問題もある。
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤が上限値超であると、得られる凝集酵素あるいは凝集細胞の数量はほとんど変わらないため不経済である。また、顆粒内部に間隙が多くなり、顆粒の強度が不足しやすくなってしまい、顆粒の使用期間が短くなりやすい。
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を増やすにつれて、得られる凝集酵素あるいは凝集細胞の大きさが大きくなる傾向にある。
The ratio of the content of the cationic flocculant or the anionic flocculant to the total content of individual enzymes or individual cells is preferably in the range of 1: 0.001 to 1: 0.6. : More preferably in the range of 0.004 to 1: 0.15.
When the cationic flocculant or the anionic flocculant is less than the lower limit, it is difficult to obtain a sufficient amount of flocculant enzyme or flocculent cells. There is also a problem that it is difficult to increase the enzyme activity of granules.
If the cationic flocculant or the anionic flocculant exceeds the upper limit value, the quantity of the obtained flocculant enzyme or flocculent cells hardly changes, which is uneconomical. In addition, the gap inside the granule increases, the strength of the granule tends to be insufficient, and the period of use of the granule tends to be shortened.
As the content of the cationic flocculant or the anionic flocculant increases, the size of the obtained flocculant enzyme or flocculent cells tends to increase.
（任意成分）
本発明の構成及び作用効果を妨げない範囲で、本発明に係る顆粒に任意成分を含有させることができる。任意成分としては、例えば、陰性高分子、陽性高分子、塩類、架橋剤等を使用することができる。
(Optional component)
An arbitrary component can be contained in the granule according to the present invention as long as the configuration and the operational effects of the present invention are not hindered. Examples of optional components that can be used include negative polymers, positive polymers, salts, and cross-linking agents.
カチオン系凝集剤によって凝集酵素もしくは凝集細胞を生成させると、顆粒内、もしくは顆粒表面に過剰にカチオン性の官能基が存在する場合がある。これによって、酵素活性が減少する場合がある。この問題を改善するために、ポリアニオンを添加することで、酵素活性を向上させることができる。さらに、顆粒の凝集性を向上させることもできる。
前記ポリアニオンとしては、アクリル酸、スルホン酸、硫酸、カルボン酸、リン酸、など負電荷を帯びることができる官能基を有する高分子である。
When agglutinating enzymes or aggregated cells are generated by a cationic flocculant, there may be an excess of cationic functional groups in the granule or on the granule surface. This may reduce enzyme activity. In order to improve this problem, the enzyme activity can be improved by adding a polyanion. Furthermore, the cohesiveness of the granules can be improved.
The polyanion is a polymer having a functional group that can be negatively charged, such as acrylic acid, sulfonic acid, sulfuric acid, carboxylic acid, and phosphoric acid.
アニオン系凝集剤によって凝集酵素もしくは凝集細胞を生成させると、顆粒内、もしくは顆粒表面に過剰にアニオン性の官能基が存在する場合がある。これによって、酵素活性が減少する場合がある。この問題を改善するために、ポリカチオンを添加することで、酵素活性を向上させることができる。さらに、顆粒の凝集性を向上させることもできる。
ポリカチオンとしては、ピリジニウム基、アンモニウム基、４級アンモニウム基、アミノ基などの正荷電を帯びることのできる官能基を有する高分子である。
When an aggregating enzyme or aggregated cells are produced by an anionic flocculant, an anionic functional group may exist excessively in the granule or on the granule surface. This may reduce enzyme activity. In order to improve this problem, enzyme activity can be improved by adding a polycation. Furthermore, the cohesiveness of the granules can be improved.
The polycation is a polymer having a positively charged functional group such as a pyridinium group, an ammonium group, a quaternary ammonium group, or an amino group.
顆粒の形成工程あるいは顆粒形成後の工程において、塩類を添加することで酵素活性を向上させることができる場合がある。 In the granule formation step or the step after granule formation, the enzyme activity may be improved by adding salts.
