JP2016094406A - Astrocyte differentiation inducer, and gfap expression inducer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤に関する。 The present invention relates to an astrocyte differentiation inducer and a GFAP expression inducer.
高齢化社会が進むにつれて認知症などの老化を原因とする各種神経変性疾患が問題となっている。かかる疾患は患者のみならず介護者の日常生活へも大きな負担を生じ、社会レベルでは医療費・介護費の膨大に繋がっている。 As an aging society progresses, various neurodegenerative diseases caused by aging such as dementia are becoming a problem. Such diseases cause a great burden not only on patients but also on the daily lives of caregivers, leading to enormous medical and nursing costs at the social level.
また、極度のストレス負荷（例えば、交通事故、過労、いじめ・虐待、犯罪抵触など）を受けることにより各種脳神経機能障害をもたらすことも知られ社会問題にもなっている。神経細胞を増強・促進する事により脳機能を改善したいニーズは従来からあり、安全性が高く、且つ長期摂取可能な医薬品等が求められている。 It is also known to cause various cranial nerve dysfunctions due to extreme stress loads (for example, traffic accidents, overwork, bullying / abuse, criminal conflict, etc.), which is also a social problem. Conventionally, there is a need to improve brain function by enhancing and promoting nerve cells, and there is a demand for drugs that are highly safe and can be taken for a long time.
近年、神経系細胞の分化制御機構は急速に明らかになっているが、安全性が高く、且つ長期摂取可能な神経系細胞の分化促進剤や分化誘導剤は、まだ明らかとなっていない。ゾニサミド（パーキンソン病薬）や冬虫夏草抽出物ではアストロサイトを増殖したという報告があるが、安全性や費用の面からは更なる改善が必要な状況である。 In recent years, the differentiation control mechanism of nervous system cells has been rapidly clarified, but a differentiation promoter and differentiation inducer for nervous system cells that are highly safe and can be ingested for a long time have not yet been clarified. Zonisamide (a Parkinson's disease drug) and Cordyceps extract have reported astrocyte growth, but further improvements are necessary in terms of safety and cost.
ポリフェノールは、その特性から、医薬、化粧品、食品など様々な分野に利用されている、安価で安全性の高い物質である。 Polyphenols are inexpensive and highly safe substances that are used in various fields such as pharmaceuticals, cosmetics, and foods because of their characteristics.
例えば、レスベラトロールはスチルベン類の化合物であり、ブドウに含まれているが、アストロサイトの増殖については影響がないとの報告がある(非特許文献1を参照)。
ピセアタンノールは、例えば、トケイソウ科トケイソウ属（Passiflora）の果物であるパッションフルーツの種子に含まれており、シミ、ソバカス、日焼けなどによる色素沈着の原因となるメラニンの生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献１を参照）。
For example, resveratrol is a compound of stilbenes and is contained in grapes, but it has been reported that there is no effect on the growth of astrocytes (see Non-Patent Document 1).
Piceatannol is contained in the seeds of passion fruit, for example, the fruit of the Passiflora family Passiflora, and has the effect of suppressing the formation of melanin that causes pigmentation due to spots, buckwheat, sunburn, etc. (See Patent Document 1).
本発明は、新規なアストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel astrocyte differentiation inducer and GFAP expression inducer.
本発明にかかる一実施態様は、神経幹細胞をアストロサイトに高率に分化誘導するアストロサイト分化誘導剤であって、ピセアタンノールを有効成分として含有するアストロサイト分化誘導剤である。このアストロサイト分化誘導剤は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、外傷性神経損傷、脊髄損傷、脳卒中、脳出血、脳血栓、脳塞栓、黄斑変性、作動振顫、遅発性ジスキネジア、パニック障害、不安障害、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイマー病、てんかん、糖尿病神経障害に対する予防薬または治療薬であってもよい。このアストロサイトはＧＦＡＰ発現細胞であってもよい。 One embodiment according to the present invention is an astrocyte differentiation inducer that induces differentiation of neural stem cells into astrocytes at a high rate, and an astrocyte differentiation inducer containing piceatannol as an active ingredient. This astrocyte differentiation-inducing agent is used in Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, progressive supranuclear palsy, multiple sclerosis, Huntington's disease, multiple system atrophy, spinocerebellar degeneration, traumatic nerve Injury, spinal cord injury, stroke, cerebral hemorrhage, cerebral embolism, macular degeneration, tremor, delayed dyskinesia, panic disorder, anxiety disorder, depression, alcoholism, insomnia, mania, Alzheimer's disease, epilepsy, diabetes It may be a prophylactic or therapeutic agent for neurological disorders. The astrocyte may be a GFAP-expressing cell.
本発明にかかる他の実施態様は、神経幹細胞においてＧＦＡＰの発現を高率に誘導するＧＦＡＰ発現誘導剤であって、ピセアタンノールを有効成分として含有するＧＦＡＰ発現誘導剤である。このＧＦＡＰ発現誘導剤は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、外傷性神経損傷、脊髄損傷、脳卒中、脳出血、脳血栓、脳塞栓、黄斑変性、作動振顫、遅発性ジスキネジア、パニック障害、不安障害、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイマー病、てんかん、糖尿病神経障害に対する予防薬または治療薬であってもよい。 Another embodiment of the present invention is a GFAP expression inducer that induces GFAP expression at a high rate in neural stem cells, and that contains piceatannol as an active ingredient. This GFAP expression inducer is used in Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, progressive supranuclear palsy, multiple sclerosis, Huntington's disease, multiple system atrophy, spinocerebellar degeneration, traumatic nerve injury Spinal cord injury, stroke, cerebral hemorrhage, cerebral thrombosis, cerebral embolism, macular degeneration, actuation tremor, delayed dyskinesia, panic disorder, anxiety disorder, depression, alcoholism, insomnia, mania, Alzheimer's disease, epilepsy, diabetic nerve It may be a prophylactic or therapeutic agent for the disorder.
