JP2016057219A - Mass analysis data processing method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、質量分析データの処理方法に関する。 The present invention relates to a method for processing mass spectrometry data.
生命科学の研究や医療、医薬品開発などの分野においては、生体試料を対象としてタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖、脂肪酸、有機酸など様々な物質を網羅的に同定し定量することが重要である。このうち、比較的低分子であるアミノ酸、脂肪酸又は有機酸を測定対象として網羅的に解析する場合をメタボローム解析と称し、タンパク質やペプチドを測定対象として網羅的に解析する場合はプロテオーム解析と称している。これらの物質の網羅的解析において、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、キャピラリー電気泳動等の成分分離装置と、質量分析装置とを組合せた解析手法が非常に大きな威力を発揮している。 In fields such as life science research, medicine, and drug development, it is important to comprehensively identify and quantify various substances such as proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, sugar chains, fatty acids, and organic acids in biological samples. It is. Of these, the case of comprehensive analysis of amino acids, fatty acids, or organic acids, which are relatively low molecules, as measurement targets is called metabolome analysis, and the case of comprehensive analysis of proteins and peptides as measurement targets is called proteome analysis. Yes. In the comprehensive analysis of these substances, an analysis method combining a component analyzer such as a gas chromatograph, a liquid chromatograph, a capillary electrophoresis and a mass spectrometer is very powerful.
現在のところ、例えば、液体クロマトグラフと質量分析装置とを組合せた解析手法により医療診断や病因解析を行う場合、複数のマスクロマトグラフを比較して解析することが行われている。
液体クロマトグラフィーと質量分析装置とを組合せた解析手法により複数のマスクロマトグラフを比較して解析する方法の１つの例として、特許文献１に記載の方法がある。特許文献１にはメタボローム解析における生体物質及び代謝物の同定方法が記載されている。特許文献１に記載の方法では、質量分析データにおいてサンプルごとに精密質量及び保持時間の少なくとも一方の昇順又は降順にイオン強度を並べ替え、又はサンプルごとにイオン強度の降順に精密質量及び保持時間の少なくとも一方を並べ替え、並べ替えたデータについてサンプル間で比較して精密質量又は保持時間の少なくとも一方の一致又は不一致を検索し、一致した精密質量又は保持時間の少なくとも一方について精密質量及び保持時間に基づいて物質名を同定する。
At present, for example, when performing a medical diagnosis or pathogenesis analysis by an analysis method combining a liquid chromatograph and a mass spectrometer, a plurality of mass chromatographs are compared and analyzed.
As an example of a method for comparing and analyzing a plurality of mass chromatographs by an analysis method combining liquid chromatography and a mass spectrometer, there is a method described in Patent Document 1. Patent Document 1 describes a method for identifying biological substances and metabolites in metabolomic analysis. In the method described in Patent Document 1, the ion mass is rearranged in ascending or descending order of at least one of the accurate mass and the retention time for each sample in the mass spectrometry data, or the accurate mass and the retention time are decreased in descending order of the ion intensity for each sample. Sort at least one and compare the sorted data between samples to find at least one match or mismatch in exact mass or retention time, and find exact mass and retention time for at least one of the matched exact mass or retention time The substance name is identified based on this.
ここで、質量分析用試料に含まれる非常に多種の測定対象成分の精密質量、イオン強度及び保持時間の情報を含む、複数の質量分析データを比較する場合、同一の測定対象成分の保持時間は同一であることが、データ処理の簡便性の観点から好ましい。しかし実際は、分離操作等の条件などにより、同一の測定対象成分であっても保持時間にずれが生じる。
質量分析データの処理方法の信頼性を高める上で、測定対象物質を特定するために、異なる分析用試料間で生じるこのような保持時間のずれを補正する必要がある。しかし、試料の成分組成、分離カラムの種類、溶出液の組成、溶出液の流速等、保持時間に影響を及ぼす要素は多岐にわたる。したがって、同一の測定対象成分で生じた保持時間のずれを補正する作業は、非常に煩雑かつ困難である。
Here, when comparing multiple mass spectrometry data, including accurate mass, ionic strength, and retention time information for a wide variety of measurement target components contained in a sample for mass spectrometry, the retention time for the same measurement target component is The same is preferable from the viewpoint of simplicity of data processing. However, in practice, the retention time varies even with the same component to be measured due to conditions such as separation operation.
In order to increase the reliability of the method of processing mass spectrometry data, it is necessary to correct such a shift in retention time that occurs between different analytical samples in order to specify a measurement target substance. However, there are various factors that affect the retention time, such as the composition of the sample, the type of separation column, the composition of the eluate, and the flow rate of the eluate. Therefore, it is very cumbersome and difficult to correct the shift of the holding time caused by the same component to be measured.
そこで本発明は、質量分析データの処理において同一の測定対象成分間で一致させることが困難な保持時間の情報によらず、複数の質量分析用試料間で質量分析データの比較及び解析を正確かつ簡便に行う、質量分析データの処理方法の提供を課題とする。
さらに本発明は、質量分析データの処理において同一の測定対象成分間で一致させることが困難な保持時間の情報によらず、複数の質量分析用試料間で質量分析データの比較及び解析を正確かつ簡便に行う、質量分析装置の提供を課題とする。
Therefore, the present invention accurately compares and analyzes mass spectrometry data between a plurality of samples for mass spectrometry, regardless of the retention time information that is difficult to match between the same components to be measured in mass spectrometry data processing. It is an object of the present invention to provide a mass spectrometry data processing method that is simply performed.
Furthermore, the present invention provides accurate and accurate comparison and analysis of mass spectrometry data between a plurality of samples for mass spectrometry, regardless of retention time information that is difficult to match between the same components to be measured in mass spectrometry data processing. It is an object to provide a mass spectrometer that is simply performed.
