JP2016119915A - 肝実質細胞中のｐ４５０タンパク質のアイソフォームの質量分析による定量 - Google Patents

肝実質細胞中のｐ４５０タンパク質のアイソフォームの質量分析による定量 Download PDF

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Abstract

【課題】チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）誘導について薬物をスクリーニングする方法を提供すること。
【解決手段】この方法は、薬物を、ミクロソームを含む生物学的サンプルとインキュベートし、次いで少なくとも１つのチトクロームＰ４５０アイソフォームを定量することを含んでもよい。アイソフォームは、２Ｂ６アイソフォーム、３Ａ４アイソフォーム、１Ａ２アイソフォームおよび３Ａ５アイソフォームから選択することができる。いくつかの実施形態では、この方法は、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳＭＳ）を使用する。定量された値は、閾値と比較してもよく、定量された値が閾値を超えない場合、薬物を許容可能なＣＹＰ誘導能を示すものと決定することができる。また、単離されたペプチドも提供する。
【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００９年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／２５２，６４８号および２００９年１０月１６日に出願された同第６１／２５２，４３０号（これらの両方は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の最先出願日の利益を主張する。
本教示は、チトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）、および質量分析法を用いた酵素の検出に関する。
チトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）は、薬物を代謝する主要な酵素であり、実験的医薬化合物は、開発プロセスの初期にそのＣＹＰ誘導能について評価されるのが一般である。化学物質に反応するＣＹＰ誘導プロファイルの測定については、薬物安全性評価の基本的な側面として使用することができるが、これらのタンパク質の発現は、転写機構、転写後機構および翻訳機構により調節されている。このため、ｍＲＮＡを用いたアッセイは、ＣＹＰ誘導の信頼性の高い予測指標ではない。さらに、ＣＹＰは、特にサブファミリー内で広範なアミノ酸配列相同性を示すため、Ｐ４５０タンパク質の発現法も識別力に乏しい。
本教示の種々の実施形態によれば、化学標識をまったく必要とせずにチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ）の１Ａ２アイソフォーム、２Ｂ６アイソフォーム、３Ａ４アイソフォームおよび３Ａ５アイソフォームを定量する方法を提供する。アイソフォーム特異的トリプシンペプチドについては、その最適なＱ１およびＱ３のトランジションと共に、肝実質細胞由来のサンプル、たとえば、ミクロソームを用いた液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳＭＳ）解析で観察することができる。こうした観察されたペプチドおよびトランジションを用いれば、アイソフォーム１Ａ２、２Ｂ６、３Ａ４および３Ａ５の信頼性の高いＣＹＰ定量が可能になり得る。
種々の実施形態によれば、ペプチドおよび最適なＭＲＭトランジションのセットを、薬物とのインキュベーションにより濃度が影響されない「ハウスキーピング」ミクロソーム（ｍｉｃｒｏｓｏｍｏｌ）タンパク質として提供する。このセットは、定量解析のための補正タンパク質として使用してもよい。いくつかの実施形態では、アイソフォーム特異的ペプチドの重い形態、たとえば、Ｃ１３および／またはＮ１５で標識された形態をサンプルに添加することにより、定量化を行ってもよい。図１は、ヒトミクロソームのＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ３／３Ａ４の典型的なＭＲＭ解析を示し、図１ではアイソフォーム特異的ペプチドの一部を表示してある。以下の表１〜４に、本教示の種々の実施形態により観察された最も高感度のアイソフォーム特異的ペプチドのセットごとに最適化トランジションを示す。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ２Ｂ６に特異的な単離されたペプチド。
（項目２）
配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ３Ａ４に特異的な単離されたペプチド。
（項目３）
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列を含む、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ１Ａ２に特異的な単離されたペプチド。
（項目４）
配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を含む、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ３Ａ５に特異的な単離されたペプチド。
（項目５）
サンプル中のチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の少なくとも１つのアイソフォームの量を決定するための方法であって、質量分析法技術の使用を含み、チトクロームＰ４５０の前記少なくとも１つのアイソフォームはＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ５の少なくとも１つを含む、方法。
（項目６）