本発明によって、新規なアストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤を提供することができるようになった。 According to the present invention, a novel astrocyte differentiation inducer and GFAP expression inducer can be provided.
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
（１）アストロサイト分化誘導剤またはＧＦＡＰ発現誘導剤に含まれるピセアタンノール
本願発明のアストロサイト分化誘導剤またはＧＦＡＰ発現誘導剤は、ピセアタンノールを有効成分として含有する。ピセアタンノールは、安全性が高く、且つ継続摂取が容易な化合物として知られているので、本願発明の薬剤も、安全性が高く、且つ継続摂取が容易という有利な点を有する。
(1) Piceatannol contained in an astrocyte differentiation inducer or GFAP expression inducer The astrocyte differentiation inducer or GFAP expression inducer of the present invention contains piceatannol as an active ingredient. Since piceatannol is known as a compound having high safety and easy continuous intake, the drug of the present invention also has an advantage of high safety and easy continuous intake.
スチルベン化合物とは、スチルベン骨格を有するポリフェノールの総称であり、ピセアタンノールはその一種である。ピセアタンノールは、化学合成品であってもよいし、植物等の自然物由来であってもよい。 A stilbene compound is a general term for polyphenols having a stilbene skeleton, and piceatannol is a kind thereof. Piceatannol may be a chemically synthesized product or may be derived from natural products such as plants.
植物を、乾燥した後に、破砕、粉砕、または、切断などによって種子等の分解物を得、溶媒を用いて抽出し、残渣を除去することによって抽出液を得ることができる。さらに、抽出液から溶媒を除去することによって、抽出物を得ることができる。抽出物の形状は、特に限定されず、例えば粉体などの固体状、アモルファス状、または、オイル状であっても良い。 After the plant is dried, a decomposition product such as seeds is obtained by crushing, pulverizing, cutting, or the like, extracted using a solvent, and an extract can be obtained by removing the residue. Furthermore, an extract can be obtained by removing the solvent from the extract. The shape of the extract is not particularly limited, and may be, for example, a solid such as powder, an amorphous form, or an oil form.
アストロサイト分化誘導剤に含有させるピセアタンノールは、植物の抽出液をそのまま用いてもよく、この抽出液から様々な方法でピセアタンノールを精製したり、様々な溶媒で希釈したりして得られた様々な純度や様々な濃度の抽出液を用いてもよいが、植物から抽出物を得る段階のいずれのものも、植物エキスとして、アストロサイト分化誘導剤に使用することができる。また、抽出物を溶媒で溶解して得られた溶液を植物エキスとして用いてもよい。 The piceatannol contained in the astrocyte differentiation-inducing agent may be used as it is from a plant extract, and can be obtained by purifying piceatannol from this extract by various methods or diluting with various solvents. Extracts with various purity and various concentrations may be used, but any of the steps for obtaining an extract from a plant can be used as an astrocyte differentiation inducer as a plant extract. Moreover, you may use the solution obtained by melt | dissolving an extract with a solvent as a plant extract.
抽出に用いる溶媒の種類は、当業者であれば適切に選択することができるが、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン等の有機溶媒または含水有機溶媒、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であっても良く、水、エタノール、１，３−ブチレングリコール、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であることが好ましく、水、エタノール、または、水およびエタノールの混合溶媒である含水エタノールであることがより好ましい。ここで、「含水有機溶媒」とは「水を含む有機溶媒」の意である。この含水有機溶媒を製造するために有機溶媒に添加する水は特に限定されず、純水でも不純物を含む水でもよく、酸性水溶液であってもアルカリ性水溶液であってもよく、様々なイオンを含んだ緩衝液であってもよい。また、抽出に用いる溶媒の温度は、その溶媒が液体の物性を保つ温度範囲から適宜選択できる。 The type of the solvent used for extraction can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, water, methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, glycerin, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol , Dimethyl sulfoxide, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, 2-propanol, 1,4-dioxane, hexane, chloroform, dichloromethane, and other organic solvents or hydrous organic solvents, or a mixture of two or more solvents selected from these It may be a solvent, and is preferably water, ethanol, 1,3-butylene glycol, or a mixed solvent of two or more solvents selected from these, water, ethanol, or a mixed solvent of water and ethanol More preferred is water-containing ethanol . Here, the “hydrated organic solvent” means “an organic solvent containing water”. Water to be added to the organic solvent for producing the water-containing organic solvent is not particularly limited, and it may be pure water or water containing impurities, may be an acidic aqueous solution or an alkaline aqueous solution, and may contain various ions. It may be a buffer solution. In addition, the temperature of the solvent used for extraction can be appropriately selected from a temperature range in which the solvent maintains liquid properties.
混合溶媒を用いる場合の、各溶媒の混合比は特に限定されないが、例えば水およびエタノールの混合溶媒を用いる場合には、水とエタノールとの体積比は、１：９９〜９９：１であっても良く、３：９７〜８０：２０であることが好ましく、５：９５〜５０：５０であることがより好ましく、１０：９０〜４０：６０であることが特に好ましい。 When using a mixed solvent, the mixing ratio of each solvent is not particularly limited. For example, when using a mixed solvent of water and ethanol, the volume ratio of water to ethanol is 1:99 to 99: 1. The ratio is preferably 3:97 to 80:20, more preferably 5:95 to 50:50, and particularly preferably 10:90 to 40:60.