顆粒の形成工程あるいは顆粒形成後の工程において、架橋剤を添加することで、凝集酵素を構成する酵素間あるいは凝集細胞を構成する細胞間を架橋させることが可能になる。これによって顆粒の強度を向上させることができる。
架橋剤としては、例えば、ジアゾニウム基、アジド基、イソシアネート基、酸クロライド基、酸無水物基、イミノカーボネート基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボジイミド基、又はアジリジン基を含むものが挙げられる。
微粒子と酵素、微粒子と細胞間を結合させる場合は、シランカップリング剤を使用することも可能である。アミノ基を有する微粒子を使用し、アルデヒド基を有する架橋剤を使用することにより、微粒子と酵素、微粒子と細胞間を架橋させることもできる。
By adding a cross-linking agent in the granule formation step or the post-granule formation step, it is possible to crosslink between the enzymes constituting the agglutinating enzyme or between the cells constituting the aggregated cell. Thereby, the strength of the granules can be improved.
Examples of the crosslinking agent include a diazonium group, an azide group, an isocyanate group, an acid chloride group, an acid anhydride group, an iminocarbonate group, an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a hydroxyl group, an aldehyde group, a carbodiimide group, or an aziridine group. The thing containing is mentioned.
A silane coupling agent can be used for binding between the microparticle and the enzyme and between the microparticle and the cell. By using fine particles having an amino group and using a crosslinking agent having an aldehyde group, the fine particles and the enzyme, and the fine particles and the cells can be crosslinked.
任意成分の含有量は、顆粒に含まれる固形分を１００質量％とした場合、０.０１質量％〜０．５質量％の範囲内にすることが好ましい。 The content of the optional component is preferably in the range of 0.01% by mass to 0.5% by mass when the solid content in the granule is 100% by mass.
＜顆粒の製造方法＞
細胞を使用する場合、例えば、以下の工程を経ることで顆粒を製造することができる。
（１）細胞を培養する工程
（２）凝集細胞に微粒子を添加し、必要に応じて任意成分を添加する工程
（３）細胞に凝集剤を添加し、凝集細胞を生じさせる工程
（４）固液分離
（５）得られた固体部分を乾燥させる工程
（６）顆粒への成型工程
細胞の代わりに酵素を使用する場合は、市販の酵素を使用し、上記（２）の工程以降を行えばよい。
<Granule production method>
When cells are used, for example, granules can be produced through the following steps.
(1) Step of culturing cells (2) Step of adding microparticles to aggregated cells and adding optional components as necessary (3) Step of adding an aggregating agent to cells to generate aggregated cells (4) Solid Liquid separation (5) Step of drying the obtained solid part (6) Molding step into granules When using an enzyme instead of cells, a commercially available enzyme is used, and after the step (2) above, Good.
カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を増やすにつれて、得られる凝集酵素あるいは凝集細胞の大きさが大きくなる傾向にある。凝集酵素あるいは凝集細胞が大きいものを使用して顆粒を作成すると、間隙が生じやすくなるとともに流路を形成しやすくなる。この結果、顆粒内部の流路に反応液が浸透しやすくなるため、活性が上昇するとともに顆粒が反応液に沈降しやすくなる。すなわち、凝集酵素あるいは凝集細胞の大きさを大きくすることによって、複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の内部もしくは外部の少なくとも一方に向けて存在する流路と、を形成することが可能である。 As the content of the cationic flocculant or the anionic flocculant increases, the size of the obtained flocculant enzyme or flocculent cells tends to increase. When a granule is prepared using an agglutinating enzyme or a large aggregated cell, a gap is easily formed and a channel is easily formed. As a result, the reaction liquid easily penetrates into the flow path inside the granule, so that the activity increases and the granule easily settles in the reaction liquid. That is, by increasing the size of the agglutinating enzyme or the aggregating cell, a gap existing between adjacent agglutinating enzymes among a plurality of agglutinating enzymes or between adjacent aggregating cells among the aggregating cells, and the gap To the flow path existing toward at least one of the inside and the outside of the granule.
