JP2016082923A - Escherichia coli variant, extract, acellular protein synthesis reaction solution, stable isotope-labeled protein synthesis kit, and production method of stable isotope-labeled protein - Google Patents

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松田　夏子
Natsuko Matsuda
夏子 松田
木川　隆則
Takanori Kikawa
隆則 木川
松田　貴意
Takai Matsuda
貴意 松田
順 横山
Jun Yokoyama
順 横山
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Taiyo Nippon Sanso Corp
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an extract for simply synthesizing a strictly stable isotope-labeled protein, an acellular protein synthesis reaction solution, a stable isotope-labeled protein synthesis kit, and a production method of the stable-isotope labeled protein, as well as an Escherichia coli cell body used for them.SOLUTION: The Escherichia coli variant of the invention is characterized by that the enzymatic activity of two or more metabolic enzymes selected from the group consisting of asparaginase, serine deaminase, glutamine synthetase, γ-glutamyl cysteine synthetase, aspartate ammonia lyase, asparagine synthetase, arginine decarboxylase, and tryptophanase is lowered or inactivated.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、大腸菌変異体、抽出液、無細胞タンパク質合成反応液、安定同位体標識タンパク質合成キット、安定同位体標識タンパク質の製造方法、及び、大腸菌変異体の培養方法に関する。   The present invention relates to an E. coli mutant, an extract, a cell-free protein synthesis reaction solution, a stable isotope-labeled protein synthesis kit, a method for producing a stable isotope-labeled protein, and a method for culturing an E. coli mutant.

様々なタンパク質が持つ多様な生体機能は、その固有のアミノ酸配列とそれに起因する立体構造に基づくことが知られており、個々のタンパク質の立体構造を知ることは、それらの生体機能を知る上で極めて重要である。タンパク質の立体構造情報は、医学、生物学的基礎研究としての生命理解を深めるとともに、重要な疾患に関わる知見を与え、医薬品開発にも大きく貢献している。
また、タンパク質工学による有用な酵素作出のための基盤情報として活用されるなど、産業応用可能な重要な知的財産として広く利用されている。 Various biological functions possessed by various proteins are known to be based on their unique amino acid sequences and the resulting three-dimensional structures. Knowing the three-dimensional structures of individual proteins is important for understanding their biological functions. Very important. Protein three-dimensional structure information contributes to drug development by deepening understanding of life as basic medical and biological research, as well as providing knowledge related to important diseases.
In addition, it is widely used as an important intellectual property applicable to industries, such as being used as basic information for the production of useful enzymes by protein engineering.

現在、タンパク質の立体構造を解析する手段として、タンパク質の結晶を用いるＸ線回折法が主流であるが、結晶化が困難なタンパク質も少なくない。また、Ｘ線回折法では、結晶状態での構造決定に限られ、この結晶構造は、タンパク質が実際に生体機能を発現する溶液状態と異なることから、核磁気共鳴分光分析法（ＮＭＲ法）による構造解析が注目を集めている。   Currently, X-ray diffraction using protein crystals is the mainstream as a means for analyzing the three-dimensional structure of proteins, but there are many proteins that are difficult to crystallize. In addition, the X-ray diffraction method is limited to the structure determination in the crystal state, and this crystal structure is different from the solution state in which the protein actually expresses the biological function, so that the nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR method) is used. Structural analysis is attracting attention.

ＮＭＲ法は、タンパク質分子が自由に動き回ることのできる溶液状態での解析が可能であることから、Ｘ線回折法による静的環境とは異なる構造情報を得ることができる。特に動的構造を伴う分子間相互作用などの構造解析に有効とされており、Ｘ線回折法により得られる構造情報を補完することで、より実用的な機能構造情報を得ることが可能になる。   Since the NMR method enables analysis in a solution state in which protein molecules can move freely, structural information different from the static environment by the X-ray diffraction method can be obtained. It is especially effective for structural analysis such as intermolecular interaction with dynamic structure, and it becomes possible to obtain more practical functional structure information by complementing the structural information obtained by X-ray diffraction method. .

このように、ＮＭＲ法は、結晶化が不要で、溶液状態での動的構造情報を得られる有用な手法であるが、その一方で課題もある。それは、一般に構造決定可能な分子量が概ね１−２万に限られることである。
近年、この課題を解決するため、様々な改良、改善がなされてきた。例えば、ＮＭＲで検出可能な安定同位体核種である１３Ｃ、１５Ｎをタンパク質に標識する技術、多次元多核種ＮＭＲ測定技術、ハードウェア、ソフトウェアの改良などである。これらの技術開発により、最近では分子量２−２．５万程度のタンパク質の立体構造を決定できるようになってきている。
また、最近ではタンパク質を構成するアミノ酸の適切な部位に立体選択的に安定同位体を導入したＮＭＲ法に最適化されたＳＡＩＬ（Ｓｔｅｒｅｏ−ａｒｒａｙ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ;立体整列同位体標識)アミノ酸が開発され，これらを駆使することで、解析対象は分子量４−５万程度まで拡大した（非特許文献１、特許文献１参照。）。
さらに、近年カナダのＮＭＲ研究グループにより、タンパク質の疎水性コアを形成するアミノ酸残基のうち，ロイシン、バリン、イソロイシンのメチル基のみを選択的に１３ＣＨ３にし、残りの水素を全て重水素化することにより分子量１０万を超える高分子量タンパク質の構造解析に成功している（非特許文献２、３参照。）。
また、ＮＭＲ法による構造解析の際、アミノ酸毎のシグナルの帰属を容易にする目的で、培養液中に特定の安定同位体標識アミノ酸を添加し、アミノ酸選択的に標識する方法なども検討されている（非特許文献５参照。）。
このように、タンパク質分子内にＮＭＲで測定可能な安定同位体核種を適切に配することで、従来ＮＭＲ法では困難であった高分子量のタンパク質の構造解析が可能であることが示された。 As described above, the NMR method is a useful technique that does not require crystallization and can obtain dynamic structure information in a solution state. In general, the molecular weight that can be determined is generally limited to 1 to 20,000.
In recent years, various improvements and improvements have been made to solve this problem. For example, there are techniques for labeling 13 C and 15 N, which are stable isotope nuclides detectable by NMR, to proteins, multidimensional multi-nuclide NMR measurement techniques, hardware, and software improvements. With these technological developments, it has recently become possible to determine the three-dimensional structure of a protein having a molecular weight of about 2-25,000.
Recently, SAIL (Stereo-array isotopic labeling) amino acids optimized for NMR methods in which stable isotopes are stereoselectively introduced into appropriate sites of amino acids constituting proteins have been developed. By making full use of these, the object of analysis was expanded to a molecular weight of about 450,000 (see Non-Patent Document 1 and Patent Document 1).
Furthermore, in recent years, a Canadian NMR research group has selectively changed the methyl group of leucine, valine, and isoleucine to 13 CH 3 among the amino acid residues that form the hydrophobic core of proteins, and all the remaining hydrogens are deuterated. By doing so, the structure analysis of high molecular weight protein having a molecular weight exceeding 100,000 has been successfully performed (see Non-Patent Documents 2 and 3).
In addition, for the purpose of facilitating assignment of signals for each amino acid during structural analysis by NMR method, a method of adding a specific stable isotope-labeled amino acid to the culture medium and selectively labeling the amino acid has been studied. (See Non-Patent Document 5).
Thus, it was shown that structural analysis of high molecular weight proteins, which was difficult with conventional NMR methods, can be achieved by appropriately arranging stable isotope nuclides that can be measured by NMR in protein molecules.

ＮＭＲ法によるタンパク質の構造解析用に安定同位体標識タンパク質を調製する場合、一般に安定同位体標識されたブドウ糖（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−１３Ｃ６;１３Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）および塩化アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ−１５Ｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ;１５ＮＨ３Ｃｌ）を含む無機培地で遺伝子組換え大腸菌等を培養することにより安定同位体標識タンパク質を得ることができる（非特許文献４参照。）。この場合、得られるタンパク質の全ての炭素および窒素が、１３Ｃ、１５Ｎ標識されており、ＮＭＲ測定において良好なシグナルとして、タンパク質を構成する炭素、窒素を高感度に計測することが可能となる。 When preparing stable isotope-labeled proteins for structural analysis of proteins by NMR method, generally stable isotope-labeled glucose (D-glucose- 13 C 6 ; 13 C 6 H 12 O 6 ) and ammonium chloride (Ammonium- A stable isotope-labeled protein can be obtained by culturing genetically modified Escherichia coli or the like in an inorganic medium containing 15 N chloride ( 15 NH 3 Cl) (see Non-Patent Document 4). In this case, all carbon and nitrogen of the obtained protein are labeled with 13 C and 15 N, and it becomes possible to measure carbon and nitrogen constituting the protein with high sensitivity as a good signal in NMR measurement. .

しかしながら，全ての炭素、窒素を安定同位体標識する方法では、高分子量タンパク質では多くのシグナルが重なってしまい、解析が困難である。そこで、上述のようにＮＭＲ法に最適化されたＳＡＩＬアミノ酸やメチル選択的標識およびアミノ酸選択標識など、部位特異的に安定同位体を導入したアミノ酸を効率的にタンパク質に導入する技術が求められている。   However, in the method of stable isotope labeling of all carbon and nitrogen, many signals are overlapped with high molecular weight proteins, and analysis is difficult. Therefore, there is a need for a technique for efficiently introducing amino acids into which stable isotopes have been introduced in a site-specific manner, such as SAIL amino acids, methyl-selective labels, and amino acid-selective labels optimized for NMR methods as described above. Yes.

アミノ酸選択的および部位特異的安定同位体標識アミノ酸をタンパク質に導入する方法として、アミノ酸やアミノ酸前駆体を無機培地に添加し、それが細胞内に取り込まれることで安定同位体標識タンパク質を調製するという方法が提案されている（非特許文献２、３、５参照。）。
しかしながら、この方法では、細胞内に取り込まれた安定同位体標識アミノ酸やその前駆体が生命維持に関わるさまざまな代謝を受け、他のアミノ酸等へ安定同位体が流れてしまうという問題があった。せっかくアミノ酸選択的標識や高価な部位特異的安定同位体標識アミノ酸等でタンパク質を合成したとしても、この方法では、タンパク質の適切な部位に正確かつ効率的に導入することはできなかった。 As a method for introducing amino acid-selective and site-specific stable isotope-labeled amino acids into proteins, an amino acid or amino acid precursor is added to an inorganic medium, which is incorporated into cells to prepare stable isotope-labeled proteins. A method has been proposed (see Non-Patent Documents 2, 3, and 5).
However, this method has a problem in that stable isotope-labeled amino acids and precursors incorporated into cells undergo various metabolisms related to life support, and stable isotopes flow to other amino acids. Even if a protein is synthesized with an amino acid-selective label or an expensive site-specific stable isotope-labeled amino acid, this method cannot accurately and efficiently introduce the protein into an appropriate site of the protein.

ただし、一部の代謝を受けにくい特徴的なアミノ酸前駆体については実用的な標識が可能である。トロント大学のルイス・ケイらは、疎水性アミノ酸であるロイシン、バリン、イソロイシンのそれぞれの前駆体であるα-ケトブチル酸及びα-ケトイソバレニン酸のメチル基を１３ＣＨ３にし、その他の炭素及び水素をそれぞれ１２Ｃと重水素（Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ；２Ｈ）にしたものを無機培地に添加することで、ロイシン、バリン、イソロイシンのメチル基選択的な１３Ｃ標識を達成している（非特許文献２、３参照。）。しかし、本方法はロイシン、バリン、イソロイシンという特徴的な前駆体を持つ疎水性アミノ酸に限られ、様々な代謝を受けることから他のアミノ酸への適用は困難である。 However, some characteristic amino acid precursors that are not easily metabolized can be labeled practically. Lewis Kay et al. At the University of Toronto changed the methyl groups of α-ketobutyric acid and α-ketoisovalenic acid precursors of the hydrophobic amino acids leucine, valine, and isoleucine to 13 CH 3 and other carbons and hydrogens. Addition of 12 C and deuterium (Deuterium; 2 H) to an inorganic medium achieves methyl group-selective 13 C labeling of leucine, valine, and isoleucine (Non-Patent Documents 2 and 3). reference.). However, this method is limited to hydrophobic amino acids having characteristic precursors such as leucine, valine, and isoleucine, and since it undergoes various metabolisms, it is difficult to apply to other amino acids.