溶媒として、水、または、水との混合溶媒を用いる場合には、熱水、または、熱水との混合溶媒であることが好ましい。水、または、水との混合溶媒は塩を含んでいても良く、塩を含む溶媒の例として、バッファー（緩衝液）であっても良い。バッファーのｐＨは、特に限定されず、酸性、中性、または、アルカリ性のいずれであっても良いが、酸性であることが好ましく、ｐＨ６以下の酸性であることがより好ましく、ｐＨ１〜ｐＨ５の酸性であることがさらに好ましい。バッファーに用いる塩の種類は特に限定されず、例として、クエン酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩、酢酸塩および炭酸塩などが挙げられる。 When water or a mixed solvent with water is used as the solvent, it is preferably hot water or a mixed solvent with hot water. Water or a mixed solvent with water may contain a salt, and may be a buffer (buffer) as an example of a solvent containing a salt. The pH of the buffer is not particularly limited, and may be acidic, neutral, or alkaline, but is preferably acidic, more preferably acidic at pH 6 or lower, and acidic from pH 1 to pH 5. More preferably. The kind of salt used for the buffer is not particularly limited, and examples thereof include citrate, malate, phosphate, acetate, and carbonate.
抽出液から溶媒を除去する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。例えば、減圧留去、凍結乾燥、または、スプレードライ（噴霧乾燥）であっても良いが、凍結乾燥、または、スプレードライであることが好ましく、スプレードライであることがより好ましい。 The method for removing the solvent from the extract is not particularly limited, and a known method can be used. For example, vacuum distillation, freeze drying, or spray drying (spray drying) may be used, but freeze drying or spray drying is preferable, and spray drying is more preferable.
ここで、植物の種類は、ピセアタンノールを含む植物であれば特に限定されず、例えば、パッションフルーツ（例えば、Passiflora edulis、Passiflora alata、Passiflora amethystine、Passiflora antioquiensis、Passiflora biflora、Passiflora buonapartea、Passiflora capsularis、Passiflora cearensis、Passiflora coccinea、Passiflora cochinchinesis、Passiflora filamentosa、Passiflora herbertiana、Passiflora laurifolia、Passiflora ligularis、Passiflora lunata、Passiflora lutea、Passiflora maliformis、Passiflora mixta、Passiflora mucronata、Passiflora mollissima、Passiflora nibiba、Passiflora organensis、Passiflora pallida、Passiflora parahypensis、Passiflora pedeta、Passiflora pinnatistipula、Passiflora popenovii、Passiflora quadrangularis、Passiflora riparia、Passiflora rubra、Passiflora serrate、Passiflora tiliaefolia、Passiflora tripartite、Passiflora villosa、Passiflora warmingiiなど）、テンニンカ（例えば、Rhodomyrtus tomentosaなど）、ブラシノキ（例えば、マキバブラシノキCallistemon speciosus、Callistemon rigidusなど）などが挙げられる。抽出するのは、ピセアタンノールが含まれていれば、植物全体のうち、どの部分であっても良く、例えば、果実、花、種子、葉、枝、樹皮、幹、茎、または、根であっても良いが、パッションフルーツを用いる場合は種子であることが好ましく、テンニンカである場合には果実であることが好ましく、ブラシノキである場合には茎であることが好ましい。 Here, the type of plant is not particularly limited as long as it is a plant containing piceatannol. Passiflora cearensis, Passiflora coccinea, Passiflora cochinchinesis, Passiflora filamentosa, Passiflora herbertiana, Passiflora laurifolia, Passiflora ligularis, Passiflora lunata, Passiflora lutea, Passiflora maliformis, Passiflora mixta, Passiflora mixa, Passiflora , Passiflora pedeta, Passiflora pinnatistipula, Passiflora popenovii, Passiflora quadrangularis, Passiflora riparia, Passiflora rubra, Passiflora serrate, Passiflora tiliaefolia, Passiflora tripartite, Passiflora villosa, Passiflora warmingii (ex. , Etc. Rhodomyrtus tomentosa), Burashinoki (e.g., Makiba Burashinoki Callistemon speciosus, etc. Callistemon rigidus), and the like. Any part of the whole plant can be extracted as long as it contains piceatannol, for example, fruit, flower, seed, leaf, branch, bark, trunk, stem or root. However, when passion fruit is used, it is preferably a seed, when it is a tenninka, it is preferably a fruit, and when it is brassica, it is preferably a stem.
（２）アストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤
ピセアタンノールは、医薬または試薬として用いられる薬剤として、in vivoまたはin vitroで用いて、神経幹細胞においてＧＦＡＰ（Glial fibrillary acidic protein：グリア細胞線維性酸性タンパク質）を高率に発現させることができるＧＦＡＰ発現誘導剤とすることができる。ここで、「ＧＦＡＰ発現誘導」及び「神経幹細胞においてＧＦＡＰを高率に発現させる」とは、一つの神経幹細胞に対しては、その薬剤がない場合より高い確率でＧＦＡＰを発現させることを意味し、神経幹細胞の集団に対しては、その薬剤がない場合より高い割合でＧＦＡＰを発現させることを意味する。
(2) Astrocyte differentiation inducer and GFAP expression inducer Piceatannol is used in vivo or in vitro as a drug or reagent, and is used in neural stem cells as GFAP (Glial fibrillary acidic protein: glial cell fibrosis). Acidic protein) can be expressed as a GFAP expression inducer. Here, “GFAP expression induction” and “express GFAP in neural stem cells at a high rate” mean that GFAP is expressed with a higher probability for one neural stem cell than without the drug. It means that for a population of neural stem cells, GFAP is expressed at a higher rate than without the drug.