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。
具体的には、本発明者らは、相互分離した測定対象成分を高分解能質量分析装置で分析して得られた、測定対象成分の精密質量（以下、「m/z値」ともいう）、イオン強度及び保持時間の情報を含む３次元の質量分析データから測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去し、続いて、イオン強度の情報を全てm/z軸上に蓄積して、m/z値及びイオン強度の情報を含む２次元の質量分析データに変換した。そして、m/z値で測定対象成分を区別し、異なる質量分析用試料間で２次元に変換した質量分析データを比較することで、保持時間の情報によらず正確かつ簡便に複数の質量分析用試料間で質量分析データの比較及び解析が可能となることを見出した。
本発明はこの知見に基づき完成されるに至ったものである。
The present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems.
Specifically, the present inventors obtained the accurate mass (hereinafter also referred to as “m / z value”) of the measurement target component obtained by analyzing the measurement target components separated from each other with a high-resolution mass spectrometer. The information derived from the isotope of the component to be measured and the information derived from noise are removed from the three-dimensional mass spectrometry data including the information of the ion intensity and the retention time, and then all the information of the ion intensity is on the m / z axis And converted into two-dimensional mass spectrometry data including m / z value and ion intensity information. By distinguishing components to be measured by m / z values and comparing the two-dimensionally converted mass spectrometry data between different mass spectrometry samples, multiple mass analyzes can be performed accurately and easily regardless of retention time information. It was found that mass spectrometric data can be compared and analyzed between samples.
The present invention has been completed based on this finding.
本発明は、質量分析データの処理方法であって、
（ａ）質量分析用試料に含まれる測定対象成分を分離し、
（ｂ）高分解能質量分析装置を用いて、分離した測定対象成分それぞれをイオン化して精密質量及びイオン強度を測定し、
（ｃ）得られた精密質量及びイオン強度のデータから、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去し、
（ｄ）質量分析用試料ごとに測定した全てのイオン強度の情報を精密質量ごとに蓄積して、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを得、
（ｅ）得られた質量分析データを少なくとも２つの質量分析用試料間で比較し、精密質量の一致又は不一致を検知し、
（ｆ）前記少なくとも２つの質量分析用試料間で、精密質量が一致するイオン強度同士の差分又は比を算出し、質量分析データの比較及び解析を行う、
質量分析データの処理方法に関する。
The present invention is a method of processing mass spectrometry data,
(A) separating the measurement target component contained in the sample for mass spectrometry,
(B) Using a high-resolution mass spectrometer, each separated component to be measured is ionized to measure accurate mass and ionic strength,
(C) From the obtained accurate mass and ionic strength data, information derived from the isotope of the measurement target component and information derived from noise are removed,
(D) Accumulating all ionic strength information measured for each sample for mass spectrometry for each accurate mass, obtaining mass spectrometry data including information on the precise mass and ionic strength of each measurement target component,
(E) comparing the obtained mass spectrometry data between at least two mass spectrometry samples to detect coincidence or inconsistency of the exact mass;
(F) calculating the difference or ratio between the ion intensities having the same exact mass between the at least two samples for mass spectrometry, and comparing and analyzing the mass spectrometry data;
The present invention relates to a method for processing mass spectrometry data.
また本発明は、前記質量分析データの処理方法に基づき、少なくとも２つの質量分析用試料間で、測定対象成分それぞれの量を比較する方法に関する。 The present invention also relates to a method for comparing the amount of each component to be measured between at least two mass spectrometry samples based on the mass spectrometry data processing method.
さらに本発明は、
分離した測定対象成分をイオン化する、イオン化部、
前記イオン化部によりイオン化された測定対象成分の精密質量及びイオン強度を高分解能で測定し、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを検出する、質量分析部、及び
前記質量分析部により得られた質量分析データの比較及び解析を行う、情報処理部、
を有し、
前記情報処理部が、
前記質量分析部が検出した質量分析データから測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去し、
続けて、質量分析用試料ごとに全てのイオン強度の情報を精密質量ごとに蓄積して、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを作製し、
作製した質量分析データを少なくとも２つの質量分析用試料間で比較し、精密質量の一致又は不一致を検知し、
前記少なくとも２つの質量分析用試料間で、精密質量が一致するイオン強度同士の差分又は比を算出し、質量分析データの比較及び解析を行う、
質量分析装置に関する。
Furthermore, the present invention provides
An ionization unit that ionizes the separated measurement target component,
A mass analysis unit that measures the accurate mass and ion intensity of the measurement target component ionized by the ionization unit with high resolution, and detects mass spectrometry data including information on the accurate mass and ion intensity of each measurement target component; and An information processing unit that compares and analyzes mass spectrometry data obtained by the mass analysis unit,
Have
The information processing unit
The information derived from the isotope of the measurement target component and the information derived from noise are removed from the mass spectrometry data detected by the mass spectrometer,
Next, for each sample for mass spectrometry, information on all ionic strengths is accumulated for each accurate mass, and mass spectrometry data including information on the accurate mass and ionic strength of each measurement target component is created.
Compare the created mass spectrometry data between at least two mass spectrometry samples, detect exact mass match or mismatch,
Calculate the difference or ratio between the ionic strengths of which the exact masses match between the at least two mass spectrometry samples, and compare and analyze the mass spectrometry data.
The present invention relates to a mass spectrometer.
本発明の質量分析データの処理方法は、質量分析データの処理において同一の測定対象成分間で一致させることが困難な保持時間の情報によらず、複数の質量分析用試料間で質量分析データの比較及び解析を行うことができる。そのため、保持時間と、精密質量及びイオン強度との間での対応付けを回避することができ、質量分析データの処理を正確かつ簡便に行うことができる。
さらに本発明の質量分析装置は、質量分析データの処理において同一の測定対象成分間で一致させることが困難な保持時間の情報によらず、複数の質量分析用試料間で質量分析データの比較及び解析を正確かつ簡便に行うことができる。
また、偶然に保持時間が一致した異なる測定対象成分を、誤って同一の測定対象成分と認識することを防止することができる。
The mass spectrometry data processing method according to the present invention is not related to the retention time information that is difficult to match between the same components to be measured in the mass spectrometry data processing, and the mass spectrometry data can be processed between a plurality of mass spectrometry samples. Comparison and analysis can be performed. Therefore, it is possible to avoid the correspondence between the retention time, the accurate mass, and the ionic strength, and the mass analysis data can be processed accurately and simply.