これらの課題を解決するため開発されたものが無細胞タンパク質合成系を用いた安定同位体標識タンパク質調製方法である（非特許文献６、特許文献２参照。）。無細胞タンパク質合成とは、細胞の抽出液を用い、試験管内でタンパク質を合成する技術であり、生細胞と異なり、添加したアミノ酸が様々な生命維持に関わる代謝を受けることなくタンパク質に取り込まれるという特徴を有する。すなわち、アミノ酸選択的および部位特異的標識アミノ酸を無細胞タンパク質合成系内に添加することで、非常に効率的かつ適切な部位に安定同位体を目的タンパク質に導入することが可能となる（非特許文献７参照。）。   What has been developed to solve these problems is a method for preparing a stable isotope-labeled protein using a cell-free protein synthesis system (see Non-Patent Document 6 and Patent Document 2). Cell-free protein synthesis is a technology that uses cell extracts to synthesize proteins in vitro. Unlike living cells, added amino acids are incorporated into proteins without undergoing various life-supporting metabolisms. Has characteristics. That is, by adding amino acid-selective and site-specific labeled amino acids into a cell-free protein synthesis system, it is possible to introduce a stable isotope into a target protein at a very efficient and appropriate site (non-patented). Reference 7).

しかしながら、この無細胞タンパク質合成系による標識タンパク質調製法においても細胞抽出液に含まれるアミノ酸等代謝酵素による安定同位体標識アミノ酸の代謝反応を完全には抑えることができていない。
そこで、無細胞タンパク質合成系による安定同位体標識アミノ酸の代謝反応を抑えるために、反応液内にアミノ酸代謝阻害剤を添加する方法が開発された（特許文献３、非特許文献８参照。）。特に発明者らは、無細胞タンパク質合成系内のアミノ酸や有機酸等の代謝反応の詳細を高感度なアミノ酸分析計や質量分析計を用いて調査した。その結果、アミノ酸代謝に関わる各種酵素反応が無細胞タンパク質合成系内で起こることを見いだした。その後、それぞれの酵素反応に特異的な酵素阻害剤６種類を添加することで、目的の安定同位体標識を正確に効率よく導入することに成功した。 However, even in this labeled protein preparation method using a cell-free protein synthesis system, the metabolic reaction of stable isotope-labeled amino acids by metabolic enzymes such as amino acids contained in cell extracts cannot be completely suppressed.
Therefore, in order to suppress the metabolic reaction of stable isotope-labeled amino acids by the cell-free protein synthesis system, a method of adding an amino acid metabolism inhibitor in the reaction solution has been developed (see Patent Document 3 and Non-Patent Document 8). In particular, the inventors investigated the details of metabolic reactions such as amino acids and organic acids in the cell-free protein synthesis system using a highly sensitive amino acid analyzer or mass spectrometer. As a result, we found that various enzyme reactions related to amino acid metabolism occur in a cell-free protein synthesis system. Subsequently, by adding six kinds of enzyme inhibitors specific to each enzyme reaction, the target stable isotope label was successfully introduced accurately and efficiently.

国際公開第０３／０５３９１０号International Publication No. 03/053910 特許第３３１７９８３号公報Japanese Patent No. 3317983 特許第３１４５４３１号公報Japanese Patent No. 3145431

Ｋａｉｎｏｓｈｏ, Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００６) ｖｏｌ．４４０，ｐｐ．５２−５７．Kainosho, M .; , Et. al. , Nature, (2006) vol. 440, pp. 52-57. Ｒｏｓｅｎ， Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.，(１９９６)ｖｏｌ．２６３，ｐｐ．６２７−６３６．Rosen, M.M. , Et. al. , J .; Mol. Biol., (1996) vol. 263, pp. 627-636. Ｔｕｇａｒｉｎｏｖ，Ｖ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００３) ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１３８６８−１３８７８．Tugarinov, V.M. , Et. al. , J .; Am. Chem. Soc. , (2003) vol. 125, pp. 13868-13878. Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．,(１９９４) ｖｏｌ．９１，ｐｐ．１１３４３−１１３４７.Szyperski, T .; , Et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , (1994) vol. 91, pp. 11343-11347. Ｔａｎｉｏ,Ｍ．, ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（２００８) ｖｏｌ．３８６ ，ｐｐ．１５６−１６０.Tanio, M .; , et. al. , Anal. Biochem. , (2008) vol. 386, pp. 156-160. Ｋｉｇａｗａ, Ｔ．,ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，（１９９９) ｖｏｌ．４４２, ｐｐ．１５−１９.Kigawa, T .; , et. al. , FEBS Letter, (1999) vol. 442, pp. 15-19. Ｋｉｇａｗａ, Ｔ,ｅｔ．ａｌ．，Ｊ.Ｂｉｏｍｏｌ. ＮＭＲ （１９９５) ｖｏｌ．６, ｐｐ．１２９−１３４．Kigawa, T, et. al. , J. Biomol. NMR (1995) vol. 6, pp. 129-134. Ｙｏｋｏｙａｍａ,Ｊ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（２０１１) ｖｏｌ． ４１１(２)， ｐｐ．２２３−２２９．Yokoyama, J. et al. , Et. al. , Anal. Biochem. , (2011) vol. 411 (2), pp. 223-229.

しかし、アミノ酸代謝阻害剤を用いる方法では、一部の阻害剤が市販されておらず、危険性の高い原料および反応を経て合成する必要があった。また、阻害剤添加によりタンパク質の合成量が減少するという問題があった。   However, in the method using an amino acid metabolism inhibitor, some inhibitors are not commercially available, and it has been necessary to synthesize them through highly dangerous raw materials and reactions. In addition, there is a problem that the amount of protein synthesis decreases due to the addition of an inhibitor.

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に合成するための抽出液、無細胞タンパク質合成反応液、安定同位体標識タンパク質合成キット、及び安定同位体標識タンパク質の製造方法、並びに、それらに用いる大腸菌変異体を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of the above circumstances, and includes an extract, a cell-free protein synthesis reaction solution, a stable isotope-labeled protein synthesis kit, and a stable for simply synthesizing a strict stable isotope-labeled protein. It is an object of the present invention to provide a method for producing an isotope-labeled protein, and an Escherichia coli mutant used therein.

本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わる代謝酵素の酵素活性を低下又は失活させた大腸菌変異体を作製することにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１２）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、及びトリプトファナーゼからなる群から選ばれる二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活していることを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ｇｓｈＡ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、ａｓｎＢ遺伝子、ｓｐｅＡ遺伝子、及びｔｎａＡ遺伝子からなる群から選ばれる二種以上の遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が置換又は欠損していることが好ましい。
（３）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることが好ましい。
（４）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることが好ましい。
（５）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることが好ましい。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive research, and as a result, produced an E. coli mutant in which the enzyme activity of a metabolic enzyme involved in the metabolism of a stable isotope-labeled amino acid is reduced or inactivated. It was found that can be solved. One embodiment of the present invention provides the following (1) to (12).
(1) The Escherichia coli mutant in one embodiment of the present invention comprises asparaginase, serine deaminase, glutamine synthetase, γ-glutamylcysteine synthetase, aspartate ammonia lyase, asparagine synthetase, arginine decarboxylase, and tryptophanase. The enzyme activity of two or more kinds of metabolic enzymes selected from the group is reduced or inactivated.
(2) The Escherichia coli mutant in one embodiment of the present invention comprises ansA gene, ansB gene, sdaA gene, sdaB gene, glnA gene, gshA gene, aspA gene, asnA gene, asnB gene, speA gene, and tnaA gene. In two or more genes selected from the group, it is preferable that at least a part of the bases in each gene is substituted or deleted.
(3) The Escherichia coli mutant according to one embodiment of the present invention lacks at least a part of bases in each gene in all genes of the group consisting of ansA gene, ansB gene, asnA gene, and asnB gene. Preferably it is.
(4) The Escherichia coli mutant in one embodiment of the present invention is an all-gene group consisting of ansA gene, ansB gene, sdaA gene, sdaB gene, glnA gene, asnA gene, and asnB gene. It is preferable that at least a part of the base is missing.
(5) The Escherichia coli mutant according to one embodiment of the present invention includes all the genes in the group consisting of ansA gene, ansB gene, sdaA gene, sdaB gene, glnA gene, aspA gene, asnA gene, and asnB gene. It is preferable that at least a part of the base in the gene is missing.

（６）本発明の一実施態様における抽出液は、先に記載の大腸菌変異体より抽出されたことを特徴とする。
（７）本発明の一実施態様における無細胞タンパク質合成反応液は、先に記載の抽出液を含有することを特徴とする。
（８）本発明の一実施態様における無細胞タンパク質合成反応液は、更に、アミノオキシ酢酸、Ｌ−メチオニンスルホキシイミン、Ｌ−ブチオニンスルホキシイミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、５−ジアゾ−４−オキソ−Ｌ−ノルバリン、Ｓ−メチル−Ｌ−システインスルホキシイミン、及びＤ−リンゴ酸からなる群から選ばれる一種以上のアミノ酸代謝阻害剤を含有することが好ましい。
（９）本発明の一実施態様における安定同位体標識タンパク質合成キットは、先に記載の無細胞タンパク質合成反応液を含有することを特徴とする。
（１０）本発明の一実施態様における安定同位体標識タンパク質の製造方法は、先に記載の無細胞タンパク質合成反応液を用いることを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様における大腸菌変異体の培養方法は、先に記載の大腸菌変異体をグルタミン含有培地で培養することを特徴とする。
（１２）本発明の一実施態様における大腸菌変異体の培養方法は、前記グルタミン含有培地が、更にピルビン酸ナトリウムを含有することが好ましい。 (6) The extract in one embodiment of the present invention is characterized by being extracted from the aforementioned Escherichia coli mutant.
(7) The cell-free protein synthesis reaction liquid in one embodiment of the present invention is characterized by containing the above-described extract.
(8) The cell-free protein synthesis reaction solution according to one embodiment of the present invention may further include aminooxyacetic acid, L-methionine sulfoximine, L-butionine sulfoximine, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine It is preferable to contain one or more amino acid metabolism inhibitors selected from the group consisting of 5-diazo-4-oxo-L-norvaline, S-methyl-L-cysteinesulfoximine, and D-malic acid.
(9) A stable isotope labeled protein synthesis kit according to an embodiment of the present invention is characterized by containing the cell-free protein synthesis reaction solution described above.
(10) The method for producing a stable isotope-labeled protein in one embodiment of the present invention is characterized by using the cell-free protein synthesis reaction solution described above.
(11) The method for culturing an E. coli mutant according to one embodiment of the present invention is characterized in that the E. coli mutant described above is cultured in a glutamine-containing medium.
(12) In the method for culturing an Escherichia coli variant in one embodiment of the present invention, the glutamine-containing medium preferably further contains sodium pyruvate.

本発明によれば、厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に得られる。   According to the present invention, a strict stable isotope labeled protein can be easily obtained.

アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。It is a diagram showing an isotope involved in dilute acid metabolism and its inhibitor upon amino selectively 15 N-labeled. アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。It is a diagram showing an isotope involved in dilute acid metabolism and its inhibitor upon amino selectively 15 N-labeled. アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。It is a diagram showing an isotope involved in dilute acid metabolism and its inhibitor upon amino selectively 15 N-labeled. アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。It is a diagram showing an isotope involved in dilute acid metabolism and its inhibitor upon amino selectively 15 N-labeled. アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。It is a diagram showing an isotope involved in dilute acid metabolism and its inhibitor upon amino selectively 15 N-labeled. 実施例１におけるＰＣＲの結果を示した図である。FIG. 3 shows the results of PCR in Example 1. 実施例１における大腸菌の増殖速度比較の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the growth rate comparison of colon_bacillus | E._coli in Example 1. FIG. 実施例１における大腸菌の増殖速度比較の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the growth rate comparison of colon_bacillus | E._coli in Example 1. FIG. 実施例１におけるＮＭＲ測定の結果を示した図である。2 is a diagram showing the results of NMR measurement in Example 1. FIG. 実施例１におけるＮＭＲ測定の結果を示した図である。2 is a diagram showing the results of NMR measurement in Example 1. FIG. 実施例１におけるＮＭＲ測定の結果を示した図である。2 is a diagram showing the results of NMR measurement in Example 1. FIG. 実施例１におけるＮＭＲ測定の結果を示した図である。2 is a diagram showing the results of NMR measurement in Example 1. FIG. 実験例２におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの活性測定の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the activity measurement of the chloramphenicol acetyltransferase in Experimental example 2. FIG. 実施例３におけるＰＣＲの結果を示した図である。It is the figure which showed the result of PCR in Example 3. 実施例３における大腸菌の増殖速度比較の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the growth rate comparison of Escherichia coli in Example 3. 実施例４におけるアミノ酸分析の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the amino acid analysis in Example 4. 実施例４におけるアミノ酸分析の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the amino acid analysis in Example 4.