また、ＧＦＡＰはアストロサイトの特異的マーカーであるので、この際、アストロサイトへの分化を高率に誘導することができるアストロサイト分化誘導剤とすることもできる。ここで、「アストロサイト分化誘導」及び「アストロサイトへの分化を高率に誘導する」とは、一つの神経幹細胞に対しては、その薬剤がない場合より高い確率でアストロサイトへ分化誘導することを意味し、神経幹細胞の集団に対しては、その薬剤がない場合より高い割合でアストロサイトへ分化誘導することを意味する。 Further, since GFAP is a specific marker for astrocytes, it can be used as an astrocyte differentiation inducer that can induce differentiation into astrocytes at a high rate. Here, “inducing astrocyte differentiation” and “inducing differentiation into astrocytes at a high rate” means that one neural stem cell is induced to differentiate into astrocytes with a higher probability than without the drug. This means that the neural stem cell population induces differentiation into astrocytes at a higher rate than without the drug.
本発明に係る薬剤は、有効成分の他、必要に応じて、一般に用いられる各種成分をさらに含み得るものであり、例えば、1種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤などを含み得る。 The drug according to the present invention may further contain various components that are generally used in addition to the active ingredient, if necessary, for example, one or more pharmaceutically acceptable excipients, disintegrants, dilutions Agents, lubricants, flavoring agents, coloring agents, sweeteners, flavoring agents, suspending agents, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, adjuvants, preservatives, buffering agents, binders, stabilizers, coating agents, etc. Can be included.
＝＝in vivoでの使用＝＝
in vivoで用いる場合、投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路、非経口経路のいずれによっても投与できる。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与を実施することができる。直接投与する場合、神経幹細胞が局在する海馬や側脳室またはそれらの近傍に投与することが好ましい。
== In vivo use ==
When used in vivo, the route of administration can be selected from either systemic administration or local administration. In this case, an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like. The drug according to the present invention can be administered by either oral route or parenteral route. Examples of parenteral routes include normal intravenous administration and intraarterial administration, as well as subcutaneous, intradermal and intramuscular administration. Furthermore, transmucosal administration or transdermal administration can be performed. When administered directly, it is preferable to administer to the hippocampus, lateral ventricle or the vicinity where the neural stem cells are localized.
経口用固形製剤を調製する場合は、有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などを製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどを、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などを例示できる。 When preparing an oral solid preparation, after adding excipients, binders, disintegrating agents, lubricants, coloring agents, corrigents, flavoring agents, etc. to the active ingredient, tablets by a conventional method, Coated tablets, granules, powders, capsules and the like can be produced. Such additives may be those commonly used in the art. For example, excipients include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid As a binder, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl starch, methylcellulose, ethylcellulose, shellac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone, etc. Disintegrants include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, lactose, and lubricants such as purified talc, stearin Salts, borax, polyethylene glycol and the like, as the corrigent sucrose, orange peel, citric acid, can be exemplified tartaric acid.
経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤などを加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などを製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどを挙げることができる。 When an oral liquid preparation is prepared, a liquid preparation, a syrup, an elixir or the like can be produced by a conventional method by adding a corrigent, a buffer, a stabilizer, a corrigent and the like to the active ingredient. In this case, the flavoring agent may be those listed above, examples of the buffer include sodium citrate, and examples of the stabilizer include tragacanth, gum arabic, and gelatin.
注射剤を調製する場合は、有効成分にpH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のpH調節剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを挙げることができる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、 エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを挙げることができる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが例示できる。 When preparing injections, add pH regulators, buffers, stabilizers, tonicity agents, local anesthetics, etc. to active ingredients, and manufacture injections for subcutaneous, intramuscular and intravenous injections using conventional methods. can do. In this case, examples of the pH adjuster and buffer include sodium citrate, sodium acetate, and sodium phosphate. Examples of the stabilizer include sodium pyrosulfite, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), thioglycolic acid, and thiolactic acid. Examples of local anesthetics include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride. Examples of isotonic agents include sodium chloride and glucose.
坐剤を調製する場合は、有効成分に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライドなどを、さらに必要に応じてツイーン（登録商標）のような界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。 When preparing a suppository, a formulation carrier known in the art, such as polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglyceride, or the like, and a surfactant such as Tween (registered trademark) as necessary are used as active ingredients. After adding an agent etc., it can manufacture by a conventional method.
軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤などが必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどを挙げることができる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどを挙げることができる。 When preparing an ointment, bases, stabilizers, wetting agents, preservatives and the like that are usually used as active ingredients are blended as necessary, and mixed and formulated by a conventional method. Examples of the base include liquid paraffin, white petrolatum, white beeswax, octyldodecyl alcohol, and paraffin. Examples of the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, and the like.
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペーストなどを常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタンなどのフィルムあるいは発泡体シートが適当である。 When producing a patch, the ointment, cream, gel, paste and the like may be applied to a normal support by a conventional method. As the support, a woven fabric, nonwoven fabric, soft vinyl chloride, polyethylene, polyurethane film or foam sheet made of cotton, suf, chemical fiber is suitable.