Furthermore, the mass spectrometer of the present invention is capable of comparing mass analysis data between a plurality of samples for mass spectrometry, regardless of retention time information that is difficult to match between the same components to be measured in the processing of mass spectrometry data. Analysis can be performed accurately and easily.
In addition, it is possible to prevent different measurement target components having the same retention times from being accidentally recognized as the same measurement target component.
本発明における「質量分析」とは、測定対象物質の定量値を絶対値又は相対値で算出し分析することの他に、質量分析試料間で同種の測定対象物質の含有量を比較することを含む概念である。
また本発明における「質量分析用試料」は、複数の測定対象物質を含む試料であり、プロテオーム解析やメタボローム解析の対象となる生体由来の試料が好ましい。質量分析用試料の例としては、血液（血清、血漿）、尿、体液、培養液、細胞、組織抽出物などが挙げられる。また「質量分析用試料に含まれる測定対象成分」としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖、脂肪酸、有機酸などが挙げられる。このうち、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸が好ましい。なお本明細書において、「タンパク質」、「ペプチド」及び「アミノ酸」は、タンパク質の酵素処理産物をも含む概念で用いる。
In the present invention, “mass spectrometry” refers to comparing the content of the same kind of measurement target substance between mass spectrometry samples in addition to calculating and analyzing the quantitative value of the measurement target substance as an absolute value or relative value. It is a concept that includes.
Moreover, the “sample for mass spectrometry” in the present invention is a sample containing a plurality of substances to be measured, and is preferably a sample derived from a living body that is a target of proteome analysis or metabolome analysis. Examples of the sample for mass spectrometry include blood (serum, plasma), urine, body fluid, culture fluid, cell, tissue extract and the like. Examples of the “component to be measured contained in the sample for mass spectrometry” include proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, sugar chains, fatty acids, organic acids and the like. Of these, proteins, peptides and amino acids are preferred. In the present specification, “protein”, “peptide” and “amino acid” are used in a concept including an enzyme treatment product of protein.
本発明の質量分析データの処理方法における処理手順について、図１に示すフローチャートに基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。 A processing procedure in the mass spectrometry data processing method of the present invention will be described based on the flowchart shown in FIG. However, the present invention is not limited to this.
［ステップＳ１１］測定対象成分の分離
まず、質量分析用試料に含まれる測定対象成分の分離を行う。測定対象成分の分離は、質量分析に供した際に各測定対象成分のイオン化に相互に影響を及ぼさない程度まで行われていることが好ましい。さらに、各測定対象成分のイオン化による質量分析への影響が無視できる程度まで、測定対象成分を分離することが好ましい。
測定対象成分の分離は、常法により行うことができる。例えば、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ又はキャピラリー電気泳動装置等を用いて、測定対象成分を分離することができる。また、測定対象成分を分離する方法は前記方法に限られることはなく、例えば、測定対象成分の極性差、分子量差等に基づいて、測定対象成分を分離することができる。
前記液体クロマトグラフとしては、溶離液を送液する高圧グラジエントポンプ、質量分析用試料を導入するオートインジェクター、及び充填剤を充填した分離カラムを備えた液体クロマトグラフを用いることができる。充填剤は微粒子型又はモノリス型等を用いることができる。また前記ガスクロマトグラフとしては、質量分析用試料を導入する試料導入部、導入した試料を分離カラムに移動させるガスを導入するキャリアガス導入部、及び充填剤を充填した分離カラムを備えたガスクロマトグラフを用いることができる。さらに前記キャピラリー電気泳動装置としては、質量分析用試料を導入する試料導入部、及びゲルを充填したキャピラリーを備えたキャピラリー電気泳動装置を用いることができる。
[Step S11] Separation of measurement target component First, a measurement target component contained in a sample for mass spectrometry is separated. It is preferable that the measurement target component is separated to the extent that it does not affect the ionization of each measurement target component when subjected to mass spectrometry. Furthermore, it is preferable to separate the measurement target components to such an extent that the influence on the mass spectrometry by ionization of each measurement target component can be ignored.
The component to be measured can be separated by a conventional method. For example, the component to be measured can be separated using a gas chromatograph, a liquid chromatograph, a capillary electrophoresis apparatus, or the like. Further, the method for separating the measurement target component is not limited to the above method, and for example, the measurement target component can be separated based on the polarity difference, the molecular weight difference, or the like of the measurement target component.
As the liquid chromatograph, a high-pressure gradient pump for feeding an eluent, an autoinjector for introducing a sample for mass spectrometry, and a liquid chromatograph equipped with a separation column packed with a filler can be used. The filler may be a fine particle type or a monolith type. The gas chromatograph includes a sample introduction part for introducing a sample for mass spectrometry, a carrier gas introduction part for introducing a gas for moving the introduced sample to the separation column, and a gas chromatograph provided with a separation column filled with a packing material. Can be used. Furthermore, as the capillary electrophoresis apparatus, a capillary electrophoresis apparatus having a sample introduction part for introducing a sample for mass spectrometry and a capillary filled with a gel can be used.
［ステップＳ１２］測定対象成分の精密質量及びイオン強度の測定
次に、ステップＳ１１で分離した各測定対象成分のイオン化を行う。測定対象成分のイオン化方法としては通常のイオン化方法より適宜選択することができる。具体例としては、エレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法、大気圧光イオン化法、電子イオン化法、化学イオン化法、高速原子衝撃法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法などが挙げられる。本発明において、測定対象成分のm/z値の検出感度の観点から、エレクトロスプレーイオン化法が好ましい。
[Step S12] Measurement of accurate mass and ionic strength of measurement target component Next, each measurement target component separated in step S11 is ionized. The ionization method for the component to be measured can be appropriately selected from ordinary ionization methods. Specific examples include electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, atmospheric pressure photoionization, electron ionization, chemical ionization, fast atom bombardment, matrix-assisted laser desorption ionization, and the like. In the present invention, the electrospray ionization method is preferable from the viewpoint of the detection sensitivity of the m / z value of the component to be measured.