≪大腸菌変異体≫
本発明の大腸菌変異体は、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、及びトリプトファナーゼからなる群から選ばれる二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活している変異体である。
本発明において、「酵素活性が低下又は失活している」とは、本発明の大腸菌変異体の酵素活性が、対応する野生型の代謝酵素の酵素活性に対して相対的に低下又は失活していることを意味する。 ≪Escherichia coli mutant≫
The Escherichia coli mutant of the present invention is at least two selected from the group consisting of asparaginase, serine deaminase, glutamine synthetase, γ-glutamylcysteine synthetase, aspartate ammonia lyase, asparagine synthetase, arginine decarboxylase, and tryptophanase. This is a mutant in which the enzyme activity of the metabolic enzyme is reduced or inactivated.
In the present invention, “the enzyme activity is reduced or inactivated” means that the enzyme activity of the E. coli mutant of the present invention is relatively decreased or inactivated relative to the enzyme activity of the corresponding wild-type metabolic enzyme. Means that

本発明者らは、無細胞タンパク質合成系内のアミノ酸や有機酸等の代謝反応の詳細を高感度なアミノ酸分析計や質量分析計を用いて調査したところ、図１〜図５に示すようなアミノ酸代謝に関わる酵素反応が無細胞タンパク質合成系内で起こることを見出した（Ｙｏｋｏｙａｍａ,Ｊ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（２０１１) ｖｏｌ． ４１１（２），ｐｐ．２２３−２２９．参照。）。図１〜図５中、ＡＯＡ:はアミノオキシ酢酸を示し、ＤＯＮ:は６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンを示し、ＤＯＮＶ:は５−ジアゾ−４−オキソ−Ｌ−ノルバリンを示し、ＭＳはＬ−メチオニンスルホキシイミンを示し、ＳＭＣＳはＳ−メチル−Ｌ−システインスルホキシイミンを示し、ＢＳＯはＬ−ブチオニンスルホキシイミンを示し、Ｄ−ＭａｌａｔｅはＤ−リンゴ酸を示す。
無細胞タンパク質合成系内の代謝酵素として、上述したアスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、トリプトファナーゼ等が挙げられる。かかる酵素の中から二種以上の代謝酵素を選択し、選択した代謝酵素の酵素活性を低下又は失活させた大腸菌変異体を用いて安定同位体標識タンパク質を製造することにより、安定同位体標識したアミノ酸が代謝されて目的以外のアミノ酸に変化することを防ぐことができる。 The present inventors investigated the details of metabolic reactions such as amino acids and organic acids in the cell-free protein synthesis system using a highly sensitive amino acid analyzer or mass spectrometer, and as shown in FIGS. It has been found that an enzyme reaction related to amino acid metabolism occurs in a cell-free protein synthesis system (Yokoyama, J., et.al., Anal. Biochem., (2011) vol. 411 (2), pp. 223-229. .reference.). 1 to 5, AOA: indicates aminooxyacetic acid, DON: indicates 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DONV: indicates 5-diazo-4-oxo-L-norvaline, MS indicates L-methionine sulphoximine, SMCS indicates S-methyl-L-cysteine sulphoximine, BSO indicates L-butionine sulphoximine, and D-Malate indicates D-malic acid.
Examples of metabolic enzymes in the cell-free protein synthesis system include asparaginase, serine deaminase, glutamine synthetase, γ-glutamylcysteine synthetase, aspartate ammonia lyase, asparagine synthetase, arginine decarboxylase, and tryptophanase. Stable isotope labeling is achieved by selecting two or more metabolic enzymes from these enzymes and producing a stable isotope-labeled protein using an E. coli mutant in which the enzyme activity of the selected metabolic enzyme is reduced or inactivated. It is possible to prevent the amino acid from being metabolized and changing to a non-target amino acid.

大腸菌中の代謝酵素の酵素活性を低下又は失活させる方法としては、該代謝酵素をコードする大腸菌の染色体ＤＮＡの少なくとも一部の塩基を置換又は欠損させる方法、該染色体ＤＮＡに挿入配列を組み込み、フレームシフトを引き起こさせる方法、該代謝酵素のドミナントネガティブ型を一過的又は安定的に大腸菌に過剰発現させる方法等が挙げられる。
これらの中でも、該代謝酵素をコードする大腸菌の染色体ＤＮＡの少なくとも一部の塩基を置換又は欠損させる方法が好ましい。 As a method for reducing or inactivating the enzymatic activity of a metabolic enzyme in E. coli, a method for substituting or deleting at least a part of the chromosomal DNA of E. coli encoding the metabolic enzyme, an insertion sequence is incorporated into the chromosomal DNA, Examples thereof include a method for causing a frame shift and a method for transiently or stably overexpressing a dominant negative form of the metabolic enzyme in E. coli.
Among these, a method of substituting or deleting at least a part of bases of chromosomal DNA of Escherichia coli encoding the metabolic enzyme is preferable.

大腸菌の染色体ＤＮＡを欠損させる方法としては、相同組換えを利用した方法が挙げられる。相同組換えを利用した方法としては、大腸菌の染色体ＤＮＡ上において欠損させたい遺伝子又はＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡ断片を、該大腸菌内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドＤＮＡと連結した相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。該相同組換え用プラスミドを常法により大腸菌内に導入した後、薬剤耐性を指標にして、相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株が選択される。   Examples of the method for deleting the chromosomal DNA of E. coli include a method using homologous recombination. As a method utilizing homologous recombination, a gene to be deleted on the chromosomal DNA of Escherichia coli or a DNA fragment existing on both outer sides of the DNA was ligated with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the Escherichia coli. Examples thereof include a method using a plasmid for homologous recombination. After introducing the plasmid for homologous recombination into Escherichia coli by a conventional method, a transformant in which the plasmid for homologous recombination is incorporated into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.

また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換又は付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法が挙げられる。
具体的には、染色体ＤＮＡ上において欠損させたい遺伝子又はＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡ断片を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせる方法が挙げられる。当該方法は、上述した代謝酵素をコードする遺伝子群の中から二種以上の遺伝子を欠損させた欠損株を作製する際に適している。
遺伝子欠損方法は、様々な技術や関連製品が販売されており、何れの方法を採用しても構わない。遺伝子欠損方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ 社より発売されているＲｅｄ／ＥＴ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍなどが例示される。
Ｒｅｄ／ＥＴ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍは、直鎖状のＤＮＡ断片を用いることができ、薬剤耐性遺伝子とスクロース感受性遺伝子をそれぞれ２段階で染色体ＤＮＡ上の標的遺伝子領域に導入する方法で、標的遺伝子領域に薬剤耐性遺伝子等の挿入領域が残存しないことから、複数の遺伝子欠損を実施する方法として優れている（Ｚｈａｎｇ, Ｙ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９８) ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１２３−１２８．参照。）。 In addition, as a method using homologous recombination that efficiently introduces a base deletion, substitution or addition into a plurality of genes, a method using linear DNA can be mentioned.
Specifically, a linear DNA containing a gene to be deleted on a chromosomal DNA or a DNA fragment existing on both outer sides of the DNA is taken into a cell, and a homologous group is introduced between the chromosomal DNA and the introduced linear DNA. There is a method of causing the change. This method is suitable for preparing a defective strain in which two or more genes are deleted from the gene group encoding the metabolic enzyme described above.
Various techniques and related products are sold as gene deletion methods, and any method may be adopted. Examples of the gene deletion method include Red / ET recombination system sold by Gene Bridges.
The Red / ET recombination system can use a linear DNA fragment, and introduces a drug resistance gene and a sucrose sensitivity gene into the target gene region on the chromosomal DNA in two steps, respectively. Since insertion regions such as genes do not remain, this method is excellent as a method for carrying out multiple gene deletions (Zhang, Y., et. Al., Nature Genetics, (1998) vol. 20, pp. 123-128. reference.).