前記質量分析法技術はタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）技術を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記質量分析法技術は液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）技術を含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術は三連四重極型装置、および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）の使用を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記決定は、三連四重極型装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含むチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ２Ｂ６に特異的な単離されたペプチドを検出することにより、前記サンプル中のＣＹＰ２Ｂ６の量を決定することを含む、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記単離されたペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記方法は約５４８／９１１、約５４８／６８１または約５４８／５６６のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記単離されたペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記方法は約４９４／７７７、約４９４／４３７または約４９４／８７４のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記単離されたペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記方法は約４２１／５０８、約４２１／６０７または約４２１／６９４のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記単離されたペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記方法は約４７９／４９９、約４７９／６１４または約４７９／７２７のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記決定は、三連四重極型装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて、配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ３Ａ４に特異的な単離されたペプチドを検出することにより、前記サンプル中のＣＹＰ３Ａ４の量を決定することを含む、項目５に記載の方法。
（項目１５）
前記単離されたペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含み、前記方法は約４４０／５４９、約４４０／６５０または約４４０／５３２のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記単離されたペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約７０４／７９４、約７０４／９２９、約５６４／６８９、約５６４／７４５または約５６４／７９０のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記単離されたペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約７９８／８１９、約７９８／９３２または約７９８／１００４のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記決定は、三連四重極型装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列を含むチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ１Ａ２に特異的な単離されたペプチドを検出することにより、前記サンプル中のＣＹＰ１Ａ２の量を決定することを含む、項目５に記載の方法。
（項目１９）
前記単離されたペプチドは配列番号８のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約４３２／６３６、約４３２／５３５または約４３２／４７８のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記単離されたペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約４８２／８００、約４８２／６２８または約４８２／７４３のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記単離されたペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約４９１／７２１、約４９１／８３４または約４９１／５３５のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記単離されたペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約５２８／５０１、約５２８／６１４または約５２８／７２７のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記単離されたペプチドは配列番号１２のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約５７１／７８３、約５７１／９７１、約５７１／１０２８、約３８１／５８７、約３８１／４７４または約３８１／３７５のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記単離されたペプチドは配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約６９５／６９５、約６９５／８３７または約６９５／９５０のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記単離されたペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記方法は、約５３６／７９５、約５３６／５８４または約５３６／６９８のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記決定は、三連四重極型装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を含むチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ３Ａ５に特異的な単離されたペプチドを検出することにより、前記サンプル中のＣＹＰ３Ａ５の量を決定することを含む、項目５に記載の方法。
（項目２７）
前記単離されたペプチドは配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記方法は約４６８／５８１、約４６８／６７９または約４６８／７３６のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記単離されたペプチドは配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記方法は約４７０／４９４、約４７０／６０８または約４７０／７２２のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記単離されたペプチドは配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記方法は約５８９／７４７、約５８９／６９６または約５８９／６４７のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含む、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）誘導について薬物をスクリーニングするための方法であって、
前記薬物を、ミクロソームを含む生物学的サンプルとインキュベートすること、
液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳＭＳ）を用いて２Ｂ６アイソフォーム、３Ａ４アイソフォーム、１Ａ２アイソフォームおよび３Ａ５アイソフォームの群から選択される少なくとも１つのチトクロームＰ４５０アイソフォームを定量すること、
定量された値を閾値と比較すること、
前記定量された値が前記閾値を超えない場合、前記薬物が許容可能なＣＹＰ誘導能を有するものと決定すること
を含む、方法。
（項目３１）
前記ミクロソームを含む生物学的サンプルはヒトに由来する、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
配列番号１〜１７のアミノ酸配列の１つまたは複数を含む、ＣＹＰアイソフォームＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２またはＣＹＰ３Ａ５に特異的な１つまたは複数の単離されたペプチドを含む、キット。
（項目３３）
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む、項目３２に記載のキット。
（項目３４）
配列番号５、配列番号６または配列番号７の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む、項目３２に記載のキット。
（項目３５）
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む、項目３２に記載のキット。
（項目３６）
配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７の１つまたは複数のアミノ酸配列を含む、項目３２に記載のキット。
（項目３７）
ホモジニアスアッセイを含む、項目３２に記載のキット。
（項目３８）
前記キットを用いてアッセイを実施するための質量分析機器の設定として使用されるトランジション対に関する情報を含む、項目３２に記載のキット。
本教示について、添付図面を参照しながら説明する。図面は、本教示を説明することを意図しており、本教示を限定することを意図するものではない。
図１は、２０μｇのミクロソーム調製物のＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４に関するＭＲＭ解析を示す（＋ＭＲＭ（４１２対）の抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ））。 図２は、１μｌのミクロソーム調製物のＣＹＰ２Ｂ６に関するＭＲＭ解析を示す（＋ＭＲＭ（１５対）の抽出されたイオンクロマトグラム）。 図３は、２μｇのミクロソーム調製物のＣＹＰ１Ａ２に関するＭＲＭ解析を示す（＋ＭＲＭ（５７対）の抽出されたイオンクロマトグラム）。 図４は、１μｌのミクロソーム調製物のＣＹＰ３Ａ４に関するＭＲＭ解析を示す（＋ＭＲＭ（３４対）の抽出されたイオンクロマトグラム）。 図５Ａは、３０μｌのミクロソーム調製物の３Ａ５に関するＭＲＭ解析を示す（＋ＭＲＭ（４８対）の抽出されたイオンクロマトグラム）。図５Ｂは、３０μｌのミクロソーム調製物の３Ａ５に関するＭＲＭ解析を示す（＋ＭＲＭ（４８対）の抽出されたイオンクロマトグラム）。図５Ｃは、３０μｌのミクロソーム調製物の３Ａ５に関するＭＲＭ解析を示す（＋ＭＲＭ（４８対）の抽出されたイオンクロマトグラム）。 図６は、ＲＮＡアッセイ、酵素活性アッセイ、および本教示のタンパク質定量法を用いて、ＣＹＰ２Ｂ６の誘導剤で処理した肝細胞のサンプル調製物中で観察されたタンパク質発現の変化を示すグラフを示す。 図７は、ＲＮＡアッセイ、酵素活性アッセイ、および本教示のタンパク質定量法を用いて、ＣＹＰ１Ａ２の誘導剤で処理した肝細胞のサンプル調製物中で観察されたタンパク質発現の変化を示すグラフを示す。 図８は、ＲＮＡアッセイ、酵素活性アッセイ、および本教示のタンパク質定量法を用いて、ＣＹＰ３Ａ４の誘導剤で処理した肝細胞のサンプル調製物中で観察されたタンパク質発現の変化を示すグラフを示す。