そしてイオン化された測定対象成分について、高分解能質量分析装置を用いてm/z値及びイオン強度を測定する。
ここで「高分解能質量分析装置」とは、測定対象成分のm/z値を小数点以下４桁以上のオーダーで測定できる質量分析装置をいう。小数点以下４桁以上のオーダーでm/z値を測定することで、m/z値のみに基づいて測定対象物質種を特定し同定することができる。質量分析の測定原理としては、フーリエ変換型質量分析（以下、「FT/MS」ともいう）、飛行時間型質量分析（以下、「TOF」ともいう）、イオントラップ型質量分析、磁場偏向型質量分析、四重極型質量分析、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析（以下、「FT/ICR-MS」ともいう）、加速器質量分析、タンデム型質量分析が挙げられる。本発明ではこれらの測定原理のうち、１０％谷定義Ｒ10%が５，０００以上のもの、及び／又は半値幅ＲFWHMが１０，０００以上のものから好適に選択することができる。
本発明で好ましく用いることができる高分解能質量分析装置の具体例としては、FT/ICR-MSタイプの分析装置、FT-Orbitrapタイプの分析装置、High-Ref-TOFタイプの分析装置が挙げられる。
Then, the m / z value and ion intensity of the ionized measurement target component are measured using a high resolution mass spectrometer.
Here, the “high resolution mass spectrometer” refers to a mass spectrometer capable of measuring the m / z value of the measurement target component in the order of four digits after the decimal point. By measuring the m / z value in the order of 4 digits or more after the decimal point, it is possible to identify and identify the measurement target substance type based only on the m / z value. The measurement principle of mass spectrometry includes Fourier transform mass spectrometry (hereinafter also referred to as “FT / MS”), time-of-flight mass spectrometry (hereinafter also referred to as “TOF”), ion trap mass spectrometry, and magnetic field deflection mass. Analysis, quadrupole mass spectrometry, Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (hereinafter also referred to as “FT / ICR-MS”), accelerator mass spectrometry, and tandem mass spectrometry. In the present invention, among these measurement principles, a 10% valley definition R 10% of 5,000 or more and / or a half width R FWHM of 10,000 or more can be suitably selected.
Specific examples of high-resolution mass spectrometers that can be preferably used in the present invention include FT / ICR-MS type analyzers, FT-Orbitrap type analyzers, and High-Ref-TOF type analyzers.
［ステップＳ１３］測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報の除去
後述するステップＳ１４における全てのイオン強度の情報をm/z値ごとに蓄積する前に、質量分析データから、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去する。測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去することで、測定対象物質の検出を確実に行うことができるとともに、質量分析データの処理が容易となる。
[Step S13] Removal of information derived from isotopes of components to be measured and information derived from noise Before accumulating all ion intensity information in step S14 described later for each m / z value, from mass spectrometry data, Information derived from isotopes of components to be measured and information derived from noise are removed. By removing the information derived from the isotope of the measurement target component and the information derived from the noise, the measurement target substance can be reliably detected and the mass spectrometry data can be easily processed.
前記ステップＳ１２において、エレクトロスプレーイオン化法などに付して測定対象成分をイオン化した場合、１価のイオンのほかに多価イオンも生成する場合がある。この場合、ステップＳ１３で取得する質量分析データでは、多価イオンに由来するピークの情報が、１価のイオンに由来するピークに対して1/z（zはイオン価数を表す）の間隔で出現する。
そこで本発明では、全てのイオン強度の情報をm/z値ごとに蓄積する前に、観測されたピークが多価イオンに由来するピークであるかを判断することが好ましい。そして、観測されたピークが多価イオンに由来するピークである場合、その情報を測定対象成分の同位体に由来する情報として、得られた質量分析データから除去することができる。
In step S12, when the component to be measured is ionized by electrospray ionization or the like, multivalent ions may be generated in addition to monovalent ions. In this case, in the mass spectrometry data acquired in step S13, the peak information derived from multivalent ions is 1 / z (z represents the ion valence) with respect to the peak derived from monovalent ions. Appear.
Therefore, in the present invention, it is preferable to determine whether or not the observed peak is a peak derived from multivalent ions before storing all ion intensity information for each m / z value. And when the observed peak is a peak derived from multivalent ions, the information can be removed from the obtained mass spectrometry data as information derived from the isotope of the measurement target component.
また、前述のノイズとしては、主に高分解能質量分析装置特有の機械的なノイズが挙げられる。
機械的なノイズは、測定対象成分を含まない試料に対して前述と同様の操作を行い、質量分析データに出現したピークを機械的ノイズとして予め特定する。そして、全てのイオン強度の情報をm/z値ごとに蓄積する前に、機械的ノイズとして特定したピークの情報の除去を行うことが好ましい。
あるいは、機械的ノイズは、前述の同位体のパターンを示さない。したがって、前述した同位体を特定する際に、同位体のパターンを示さないと判断したピークを機械的ノイズとして除去することが好ましい。
Moreover, as the above-mentioned noise, mechanical noise peculiar to a high-resolution mass spectrometer is mainly mentioned.
For mechanical noise, the same operation as described above is performed on a sample that does not contain the component to be measured, and a peak that appears in the mass spectrometry data is specified in advance as mechanical noise. It is preferable to remove the peak information specified as mechanical noise before storing all the ion intensity information for each m / z value.
Alternatively, the mechanical noise does not show the aforementioned isotope pattern. Therefore, when specifying the isotope described above, it is preferable to remove a peak determined not to show an isotope pattern as mechanical noise.
［ステップＳ１４］精密質量及びイオン強度を含む質量分析データの取得
次に、各測定対象成分の全てのイオン強度を精密質量ごとに蓄積し、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度を含む質量分析データを取得する。このステップにより、生じたずれの補正が困難な、各測定対象成分の保持時間の情報を含まない質量分析データを得ることができる。
以下、精密質量及びイオン強度を含む質量分析データの取得方法の１例を図２に示す概略図に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
[Step S14] Acquisition of Mass Analysis Data Including Accurate Mass and Ion Strength Next, all the ion intensities of each measurement target component are accumulated for each accurate mass, and mass analysis including the accurate mass and ion intensity of each measurement target component Get the data. By this step, it is possible to obtain mass spectrometry data that does not include information on the retention time of each measurement target component that is difficult to correct the generated deviation.