上述した代謝酵素をコードする遺伝子としては、アスパラギナーゼをコードするａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子；セリンデアミナーゼをコードするｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子；グルタミンシンセターゼをコードするｇｌｎＡ遺伝子；γ-グルタミルシステインシンセターゼをコードするｇｓｈＡ遺伝子；アスパラギン酸アンモニアリアーゼをコードするａｓｐＡ遺伝子；アスパラギンシンセターゼをコードするａｓｎＡ遺伝子、ａｓｎＢ遺伝子；アルギニンデカルボキシラーゼをコードするｓｐｅＡ遺伝子；トリプトファナーゼをコードするｔｎａＡ遺伝子等の遺伝子群が挙げられる。
本発明の大腸菌変異体は、これらの遺伝子群の中から、二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活するように、遺伝子を選択して、選択したそれぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が置換又は欠損しているものであることが好ましい。より詳細には、標的遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡから−２００塩基上流から、終止コドンＴＡＡのＡから＋１００塩基下流までの範囲内にある塩基が欠損しているものであることが好ましく、開始コドンＡＴＧのＡから−１７０塩基上流から、終止コドンＴＡＡのＡから＋５０塩基下流までの範囲内にある塩基を欠損しているものであることがより好ましい。フレームシフトが生じるように塩基を欠損させてもよいし、代謝酵素の活性中心に相当する塩基配列を含む範囲を欠損させてもよい。
これら遺伝子群において、欠損した遺伝子は３種以上が好ましく、４種以上がより好ましく、５種以上が更に好ましく、６種以上が更に好ましく、７種以上が更に好ましい。なお、これら遺伝子群において８種以上欠損させても良いが、細胞増殖への影響を考慮すると、７種欠損以下が最も好ましい。具体的には、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることが好ましく、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることがより好ましい。また、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していてもよい。
これらの遺伝子群は、生命活動に重要なアミノ酸代謝経路に関わることから、大腸菌の生命維持に及ぼす影響が大きいことが予想されるため、通常、複数の遺伝子を同時に欠損させるという着想はし難いものである。しかし、実施例において後述するように、本発明者は、ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ａｓｎＡおよびａｓｎＢの４重遺伝子欠損株の培養時の増殖を調べたところ野生株と比較して遜色なく増殖することを確認している（図７）。しかしながら、上記遺伝子群の内、ｇｌｎＡを欠損させた株では、野生株に比べ、著しい増殖抑制がみられた。発明者らは、鋭意当該ｇｌｎＡ欠損株の培養条件を検討した結果、培養時の培地中に最終濃度で０．５ｍＭのグルタミンを添加することで、野生株と遜色ない増殖を示すことを見出した。培地中のグルタミンの濃度としては、１μＭ〜１Ｍが好ましく、１０μＭ〜１００ｍＭがより好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭが更に好ましく、０．２ｍＭ〜０．８ｍＭが特に好ましい。
さらに、欠損遺伝子を増やし、ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢおよびｇｌｎＡの７重欠損株を作成し、同様に培養速度を調べたところ、当該７重欠損株においても培地に最終濃度で０．５ｍＭのグルタミンを添加することで、野生株とほぼ同等の増殖速度で培養できることを見出した（図８）。さらに発明者らは、上記ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢおよびｇｌｎＡの７重欠損にａｓｐＡを加えた８重遺伝子欠損株の作製も試みた。当該８重遺伝子欠損株では、培地に０．５ｍＭのグルタミンを添加した場合においても野生株と比べ、増殖速度および到達濁度の低下が見られた。当該８重欠損株についても、増殖抑制を改善する添加物につき鋭意調査および検討を重ねた結果、０．５ｍＭのグルタミンに加え、ピルビン酸ナトリウムを終濃度で３０ｍＭになるように培地に添加することにより、培養時の増殖速度および到達濁度が向上し、改善が見られた（図１５）。培地中のピルビン酸ナトリウムの濃度としては、０．１ｍＭ〜０．５Ｍがより好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭが更に好ましく、１０ｍＭ〜６０ｍＭが特に好ましい。当該８重欠損株からＳ３０抽出液を調製し、ＣＡＴタンパク質合成量を野生株と比較したところ、遜色ない合成量が得られることを確認した。生命活動に極めて重要なアミノ酸に関わる代謝遺伝子群の内、８遺伝子にも及ぶ多重欠損を行った例は無く、グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムの添加による増殖速度の改善方法の発見は本発明において重要な知見であった。
更に、本発明者は、７種の酵素遺伝子を欠損させることで、バッチ反応におけるタンパク質合成量の増加を確認している（図１３）。これは、アミノ酸分解に関わる酵素遺伝子を欠損させたことで、アミノ酸の分解が抑えられたためと推察される。
このように上記に限らず、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、及びトリプトファナーゼからなる酵素群に関わる遺伝子欠損により、アミノ酸要求性等が示されるなど生育低下が確認された場合は、培養液にアミノ酸および有機酸等適切な物質を添加して培養してもよい。
本発明の大腸菌変異体は、ハンドリングが容易で、かつ、後述する安定同位体標識タンパク質の作製に最適である。 The genes encoding the metabolic enzymes described above include the ansA gene and ansB gene encoding asparaginase; the sdaA gene and sdaB gene encoding serine deaminase; the glnA gene encoding glutamine synthetase; and the γ-glutamylcysteine synthetase. Examples include gshA gene; aspA gene encoding aspartate ammonia lyase; asnA gene encoding asparagine synthetase, asnB gene; speA gene encoding arginine decarboxylase; and tnaA gene encoding tryptophanase.
The Escherichia coli mutant of the present invention is selected from such a group of genes so that the enzyme activities of two or more metabolic enzymes are reduced or inactivated, and at least a part of each selected gene is selected. It is preferable that these bases are substituted or missing. More specifically, it is preferable that a base in the range from -200 bases upstream of the start codon ATG of the target gene to +100 bases downstream of the stop codon TAA is deleted. It is more preferable that the base in the range from -170 bases upstream of ATG to +50 bases downstream of A from the stop codon TAA is deleted. A base may be deleted so that a frame shift occurs, or a range including a base sequence corresponding to the active center of a metabolic enzyme may be deleted.
In these gene groups, the number of missing genes is preferably 3 or more, more preferably 4 or more, still more preferably 5 or more, still more preferably 6 or more, and still more preferably 7 or more. In addition, although 8 or more types may be deleted in these gene groups, in consideration of the influence on cell proliferation, 7 types or less are most preferable. Specifically, in all genes of the group consisting of ansA gene, ansB gene, asnA gene, and asnB gene, it is preferable that at least a part of the bases in each gene is deleted, and the ansA gene, ansB gene More preferably, all of the sdaA gene, the sdaB gene, the glnA gene, the asnA gene, and the asnB gene are deficient in at least some of the bases. Further, in all genes of the ansA gene, the ansB gene, the sdaA gene, the sdaB gene, the aspA gene, the glnA gene, the asnA gene, and the asnB gene, at least a part of the bases in each gene may be deleted.
Since these genes are involved in amino acid metabolism pathways important for life activities, it is expected to have a large impact on the life support of E. coli, so it is usually difficult to conceive the idea of deleting multiple genes simultaneously. It is. However, as will be described later in the Examples, the present inventor confirmed that the quadruple gene-deficient strains of ansA, ansB, asnA, and asnB grew at the time of culturing and compared with the wild strain, (FIG. 7). However, among the above-mentioned gene groups, the strain in which glnA was deleted showed marked growth suppression compared to the wild strain. The inventors have intensively studied the culture conditions of the glnA-deficient strain, and as a result, found that the addition of 0.5 mM glutamine at the final concentration to the culture medium at the time of culture shows a growth comparable to that of the wild strain. . The concentration of glutamine in the medium is preferably 1 μM to 1M, more preferably 10 μM to 100 mM, still more preferably 0.1 mM to 10 mM, and particularly preferably 0.2 mM to 0.8 mM.
Furthermore, the number of defective genes was increased, and seven-deficient strains of ansA, ansB, asnA, asnB, sdaA, sdaB and glnA were prepared, and the culture rate was examined in the same manner. It was found that by adding 0.5 mM glutamine, it was possible to culture at a growth rate almost the same as that of the wild type (FIG. 8). Furthermore, the inventors also tried to produce an 8-fold gene-deficient strain in which aspA was added to the 7-fold deletion of the ansA, ansB, asnA, asnB, sdaA, sdaB and glnA. In the 8-fold gene-deficient strain, even when 0.5 mM glutamine was added to the medium, the growth rate and the ultimate turbidity were reduced compared to the wild strain. As a result of intensive investigations and investigations on additives that improve growth suppression, the 8-fold deficient strain should be added to the medium so that the final concentration of sodium pyruvate is 30 mM in addition to 0.5 mM glutamine. As a result, the growth rate and ultimate turbidity during culture were improved, and improvements were observed (FIG. 15). The concentration of sodium pyruvate in the medium is more preferably 0.1 mM to 0.5 M, further preferably 1 mM to 100 mM, and particularly preferably 10 mM to 60 mM. When an S30 extract was prepared from the 8-deficient strain and the amount of CAT protein synthesized was compared with that of the wild strain, it was confirmed that a comparable amount of synthesis was obtained. Of the metabolic genes related to amino acids that are extremely important for life activity, there are no examples of multiple deletions as many as 8 genes, and the discovery of a method for improving the growth rate by adding glutamine and sodium pyruvate is important in the present invention. It was knowledge.
Furthermore, the present inventor has confirmed an increase in the amount of protein synthesis in a batch reaction by deleting seven kinds of enzyme genes (FIG. 13). This is probably because the degradation of amino acids was suppressed by deleting the enzyme genes involved in amino acid degradation.
As described above, due to a gene deficiency related to an enzyme group consisting of asparaginase, serine deaminase, glutamine synthetase, γ-glutamylcysteine synthetase, aspartate ammonia lyase, asparagine synthetase, arginine decarboxylase, and tryptophanase. In the case where a decrease in growth is confirmed, such as when amino acid requirement is shown, an appropriate substance such as an amino acid and an organic acid may be added to the culture medium for cultivation.
The Escherichia coli mutant of the present invention is easy to handle and is optimal for the production of a stable isotope labeled protein described later.

≪抽出液≫
本発明の抽出液は、上述した本発明の大腸菌変異体より抽出されたものである。該抽出液は、大腸菌Ｓ３０の抽出物であることが好ましい。大腸菌Ｓ３０抽出液は、増殖させた大腸菌の菌体を破砕して細胞破砕液を得て、この細胞破砕液を３０，０００ｘｇの遠心分離にかけて分離した上清から得られる。
大腸菌Ｓ３０抽出液は、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ポリペプチド鎖開始因子（ＩＦ）、同伸長因子（ＥＦ）及び同終結因子等、翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいるため、無細胞タンパク質合成に適している。 ≪Extract liquid≫
The extract of the present invention is extracted from the aforementioned Escherichia coli mutant of the present invention. The extract is preferably an extract of E. coli S30. The Escherichia coli S30 extract is obtained from a supernatant obtained by crushing the grown Escherichia coli cells to obtain a cell lysate, and separating the cell lysate by centrifugation at 30,000 × g.
Since the E. coli S30 extract contains all enzymes and factors of E. coli necessary for translation, such as ribosome, aminoacyl-tRNA synthetase, polypeptide chain initiation factor (IF), elongation factor (EF), and termination factor. Suitable for cell-free protein synthesis.

≪無細胞タンパク質合成反応液≫
本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、上述した本発明の抽出液を含有する。無細胞タンパク質合成系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子等、翻訳に必要な要素が含まれている。
このような無細胞翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が一般的に用いられる。ウサギ網状赤血球抽出液や小麦胚芽抽出液と比較して、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、遺伝子操作や培養等の容易な大腸菌を用いたものであるため、簡便さという点で優れている。更に、標的とする代謝酵素の欠損株を的確に作製でき、目的の安定同位体標識タンパク質を得られる点からも優れている。
更に、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、目的タンパク質の構成材料となるアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン、及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸を含むことが好ましい。また、上記に限らず非天然型のアミノ酸や放射性および蛍光標識アミノ酸を添加しても良い。 ≪Cell-free protein synthesis reaction solution≫
The cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention contains the above-described extract of the present invention. A cell-free protein synthesis system is a protein translation system consisting of components that have the ability to synthesize proteins extracted from appropriate cells. This system contains elements necessary for translation, such as ribosomes, translation initiation factors, and translation elongation factors. include.
As such a cell-free translation system, Escherichia coli extract, rabbit reticulocyte extract, wheat germ extract and the like are generally used. Compared to rabbit reticulocyte extract or wheat germ extract, the cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention uses Escherichia coli which is easy to genetically manipulate and culture, and is superior in terms of simplicity. Yes. Furthermore, this method is excellent in that a target metabolic enzyme-deficient strain can be accurately produced and the target stable isotope-labeled protein can be obtained.
Furthermore, the cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention comprises alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, which are constituent materials of the target protein. It preferably contains an amino acid selected from the group consisting of tryptophan, tyrosine, valine, asparagine, and glutamine. Further, not limited to the above, non-natural amino acids and radioactive and fluorescently labeled amino acids may be added.

無細胞タンパク質合成反応系内で、転写と翻訳の両反応を共役させる場合、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオチドを含有していることが好ましい。また、アミノアシルｔＲＮＡの合成、及びｍＲＮＡの翻訳反応にはＡＴＰ及びＧＴＰが必要であることから、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、これらをＡＴＰ再生に関与する酵素とともにエネルギー源として含むことが好ましい。
ＡＴＰ再生に関与する酵素としては、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ又はクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組み合わせが挙げられる。また、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、合成したタンパク質が適切立体構造を形成できるように、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ及びＨＳＰ７０等のシャペロンタンパク質を含有してもよい。
また、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、タンパク質合成能を向上させる点で、アンモニウム塩を含有することが好ましい。アンモニウム塩としては、酢酸アンモニウム、安息香酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、塩化アンモニウム等が挙げられる。
本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、添加剤として、リボヌクレアーゼ阻害剤、ジチオトレイトール等の還元剤、スペルミジン等のＲＮＡ安定化剤、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）等のプロテアーゼ阻害剤等を含有してもよい。
また、本発明の無細胞タンパク質合成反応液中の緩衝液としては、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような一般的な緩衝剤が用いられる。 When coupling both transcription and translation reactions in a cell-free protein synthesis reaction system, the cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention preferably contains an RNA polymerase such as T7 RNA polymerase and a ribonucleotide. In addition, since ATP and GTP are required for the synthesis of aminoacyl-tRNA and the translation reaction of mRNA, the cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention may contain these as an energy source together with the enzyme involved in ATP regeneration. preferable.
Enzymes involved in ATP regeneration include a combination of phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase or a combination of creatine phosphate and creatine kinase. In addition, the cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention may contain chaperone proteins such as DnaJ, DnaK, GroE, GroEL, GroES, and HSP70 so that the synthesized protein can form an appropriate three-dimensional structure.
In addition, the cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention preferably contains an ammonium salt from the viewpoint of improving the protein synthesis ability. Examples of ammonium salts include ammonium acetate, ammonium benzoate, ammonium citrate, and ammonium chloride.
The cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention contains, as additives, a ribonuclease inhibitor, a reducing agent such as dithiothreitol, an RNA stabilizer such as spermidine, a protease inhibitor such as phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), and the like. You may contain.
In addition, as a buffer solution in the cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention, general buffer agents such as Hepes-KOH and Tris-OAc are used.