顆粒内部に間隙及び流路を形成するために、カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を変えることも好ましい。例えば、カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を多くして凝集酵素あるいは凝集細胞を作成したものと、カチオン系凝集剤あるいはアニオン系凝集剤の含有量を少なくして凝集酵素あるいは凝集細胞を作成したものと、を混合して顆粒を作成することによって、顆粒内部に間隙及び流路を形成させることもできる。 It is also preferable to change the content of the cationic flocculant or the anionic flocculant in order to form gaps and flow paths inside the granules. For example, an aggregating enzyme or an aggregating cell produced by increasing the content of a cationic aggregating agent or an anionic aggregating agent, or an aggregating enzyme or aggregating cell produced by reducing the content of a cationic aggregating agent or an anionic aggregating agent It is also possible to form gaps and flow paths inside the granules by mixing them with those prepared.
＜顆粒の使用方法＞
得られた顆粒をカラムなどの担体・容器に充填した後、反応液を添加すればよい。反応は連続で行ってもよいし、バッチで行ってもよい。
反応液は目的とする生産物が得られるような基質を含み、顆粒を構成する酵素あるいは細胞に含まれる酵素が失活しにくいようなｐＨ条件となるような緩衝液を採用すればよい。基質濃度、ｐＨ条件は適宜決定すればよい。反応液は通常水を溶媒とするが、これに限られるものではなく、混合溶媒を使用してもよい。
<Usage of granules>
The reaction mixture may be added after filling the obtained granules into a carrier or container such as a column. The reaction may be performed continuously or batchwise.
The reaction solution may contain a substrate that can produce the target product, and a buffer solution that has a pH condition that makes it difficult for the enzyme constituting the granules or the enzyme contained in the cells to be inactivated. The substrate concentration and pH conditions may be determined as appropriate. The reaction solution usually uses water as a solvent, but is not limited thereto, and a mixed solvent may be used.
以下、本発明を実施例を用いて説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。 Hereinafter, although the present invention is explained using an example, the present invention is not limited to this.
＜実施例１：微粒子を添加した酵素固定化顆粒の調製＞
放線菌であるストレプトマイセス ムリナス ＮＢＲＣ１４８０２の培養液を用いて酵素固定化顆粒の取得を実施した。
コーンスティープ・リカー１．５％、グルコース１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％、ＣｏＣｌ2 １×１０-3Ｍからなる培地（ｐＨ６）４ｍｌを計１８ｍｍの試験管に入れ、常法により殺菌後、放線菌であるストレプトマイセス ムリナス ＮＢＲＣ１４８０２を接種し、３０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液をｐＨ８．５に調整後、顆粒に含まれる固形分に対して１．５質量％になるように添加した。微粒子として昭和化学工業製株式会社製のラヂオライト＃３０００(平均微粒子径 ７４．９ μｍ；シリカを主成分とする珪藻土；比重２．２)、ラヂオライト＃１００(平均粒径 １２．８ μｍ；シリカを主成分とする珪藻土；比重２．２)、中央シリカ株式会社製シリカ６００Ｈ(平均粒径 ３３．９μｍ；シリカが主成分；比重２．２)又は日本製紙株式会社製ＫＣフロックＷ−３００Ｇ(平均粒径 約２８μｍ；セルロース粉末が主成分；比重１．０６６)の４種類を用いた。微粒子を添加した培養液に対して、ポリカチオン凝集剤としてポリエチレンイミン溶液（日本触媒社製 商品名ＳＰ−００３）を添加し、３０分間撹拌した。その後、ポリアニオンとしてポリアクリル酸ナトリウム溶液（日本触媒社製 商品名ＬシリーズＤＬ）を添加し、３０分間撹拌を行い、菌体を凝集させ、当該液を濾過することで湿潤菌体を得た。顆粒に含まれる固形分に対して、ポリカチオン凝集剤は１０％、ポリアニオンは３．５％となるように添加した（いずれも固形分）。この湿潤状態の凝集菌体を１．５ｍｍ径の穴から押し出し、得られた成形物を略均一な大きさ（１．５ｍｍ×１．５ｍｍ×２．０ｍｍ）になるまで解して顆粒状にした。その後、その顆粒を１１０℃で１５分間乾燥させ、酵素固定化顆粒として取得した。
<Example 1: Preparation of enzyme-immobilized granules to which fine particles are added>
Enzyme-immobilized granules were obtained using a culture solution of Streptomyces murinas NBRC14802, an actinomycete.