種々の実施形態によれば、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）誘導について薬物をスクリーニングする方法であって、薬物を、ミクロソームを含む生物学的サンプルとインキュベートすること、および少なくとも１つのＣＹＰアイソフォームを定量することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、アイソフォームは、２Ｂ６アイソフォーム、３Ａ４アイソフォーム、１Ａ２アイソフォームおよび３Ａ５アイソフォームから選択される１つまたは複数のアイソフォームを含んでもよい。この方法は、各アイソフォームの量を定量するため、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳＭＳ）技術を使用することを含んでもよい。それぞれの定量された値を閾値と比較してもよく、定量された値が閾値を超えない場合、薬物を許容可能なＣＹＰ誘導能を有するものとして同定することができる。閾値については、所望のＣＹＰ誘導能に基づき選択するか、または事前に設定してもよいし、あるいは、スクリーニング対象の薬物に類似しているかまたは類似していない１種または複数種の異なる薬物のＣＹＰ誘導能に基づき選択するか、または事前に設定してもよい。いくつかの実施形態では、ミクロソームを含む生物学的サンプルは、哺乳動物由来でも、霊長類由来でも、またはヒト由来でもよい。
種々の実施形態によれば、薬物を、ヒト肝実質細胞を含むサンプルとインキュベートしてもよい。いくつかの実施形態では、薬物とのインキュベーション後、ヒト肝実質細胞を含むサンプルを用いて、たとえば、１６Ｇの遠心分離により少なくとも１つのミクロソーム画分を得てもよい。ミクロソーム画分は、ＣＹＰに特異的な単離されたペプチド（アイソフォーム特異的ペプチド）を検出することにより、薬物によるＣＹＰ誘導について解析することができる。いくつかの実施形態によれば、薬物とのインキュベーション後、ヒト肝実質細胞を含むサンプルを用いて、たとえば、９Ｇの遠心分離により少なくとも１つのＳ９画分を得てもよい。Ｓ９画分を解析して、たとえば、ＣＹＰに特異的な単離されたペプチド（アイソフォーム特異的ペプチド）を検出することにより、薬物によるＣＹＰ誘導を検出してもよい。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＣＹＰアイソフォームを定量するため、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳＭＳ）技術を用いてミクロソーム画分またはＳ９画分を解析してもよい。それぞれの定量された値を閾値と比較してもよく、定量された値が閾値を超えない場合、薬物を許容可能なＣＹＰ誘導能を有するものとして同定することができる。
種々の実施形態によれば、肝実質細胞のＣＹＰを直接解析する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体ペプチドを用いて肝実質細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｃｔｅ）からアイソフォーム特異的ペプチドを直接抽出してもよい。いくつかの実施形態によれば、抗体ペプチドを用いてアイソフォーム特異的ペプチドを肝実質細胞から直接抽出すれば、Ｓ９画分またはミクロソーム画分を調製する必要がなるという利点があり、薬物とのインキュベーションの際に必要とされる肝細胞が少なくなると考えられる。
いくつかの実施形態では、本方法は、検出された誘導を対照と比較してすることを含む。たとえば、薬物によるＣＹＰの誘導はほとんどないか、まったくないことが望ましいため、薬物が、許容可能と見なされるには、陽性対照と比較して必ず（＜）４０％未満の誘導を示すように閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定してもよい。いくつかの実施形態では、薬物は、許容可能と見なされるには、陽性対照と比較して（＜）３０％未満の誘導を示さなければならない。他の実施形態では、薬物が、許容可能と見なされるには、陽性対照と比較して（＜）２０％未満の誘導を示さなければならない。
種々の実施形態によれば、サンプル中のチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の少なくとも１つのアイソフォームの量を決定するための方法を提供する。この方法は、質量分析法技術の使用を含んでもよく、チトクロームＰ４５０の少なくとも１つのアイソフォームは、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ５の少なくとも１つを含む。質量分析法技術は、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）技術および／または液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）技術を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この技術は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術と、三連四重極型質量分析装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）の使用とを含む。