本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、所定の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活した大腸菌抽出液を含有していることに加えて、代謝酵素の阻害剤を含有していてもよい。かかる代謝酵素阻害剤としては、アスパラギン酸アミノ基転移酵素の阻害剤であるアミノオキシ酢酸；グルタミンシンセターゼの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシイミン；γ-グルタミルシステインシンセターゼの阻害剤であるＬ−ブチオニンスルホキシイミン；グルタミナーゼの阻害剤である６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；アスパラギナーゼの阻害剤である５−ジアゾ−４−オキソ−Ｌ−ノルバリン；アスパラギンシンセターゼの阻害剤であるＳ−メチル−Ｌ−システインスルホキシイミン；アスパラギン酸アンモニアリアーゼの阻害剤であるＤ−リンゴ酸等が挙げられる。
本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、これらの代謝酵素阻害剤からなる群の中から、一種以上選択されることが好ましい。かかる代謝酵素阻害剤は、本発明の大腸菌変異体において酵素活性が低下又は失活している代謝酵素の阻害剤であってもよく、該代謝酵素とは異なる別の代謝酵素の阻害剤であってもよい。前者の場合には、無細胞タンパク質合成反応系において、特定の代謝酵素の酵素活性をより強力に阻害することができ、後者の場合には、複数の代謝経路における代謝酵素の酵素活性を広範に阻害することができる。特に、アミノオキシ酢酸は、アミノ基転移酵素を広く阻害することが知られており、本発明の大腸菌抽出液と組み合わせることで、アミノ酸選択的な安定同位体標識等の厳密な安定同位体標識タンパク質を合成するのに非常に有効である。 The cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention may contain a metabolic enzyme inhibitor in addition to the E. coli extract in which the enzyme activity of a predetermined metabolic enzyme is reduced or inactivated. Such metabolic enzyme inhibitors include aminooxyacetic acid which is an inhibitor of aspartate aminotransferase; L-methionine sulfoximine which is an inhibitor of glutamine synthetase; L which is an inhibitor of γ-glutamylcysteine synthetase. Inhibitor of glutaminase 6-diazo-5-oxo-L-norleucine; Inhibitor of asparaginase 5-diazo-4-oxo-L-norvaline; Inhibitor of asparagine synthetase Specific S-methyl-L-cysteine sulfoximine; D-malic acid which is an inhibitor of aspartate ammonia lyase, and the like.
The cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention is preferably selected from one or more groups selected from these metabolic enzyme inhibitors. Such a metabolic enzyme inhibitor may be an inhibitor of a metabolic enzyme whose enzyme activity is reduced or inactivated in the Escherichia coli mutant of the present invention, and is an inhibitor of another metabolic enzyme different from the metabolic enzyme. May be. In the former case, the enzyme activity of a specific metabolic enzyme can be more strongly inhibited in a cell-free protein synthesis reaction system, and in the latter case, the enzyme activity of a metabolic enzyme in multiple metabolic pathways can be broadened. Can be inhibited. In particular, aminooxyacetic acid is known to widely inhibit aminotransferase, and in combination with the Escherichia coli extract of the present invention, strict stable isotope labeled protein such as amino acid selective stable isotope labeling. It is very effective to synthesize.

≪安定同位体標識タンパク質合成キット≫
本発明の安定同位体標識タンパク質合成キットは、上述した本発明の無細胞タンパク質合成反応液を含有する。
該安定同位体標識タンパク質合成キットは、上述したタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸が、１３Ｃ、１５Ｎ、重水素（Ｄ）等の安定同位体により標識された標識アミノ酸を含むことが好ましい。
１種類以上の標識アミノ酸を含むアミノ酸混合体としては、多種類の組み合わせが考えられ、その組み合わせは、様々な目的に応じて適宜選択できる。例えば、２０種類のアミノ酸のうちの１種類を標識アミノ酸とし、残りの１９種類を非標識アミノ酸としたアミノ酸混合体の２０種類の組合せにすることで、ＮＭＲ測定におけるシグナルがどのアミノ酸に由来するかを特定できる点で好ましい。また、２種類又は３種類のアミノ酸を標識アミノ酸とし、残りの１８種類又は１７種類を非標識アミノ酸としたアミノ酸混合体を組合せることで、隣り合うアミノ酸との結合をＮＭＲ測定により観測することが可能となり、帰属をより容易に行うことが可能となる。もちろん、ＮＭＲ測定におけるシグナルの対比用サンプルとして、全ての種類のアミノ酸を標識アミノ酸としたアミノ酸混合体、全ての種類のアミノ酸を非標識アミノ酸としたアミノ酸混合体を組み合わせてもよい。選択される標識アミノ酸は、１３Ｃ、１５Ｎ、Ｄ、１７Ｏ、１８Ｏのいずれかの安定同位体で一か所でも標識されていればよく。その組み合わせは目的に応じて決定すればよい。
所定の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活している大腸菌変異体と、所定の標識アミノ酸とを適切に組み合わせることにより、得られた安定同位体標識タンパク質のＮＭＲ測定において構造解析に適したシグナルを得ることができる。 ≪Stable isotope labeled protein synthesis kit≫
The stable isotope labeled protein synthesis kit of the present invention contains the above-described cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention.
In the stable isotope-labeled protein synthesis kit, at least one of 20 kinds of amino acids constituting the above-described protein is labeled with a stable isotope such as 13 C, 15 N, deuterium (D), etc. It preferably contains a labeled amino acid.
As the amino acid mixture containing one or more kinds of labeled amino acids, various kinds of combinations are conceivable, and the combinations can be appropriately selected according to various purposes. For example, by combining 20 kinds of amino acid mixtures in which one of 20 kinds of amino acids is a labeled amino acid and the remaining 19 kinds are unlabeled amino acids, the amino acid from which the signal in NMR measurement is derived Is preferable in that it can be specified. In addition, by combining an amino acid mixture in which two or three amino acids are labeled amino acids and the remaining 18 or 17 amino acids are unlabeled amino acids, the binding to adjacent amino acids can be observed by NMR measurement. This makes it possible to perform attribution more easily. Of course, as a sample for comparison of signals in NMR measurement, an amino acid mixture in which all kinds of amino acids are labeled amino acids and an amino acid mixture in which all kinds of amino acids are unlabeled amino acids may be combined. The labeled amino acid to be selected may be any one of 13 C, 15 N, D, 17 O, and 18 O with a stable isotope. The combination may be determined according to the purpose.
A signal suitable for structural analysis in NMR measurement of the obtained stable isotope-labeled protein by appropriately combining an E. coli mutant whose enzyme activity of a given metabolic enzyme is reduced or inactivated and a given labeled amino acid Can be obtained.

≪安定同位体標識タンパク質の製造方法≫
本発明の安定同位体標識タンパク質の製造方法は、上述した本発明の無細胞タンパク質合成反応液を用いる方法であり、該方法は、上述した安定同位体標識タンパク質合成キットを用いた方法であることが好ましい。
安定同位体標識タンパク質の製造において、従来から知られているバッチ法、透析法のいずれの方法を用いてもよい。これらの方法については定法に従う。
無細胞タンパク質合成系により合成されたタンパク質は、大腸菌内で合成されたタンパク質と比較して、集菌や溶菌作業が不要のため、簡便に、構造解析に適した純度のタンパク質を得ることができる。精製法としては、硫酸アンモニウム沈殿、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の方法が挙げられ、これらの方法を目的タンパク質の性質に応じて適宜組み合わせて行うことができる。
また、目的タンパク質に予めタグペプチド配列を付加させておき、タグを特異的に認識する物質を用いたアフィニティー精製法も挙げられる。当該精製法は、高純度のタンパク質を得る上で特に好ましい。当該タグとしては６×ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）、ＧＳＴタグ及びマルトース結合性タグ等が挙げられる。
本発明の安定同位体標識タンパク質の製造方法によれば、ＮＭＲ測定において構造解析に適したシグナルを簡便に得ることができる。 ≪Method for producing stable isotope-labeled protein≫
The method for producing a stable isotope-labeled protein of the present invention is a method using the above-described cell-free protein synthesis reaction solution of the present invention, and the method is a method using the above-mentioned stable isotope-labeled protein synthesis kit. Is preferred.
In the production of a stable isotope-labeled protein, any conventionally known batch method or dialysis method may be used. These methods are followed by the standard method.
Proteins synthesized by the cell-free protein synthesis system do not require bacterial collection or lysis, compared to proteins synthesized in E. coli, so that proteins with a purity suitable for structural analysis can be easily obtained. . Examples of purification methods include ammonium sulfate precipitation, anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and the like, and these methods are appropriately combined depending on the properties of the target protein. Can be done.
Further, an affinity purification method using a substance that specifically recognizes the tag by adding a tag peptide sequence to the target protein in advance. This purification method is particularly preferable for obtaining a highly pure protein. Examples of the tag include a 6 × histidine tag (6 × His), a GST tag, and a maltose binding tag.
According to the method for producing a stable isotope-labeled protein of the present invention, a signal suitable for structural analysis can be easily obtained in NMR measurement.

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to a following example.

［実施例１］
大腸菌ＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のゲノムＤＮＡを抽出し、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、及びアスパラギンシンセターゼ、それぞれの代謝酵素をコードする遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定し、ａｓｎＡ（配列番号１）、 ａｓｎＢ（配列番号２）、 ａｎｓＡ（配列番号３）、 ａｎｓＢ（配列番号４）、ｇｌｎＡ（配列番号５）、 ｓｄａＡ（配列番号６）、ｓｄａＢ（配列番号７）の遺伝子配列情報を得た。
次に決定した遺伝子配列に基づき、ＢＬ２１株において、Ｒｅｄ／ＥＴ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（フナコシ株式会社，Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ製）を用いて、安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わるそれぞれの酵素をコードした４遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ）の欠損及び７遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ,ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）の欠損を行った。欠損方法の詳細は、製品マニュアルおよびＺｈａｎｇ, Ｙ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９８) ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１２３−１２８．を参照し、実施した。
ａｓｎＡ遺伝子については、ａｓｎＡのプロモーター配列(開始コドンＡＴＧのＡから−２４塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡから−２１５塩基上流までを欠損させた。ａｓｎＢ遺伝子については、ａｓｎＢのプロモーター配列(開始コドンＡＴＧのＡから−４５塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡから＋３０塩基下流まで欠損させた。ａｎｓＡ遺伝子については、ａｎｓＡの推定上のＳＤ配列 (開始コドンＡＴＧのＡから−１４塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。ａｎｓＢ遺伝子については、ａｎｓＢのプロモーター配列(開始コドンＡＴＧのＡから−６２塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。ｇｌｎＡ遺伝子については、ｇｌｎＡの開始コドンＡＴＧのＡから−１６３塩基上流から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。ｓｄａＡ遺伝子については、ｓｄａＡの転写開始配列(開始コドンＧＴＧのＧから−１２３塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。ｓｄａＢ遺伝子については、ｓｄａＢの推定上のＳＤ配列(開始コドンＡＴＧのＡから−２１塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。
目的の遺伝子が正しく欠損されたことをＤＮＡシークエンサーにより確認した。
ａｓｎＡ遺伝子については、配列番号８で表される配列が欠損していることが確認され、ａｓｎＢ遺伝子については、配列番号９で表される配列が欠損していることが確認され、ａｎｓＡ遺伝子については、配列番号１０で表される配列が欠損していることが確認され、ａｎｓＢ遺伝子については、配列番号１１で表される配列が欠損していることが確認され、ｇｌｎＡ遺伝子については、配列番号１２で表される配列が欠損していることが確認され、ｓｄａＡ遺伝子については、配列番号１３で表される配列が欠損していることが確認され、ｓｄａＢ遺伝子については、配列番号１４で表される配列が欠損していることが確認された。 [Example 1]
Genomic DNA of Escherichia coli BL21 (manufactured by Novagen) was extracted, and gene sequences encoding asparaginase, serine deaminase, glutamine synthetase, and asparagine synthetase, and their respective metabolic enzymes, were sequenced by DNA sequencer Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). AsnA (SEQ ID NO: 1), asnB (SEQ ID NO: 2), ansA (SEQ ID NO: 3), ansB (SEQ ID NO: 4), glnA (SEQ ID NO: 5), sdaA (SEQ ID NO: 6), sdaB The gene sequence information of (SEQ ID NO: 7) was obtained.
Next, based on the determined gene sequence, 4 genes encoding each enzyme involved in the metabolism of stable isotope-labeled amino acids using Red / ET recombination system (Funakoshi Co., Ltd., Gene Bridges GmbH) in BL21 strain ( deletion of asnA, asnB, ansA, ansB) and deletion of 7 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) were performed. Details of the defect method can be found in the product manual and Zhang, Y. et al. , Et. al. , Nature Genetics, (1998) vol. 20, pp. 123-128. Was carried out.
As for the asnA gene, the promoter sequence of asnA (from A to -24 bases upstream from start codon ATG) to A to -215 bases upstream from stop codon TAA were deleted. The asnB gene was deleted from the promoter sequence of asnB (-45 bases upstream from A of start codon ATG) to +30 bases downstream of A of stop codon TAA. The ansA gene was deleted from the putative SD sequence of ansA (-14 bases upstream from A of the start codon ATG) to A of the stop codon TAA. The ansB gene was deleted from the promoter sequence of ansB (-62 bases upstream from A of the start codon ATG) to A of the stop codon TAA. The glnA gene was deleted from A of the start codon ATG of glnA to A of the stop codon TAA from -163 base upstream. The sdaA gene was deleted from the transcription start sequence of sdaA (-123 bases upstream from G of the start codon GTG) to A of the stop codon TAA. The sdaB gene was deleted from the putative SD sequence of sdaB (from the start codon ATG A to -21 bases upstream) to the stop codon TAA A.
The DNA sequencer confirmed that the target gene was correctly deleted.
For the asnA gene, it was confirmed that the sequence represented by SEQ ID NO: 8 was deleted, for the asnB gene, the sequence represented by SEQ ID NO: 9 was confirmed, and for the ansA gene, , It is confirmed that the sequence represented by SEQ ID NO: 10 is missing, the ansB gene is confirmed to be missing the sequence represented by SEQ ID NO: 11, and the glnA gene is identified by SEQ ID NO: 12 The sdaA gene is confirmed to be defective, and the sdaB gene is identified to be SEQ ID NO: 14. It was confirmed that the sequence was missing.