薬剤に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量や投薬の回数などにより適宜決定できる。用量は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択される。一日投与量は1日1回乃至数回に分けて投与することができる。 The amount of the active ingredient contained in the drug can be appropriately determined depending on the dose of the active ingredient, the number of doses, and the like. The dose is not particularly limited, and the effectiveness of the contained components, administration form, administration route, type of disease, nature of the subject (such as weight, age, medical condition and use of other drugs), and judgment of the doctor in charge It is appropriately selected according to the above. The daily dose can be administered once to several times a day.
投与する動物種は即に限定されず、脊椎動物であってもよいが、ほ乳類であることが好ましく、ヒトであることが最も好ましい。ピセアタンノールを含む薬剤を生体に投与すると、in vivoで、神経幹細胞に対しＧＦＡＰ発現が高率で誘導され、また神経幹細胞がアストロサイトに高率で分化誘導されるようになる。 The species of animal to be administered is not immediately limited and may be a vertebrate, but is preferably a mammal, and most preferably a human. When a drug containing piceatannol is administered to a living body, GFAP expression is induced to neural stem cells at a high rate in vivo, and neural stem cells are induced to differentiate into astrocytes at a high rate in vivo.
＝＝in vitroでの使用＝＝
in vitroで用いる場合、ピセアタンノールを含む薬剤を、神経幹細胞を含む培養細胞や培養組織を培養する培地に添加すればよい。培地中の濃度は特に限定されず、培養する細胞や組織によって、適宜決めることができるが、例えば、１０μＭ以下であってもよく、５μＭ以下であってもよく、２．５μＭ以下であってもよく、１μＭ以下であってもよい。
== In vitro use ==
When used in vitro, a drug containing piceatannol may be added to a culture medium for culturing cultured cells or cultured tissues containing neural stem cells. The concentration in the medium is not particularly limited and can be appropriately determined depending on the cells or tissues to be cultured. For example, it may be 10 μM or less, 5 μM or less, or 2.5 μM or less. It may be 1 μM or less.
用いる神経幹細胞の由来は特に限定されず、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ミューズ細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などの多能性幹細胞、または間充織幹細胞や臍帯血幹細胞などの幹細胞から誘導された神経幹細胞でも、生体から単離された神経幹細胞でも構わない。 The origin of the neural stem cells to be used is not particularly limited, and pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and muse cells (Muse cells), or mesenchymal stem cells and cord blood A neural stem cell derived from a stem cell such as a stem cell or a neural stem cell isolated from a living body may be used.
神経幹細胞をアストロサイトに分化誘導する条件下で、本発明のアストロサイト分化誘導剤を神経幹細胞に適用すると、神経幹細胞は高率でアストロサイトに分化するようになる。アストロサイトに分化させる条件は特に限定されず、公知の分化条件を用いればよい。 When the astrocyte differentiation inducer of the present invention is applied to neural stem cells under conditions that induce differentiation of neural stem cells into astrocytes, the neural stem cells differentiate into astrocytes at a high rate. Conditions for differentiation into astrocytes are not particularly limited, and known differentiation conditions may be used.
また、神経幹細胞をアストロサイトに分化誘導する条件下で、神経幹細胞に本発明のＧＦＡＰ発現誘導剤を適用すると、神経幹細胞が高率にＧＦＡＰを発現するようになる。アストロサイトに分化させる条件は特に限定されず、公知の分化条件を用いればよい。 In addition, when the GFAP expression inducer of the present invention is applied to neural stem cells under conditions that induce differentiation of neural stem cells into astrocytes, neural stem cells express GFAP at a high rate. Conditions for differentiation into astrocytes are not particularly limited, and known differentiation conditions may be used.
（３）アストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤の医薬としての使用
近年、アストロサイトは、従来考えられていたような、神経細胞の支持や神経細胞に対する栄養供給だけでなく、神経回路形成促進、神経伝達物質濃度調節、細胞外イオン濃度調節、オリゴデンドロサイトの髄鞘形成活性の亢進、記憶形成などの高次機能への関与、精神病性障害への関与など多様な機能を有することが明らかになっている。
(3) Use of Astrocyte Differentiation Inducing Agent and GFAP Expression Inducing Agent as Drugs In recent years, astrocytes are not only supporting nerve cells and supplying nutrients to neurons, but also promoting the formation of neural circuits as previously thought. It is clear that it has various functions such as regulation of neurotransmitter concentration, regulation of extracellular ion concentration, enhancement of myelination activity of oligodendrocytes, involvement in higher-order functions such as memory formation, involvement in psychotic disorders It has become.
そこで、本発明にかかるアストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤は、神経系疾患、特に中枢神経系疾患の治療に用いることができる。この神経系疾患には、神経変性疾患、神経障害、神経損傷、脳脊髄炎、精神病性障害、二次的神経障害などが含まれ、例えば、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、外傷性神経損傷、脊髄損傷、脳卒中、脳出血、脳血栓、脳塞栓、黄斑変性、作動振顫、遅発性ジスキネジア、パニック障害、不安障害、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイマー病、てんかん、糖尿病神経障害などが例示できる。 Therefore, the astrocyte differentiation inducer and GFAP expression inducer according to the present invention can be used for the treatment of nervous system diseases, particularly central nervous system diseases. This nervous system disease includes neurodegenerative disease, neuropathy, nerve injury, encephalomyelitis, psychotic disorder, secondary neuropathy, etc., for example, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease , Progressive supranuclear palsy, multiple sclerosis, Huntington's disease, multiple system atrophy, spinocerebellar degeneration, traumatic nerve injury, spinal cord injury, stroke, cerebral hemorrhage, cerebral thrombosis, cerebral embolism, macular degeneration, working tremor, Examples include late-onset dyskinesia, panic disorder, anxiety disorder, depression, alcoholism, insomnia, mania, Alzheimer's disease, epilepsy, diabetic neuropathy and the like.