図１は、本実施例で下記のように調製されたミクロソームサンプル調製物のＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４のほか、「ハウスキーピング」ミクロソームタンパク質（ミクロソームＧＳＴ、コルチコステロイド１１βおよびミクロソームトリグリセリド（Ｔｒｙｇｌｙｃｅｒｉｄｅ））の典型的なＭＲＭ解析を示す。ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４の量は、たとえば、サンプル調製物に、アイソフォーム特異的ペプチドの重い形態を添加する同位体希釈質量分析法により決定してもよい。ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４の量は、当該技術分野において公知の他の従来の方法を用いて決定してもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、ＬＣ−ＭＳＭＳを使用し、アイソフォーム特異的ペプチドおよび同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ：ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）を多重反応モニタリング（ＭＲＭ）により定量してＣＹＰ誘導プロファイルを作製する。この方法は、たとえば、参照によってその全体を本明細書に援用するＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，６（６），ｐａｇｅｓ １９３４−１９４７（Ｍａｒｃｈ ２００６）に記載されているように、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．により示された、ＩＣＡＴで標識したアイソフォーム特異的システインを含むペプチドを定量するアプローチと同様のアプローチを使用してもよい。
図２は、本明細書に記載するように調製したミクロソーム調製物のＣＹＰ２Ｂ６の典型的なＭＲＭ解析を示す。以下の表１に記載の配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドは、ＣＹＰ２Ｂ６に特異的である。
図３は、本明細書に記載するように調製したミクロソーム調製物のＣＹＰ１Ａ２の典型的なＭＲＭ解析を示す。以下の表３に記載の配列番号８、９、１０、１１、１２、１３または１４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドは、ＣＹＰ１Ａ２に特異的である。
図４は、本明細書に記載するように調製したミクロソーム調製物のＣＹＰ３Ａ４の典型的なＭＲＭ解析を示す。以下の表２に記載の配列番号５、６または７のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドは、ＣＹＰ３Ａ４に特異的である。配列番号５、６または７のアミノ酸配列を含むペプチドを使用してＣＹＰ３Ａ３を同定および／または定量してもよいことも理解すべきである。
以下の表４に記載の配列番号１５、１６または１７のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドは、ＣＹＰ３Ａ５に特異的である。
図５Ａ〜図５Ｃは、本明細書に記載するように調製したミクロソーム調製物のＣＹＰ３Ａ５の３種の典型的なＭＲＭ解析の画面を示す。各画面は、個々のペプチドに使用される特定のトランジションに関する。配列番号１５、１６または１７のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドは、ＣＹＰ３Ａ５に特異的である。
種々の実施形態によれば、この方法は、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ２Ｂ６に特異的な単離されたペプチド、たとえば、本明細書に記載の配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含むアイソフォームの１つまたは複数を検出することにより、サンプル中のＣＹＰ２Ｂ６の量を決定することを含んでもよい。この量は、三連四重極型質量分析装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて決定してもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約５４８／９１１、約５４８／６８１または約５４８／５６６のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。本明細書で使用する場合、「約」という用語は、＋／−１原子質量単位の範囲内にあることを意味する。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４９４／７７７、約４９４／４３７または約４９４／８７４のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号３のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４２１／５０８、約４２１／６０７または約４２１／６９４のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４７９／４９９、約４７９／６１４または約４７９／７２７のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。
種々の実施形態によれば、この方法は、本明細書に記載の配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ３Ａ４に特異的な単離されたペプチドを検出することにより、サンプル中のＣＹＰ３Ａ４の量を決定することを含んでもよい。この方法は、たとえば、三連四重極型質量分析装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号５のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４４０／５４９、約４４０／６５０または約４４０／５３２のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約７０４／７９４、約７０４／９２９、約５６４／６８９、約５６４／７４５または約５６４／７９０のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約７９８／８１９、約７９８／９３２または約７９８／１００４のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。