Hereinafter, an example of a method for acquiring mass spectrometry data including accurate mass and ionic strength will be described based on the schematic diagram shown in FIG. However, the present invention is not limited to this.
通常の質量分析データの処理方法においては、図２に示すように、液体クロマトグラフに付して得られる各測定対象物質の保持時間と、質量分析装置により測定したm/z値及びイオン強度とを、それぞれ３軸に展開した多段マスクロマトグラムを形成する。
これに対し本発明では、前記ステップＳ１１において各測定対象物質の保持時間を測定し図２に示すような多段マスクロマトグラムを作成する場合、全ての保持時間に渡る全ピークをm/z軸−イオン強度軸の２次元平面へ蓄積する。これにより、全てのイオン強度がm/z値ごとに蓄積され、かつ各測定対象成分のm/z値及びイオン強度の情報を含み保持時間の情報を含まない質量分析データを取得することができる。
In a normal mass spectrometry data processing method, as shown in FIG. 2, the retention time of each measurement target substance obtained by applying to a liquid chromatograph, the m / z value and the ionic strength measured by the mass spectrometer, Are formed in a multistage mass chromatogram developed on three axes.
On the other hand, in the present invention, when the retention time of each measurement target substance is measured in step S11 and a multistage mass chromatogram as shown in FIG. 2 is created, all peaks over all retention times are represented by the m / z axis − Accumulate in the two-dimensional plane of the ion intensity axis. Thereby, all the ion intensities are accumulated for each m / z value, and mass spectrometry data including the m / z value and the ion intensity information of each measurement target component but not the retention time information can be acquired. .
以上、多段マスクロマトグラムから各測定対象成分のm/z値及びイオン強度を含み保持時間の情報を含まない質量分析データを取得する方法の１例について説明した。しかし、本発明では、前記ステップＳ１１において各測定対象物質の保持時間を測定せず、前記ステップＳ１２で測定したm/z値及びイオン強度から測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報の除去し、各測定対象成分のm/z値及びイオン強度の情報を含む質量分析データを直接作製してもよい。
また、ステップＳ１４で取得する質量分析データは、m/z軸−イオン強度軸の２次元平面のマスクロマトグラムであってもよいし、各測定対象物質のm/z値とイオン強度とを列記したリスト形式のデータであってもよい。
Heretofore, an example of a method for obtaining mass spectrometry data including m / z values and ionic strengths of each measurement target component and not including retention time information from the multistage mass chromatogram has been described. However, in the present invention, the retention time of each measurement target substance is not measured in Step S11, but the information is derived from information and noise derived from the isotope of the measurement target component from the m / z value and ion intensity measured in Step S12. The information to be removed may be removed, and mass spectrometry data including information on the m / z value and ionic strength of each measurement target component may be directly created.
The mass spectrometry data acquired in step S14 may be a two-dimensional plane mass chromatogram of m / z axis-ion intensity axis, and lists the m / z value and ion intensity of each measurement target substance. The list format data may be used.
［ステップＳ１５］質量分析データの比較、及びm/z値の一致又は不一致の検知
次に、ステップＳ１４で取得した質量分析データを質量分析用試料間で比較し、m/z値の一致又は不一致の検知を行う。
前述のように本発明では、小数点以下４桁以上のオーダーでm/z値を測定できる質量分析装置を用いて、測定対象成分のm/z値を測定する。したがって、m/z値の一致又は不一致の検知を行うことで、前述の保持時間の情報によらずm/z値に基づいて測定対象成分を他の成分と区別して特定することができる。なお本発明において、m/z値が一致するか否かの判断は、例えば、２つのm/z値の誤差が１０ｐｐｍ程度の範囲内であるかを確認して行うことができる。
[Step S15] Comparison of mass spectrometry data and detection of coincidence or mismatch of m / z values Next, the mass spectrometry data acquired in step S14 is compared between samples for mass spectrometry, and the coincidence or mismatch of m / z values. Detection is performed.
As described above, in the present invention, the m / z value of the component to be measured is measured using a mass spectrometer that can measure the m / z value in the order of four or more digits after the decimal point. Therefore, by detecting whether the m / z value matches or does not match, the measurement target component can be distinguished from other components based on the m / z value regardless of the information on the retention time described above. In the present invention, whether or not the m / z values match can be determined by, for example, confirming whether the error between the two m / z values is within a range of about 10 ppm.
［ステップＳ１６］m/z値が一致するイオン強度同士の差分又は比の算出
最後に、前記ステップＳ１５によりm/z値が一致すると判断したイオン強度同士に対して、差分又は比を算出する。
具体的には、前記質量分析データにおいてm/z値が一致するピーク同士についてそれぞれ面積を算出し、算出したピーク面積を比較する。これにより、質量分析用試料間で特定の測定対象成分の含有量を相対的に算出することができる。
[Step S16] Calculation of Difference or Ratio between Ion Intensities with Matched m / z Values Finally, a difference or ratio is calculated for the ion intensities determined to match with each other in step S15.
Specifically, areas are calculated for peaks having the same m / z value in the mass spectrometry data, and the calculated peak areas are compared. Thereby, it is possible to relatively calculate the content of the specific measurement target component between the samples for mass spectrometry.
本発明の質量分析データの処理方法の好ましい実施態様について説明する。
質量分析データに含まれる個々のイオン強度（ａi,j）及び全イオン強度（IntensityTotal）は、下記式（１）に示すように、保持時間（Ｔi）とm/z値（Ｍi,j）の関数として表現される。
A preferred embodiment of the method for processing mass spectrometry data of the present invention will be described.
The individual ion intensity (a i, j ) and total ion intensity (Intensity Total ) included in the mass spectrometry data are expressed by the retention time (T i ) and m / z value (M i ) as shown in the following formula (1). , j ).