更に、ＢＬ２１野生株（ｗｔ）及び７遺伝子欠損株（Δ７）において、各７遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）を増幅するためのプライマーを用意し、各遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ後の各反応液を、アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。図６に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図６中、レーン１はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｎｓＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン２は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ａｎｓＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン３はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｎｓＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン４は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ａｎｓＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン５はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｓｎＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン６は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ａｓｎＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン７はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｓｎＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン８は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ａｓｎＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン９はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ｇｌｎＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１０は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ｇｌｎＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１１はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ｓｄａＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１２は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ｓｄａＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１３はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ｓｄａＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１４は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ｓｄａＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、左端のレーンＭｒ１は１０００ｂｐＤＮＡラダーマーカーであり、右端のレーンＭｒ２は２５０ｂｐＤＮＡラダーマーカーである。図６右に、ＢＬ２１野生株（ＷＴ）及び７遺伝子欠損株（Δ７）をそれぞれ鋳型としたときに、予想される各遺伝子の増幅断片の大きさを示す。
図６に示すように、７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型として各遺伝子を増幅させたレーン（レーン２，４，６，８，１０，１２，１４）では、ＢＬ２１野生株（ＷＴ）を鋳型として各遺伝子を増幅させたレーン（レーン１，３，５，７，９，１１，１３）と比較して増幅断片が短く、標的遺伝子の欠損がなされていることが確認された。 Furthermore, primers for amplifying each 7 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) in BL21 wild type (wt) and 7 gene deficient strains (Δ7) were prepared, and each gene was amplified. I let you. Each reaction solution after PCR was applied to an agarose gel and subjected to electrophoresis, and then the agarose gel was stained with ethidium bromide. FIG. 6 shows an ethidium bromide stained image of the agarose gel after electrophoresis.
In FIG. 6, lane 1 uses BL21 wild type strain (wt) as a template, a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 15 as a forward primer for ansA gene amplification, and a base represented by SEQ ID NO: 16 as a reverse primer Reaction solution using a primer consisting of a sequence; Lane 2 uses a 7-gene deletion strain (Δ7) as a template, a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 as a forward primer for ansA gene amplification, and a sequence as a reverse primer Reaction solution using a primer comprising the base sequence represented by No. 16; Lane 3 is a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID No. 17 as a forward primer for amplification of ansB gene using BL21 wild strain (wt) as a template And represented by SEQ ID NO: 18 as a reverse primer. Reaction solution using a primer consisting of a base sequence; Lane 4 uses a 7-gene deletion strain (Δ7) as a template, a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 17 as a forward primer for ansB gene amplification, and a reverse primer Reaction solution using a primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18; Lane 5 comprises the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 as a forward primer for a asnA gene amplification using BL21 wild strain (wt) as a template. Reaction solution using a primer and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 as a reverse primer; Lane 6 has 7 gene-deficient strain (Δ7) as a template and SEQ ID NO: 19 as a forward primer for asnA gene amplification. A primer consisting of the base sequence represented by A reaction solution using a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 as a mer; Lane 7 uses the BL21 wild type strain (wt) as a template, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 as a forward primer for asnB gene amplification And a reaction solution using a primer consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 as a reverse primer; Lane 8 uses 7 gene-deficient strain (Δ7) as a template and SEQ ID NO: as a forward primer for asnB gene amplification Reaction solution using a primer consisting of the base sequence represented by No. 21 and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 as a reverse primer; Lane 9 is for glnA gene amplification using BL21 wild strain (wt) as a template As a forward primer of SEQ ID NO: 23 And a reaction solution using a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 as a reverse primer; Lane 10 uses a 7 gene-deficient strain (Δ7) as a template and SEQ ID NO: as a forward primer for glnA gene amplification Reaction solution using a primer consisting of the nucleotide sequence represented by No. 23 and a primer consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24 as a reverse primer; lane 11 is for sdaA gene amplification using BL21 wild strain (wt) as a template A reaction solution using a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 25 as a forward primer and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 as a reverse primer; Lane 12 shows a 7 gene-deficient strain (Δ7) As a template, forward ply for sdaA gene amplification A reaction solution using a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 25 as a primer and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 as a reverse primer; Lane 13 uses BL21 wild strain (wt) as a template, Reaction solution using a primer consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 as a forward primer for amplifying the sdaB gene and a primer consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 as a reverse primer; lane 14 is a 7 gene-deficient strain A reaction solution using (Δ7) as a template, a primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 as a forward primer for amplifying the sdaB gene, and a primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 as a reverse primer , Each applied lane.
The leftmost lane Mr1 is a 1000 bp DNA ladder marker, and the rightmost lane Mr2 is a 250 bp DNA ladder marker. The right side of FIG. 6 shows the expected size of the amplified fragment of each gene when BL21 wild type strain (WT) and 7 gene deletion strain (Δ7) are used as templates.
As shown in FIG. 6, in lanes (lanes 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14) in which each gene was amplified using 7 gene-deficient strain (Δ7) as a template, BL21 wild strain (WT) was used as a template. As compared with the lane (lanes 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13) in which each gene was amplified, the amplified fragment was short and it was confirmed that the target gene was deleted.

作製した４遺伝子欠損株（ΔａｓｎＡ, ΔａｓｎＢ, ΔａｎｓＢ, ΔａｎｓＡ）及び通常のＢＬ２１株の増殖速度を比較した。結果を図７に示す。作製した４遺伝子欠損株と通常のＢＬ２１株との間で増殖速度の差は見られなかった。
また、作製した７遺伝子欠損株（Δ７）及び通常のＢＬ２１株の増殖速度を比較した。結果を図８に示す。７遺伝子欠損株では、４遺伝子欠損株には見られなかった増殖速度の低下が確認されたことから、まず、どの遺伝子欠損が増殖抑制に関与しているかの特定を進めた。その結果、グルタミンシンセターゼの遺伝子であるｇｌｎＡ欠損が、増殖速度抑制の原因であることを突き止めた。次に、ｇｌｎＡ欠損を含む７遺伝子欠損株の増殖速度を改善する添加物を鋭意探索したところ、培養時に終濃度で０．５ｍＭのＬ−グルタミンを培養液に添加することで、通常のＢＬ２１とほぼ同等の増殖速度を示すことを見出した。 The growth rates of the prepared 4-gene-deficient strains (ΔasnA, ΔasnB, ΔansB, ΔansA) and the normal BL21 strain were compared. The results are shown in FIG. There was no difference in the growth rate between the prepared 4-gene-deficient strain and the normal BL21 strain.
In addition, the growth rates of the 7 gene-deficient strain (Δ7) and the normal BL21 strain prepared were compared. The results are shown in FIG. In the 7-gene-deficient strain, since a decrease in the growth rate that was not seen in the 4-gene-deficient strain was confirmed, first, identification of which gene deficiency was involved in growth suppression was advanced. As a result, it was found that glnA deficiency, which is a gene for glutamine synthetase, is a cause of growth rate suppression. Next, when an additive that improves the growth rate of a 7-gene-deficient strain containing glnA deficiency was eagerly searched, by adding 0.5 mM L-glutamine at a final concentration to the culture solution during culture, It was found that the growth rate was almost the same.

遺伝子欠損させた大腸菌ＢＬ２１株及び欠損させていない通常の大腸菌ＢＬ２１株それぞれより木川らの方法（国際公開第０３／０５３９１０号パンフレット、特許第３３１７９８３号公報、特許第３１４５４３１号公報、Ｔｕｇａｒｉｎｏｖ，Ｖ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００３) ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１３８６８−１３８７８．）で無細胞タンパク質合成反応用の抽出液（Ｓ３０抽出液）を調製した。
調製した抽出液を用いて、特許第４７８７４８８号公報、特開２００５−１０２５１３号公報、Ｋｉｇａｗａ，Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，（２００４)ｖｏｌ．５, ｐｐ．６３−６８.、Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ， （２００７) ｖｏｌ．３７, ｐｐ．２２５−２２９．を参考に無細胞タンパク質合成反応液を調製した。次にそれぞれ安定同位体標識アミノ酸として、アスパラギン−１５Ｎ２、グルタミン−１５Ｎ２、アスパラギン酸−１５Ｎ、及びグルタミン酸−１５Ｎのうち１種類と、それ以外の非標識のアミノ酸１９種類と、を混合したアミノ酸混合物溶液を調製し、上述の遺伝子欠損させた大腸菌株より調製した抽出液と、通常の大腸菌より調製した抽出液をそれぞれ含む無細胞タンパク質合成反応液を用いて、１種類のアミノ酸のみを安定同位体標識したタンパク質を合成した。
モデルタンパク質として、タンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸を含み，比較的安定で取り扱いやすいユビキチン結合ドメイン（［ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＵＢＡ）ｄｏｍａｉｎｓ；Ｌｅｕ６５５−Ｓｅｒ７１５ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ５（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ４５９７４，ＰＤＢ：２ＤＡＧ，ＢＭＲＢ：１１１７３）]、以下、ＵＢＡドメインともいう。）を用いた。 The method of Kikawa et al. (International Publication No. 03/053910, Pamphlet No. 33177983, Patent No. 3145431, Tugarinov, V., and E. coli from the E. coli BL21 strain lacking the gene and the normal E. coli BL21 strain not deficient, respectively. et.al., J. Am.Chem.Soc., (2003) vol.125, pp.13868-13878.), an extract (S30 extract) for cell-free protein synthesis reaction was prepared.
Using the prepared extract, Japanese Patent No. 4787488, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-102513, Kigawa, T, et. al. , J .; Struct. Funct. Genomics, (2004) vol. 5, pp. 63-68., Matsuda, T, et. al. , J .; Biomol. NMR, (2007) vol. 37, pp. 225-229. A cell-free protein synthesis reaction solution was prepared with reference to FIG. Then a stable isotope-labeled amino acids, respectively, asparagine - 15 N 2, glutamine - 15 N 2, aspartate - 15 N, and glutamate - and one of the 15 N, and a non-labeled amino acids 19 different otherwise, 1 type of amino acid using a cell-free protein synthesis reaction solution containing an extract prepared from the above-mentioned gene-deficient E. coli strain and an extract prepared from ordinary E. coli. Only a stable isotope-labeled protein was synthesized.
As a model protein, the ubiquitin-binding domain ([ubiquitin-associated (UBA) domains; Leu655-Ser715 of ubiquitin-carboylyl-Terminal-HydroSlROS) (relatively stable and easy to handle) includes all 20 types of amino acids constituting the protein. : P45974, PDB: 2DAG, BMRB: 11173)], and hereinafter also referred to as UBA domain).