4 ml of medium (pH 6) consisting of corn steep liquor 1.5%, glucose 1%, K 2 HPO 4 0.3%, MgSO 4 .7H 2 O 0.1%, CoCl 2 1 × 10 −3 M After putting in an 18 mm test tube and sterilizing by a conventional method, Streptomyces murinas NBRC14802 which is actinomycete was inoculated, and cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days. After adjusting the obtained culture solution to pH 8.5, it was added so that it might become 1.5 mass% with respect to solid content contained in a granule. Radiolite # 3000 (average particle size 74.9 μm; diatomaceous earth containing silica as the main component; specific gravity 2.2), Radiolite # 100 (average particle size 12.8 μm; manufactured by Showa Chemical Industry Co., Ltd.) Diatomaceous earth mainly composed of silica; specific gravity 2.2), silica 600H manufactured by Chuo Silica Co., Ltd. (average particle size 33.9 μm; silica is the main component; specific gravity 2.2), or KC Flock W-300G manufactured by Nippon Paper Industries Co., Ltd. Four types (average particle size of about 28 μm; cellulose powder as a main component; specific gravity of 1.066) were used. A polyethyleneimine solution (trade name SP-003, manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.) was added as a polycation flocculant to the culture solution to which the fine particles had been added, and stirred for 30 minutes. Thereafter, a sodium polyacrylate solution (trade name L series DL, manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.) was added as a polyanion, and the mixture was stirred for 30 minutes to aggregate the cells, and the solution was filtered to obtain wet cells. The polycation flocculant was added at 10% and the polyanion at 3.5% with respect to the solid content contained in the granules (both solid contents). The wet flocculated bacterial cells are extruded through a 1.5 mm diameter hole, and the resulting molded product is crushed until it has a substantially uniform size (1.5 mm × 1.5 mm × 2.0 mm) to form granules. did. Thereafter, the granules were dried at 110 ° C. for 15 minutes to obtain enzyme-immobilized granules.
実施例１で得られた酵素固定化顆粒のグルコースイソメラーゼ活性を測定した。活性測定に関しては（１）グルコース異性化反応と（２）フラクトースの定量の二段階で実施した。（１）のグルコース異性化反応においては酵素固定化顆粒を約４０ ｍｇを５０ ｍｌの共栓付三角フラスコに量り取り、２５０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）２ ｍｌを添加し、1時間室温にて膨潤を行った。６０℃で３分間の保温の後、基質を含む反応液（２ Ｍグルコース、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ８．０）を８ｍｌ添加し、振幅３ｃｍ、１２０ｒｐｍ、３０分間の条件で振とうを行い、異性化反応を実施した。反応を停止させるため、３０分経過時点で０．５Ｍ過塩素酸水溶液を２０ｍｌ添加した。ブランクについては顆粒を量り取っていないものを同操作で処理したものを使用した。その後、得られた溶液１２０μｌを水１０．１２ｍｌに希釈したものをサンプルとしてフラクトースの定量を行った。（２）のフラクトース定量に関しては、サンプル液０．５ｍｌ、フラクトースの発色度合を測るためのフラクトース標準液（１００μｇフラクトース／ｍｌ）をそれぞれ試験管にとり，水０．５ｍｌをそれぞれ加えて混和し、氷水中で７０％硫酸試液６ｍｌを加えよく振り混ぜ，更に氷水中で２０％ Ｌ−システイン塩酸塩溶液０．１ｍｌを加えて混和した後，５０℃で１０分間加温し，室温まで冷却し，検液とする。検液について４１０nmにおける吸光度を測定し、フラクトースの定量を行った。グルコースイソメラーゼの活性値を示す IGIUは、６０℃、ｐＨ８．０で１分間に１μmoleのグルコースをフラクトースに変換する酵素量を意味する。計算式としては、（サンプルＯＤ−ブランクＯＤ）／（フラクトース標準液）×４７４０７．４１×１００／｛酵素量（ｍｇ）×固形分｝によって算出される。尚、コントロールには同操作において微粒子非添加のものを採用し、コントロールの活性値を１００％としたときの相対値を示した。結果は表１の通りであった。 