種々の実施形態によれば、この方法は、本明細書に記載の配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列を含む、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ１Ａ２に特異的な単離されたペプチドを検出することにより、サンプル中のＣＹＰ１Ａ２の量を決定することを含んでもよい。この方法は、たとえば、三連四重極型質量分析装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用することを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号８のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４３２／６３６、約４３２／５３５または約４３２／４７８のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号９のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４８２／８００、約４８２／６２８または約４８２／７４３のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１０のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４９１／７２１、約４９１／８３４または約４９１／５３５のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１１のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約５２８／５０１、約５２８／６１４または約５２８／７２７のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１２のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約５７１／７８３、約５７１／９７１、約５７１／１０２８、約３８１／５８７、約３８１／４７４または約３８１／３７５のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１３のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約６９５／６９５、約６９５／８３７または約６９５／９５０のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１４のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約５３６／７９５、約５３６／５８４または約５３６／６９８のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。
種々の実施形態によれば、この方法は、本明細書に記載の配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を含む、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ３Ａ５に特異的な単離されたペプチドを検出することにより、サンプル中のＣＹＰ３Ａ５の量を決定することを含んでもよい。この方法は、たとえば、三連四重極型質量分析装置および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１５のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４６８／５８１、約４６８／６７９または約４６８／７３６のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１６のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約４７０／４９４、約４７０／６０８または約４７０／７２２のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、本明細書に記載の配列番号１７のアミノ酸配列を含んでもよく、この方法は、約５８９／７４７、約５８９／６９６または約５８９／６４７のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニターすることを含んでもよい。
本教示の種々の実施形態によれば、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ５の１つまたは複数に特異的な単離されたペプチドの１つまたは複数を含んでもよいキットを提供する。たとえば、このキットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む、ＣＹＰ２Ｂ６に特異的な１つまたは複数の単離されたタンパク質を含んでもよい。キットは、配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む、ＣＹＰアイソフォームＣＹＰ３Ａ４に特異的な１つまたは複数の単離されたタンパク質を含んでもよい。キットは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のアミノ酸配列を含む、ＣＹＰアイソフォームＣＹＰ１Ａ２に特異的な１つまたは複数の単離されたタンパク質を含んでもよい。