式（１）において、ａi,jは、特定の時間Ｔiに検出された、特定のm/z値（Ｍi,j）に対するイオン強度を示す。Ｔiは、特定のイオンを検出した時間を示す。Ｍi,jは、特定の時間Ｔiに検出されたイオンａに対応するm/z値を示す。
ここで、m/z値を取得するタイミング（１Scan）ごとに検出されるイオン強度は、前記式（１）においてｉ＝ｔ（ｔは任意の定数）とする場合、下記式（２）で表されるように、質量のみの関数となる。
In equation (1), a i, j represents the ion intensity for a specific m / z value (M i, j ) detected at a specific time T i . T i indicates the time of detecting the specific ion. M i, j represents an m / z value corresponding to the ion a detected at a specific time T i .
Here, the ion intensity detected at each m / z value acquisition timing (1 Scan) is expressed by the following equation (2) when i = t (t is an arbitrary constant) in the equation (1). As a function of mass only.
式（２）において、ａmonoは化合物由来の主イオンの強度を表し、ａisoは同位体由来のイオン強度を表し、ａnoiseは機械的ノイズの強度を表す。 In formula (2), a mono represents the intensity of the main ion derived from the compound, a iso represents the ion intensity derived from the isotope, and a noise represents the intensity of mechanical noise.
m/z値を取得するタイミングごとに検出されるイオン強度の１例を図３に示す。図３に示すように、m/z値を取得するタイミングごとに検出されるイオン強度は、化合物由来の主イオンと、同位体イオン由来のイオンと、機械的ノイズに分類される。
そこで本発明の好ましい実施態様では、m/z値を取得するタイミングごとに、主イオンと、同位体イオン及び機械的ノイズとを判別する。そして、下記式（３）に示すように、同位体イオン及び機械的ノイズを除去し主イオンのみを保存する。この段階での主イオンと同位体イオン及び機械的ノイズとの判別は容易である。したがって、この段階で質量分析データから同位体イオン及び機械的ノイズを除去することが、データ処理の簡便さの観点から好ましい。
FIG. 3 shows an example of ion intensity detected at each timing for obtaining the m / z value. As shown in FIG. 3, the ion intensity detected at each timing of acquiring the m / z value is classified into a main ion derived from a compound, an ion derived from an isotope ion, and mechanical noise.
Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the main ion, the isotope ion, and the mechanical noise are discriminated every time the m / z value is acquired. Then, as shown in the following formula (3), isotope ions and mechanical noise are removed and only main ions are stored. Discrimination between main ions, isotope ions and mechanical noise at this stage is easy. Therefore, it is preferable to remove isotope ions and mechanical noise from the mass spectrometry data at this stage from the viewpoint of easy data processing.
このようにして得られた質量分析データの各イオン強度の情報をm/z軸へ蓄積することで、式（４）に示すような、補正が困難な保持時間の情報を含まない質量分析データを再構築することができる。 By accumulating the information of each ion intensity of the mass spectrometry data obtained in this way on the m / z axis, the mass spectrometry data that does not include the retention time information that is difficult to correct as shown in Equation (4). Can be rebuilt.
質量分析データから、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去する方法の具体例について、図４を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。 A specific example of a method for removing information derived from isotopes of measurement target components and information derived from noise from mass spectrometry data will be described with reference to FIG. However, the present invention is not limited to this.
図４に示すように、同位体イオンは、主イオンの価数に応じて特定の間隔（1/z、ここでｚは主イオンの価数を表す。）を持って出現する。具体的には、主イオンの価数が２価の場合、主イオンと同位体イオンの間隔は、１／（主イオンの価数：２）＝０．５となる。これに対して、機械的ノイズは瞬間的に出現し、同位体イオンの出現パターンを示さない。
そこで、同位体イオンのように周期的に出現しないピークを機械的ノイズとして除去する。さらに、周期的に出現するイオンのうち、主イオンの価数を考慮して、同位体イオンを除去し、主イオンのみを選択的に取得する。このようにして、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去することができる。
As shown in FIG. 4, isotope ions appear with a specific interval (1 / z, where z represents the valence of the main ion) according to the valence of the main ion. Specifically, when the valence of the main ion is divalent, the interval between the main ion and the isotope ion is 1 / (valence of the main ion: 2) = 0.5. In contrast, mechanical noise appears instantaneously and does not show the appearance pattern of isotope ions.
Therefore, peaks that do not appear periodically, such as isotope ions, are removed as mechanical noise. Further, among the ions that appear periodically, the isotope ions are removed in consideration of the valence of the main ions, and only the main ions are selectively acquired. In this manner, information derived from the isotope of the measurement target component and information derived from noise can be removed.
同位体イオン及び機械的ノイズの除去は、以下の指針に従って実施することができる。
前記式（２）で表わされるイオン強度とm/z値の２次元データに対して、m/z軸を降順に走査し、下記式（５）で表される０より大きいイオン強度を基準として、任意の価数（z）に応じて、1/z分だけm/z値の小さい下記式（６）で表されるイオン強度との大小関係を比較する。
Isotope ion and mechanical noise removal can be performed according to the following guidelines.
For the two-dimensional data of the ion intensity and m / z value represented by the equation (2), the m / z axis is scanned in descending order, and the ion intensity greater than 0 represented by the following equation (5) is used as a reference. The magnitude relationship with the ionic strength represented by the following formula (6) whose m / z value is small by 1 / z according to the arbitrary valence (z) is compared.
式（６）においてΔは、任意の価数に応じた間隔を示す。
イオン強度の比較の結果下記式（７）を満たす場合、式（５）で表されるイオンは機械的ノイズと判定して、このイオンを除去する。
In Expression (6), Δ indicates an interval according to an arbitrary valence.
When the following formula (7) is satisfied as a result of the comparison of the ionic strength, the ion represented by formula (5) is determined as mechanical noise, and this ion is removed.
下記式（８）を満たす場合、式（５）で表されるイオンは主イオンと判定して、このイオンを保存する。 When the following formula (8) is satisfied, the ion represented by formula (5) is determined to be a main ion and stored.
以上の操作を下記式（１０）を満たすまで継続する。その際、下記式（１１）で表されるイオンを主イオンとして保存する。 The above operation is continued until the following formula (10) is satisfied. At that time, ions represented by the following formula (11) are stored as main ions.