The glucose isomerase activity of the enzyme-immobilized granule obtained in Example 1 was measured. The activity was measured in two steps: (1) glucose isomerization reaction and (2) fructose quantification. In the glucose isomerization reaction of (1), about 40 mg of the enzyme-immobilized granule was weighed into a 50 ml conical flask with a stopper, and 2 ml of 250 mM phosphate buffer (pH 8.0) was added. Swelling was performed at room temperature for an hour. After incubating at 60 ° C. for 3 minutes, 8 ml of a reaction solution containing the substrate (2 M glucose, 5 mM MgSO 4 , pH 8.0) is added and shaken under the conditions of amplitude 3 cm, 120 rpm, 30 minutes for isomerization. The reaction was carried out. In order to stop the reaction, 20 ml of an aqueous 0.5 M perchloric acid solution was added after 30 minutes. About the blank, what processed the thing which has not measured the granule by the same operation was used. Thereafter, fructose was quantified using 120 μl of the resulting solution diluted in 10.12 ml of water as a sample. For the determination of fructose in (2), 0.5 ml of the sample solution and a fructose standard solution (100 μg fructose / ml) for measuring the degree of coloration of fructose are placed in a test tube, and 0.5 ml of water is added and mixed. Add 6 ml of 70% sulfuric acid test solution, shake well, add 0.1 ml of 20% L-cysteine hydrochloride solution in ice water, mix, then warm to 50 ° C for 10 minutes, cool to room temperature, and test. Use liquid. Absorbance at 410 nm was measured for the test solution, and fructose was quantified. IGIU indicating the activity value of glucose isomerase means the amount of enzyme that converts 1 μmole of glucose into fructose per minute at 60 ° C. and pH 8.0. The calculation formula is (sample OD−blank OD) / (fructose standard solution) × 47407.41 × 100 / {enzyme amount (mg) × solid content}. In addition, the control did not add fine particles in the same operation, and the relative value when the activity value of the control was 100% was shown. The results are shown in Table 1.
表１の結果より、非添加の場合よりも微粒子添加時に最大で１５％程活性が増大したことが観察された。また、微粒子を添加したものはいずれも流路を形成していることを確認した。 From the results in Table 1, it was observed that the activity increased by up to 15% when the fine particles were added, compared to the case where no additives were added. Further, it was confirmed that any of the particles to which fine particles were added formed a flow path.
＜実施例２：微粒子の添加濃度の検討＞
添加する微粒子濃度を顆粒に含まれる固形分に対して０、１、２、３、４、５％と変化させた以外は実施例１と同様にして、酵素固定化顆粒を取得し、その活性値を比較した。尚、微粒子としてはラヂオライト＃１００を用いて実施した。
<Example 2: Examination of addition concentration of fine particles>
Enzyme-immobilized granules were obtained in the same manner as in Example 1 except that the concentration of fine particles to be added was changed to 0, 1, 2, 3, 4, 5% with respect to the solid content contained in the granules. The values were compared. In addition, it implemented using Radiolite # 100 as microparticles | fine-particles.
実施例２で得られた６種類の酵素固定化顆粒のグルコースイソメラーゼ活性を測定した。コントロールには微粒子非添加のものを採用し、コントロールの活性値を１００％としたときの相対値を示した。結果は図２の通りであった。 The glucose isomerase activity of the six types of enzyme-immobilized granules obtained in Example 2 was measured. A control without fine particles was used, and the relative value when the activity value of the control was 100% was shown. The result was as shown in FIG.
図２の結果より、０〜２％の間で濃度依存的な活性増大が認められた。２％以上ではそれ以上の活性増大は認められず、同様の結果を示した。また、微粒子を添加したものはいずれも流路を形成していることを確認した。 From the results in FIG. 2, a concentration-dependent increase in activity was observed between 0 and 2%. At 2% or more, no further increase in activity was observed, and similar results were shown. Further, it was confirmed that any of the particles to which fine particles were added formed a flow path.