合成したそれぞれのＵＢＡドメインを常法により単離精製し、ＮＭＲ測定用緩衝液に置換して、１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣ ＮＭＲ測定を実施した。結果を図９〜１２に示す。
図９（Ａ）は、通常のＢＬ２１株から抽出したＳ３０抽出液による１５Ｎ標識アスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）のアミノ酸選択標識（アスパラギン酸のみ１５Ｎ標識、残りの１９種類は非標識）によるＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。内在するアミノ酸代謝酵素によるアミノ基転移反応等により、Ｄのみならず、グルタミン酸（Ｇｌｕ， Ｅ）およびアスパラギン（Ａｓｎ， Ｎ）のシグナルも観察された。
図９（Ｂ）は、７種の遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）欠損ＢＬ２１株（Δ７）から抽出したＳ３０抽出液による無細胞タンパク質合成反応にアミノ酸代謝阻害剤であるＡＯＡおよびＤ−リンゴ酸をそれぞれ最終濃度で２０ｍＭと１０ｍＭになるように添加した。Ｄ以外のシグナルは観察されず、厳密なアスパラギン酸選択標識がなされていることが確認された。 Each synthesized UBA domain was isolated and purified by a conventional method and replaced with a buffer for NMR measurement, and 1 H, 15 N-HSQC NMR measurement was performed. The results are shown in FIGS.
FIG. 9 (A) shows UBA obtained by amino acid selective labeling of 15 N-labeled aspartic acid (Asp, D) using an S30 extract extracted from a normal BL21 strain (aspartic acid alone is 15 N-labeled, the remaining 19 types are unlabeled). 1 shows the 1 H- 15 N-HSQC spectrum of the protein. In addition to D, signals of glutamic acid (Glu, E) and asparagine (Asn, N) were also observed due to transamination reaction by an endogenous amino acid metabolizing enzyme.
FIG. 9B shows an amino acid metabolism inhibitor for cell-free protein synthesis reaction by S30 extract extracted from 7 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) deficient BL21 strain (Δ7). AOA and D-malic acid were added to a final concentration of 20 mM and 10 mM, respectively. No signal other than D was observed, confirming that strict aspartic acid selective labeling was made.

図１０（Ａ）は、通常のＢＬ２１株から抽出したＳ３０抽出液による１５Ｎ標識グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）のアミノ酸選択標識（グルタミン酸のみ１５Ｎ標識、残りの１９種類は非標識）によるＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。内在するアミノ酸代謝酵素によるアミノ基転移反応等により、Ｅのみならず、アスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）およびグルタミン（Ｇｌｎ， Ｑ）のシグナルも観察された。
図１０（Ｂ）は、７種の遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）欠損ＢＬ２１株（Δ７）から抽出したＳ３０抽出液による無細胞タンパク質合成反応にアミノ酸代謝阻害剤であるＡＯＡを最終濃度で２０ｍＭになるように添加した。Ｅ以外のシグナルは観察されず、厳密なグルタミン酸選択標識がなされていることが確認された。 FIG. 10 (A) shows the amino acid selective labeling of 15 N-labeled glutamic acid (Glu, E) with an S30 extract extracted from the normal BL21 strain (only glutamic acid 15 N-labeled, the remaining 19 types are unlabeled). 1 H- 15 N-HSQC spectrum is shown. Signals of not only E but also aspartic acid (Asp, D) and glutamine (Gln, Q) were observed by transamination reaction by an endogenous amino acid metabolizing enzyme.
FIG. 10 (B) shows an amino acid metabolism inhibitor in the cell-free protein synthesis reaction by S30 extract extracted from 7 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) deficient BL21 strain (Δ7). AOA was added to a final concentration of 20 mM. No signal other than E was observed, confirming that strict glutamate selective labeling was made.

図１１（Ａ）は、通常のＢＬ２１株から抽出したＳ３０抽出液による１５Ｎ標識グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）のアミノ酸選択標識（グルタミンのみ１５Ｎ標識、残りの１９種類は非標識）によるＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。内在するアミノ酸代謝酵素によるアミノ基転移反応等により、Ｑのみならず、グルタミン酸（Ｇｌｕ， Ｅ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）のシグナルも観察された。
図１１（Ｂ）は、７種の遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）欠損ＢＬ２１株（Δ７）から抽出したＳ３０抽出液にグルタミナーゼの阻害剤であるＤＯＮを最終濃度で５ｍＭ添加し、内在するグルタミナーゼを不活化した抽出液を用いて合成したＱのアミノ酸選択標識ＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。図１１（Ｂ）に示すように、Ｑ以外のシグナルは観察されず、厳密なグルタミン選択標識がなされていることが確認された。 FIG. 11A shows the amino acid selective labeling of 15 N-labeled glutamine (Gln, Q) with an S30 extract extracted from a normal BL21 strain (glutamine only 15 N-labeled, the remaining 19 types are unlabeled). 1 H- 15 N-HSQC spectrum is shown. Signals of not only Q but also glutamic acid (Glu, E) and aspartic acid (Asp, D) were observed by transamination reaction and the like by an endogenous amino acid metabolizing enzyme.
FIG. 11 (B) shows the final concentration of DON, which is an inhibitor of glutaminase, in an S30 extract extracted from 7 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) -deficient BL21 strain (Δ7). The 1 H- 15 N-HSQC spectrum of the amino acid selective labeled UBA protein of Q synthesized using an extract added with 5 mM and inactivating the endogenous glutaminase is shown. As shown in FIG. 11B, no signals other than Q were observed, and it was confirmed that a strict glutamine selection label was made.

図１２（Ａ）は、通常のＢＬ２１株から抽出したＳ３０抽出液による１５Ｎ標識アスパラギン（Ａｓｎ， Ｎ）のアミノ酸選択標識（アスパラギンのみ１５Ｎ標識、残りの１９種類は非標識）によるＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。内在するアミノ酸代謝酵素によるアミノ基転移反応等により、Ｎのみならず、グルタミン酸（Ｇｌｕ， Ｅ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）のシグナルも観察された。
図１２（Ｂ）は、７種の遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）欠損ＢＬ２１株（Δ７）から抽出したＳ３０抽出液を用いて合成したＮのアミノ酸選択標識ＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。図１２（Ｂ）に示すように、Ｎ以外のシグナルは観察されず、厳密なグルタミン選択標識がなされていた。 FIG. 12A shows the amino acid selective labeling of 15 N-labeled asparagine (Asn, N) with S30 extract extracted from normal BL21 strain (asparagine only 15 N-labeled, the remaining 19 types are unlabeled). 1 H- 15 N-HSQC spectrum is shown. Signals of not only N but also glutamic acid (Glu, E) and aspartic acid (Asp, D) were observed due to transamination reaction by an endogenous amino acid metabolizing enzyme.
FIG. 12 (B) shows N amino acid selective labeled UBA protein synthesized using S30 extract extracted from 7 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) deficient BL21 strain (Δ7). 1 H- 15 N-HSQC spectrum is shown. As shown in FIG. 12B, no signal other than N was observed, and a strict glutamine selection label was made.

図９〜１２から明らかなように、安定同位体標識したアミノ酸代謝に関わる遺伝子を欠損させた大腸菌株より抽出したＳ３０抽出液で合成したＵＢＡドメインでは、添加した安定同位体標識アミノ酸残基のみが標識されているのに対して、遺伝子欠損していない大腸菌株抽出液で合成したＵＢＡタンパク質では、添加したアミノ酸残基以外にも比較的強いシグナルが観測された。   As is clear from FIGS. 9 to 12, in the UBA domain synthesized with the S30 extract extracted from the E. coli strain deficient in the stable isotope-labeled amino acid metabolism-related gene, only the added stable isotope-labeled amino acid residue is present. In contrast to the labeled amino acid residues, a relatively strong signal was observed in addition to the added amino acid residues in the UBA protein synthesized with the E. coli strain extract without gene deletion.

［実施例２］
実施例１の方法で安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わるそれぞれの酵素をコードした遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）の7重欠損を行った大腸菌株と、遺伝子欠損していない通常の大腸菌株のＳ３０抽出液をそれぞれ含む無細胞タンパク質合成反応液を調製し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を合成し、その生産量を活性測定により定量した。
その結果を図１３に示す。遺伝子欠損させた大腸菌より抽出したＳ３０抽出液を含む無細胞タンパク質合成系では、遺伝子欠損させていない通常の大腸菌抽出液を用いた場合に比べ合成量が３０％以上向上していることが分かる。これは、分解され易いアスパラギンやセリンの分解が抑えられたことが要因である。 [Example 2]
Escherichia coli strains in which seven-fold deletion of genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) encoding respective enzymes involved in metabolism of stable isotope-labeled amino acids by the method of Example 1, and gene deletion Cell-free protein synthesis reaction solutions each containing an S30 extract of a normal E. coli strain were prepared, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) was synthesized, and the production amount was quantified by activity measurement.
The result is shown in FIG. It can be seen that in the cell-free protein synthesis system containing the S30 extract extracted from the gene-deficient E. coli, the amount of synthesis is improved by 30% or more compared to the case of using a normal E. coli extract that is not gene-deficient. This is because the decomposition of asparagine and serine, which are easily decomposed, is suppressed.

以上の結果から、本発明の大腸菌変異体によれば、厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に合成することができる。よって、本発明の大腸菌変異体を用いて、ＮＭＲによるタンパク質立体構造解析を迅速かつ容易に行えることが明らかである。   From the above results, according to the Escherichia coli mutant of the present invention, a strict stable isotope labeled protein can be easily synthesized. Therefore, it is clear that protein three-dimensional structure analysis by NMR can be performed quickly and easily using the Escherichia coli mutant of the present invention.

［実施例３］
実施例１において作製した（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）の７重欠損を行った大腸菌株をもとに、さらにアスパラギン酸アンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定し、ａｓｐＡ（配列番号３１）の遺伝子配列情報を得た。
次に決定した遺伝子配列に基づき、実施例１の方法で上記遺伝子情報に基づいてａｓｐＡのプロモーター配列（開始コドンＡＴＧのＡから−１０５塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。また、ａｓｐＡ遺伝子（配列番号３１）で表される配列が欠損していることがＤＮＡシークエンサーにより確認された。 [Example 3]
Based on the E. coli strain in which the seven-deficiency of (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) prepared in Example 1 was performed, a gene sequence encoding aspartate ammonia lyase was further expressed as a DNA sequencer Applied Biosystems. As determined by 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems), gene sequence information of aspA (SEQ ID NO: 31) was obtained.
Next, based on the determined gene sequence, deletion was performed from the promoter sequence of aspA (-105 base upstream from A of start codon ATG) to A of stop codon TAA based on the above gene information by the method of Example 1. Moreover, it was confirmed by a DNA sequencer that the sequence represented by the aspA gene (SEQ ID NO: 31) was defective.

更に、ＢＬ２１野生株（ｗｔ）及び８遺伝子欠損株（Δ８）において、各８遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢおよびａｓｐＡ）を増幅するためのプライマーを用意し、各遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ後の各反応液を、アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。図１４に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図１４中、レーン１から１４については、実施例１に記載の7遺伝子欠損株（Δ７）と同様である。レーン１５はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｓｐＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号３０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１６は８遺伝子欠損株（Δ８）を鋳型とし、ａｓｐＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号３０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、左端と右側のＭｒは５００ｂｐＤＮＡラダーマーカーである。図１４右に、ＢＬ２１野生株（ｗｔ）及び８遺伝子欠損株（Δ８）をそれぞれ鋳型としたときに、予想される各遺伝子の増幅断片の大きさを示す。
図１４に示すように、８遺伝子欠損株（Δ８）を鋳型として各遺伝子を増幅させたレーン（レーン２，４，６，８，１０，１２，１４、１６）では、ＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型として各遺伝子を増幅させたレーン（レーン１，３，５，７，９，１１，１３、１５）と比較して増幅断片が短く、標的遺伝子の欠損がなされていることが確認された。 Furthermore, primers for amplifying each of the 8 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB and aspA) in the BL21 wild type (wt) and the 8 gene-deficient strain (Δ8) were prepared. Was amplified. Each reaction solution after PCR was applied to an agarose gel and subjected to electrophoresis, and then the agarose gel was stained with ethidium bromide. FIG. 14 shows an ethidium bromide-stained image of the agarose gel after electrophoresis.
In FIG. 14, lanes 1 to 14 are the same as the 7-gene deletion strain (Δ7) described in Example 1. Lane 15 uses BL21 wild type (wt) as a template, a primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 as a forward primer for amplifying the aspA gene, and a primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 30 as a reverse primer Lane 16 is represented by a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 as a forward primer for amplifying the aspA gene and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 30. Each of the lanes was applied with a reaction solution using a primer having a base sequence.
The left and right Mrs are 500 bp DNA ladder markers. The right side of FIG. 14 shows the expected amplified fragment size of each gene when BL21 wild type (wt) and 8 gene-deficient strain (Δ8) are used as templates.
As shown in FIG. 14, in the lanes (lanes 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16) in which each gene was amplified using 8 gene-deficient strain (Δ8) as a template, BL21 wild strain (wt) Compared to the lanes (lanes 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15) in which each gene was amplified using as a template, it was confirmed that the amplified fragment was short and the target gene was deleted. .