キットは、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を含む、ＣＹＰアイソフォームＣＹＰ３Ａ５に特異的な１つまたは複数の単離されたタンパク質を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、キットは、ＣＹＰアイソフォームＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ５のそれぞれに特異的な少なくとも１つの単離されたペプチドを含んでもよい。たとえば、キットは、本明細書に記載の配列番号１〜１７の単離されたペプチドのそれぞれを含んでもよく、アイソフォーム特異的ペプチドごとにＱ１およびＱ３のトランジション値を測定するための説明書をさらに含んでもよい。キットは、緩衝液および酵素などの酵素消化成分、他の緩衝液、ならびに任意に他の試薬および／または成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、たとえば、使用者がサンプルを加えるだけでよいようにホモジニアスアッセイを含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、較正もしくは補正試薬または標準物質を含んでもよい。キットにはさらに、アッセイを実施する際に使用してもよい、あるいは使用すべき機器の設定に関する情報が含まれていてもよい。キットには、サンプル調製、動作条件、体積、温度設定および同種のものに関する情報が含まれていてもよい。
種々の実施形態によれば、様々な因子に応じて、様々なトランジションを使用してアッセイの結果を測定および評価してもよい。したがって、キットは、サンプルと１つまたは複数の対照試薬との間で比較測定を行うのに有用な様々なトランジション値および／または推奨設定を含んでもよい。キットは、トランジション値の特定の対、たとえば、Ｑ１／Ｑ３トランジション対、または１つもしくは複数の異なるトランジション対の値を測定するための説明書を含んでもよい。
キットは、１つまたは複数の試薬（ｒｅｇｅｎｔ）の入れ物および適切な説明書を含む密封容器に収められていてもよい。キットには、１つまたは複数のアッセイ、測定値、トランジション対、動作説明書、動作を行うためのソフトウェア、これらの組み合わせ、または同種のものに関する電子情報が保存された電子媒体が含まれていてもよい。
本教示については、以下の例および得られたデータを参照すれば、一層理解を深めることができる。以下の例および添付の図面に示した結果では、ＣＹＰ誘導試験を以下の通り実施した。
肝細胞の処理
ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４の発現および活性を高めるため、それぞれ原型肝酵素誘導剤３−メチルコラントレン（３−ＭＣ、２μＭ）、フェノバルビタール（ＰＢ、１ｍＭ）またはリファンピシン（ＲＩＦ、１０μＭ）でヒト肝実質細胞の初代培養を７２時間処理した。本教示のＣＹＰの定量法を用いて、肝酵素誘導剤による処理後にサンプル中のＣＹＰの量を決定した。さらに、選択的基質（それぞれフェナセチン、ブプロピオンおよびテストステロン）の代謝産物生成によりＣＹＰ活性を測定し、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりｍＲＮＡを測定した。
ミクロソームの調製
ミクロソームの細胞下画分を、処理した肝実質細胞をホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解し、続いて９，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離することにより調製した。次いで上清（Ｓ９画分）を１００，０００×ｇ、４℃で６０分間遠心した。得られたミクロソームのペレットを０．２５Ｍのスクロースに懸濁し、解析まで−８０℃で保存した。
トリプシン消化
１００ｕｌのミクロソーム調製物それぞれに２％ＳＤＳ５ｕｌ、続いて５０ｍＭのＴＣＥＰ１０ｕｌを加え、６０℃で１時間インキュベートした。０．１ＭのＭＭＴＳ５ｕｌを加え、室温で１０分間インキュベートした。次いで１００ｍＭのトリス（ｐＨ＝８．５０）１００ｕｌ、続いて５０ｕｇのトリプシンを加え、得られた溶液を３７℃で一晩消化した。消化物に１ｎｇの同位体標識された合成ペプチドをそれぞれ加え、ＬＣ−ＭＳにより解析した。
クロマトグラフィー
Ｃ１８ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ ５０×２．０ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｏｆ Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と連結したＡｇｉｌｅｎｔ １１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ ｏｆ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、クロマトグラフィーを行った。グラジエントは、１５分かけて５〜４０％Ｂとし、Ａは、２％ＡＣＮ、０．１％ギ酸からなり、Ｂは、９０％ＡＣＮ、１０％Ｈ２Ｏ、０．１％ギ酸からなっていた。流量は、７００μＬ／ｍｉｎであった。
質量分析法
サンプルは、Ｔｕｒｂｏ ＶＴＭソースおよびＡｎａｌｙｓｔ １．５を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ ４０００ ＱＴＲＡＰＴＭ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムで解析した。定量には、各トランジションのデュエルタイムを最大にするため、スケジュールドＭＲＭ（ｓＭＲＭ）を使用した。
データ処理
定量データは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＬＬＣ ｏｆ Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ．から入手することができるＭｕｌｔｉＱｕａｎｔＴＭ １．２ソフトウェアを用いて処理した。
結果