（１）ＧＦＡＰ発現誘導活性の測定
ＧＦＡＰ発現誘導活性の測定はマウス胚性幹(ＥＳ)細胞Ｊ１を用いて行った。まず、マウスＥＳ細胞の培養を行う上で必要なフィーダー細胞(マウス胎仔線維芽細胞：MEF)の培養を行った。
６ｃｍディッシュ（ＴＰＰ社）の底面を覆うように０．１％ゼラチン溶液（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、５％ＣＯ２、３７℃で、３０分静置した。その後、０．１％ゼラチン溶液を除去し、凍結保存してあるＭＥＦ（北山ラベス社）を６ｃｍディッシュ１枚辺り４×１０５個播種した。その際の培養液として、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＤＭＥＭ（Ｗａｋｏ社）を用いた。
(1) Measurement of GFAP expression induction activity Measurement of GFAP expression induction activity was performed using mouse embryonic stem (ES) cells J1. First, feeder cells (mouse fetal fibroblasts: MEF) necessary for culturing mouse ES cells were cultured.
A 0.1% gelatin solution (SIGMA) was added so as to cover the bottom of a 6 cm dish (TPP), and the mixture was allowed to stand at 37% at 5% CO 2 for 30 minutes. Thereafter, the 0.1% gelatin solution was removed, and 4 × 10 5 MEFs (Kitayama Labes Co., Ltd.) that had been stored frozen were seeded per 6 cm dish. As the culture solution at that time, DMEM (Wako) containing 10% FBS (Biowest), 1% Penicillin-Streptomycin-1-Glutamine (SIGMA) was used.
翌日、凍結保存してあるマウスＥＳ細胞をＭＥＦの上に６ｃｍディッシュ１枚辺り４×１０５個播種し、ＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を培養液の１０００倍希釈濃度で添加した。その際の培養液として、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、１％Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．１％５５ｍＭ ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＤＭＥＭを用いた。 The following day, mouse ES cells that had been cryopreserved were seeded on MEF at 4 × 10 5 per 6 cm dish, and LIF (Chemicon) was added at a 1000-fold dilution of the culture solution. As a culture solution at that time, 10% FBS (Hyclone), 1% L-Glutamine (Gibco), 1% non-essential amino acid (Gibco), 1% Penicillin / Streptomycin (Gibco), 0.1% 55 mM DMEM containing 2-Mercaptoethanol (Gibco) was used.
３日後に、６ｃｍディッシュで培養したＥＳ細胞をＰＢＳ（ＴａＫａＲａ社）で洗浄し、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ社）を加え、５分間インキュベート後、培養液を加えてから、上清を取って遠心分離（１２００ｒｐｍ、４分間）した。得られた細胞に再び培養液を加え、さらに３０分インキュベートした。その後、上清を取り、再び遠心分離（１２００ｒｐｍ、４分間）した。得られた細胞に再び培養液を加え、３０分インキュベートし上清に含まれる細胞を以降の実験で用いた。得られた細胞（１ｍｌ辺り３．７５×１０５個）を含む培地２０μｌの液滴を培養皿のふたの裏側に形成した。３日間インキュベートして胚様体（ＥＢ）を形成させた。 Three days later, ES cells cultured in a 6 cm dish were washed with PBS (TaKaRa), added with 0.25% Trypsin-EDTA (SIGMA), incubated for 5 minutes, added with the culture medium, and then the supernatant was removed. Taken and centrifuged (1200 rpm, 4 minutes). The culture solution was added to the obtained cells again and incubated for another 30 minutes. Thereafter, the supernatant was taken and centrifuged again (1200 rpm, 4 minutes). The culture solution was added again to the obtained cells, incubated for 30 minutes, and the cells contained in the supernatant were used in the subsequent experiments. Droplets of 20 μl of medium containing the obtained cells (3.75 × 10 5 cells per 1 ml) were formed on the back side of the lid of the culture dish. Incubation for 3 days allowed embryoid bodies (EBs) to form.
形成させたＥＢをピペットで回収後、２ｍｌ神経細胞用培養液（住友ベークライト社）を３５ｍｍ細菌培養用ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ社）に加え、そこにＥＢを添加した。その際に２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ社）と２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社）を培養皿に添加し、１日おきに２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＦＧＦ−２と２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＥＧＦを加え、浮遊培養を続けた。 After the formed EB was collected with a pipette, a 2 ml nerve cell culture solution (Sumitomo Bakelite) was added to a 35 mm bacterial culture dish (Thermo), and EB was added thereto. At that time, 20 ng / ml rhFGF-2 (R & D) and 20 ng / ml rhEGF (R & D) were added to the culture dish, 20 ng / ml rhFGF-2 and 20 ng / ml rhEGF were added every other day, and suspension culture was performed. Continued.