従来の質量分析データの処理方法では前述したように、測定対象物質を特定するために測定対象物質の保持時間の情報の補正を行う必要がある。しかし保持時間の補正を行う従来の質量分析データの処理方法は、非常に煩雑である。さらに、偶然に保持時間が一致した異なる測定対象物質を同一物質と認識する危険性が存在する。
これに対し、本発明の質量分析データの処理方法は、高分解能質量分析装置を用いてm/z値を測定するので、m/z値に基づいて測定対象物質を特定することができる。したがって、測定対象物質の保持時間の情報によらない本発明の質量分析データの処理方法は、質量分析データの処理が容易であり、且つ正確である。
As described above, in the conventional mass spectrometry data processing method, it is necessary to correct the retention time information of the measurement target substance in order to specify the measurement target substance. However, the conventional mass spectrometry data processing method for correcting the holding time is very complicated. Further, there is a risk that different measurement target substances having coincidence retention times will be recognized as the same substance.
On the other hand, since the mass spectrometry data processing method of the present invention measures the m / z value using a high-resolution mass spectrometer, the substance to be measured can be specified based on the m / z value. Therefore, the mass spectrometry data processing method according to the present invention that does not depend on the retention time information of the measurement target substance is easy and accurate to process the mass spectrometry data.
さらに、本発明の質量分析データの処理方法に基づいて、質量分析用試料に含まれる測定対象成分の質量分析を正確かつ簡便に行うことができる。
たとえば、２つの質量分析用試料の質量分析データを本発明の質量分析データの処理方法に付すことで、２つの質量分析用試料間で、各測定対象成分の相対的な含有量を知ることができる。
あるいは、測定対象成分の種類と含有量が既知の参照用試料について質量分析データを取得する。そして、質量分析用試料の質量分析データと、前記参照用試料の質量分析データを本発明の質量分析データの処理方法に付すことで、質量分析用試料の測定対象成分の含有量の絶対値を知ることができる。
Furthermore, based on the mass spectrometry data processing method of the present invention, mass analysis of the measurement target component contained in the sample for mass spectrometry can be performed accurately and simply.
For example, by applying the mass spectrometry data of two mass spectrometry samples to the mass spectrometry data processing method of the present invention, the relative content of each measurement target component can be known between the two mass spectrometry samples. it can.
Alternatively, mass spectrometry data is acquired for a reference sample whose type and content of the measurement target component are known. Then, by applying the mass spectrometry data of the mass spectrometry sample and the mass spectrometry data of the reference sample to the mass spectrometry data processing method of the present invention, the absolute value of the content of the measurement target component of the mass spectrometry sample is obtained. I can know.
次に、本発明の質量分析装置の好ましい態様について図５を参照して説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。 Next, a preferred embodiment of the mass spectrometer of the present invention will be described with reference to FIG. However, the present invention is not limited to this.
図５は、本発明の好ましい態様の質量分析装置の１例を示す装置構成図である。図５に示す質量分析装置は、液体クロマトグラフ１０、高分解能質量分析装置２０、及び情報処理部３０からなる。 FIG. 5 is an apparatus configuration diagram showing an example of a mass spectrometer according to a preferred embodiment of the present invention. The mass spectrometer illustrated in FIG. 5 includes a liquid chromatograph 10, a high resolution mass spectrometer 20, and an information processing unit 30.
図５に示す液体クロマトグラフ１０は、溶離液ａを送液する高圧グラジエントポンプ１１、質量分析用試料ｂを導入するオートインジェクター１２、及び質量分析用試料に含まれる測定対象成分を分離する分離カラム１３を備えている。液体クロマトグラフ１０はさらに、分離された測定対象成分を分取して分画するための、分取分画部を備えていてもよい。
分離カラム１３の充填剤としては、この種の液体クロマトグラフに通常用いられるものから適宜選択することができる。
本発明において液体クロマトグラフ１０は、極性差に基づいて各測定対象成分を分離することが好ましい。また本発明において、前記液体クロマトグラフをガスクロマトグラフやキャピラリー電気泳動装置等の分離手段に置き換え、測定対象成分を分離してもよい。
A liquid chromatograph 10 shown in FIG. 5 includes a high-pressure gradient pump 11 that sends an eluent a, an autoinjector 12 that introduces a mass analysis sample b, and a separation column that separates a measurement target component contained in the mass analysis sample. 13 is provided. The liquid chromatograph 10 may further include a fractionation fractionation unit for fractionating and fractionating the separated measurement target component.
The packing material for the separation column 13 can be appropriately selected from those usually used for this type of liquid chromatograph.
In the present invention, the liquid chromatograph 10 preferably separates each measurement target component based on the polarity difference. In the present invention, the liquid chromatograph may be replaced with a separation means such as a gas chromatograph or a capillary electrophoresis apparatus to separate the measurement target component.
高分解能質量分析装置２０は、イオン化部２１と質量分析部２２からなる。
液体クロマトグラフ１０により相互に分離した測定対象成分はイオン化部２１に導入される。そしてイオン化部２１が、導入された測定対象成分をそれぞれイオン化する。測定対象成分のイオン化方法としては、通常のイオン化方法より適宜選択することができる。具体例としては、エレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法、大気圧光イオン化法、電子イオン化法、化学イオン化法、高速原子衝撃法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法などが挙げられる。本発明においてイオン化部２１は、測定対象成分のm/z値の検出感度の観点から、エレクトロスプレーイオン化法により測定対象成分をイオン化することが好ましい。
イオン化部２１によりイオン化された測定対象成分は、質量分析部２２に導入される。そして、質量分析部２２が測定対象成分のm/z値及びイオン強度を高分解能で測定し、各測定対象成分のm/z値及びイオン強度の情報を含む質量分析データを検出する。質量分析部２２は、測定対象成分のm/z値を小数点以下４桁以上のオーダーで測定する。質量分析部２２を以上のように構成することにより、m/z値のみに基づいて測定対象物質種を特定し同定することができる。質量分析部２２による測定原理としては、FT/MS、TOF、イオントラップ型質量分析、磁場偏向型質量分析、四重極型質量分析、FT/ICR-MS、加速器質量分析、タンデム型質量分析が挙げられる。本発明ではこれらの測定原理のうち、１０％谷定義Ｒ10%が５，０００以上のもの、及び／又は半値幅ＲFWHMが１０，０００以上のものから好適に選択することができる。本発明で好ましく用いることができる質量分析部２２の具体例としては、FT/ICR-MSタイプの分析計、FT-Orbitrapタイプの分析計、High-Ref-TOFタイプの分析計が挙げられる。
The high resolution mass spectrometer 20 includes an ionization unit 21 and a mass analysis unit 22.