また、作製した８遺伝子欠損株（Δ８）及び通常のＢＬ２１株の増殖速度を比較した。結果を図１５に示す。グルタミンシンセターゼの遺伝子であるｇｌｎＡおよびアスパラギン酸アンモニアリアーゼの遺伝子であるａｓｐＡの欠損により、８遺伝子欠損株の増殖速度が遅くなる傾向が見られたが、培養時に終濃度で０．５ｍＭのＬ−グルタミンと終濃度で３０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを培養液に添加することで、通常のＢＬ２１とほぼ同等の増殖速度を示したものの、到達濁度は、通常のＢＬ２１株と比較して若干低かった。ただし、８遺伝子欠損株よりＳ３０抽出液を調製し、無細胞タンパク質合成反応を実施したところ、遺伝子欠損していないＢＬ２１株より調製したものと比べ遜色のないタンパク質合成量を示し、実用上十分耐えるものであった。   Further, the growth rates of the prepared 8-gene-deficient strain (Δ8) and the normal BL21 strain were compared. The results are shown in FIG. The growth rate of the 8-gene-deficient strain tended to be slow due to the deletion of glnA, which is a gene for glutamine synthetase, and aspA, which is a gene for ammonia aspartate lyase. Addition of glutamine and 30 mM sodium pyruvate at a final concentration to the culture showed a growth rate almost equivalent to that of normal BL21, but the ultimate turbidity was slightly lower than that of the normal BL21 strain. However, when an S30 extract was prepared from 8 gene-deficient strains and a cell-free protein synthesis reaction was performed, the amount of protein synthesis was inferior to that of those prepared from BL21 strains that were not gene-deficient, and practically well tolerated. It was a thing.

［実施例４］
実施例の方法で安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わるそれぞれの酵素をコードした７遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）の欠損を行った大腸菌株と、遺伝子欠損していない通常の大腸菌株のＳ３０抽出液およびアミノ酸代謝阻害剤として、アミノオキシ酢酸、Ｌ−ブチオニンスルホキシイミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンを添加した場合と添加しない場合とでそれぞれ鋳型ＤＮＡを含まない無細胞タンパク質合成反応液を調製し，３０℃で１時間反応させ、添加したアミノ酸の安定性をアミノ酸分析計（Ｗａｔｅｒｓ）で評価した。無細胞タンパク質合成反応液において、主に分解されるアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニン、セリンの５種類であり、それぞれのアミノ酸量の変化を０分、３０分および６０分後に調べた結果を図１６に示す。遺伝子欠損していない大腸菌（ｗｔ）より調製した無細胞タンパク質合成反応液では、阻害剤を添加しない場合では、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニンおよびセリンの分解が見られた。一方、７重遺伝子欠損させた大腸菌（Δ７）から調製した無細胞タンパク質合成反応液では、遺伝子欠損していない大腸菌の場合と比較して、アスパラギンとセリンの分解が顕著に抑えられていた。さらに、阻害剤を添加した、７重遺伝子欠損させた大腸菌（Δ７）から調製した無細胞タンパク質合成反応液では、上記に加え、グルタミンおよびアルギニンの分解が抑えられていた。 [Example 4]
E. coli strain in which 7 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB) encoding each enzyme involved in metabolism of stable isotope-labeled amino acids by the method of Example were deleted, and the gene was deleted. S30 extract of normal E. coli strains and amino acid metabolism inhibitors with and without aminooxyacetic acid, L-butionine sulfoximine, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine A cell-free protein synthesis reaction solution containing no template DNA was prepared, reacted at 30 ° C. for 1 hour, and the stability of the added amino acid was evaluated with an amino acid analyzer (Waters). In the cell-free protein synthesis reaction solution, there are five types of amino acids that are mainly decomposed: asparagine, aspartic acid, glutamine, arginine, and serine. Changes in the amount of each amino acid were examined after 0 minutes, 30 minutes, and 60 minutes. The results are shown in FIG. In the cell-free protein synthesis reaction solution prepared from Escherichia coli (wt) not gene-deficient, degradation of asparagine, aspartic acid, glutamine, arginine and serine was observed when no inhibitor was added. On the other hand, in the cell-free protein synthesis reaction solution prepared from Escherichia coli (Δ7) deficient in 7-fold genes, the degradation of asparagine and serine was remarkably suppressed as compared with the case of Escherichia coli without gene deficiency. Furthermore, in addition to the above, in the cell-free protein synthesis reaction solution prepared from Escherichia coli (Δ7) deficient in 7-fold genes to which an inhibitor was added, degradation of glutamine and arginine was suppressed.

実施例４の方法で安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わるそれぞれの酵素をコードした８遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ, ａｓｐＡ）の欠損を行った大腸菌株と、遺伝子欠損していない通常の大腸菌株のＳ３０抽出液およびアミノ酸代謝阻害剤として、アミノオキシ酢酸、Ｌ−ブチオニンスルホキシイミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンを添加した場合と添加しない場合とでそれぞれ鋳型ＤＮＡを含まない無細胞タンパク質合成反応液を調製し，３０℃で１時間反応させ、添加したアミノ酸の安定性をアミノ酸分析計（Ｗａｔｅｒｓ）で評価した。それぞれのアミノ酸量の変化を０分、３０分および６０分後に調べた結果を図１７に示す。遺伝子欠損していない大腸菌（ＷＴ）より調製した無細胞タンパク質合成反応液では、阻害剤を添加しない場合では、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニンおよびセリンの分解が見られた。一方、８重遺伝子欠損させた大腸菌（Δ８）から調製した無細胞タンパク質合成反応液では、遺伝子欠損していない大腸菌の場合と比較して、アスパラギン、アスパラギン酸およびセリンの分解が顕著に抑えられていた。さらに、阻害剤を添加した、８重遺伝子欠損させた大腸菌（Δ８）から調製した無細胞タンパク質合成反応液では、上記に加え、グルタミンおよびアルギニンの分解が抑えられ、無細胞タンパク質合成反応中に内在性の酵素により分解されるアミノ酸全ての分解を抑えることができていた。   E. coli strain in which 8 genes (asnA, asnB, ansA, ansB, glnA, sdaA, sdaB, aspA) encoding each enzyme involved in the metabolism of stable isotope-labeled amino acids by the method of Example 4 were deleted, and the gene With or without the addition of aminooxyacetic acid, L-butionine sulfoximine, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine as an S30 extract of normal E. coli strains and amino acid metabolism inhibitors that are not deficient A cell-free protein synthesis reaction solution containing no template DNA was prepared and reacted at 30 ° C. for 1 hour, and the stability of the added amino acid was evaluated with an amino acid analyzer (Waters). FIG. 17 shows the results of examining changes in the amount of each amino acid after 0 minutes, 30 minutes, and 60 minutes. In a cell-free protein synthesis reaction solution prepared from Escherichia coli (WT) that was not gene-deficient, asparagine, aspartic acid, glutamine, arginine, and serine were decomposed when no inhibitor was added. On the other hand, in the cell-free protein synthesis reaction solution prepared from E. coli (Δ8) deficient in 8-fold genes, the degradation of asparagine, aspartic acid and serine was significantly suppressed as compared with E. coli without gene deficiency. It was. Furthermore, in addition to the above, the cell-free protein synthesis reaction solution prepared from E. coli (Δ8) deficient in the 8-fold gene to which an inhibitor has been added suppresses the decomposition of glutamine and arginine, and is inherent in the cell-free protein synthesis reaction. It was possible to suppress the degradation of all amino acids that are degraded by sex enzymes.

以上の結果から、本発明の大腸菌変異体によれば、厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に合成することができる。よって、本発明の大腸菌変異体を用いて、ＮＭＲによるタンパク質立体構造解析を迅速かつ容易に行えることが明らかである。   From the above results, according to the Escherichia coli mutant of the present invention, a strict stable isotope labeled protein can be easily synthesized. Therefore, it is clear that protein three-dimensional structure analysis by NMR can be performed quickly and easily using the Escherichia coli mutant of the present invention.

Claims (12)

アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ及びトリプトファナーゼからなる群から選ばれる二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活していることを特徴とする大腸菌変異体。   Enzyme activity of two or more metabolic enzymes selected from the group consisting of asparaginase, serine deaminase, glutamine synthetase, γ-glutamylcysteine synthetase, aspartate ammonia lyase, asparagine synthetase, arginine decarboxylase and tryptophanase is reduced or An Escherichia coli mutant characterized by being inactivated. ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ｇｓｈＡ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、ａｓｎＢ遺伝子、ｓｐｅＡ遺伝子、及びｔｎａＡ遺伝子からなる群から選ばれる二種以上の遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が置換又は欠損している請求項１に記載の大腸菌変異体。   Among two or more genes selected from the group consisting of ansA gene, ansB gene, sdaA gene, sdaB gene, glnA gene, gshA gene, aspA gene, asnA gene, asnB gene, speA gene, and tnaA gene. The Escherichia coli mutant according to claim 1, wherein at least a part of the base is substituted or deleted. ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損している請求項１又は２に記載の大腸菌変異体。   The Escherichia coli mutant according to claim 1 or 2, wherein at least a part of bases in each gene is missing in all genes of the group consisting of ansA gene, ansB gene, asnA gene, and asnB gene. ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損している請求項１〜３のいずれか一項に記載の大腸菌変異体。   4. All genes in the group consisting of ansA gene, ansB gene, sdaA gene, sdaB gene, glnA gene, asnA gene, and asnB gene are deficient in at least some of the genes. The E. coli mutant according to any one of the above. ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損している請求項１〜４のいずれか一項に記載の大腸菌変異体。   An all-gene group consisting of ansA gene, ansB gene, sdaA gene, sdaB gene, glnA gene, aspA gene, asnA gene, and asnB gene, wherein at least a part of the bases in each gene is missing. The E. coli mutant according to any one of 1 to 4. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸菌変異体より抽出されたことを特徴とする抽出液。   An extract extracted from the Escherichia coli mutant according to any one of claims 1 to 5. 請求項６に記載の抽出液を含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成反応液。   A cell-free protein synthesis reaction solution comprising the extract according to claim 6. 更に、アミノオキシ酢酸、Ｌ−メチオニンスルホキシイミン、Ｌ−ブチオニンスルホキシイミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、５−ジアゾ−４−オキソ−Ｌ−ノルバリン、Ｓ−メチル−Ｌ−システインスルホキシイミン、及びＤ−リンゴ酸からなる群から選ばれる一種以上のアミノ酸代謝阻害剤を含有する請求項７に記載の無細胞タンパク質合成反応液。   Further, aminooxyacetic acid, L-methionine sulfoximine, L-butionine sulfoximine, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, 5-diazo-4-oxo-L-norvaline, S-methyl-L The cell-free protein synthesis reaction solution according to claim 7, comprising at least one amino acid metabolism inhibitor selected from the group consisting of -cysteine sulfoximine and D-malic acid. 請求項７又は８に記載の無細胞タンパク質合成反応液を含有することを特徴とする安定同位体標識タンパク質合成キット。   A stable isotope-labeled protein synthesis kit comprising the cell-free protein synthesis reaction solution according to claim 7 or 8. 請求項７又は８に記載の無細胞タンパク質合成反応液を用いることを特徴とする安定同位体標識タンパク質の製造方法。   A method for producing a stable isotope-labeled protein, wherein the cell-free protein synthesis reaction solution according to claim 7 or 8 is used. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸菌変異体をグルタミン含有培地で培養することを特徴とする大腸菌変異体の培養方法。   A method for culturing an Escherichia coli mutant, comprising culturing the Escherichia coli mutant according to any one of claims 1 to 5 in a glutamine-containing medium. 前記グルタミン含有培地は、更にピルビン酸ナトリウムを含有する請求項１１に記載の大腸菌変異体の培養方法。   The method for culturing an E. coli mutant according to claim 11, wherein the glutamine-containing medium further contains sodium pyruvate.
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