４日後、新しい６ｃｍディッシュに１ｍｌ ５０倍希釈Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ社）を添加した。１時間インキュベートした後、Ｍａｔｒｉｇｅｌを除去し、２ｍｌ ＤＭＥＭで洗浄しＥＢをｄｉｓｈに移した。その際の培養液として、２％Ｂ−２７（Ｇｉｂｃｏ社）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＦＧＦ−２、２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＥＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いた。一日おきに培地交換を行い、１０日間接着培養を続け、ＥＢの周りに放射状に増殖した神経幹細胞のみを回収し、凍結保存した。 After 4 days, 1 ml 50-fold diluted Matrigel (BD) was added to a fresh 6 cm dish. After 1 hour incubation, Matrigel was removed, washed with 2 ml DMEM and EB transferred to dish. As a culture solution at that time, Neurobasal Medium (Gibco) containing 2% B-27 (Gibco), 1% Penicillin / Streptomycin, 20 ng / ml rhFGF-2, 20 ng / ml rhEGF was used. The medium was changed every other day, and the adhesion culture was continued for 10 days. Only the neural stem cells grown radially around the EB were collected and stored frozen.
凍結保存した神経幹細胞を９６穴ディッシュに１ウエル辺り１×１０４個の密度で播種し、アストロサイト分化誘導条件下においた。培養液としては、２％Ｂ−２７、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＦＧＦ−２、２０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＥＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。その２日後に培地交換を行い、その翌日に培地を神経細胞用培養液に変更し、その際に、２．５μＭまたは１μＭの濃度でピセアタンノールおよびレスベラトロールを添加した。さらに、その２日後に培地交換を行いその翌日に以下に記述の免疫染色を行った。なお、コントロールとして、化合物を添加しないサンプルについて、平行して実験を行った。 Cryopreserved neural stem cells were seeded at a density of 1 × 10 4 per well in a 96-well dish and placed under conditions for inducing astrocyte differentiation. As a culture solution, Neurobasal Medium containing 2% B-27, 1% Penicillin / Streptomycin, 20 ng / ml rhFGF-2, 20 ng / ml rhEGF was used and cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Two days later, the medium was changed, and the medium was changed to a culture solution for nerve cells the next day. At that time, piceatannol and resveratrol were added at a concentration of 2.5 μM or 1 μM. Furthermore, the medium was changed two days later, and the immunostaining described below was performed the next day. As a control, an experiment was performed in parallel on a sample to which no compound was added.
各ウエルの培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ社）を添加し、４℃で３０分間静置し固定した。パラホルムアルデヒドを除去後、ＰＢＳで３回洗浄し０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社）、５％スキムミルク（Ｗａｋｏ社）を含むＰＢＳを添加し４℃で３０分間ブロッキングを行った。一次抗体を含む５％ スキムミルク含有ＰＢＳを添加し、４℃で一晩静置し抗原抗体反応を行った。なお、一次抗体にはマウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ抗体（ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を５００倍希釈にして用いた。 The medium in each well was removed, washed twice with PBS, 4% paraformaldehyde (Wako) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes for fixation. After removing paraformaldehyde, the plate was washed 3 times with PBS, PBS containing 0.2% Triton X-100 (Alfa Aesar) and 5% skim milk (Wako) was added, and blocking was performed at 4 ° C. for 30 minutes. PBS containing 5% skim milk containing the primary antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight for antigen-antibody reaction. As the primary antibody, a mouse monoclonal anti-GFAP antibody (Chemicon) was diluted 500 times and used.
一次抗体を除去し、５％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液で３回洗浄を行った。溶液を除去後、蛍光標識した二次抗体を含む５％スキムミルク含有ＰＢＳを添加し室温で３０分間静置した。なお、二次抗体にはｃｈｒｏｍｅｏ４８８標識ゴートポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体 （Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）を２００倍希釈で使用した。 The primary antibody was removed, and washing was performed 3 times with a PBS solution containing 5% skim milk. After removing the solution, 5% skim milk-containing PBS containing a fluorescently labeled secondary antibody was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. As the secondary antibody, a chroma488-labeled goat polyclonal anti-mouse IgG antibody (Active Motif) was used at a 200-fold dilution.
二次抗体を除去し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳで３回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を１０００倍希釈で添加した。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を使用し、各条件あたり８ウエルについて、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性細胞数とＧＦＡＰ陽性細胞数の数をカウントした。各化合物を２．５μＭ添加したサンプルの観察写真例を図１に示す。 After removing the secondary antibody and washing 3 times with PBS containing 0.2% Triton X-100, Hoechst 33342 (DOJINDO) was added at a 1000-fold dilution. Using a fluorescence microscope (Olympus), the number of Hoechst 33342 positive cells and GFAP positive cells was counted for 8 wells for each condition. An example of an observation photograph of a sample added with 2.5 μM of each compound is shown in FIG.
ＧＦＡＰはアストロサイト分化マーカーとして広く知られている（Kimelbrg, Neurochem Int., 2004, 45, 191-202）。また、アストロサイトは複数の突起を周囲に伸ばす形態を成している（Bushong et al, Int J Dev Neurosci., 2004, 22, 73-86）。本発明ではこれらをアストロサイトの指標とし、ＧＦＡＰ陽性かつアストロサイトに特徴的な形態を示す細胞（図２に典型的な一例を示す）の数を数え、（ＧＦＡＰ陽性細胞数）／（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性細胞数）の平均値をＧＦＡＰ陽性率またはアストロサイト分化率として算出した（図３）。また、コントロールのＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞数を１００としたときの、各サンプルのＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞数の割合を、細胞生存率として算出した（図４）。 GFAP is widely known as an astrocyte differentiation marker (Kimelbrg, Neurochem Int., 2004, 45, 191-202). In addition, astrocytes form a plurality of protrusions extending around (Bushong et al, Int J Dev Neurosci., 2004, 22, 73-86). In the present invention, these are used as indicators of astrocytes, and the number of cells (typical example shown in FIG. 2) that are GFAP-positive and characteristic of astrocytes is counted, and (number of GFAP-positive cells) / (Hoechst 33342 positive) The average value of the number of cells was calculated as a GFAP positive rate or an astrocyte differentiation rate (FIG. 3). Further, the ratio of the number of Hoechst positive cells in each sample when the number of control Hoechst positive cells was 100 was calculated as the cell viability (FIG. 4).