図６は、ＲＮＡアッセイ、ＣＹＰ活性アッセイ（図中では「酵素活性アッセイ」と記載）、および本教示のＣＹＰ定量法（図中では「タンパク質アッセイ」と記載）により観察されたＣＹＰ２Ｂ６の発現の変化を比較したグラフを示す。３−ＭＣは、ビヒクル対照であり、基礎レベルのＣＹＰ２Ｂ６を誘導する。ＰＢは、核内受容体ＣＡＲの活性化によるＣＹＰ２Ｂ６の原型誘導剤である。ＲＩＦも、ＣＹＰ２Ｂ６の周知の誘導剤である。図示したように、ＣＹＰ活性アッセイおよびＲＮＡアッセイで観察されたタンパク質発現の変化は、本教示のＣＹＰ定量法により観察された発現の変化に概ね似ている。
図７は、ＲＮＡアッセイ、ＣＹＰ活性アッセイ（図中では「酵素活性アッセイ」と記載）、および本教示のＣＹＰ定量法（図中では「タンパク質アッセイ」と記載）により観察されたＣＹＰ１Ａ２の発現の変化を比較したグラフを示す。３−ＭＣは、核内受容体ＡｈＲの活性化によるＣＹＰ１Ａ２の原型誘導剤である。ＰＢおよびＲＩＦは、誘導がある場合に基礎レベルの１Ａ２を誘導するビヒクル対照である。図示したように、ＣＹＰ活性アッセイおよびＲＮＡアッセイで観察されたタンパク質発現の変化は、３ＭＣで処理したサンプルのＲＮＡアッセイが非常に高レベルのＲＮＡを示す以外、本教示のＣＹＰ定量法により観察された発現の変化に概ね似ている。ＲＮＡアッセイは、ｍＲＮＡがすべてタンパク質に変換されるとは限らないため、タンパク質を正確に定量することができない。
図８は、ＲＮＡアッセイ、ＣＹＰ活性アッセイ（図中では「酵素活性アッセイ」と記載）、および本教示のＣＹＰ定量法（図中では「タンパク質アッセイ」と記載）により観察されたＣＹＰ３Ａ４の発現の変化を比較したグラフを示す。３−ＭＣは、ＣＹＰ３Ａ４をわずかに誘導する。ＰＢは、３Ａ４を著しく誘導する。ＲＩＦは、核内受容体ＰＸＲの活性化によるＣＹＰ３Ａ４の原型誘導剤である。図示したように、ＣＹＰ活性アッセイおよびＲＮＡアッセイで観察されたタンパク質発現の変化は、本教示のＣＹＰ定量法により観察された発現の変化に概ね似ている。
下記表１は、本教示により、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ２Ｂ６に特異的であると決定されたペプチドの配列を、それらの最適なＭＲＭ Ｑ１、Ｑ３のトランジションと共に示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションを使用して、アイソフォームＣＹＰ２Ｂ６の信頼性の高いＣＹＰ定量が可能になる。
下記表２は、本教示により、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ３Ａ４に特異的であると決定されたペプチドの配列を、それらの最適なＭＲＭ Ｑ１、Ｑ３のトランジションと共に示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションを使用して、アイソフォームＣＹＰ３Ａ４の信頼性の高いＣＹＰ定量が可能になる。
下記表３は、本教示により、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ１Ａ２に特異的であると決定されたペプチドの配列を、それらの最適なＭＲＭ Ｑ１、Ｑ３のトランジションと共に示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションを使用して、アイソフォームＣＹＰ１Ａ２の信頼性の高いＣＹＰ定量が可能になる。
下記表４は、本教示により、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォームＣＹＰ３Ａ５に特異的であると決定されたペプチドの配列を、それらの最適なＭＲＭ Ｑ１、Ｑ３のトランジションと共に示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションを使用して、アイソフォームＣＹＰ３Ａ５の信頼性の高いＣＹＰ定量が可能になる。
下記表５は、ハウスキーピングミクロソームタンパク質ミクロソームＧＳＴのペプチドの配列を、それらの最適なＭＲＭ Ｑ１、Ｑ３のトランジションと共に示す。種々の実施形態によれば、この観察されたペプチドの濃度は、薬物とのインキュベーションにより影響されないため、ペプチドは、信頼性の高いＣＹＰの定量を可能にする補正タンパク質として有用であり得る。
下記表６は、ハウスキーピングミクロソームタンパク質ミクロソームトリグリセリドのペプチドの配列を、それらの最適なＭＲＭ Ｑ１、Ｑ３のトランジションと共に示す。種々の実施形態によれば、この観察されたペプチドの濃度は、薬物とのインキュベーションにより影響されないため、ペプチドは、信頼性の高いＣＹＰの定量を可能にする補正タンパク質として有用であり得る。
下記表７は、ハウスキーピングミクロソームタンパク質コルチコステロイド１１βのペプチドの配列を、それらの最適なＭＲＭ Ｑ１、Ｑ３のトランジションと共に示す。表７の配列番号２２のペプチドのＱ１およびＱ３の質量は、アルキル化ペプチドＭＭＴＳを示し、別のアルキル化試薬に変更すると、Ｑ１、Ｑ３の質量が変化することを理解すべきである。さらに、ＭＭＴＳ以外のアルキル化試薬を使用してもよい。種々の実施形態によれば、この観察されたペプチドの濃度は、薬物とのインキュベーションにより影響されないため、ペプチドは、信頼性の高いＣＹＰの定量を可能にする補正タンパク質として有用であり得る。
ミクロソームのＬＣ−ＭＳＭＳ解析により検出される観察されたアイソフォーム特異的トリプシンペプチドを、それらの最適なＱ１、Ｑ３のトランジションと組み合わせると、化学標識アプローチをまったく必要とせずに、アイソフォーム１Ａ２、２Ｂ６、３Ａ４および３Ａ５のＣＹＰの定量法が可能になる。
本明細書の検討、および本明細書に開示された本教示の実施から、当業者には本教示の他の実施形態が明らかになるであろう。本明細書および例は、例示にとどまるものと見なされることを意図している。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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