実施例２で得られた６種類の酵素固定化顆粒について浮遊度を測定した。６種類の顆粒それぞれを７ｇ量り取り、５０℃に保温した５０ ％(ｗ／ｗ)グルコース水溶液５０ｍｌをそれぞれの顆粒に添加し、６０分間５０℃の湯浴にて静置状態で保温した。３回撹拌を行った後、メスシリンダーに移して１５分間静置したときの全顆粒容量の内、浮遊する顆粒の割合を算出した。結果は表３の通りであった。 The six types of enzyme-immobilized granules obtained in Example 2 were measured for buoyancy. 7 g of each of the 6 types of granules were weighed, 50 ml of a 50% (w / w) glucose aqueous solution kept at 50 ° C. was added to each granule, and kept warm in a 50 ° C. water bath for 60 minutes. After stirring three times, the ratio of the floating granules was calculated out of the total granule volume when transferred to a measuring cylinder and allowed to stand for 15 minutes. The results are shown in Table 3.
表３に示すように、顆粒内に微粒子を含有させることによって、当該顆粒の沈降性を改善することができた。 As shown in Table 3, the sedimentation property of the granules could be improved by incorporating fine particles in the granules.
本実施例においては、特定の微生物由来の細胞を使用して顆粒を作成することで、酵素活性の向上及び沈降性が改善したことが示された。これは、他の細胞を使用した場合においても同様である。すなわち、他の細胞を使用して本発明の顆粒を形成した場合においても、顆粒内部に流路が形成され、細胞の表面積が増えるからである。 また、微生物由来の細胞の代わりに酵素を使用した場合も同様である。すなわち、酵素を使用して本発明の顆粒を形成した場合においても、顆粒内部に流路が形成され、酵素の表面積が増えるからである。 In this example, it was shown that the enzyme activity was improved and the sedimentation property was improved by preparing granules using cells derived from a specific microorganism. This is the same when other cells are used. That is, even when the granules of the present invention are formed using other cells, a flow path is formed inside the granules and the surface area of the cells increases. The same applies when an enzyme is used instead of a cell derived from a microorganism. That is, even when the granule of the present invention is formed using an enzyme, a flow path is formed inside the granule and the surface area of the enzyme increases.
Claims (10)
当該複数の凝集酵素のうち隣接する凝集酵素の間もしくは当該複数の凝集細胞のうち隣接する凝集細胞の間に存在する間隙と、当該間隙から当該顆粒の表面側に向けて存在する流路と、を有することを特徴とする顆粒。 A granule having a plurality of agglutinating enzymes or a plurality of aggregating cells,
A gap that exists between adjacent agglutinating enzymes among the plurality of agglutinating enzymes or between adjacent aggregating cells among the plurality of aggregating cells, and a flow path that exists from the gap toward the surface side of the granules, Granules characterized by having.
A plurality of agglutinating enzymes or a plurality of agglutinating cells, a gap existing between adjacent agglutinating enzymes among the plurality of aggregating enzymes or adjacent aggregating cells among the aggregating cells, and A method for producing a useful substance, comprising: adding a reaction solution to a granule having a flow path that exists toward at least one of the inside and the outside to obtain a useful substance.
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|---|---|---|---|---|
| JP2019017355A (en) * | 2017-07-21 | 2019-02-07 | 合同酒精株式会社 | Enzyme manufacturing method |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51128474A (en) * | 1975-04-28 | 1976-11-09 | Nourinshiyou Shokuryo Kenkyusho | Process for treating of microbial cells |
| JPS59159781A (en) * | 1983-02-14 | 1984-09-10 | インペリアル・ケミカル・インダストリ−ズ・ピ−エルシ− | Production of immobilized enzyme and use thereof |
| JP2009509513A (en) * | 2005-09-30 | 2009-03-12 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | Immobilization of enzyme |
-
2015
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