（２）ＧＦＡＰ発現誘導活性の測定結果（図３）
ピセアタンノール（pice）は、２．５μＭにおいて、コントロール（control）と比較してＧＦＡＰ陽性率またはアストロサイト分化率が有意に（１９％）増加した。一方、レスベラトロール（res）は有意な変化を与えなかった。このように、ピセアタンノールは、神経幹細胞に対して、レスベラトロールより強いＧＦＡＰ発現誘導能及びアストロサイト分化誘導能を有する。
(2) GFAP expression induction activity measurement results (FIG. 3)
Piceatannol (pice) significantly increased (19%) the GFAP positive rate or astrocyte differentiation rate at 2.5 μM compared to the control. On the other hand, resveratrol (res) did not change significantly. Thus, piceatannol has a stronger ability to induce GFAP expression and astrocyte differentiation than resveratrol against neural stem cells.
（３）細胞生存率の測定結果（図４）
ピセアタンノール（pice）およびレスベラトロール（res）は１μＭ及び２．５μＭの濃度で細胞生存率を減少させず、むしろ細胞数を増加させる傾向にあった。このように、これらの濃度では各化合物の細胞毒性は無い。
（４）in vivoにおけるアストロサイト分化誘導
成体では、海馬や側脳室で神経幹細胞の増殖が認められている。本実施例では、成体マウスの海馬において、ピセアタンノールがアストロサイト分化誘導能を有することを示す。
９週齢の雄マウス(BALB/cByJJcl、日本クレア、ｎ＝４)に対し、１４日間にわたって、毎日３、１０ｍｇ／ｋｇ体重の量のピセアタンノールを経口投与した。なお、ピセアタンノールは、０．５％ＣＭＣ中０．３７５ｍｇ／ｍＬあるいは１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた溶液を用いた。コントロールとして、ピセアタンノールを溶解させていないＣＭＣを投与した。１４日後、頸椎脱臼して３分以内に大脳を摘出し、氷冷した金属板上に移して海馬を単離・凍結した。その後、ＲＮＡを抽出し、逆転写を行ってｃＤＮＡを得、リアルタイムＰＣＲを行うことで、海馬におけるアストロサイトの分化マーカーであるGfap遺伝子の発現解析を行った。発現量はGapdh遺伝子を内部標準として揃えた後、各個体ごとにトリプレットでＰＣＲを行って個体ごとの発現量を決定し、４個体の発現量の平均値±標準偏差をグラフに示した（図５）。その結果、10 mg/kg体重 で投与したマウスにおいて、コントロールと比較してGfap遺伝子の発現レベルの有意な上昇（p=0.015）が確認された。
このように、ピセアタンノールは、in vivoにおいてもアストロサイト分化誘導能を有する。
(3) Measurement results of cell viability (FIG. 4)
Piceatannol (pice) and resveratrol (res) did not decrease cell viability at concentrations of 1 μM and 2.5 μM, but rather tended to increase cell number. Thus, there is no cytotoxicity of each compound at these concentrations.
(4) In vivo astrocyte differentiation induction In adults, proliferation of neural stem cells has been observed in the hippocampus and lateral ventricles. This example shows that piceatannol has the ability to induce astrocyte differentiation in the hippocampus of adult mice.
9-week-old male mice (BALB / cByJJcl, Nippon Claire, n = 4) were orally administered daily with piceatannol in an amount of 3, 10 mg / kg body weight for 14 days. As for piceatannol, a solution in which 0.375 mg / mL or 1.25 mg / mL in 0.5% CMC was dissolved was used. As a control, CMC in which piceatannol was not dissolved was administered. After 14 days, the cerebrum was dissected within 3 minutes after dislocation of the cervical spine, and transferred to an ice-cooled metal plate to isolate and freeze the hippocampus. Subsequently, RNA was extracted, reverse transcription was performed to obtain cDNA, and real-time PCR was performed to analyze the expression of the Gfap gene, which is a differentiation marker for astrocytes in the hippocampus. After the Gapdh gene was used as an internal standard, the expression level was determined by PCR using a triplet for each individual, and the expression level for each individual was determined. 5). As a result, in the mice administered at 10 mg / kg body weight, a significant increase (p = 0.015) in the expression level of the Gfap gene was confirmed as compared with the control.
Thus, piceatannol has the ability to induce astrocyte differentiation even in vivo.
Claims (5)
ピセアタンノールを有効成分として含有するアストロサイト分化誘導剤。 An astrocyte differentiation inducer that induces differentiation of neural stem cells into astrocytes at a high rate,
An astrocyte differentiation inducer containing piceatannol as an active ingredient.
ピセアタンノールを有効成分として含有するＧＦＡＰ発現誘導剤。 A GFAP expression inducer that induces GFAP expression at a high rate in neural stem cells,
A GFAP expression inducer containing piceatannol as an active ingredient.
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