Components to be measured separated from each other by the liquid chromatograph 10 are introduced into the ionization unit 21. And the ionization part 21 ionizes each introduced measuring object component. The ionization method for the component to be measured can be appropriately selected from ordinary ionization methods. Specific examples include electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization, atmospheric pressure photoionization, electron ionization, chemical ionization, fast atom bombardment, matrix-assisted laser desorption ionization, and the like. In the present invention, the ionization unit 21 preferably ionizes the measurement target component by electrospray ionization from the viewpoint of detection sensitivity of the m / z value of the measurement target component.
The measurement target component ionized by the ionization unit 21 is introduced into the mass analysis unit 22. Then, the mass analyzer 22 measures the m / z value and ion intensity of the measurement target component with high resolution, and detects mass analysis data including information on the m / z value and ion intensity of each measurement target component. The mass spectrometric unit 22 measures the m / z value of the measurement target component in the order of four digits after the decimal point. By configuring the mass spectrometric unit 22 as described above, it is possible to identify and identify the measurement target substance type based only on the m / z value. The measurement principle by the mass analyzer 22 is FT / MS, TOF, ion trap mass analysis, magnetic field deflection mass analysis, quadrupole mass analysis, FT / ICR-MS, accelerator mass analysis, tandem mass analysis. Can be mentioned. In the present invention, among these measurement principles, a 10% valley definition R 10% of 5,000 or more and / or a half width R FWHM of 10,000 or more can be suitably selected. Specific examples of the mass analyzer 22 that can be preferably used in the present invention include an FT / ICR-MS type analyzer, an FT-Orbitrap type analyzer, and a High-Ref-TOF type analyzer.
高分解能質量分析装置２０により得られた質量分析データは情報処理部３０に送信される。そして情報処理部３０は、下記に示す処理を行う演算手段により、質量分析データの比較及び解析を行う。情報処理部３０には、分析条件などを設定するための情報入力部や、分析結果などを表示する表示部などを設けることができる。情報処理部３０は、パーソナルコンピュータなどをハードウエア資源とし、パーソナルコンピュータにインストールされた情報処理ソフトウエアを実行することにより、各機能ブロックを具現化する構成とすることができる。 Mass analysis data obtained by the high resolution mass spectrometer 20 is transmitted to the information processing unit 30. Then, the information processing unit 30 compares and analyzes the mass spectrometry data by a calculation unit that performs the following processing. The information processing unit 30 can be provided with an information input unit for setting analysis conditions and the like, a display unit for displaying analysis results, and the like. The information processing unit 30 can be configured to embody each functional block by using a personal computer or the like as hardware resources and executing information processing software installed in the personal computer.
情報処理部３０は、質量分析部２２が検出した質量分析データから測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去する。さらに情報処理部３０は、精密質量の情報を取得するタイミングごとに、質量分析データから、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去することが好ましい。測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去することで、質量分析データの処理が容易となる。 The information processing unit 30 removes information derived from the isotope of the measurement target component and information derived from noise from the mass spectrometry data detected by the mass analysis unit 22. Furthermore, it is preferable that the information processing unit 30 removes information derived from the isotope of the measurement target component and information derived from noise from the mass analysis data at every timing of obtaining accurate mass information. By removing the information derived from the isotope of the measurement target component and the information derived from noise, the mass spectrometry data can be processed easily.
情報処理部３０は続けて、質量分析用試料ごとに全てのイオン強度の情報を精密質量ごとに蓄積して、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを作製する。これにより、生じたずれの補正が困難な、各測定対象成分の保持時間の情報を含まない質量分析データを得ることができる。
得られる質量分析データは、m/z軸−イオン強度軸の２次元平面のマスクロマトグラムであってもよいし、各測定対象物質のm/z値とイオン強度とを列記したリスト形式のデータであってもよい。
The information processing unit 30 continuously accumulates information on all ion intensities for each mass analysis sample for each accurate mass, and creates mass spectrometry data including information on the accurate mass and ion intensity of each measurement target component. As a result, it is possible to obtain mass spectrometry data that does not include information on the retention time of each measurement target component that is difficult to correct the generated deviation.
The obtained mass spectrometry data may be a mass chromatogram of a two-dimensional plane of m / z axis-ion intensity axis, or data in a list format in which m / z values and ion intensity of each measurement target substance are listed. It may be.
そして情報処理部３０は、作製した質量分析データを少なくとも２つの質量分析用試料間で比較し、m/z値の一致又は不一致の検知を行う。本発明では高分解能質量分析装置２０を用いてm/z値を測定する。したがって、m/z値の一致又は不一致の検知を行うことで、m/z値に基づいて測定対象成分を他の成分と区別して特定することができる。 The information processing unit 30 compares the produced mass spectrometry data between at least two mass spectrometry samples, and detects whether the m / z values match or do not match. In the present invention, the m / z value is measured using the high resolution mass spectrometer 20. Therefore, by detecting the coincidence or mismatch of the m / z value, the measurement target component can be distinguished from other components and specified based on the m / z value.
さらに情報処理部３０は、少なくとも２つの質量分析用試料間で、m/z値が一致するイオン強度同士の差分又は比を算出する。具体的には、前記質量分析データにおいてm/z値が一致するピーク同士についてそれぞれ面積を算出し、算出したピーク面積を比較する。これにより、質量分析用試料間で特定の測定対象成分の含有量を相対的に算出することができる。 Furthermore, the information processing unit 30 calculates the difference or ratio between the ion intensities having the same m / z value between at least two mass spectrometry samples. Specifically, areas are calculated for peaks having the same m / z value in the mass spectrometry data, and the calculated peak areas are compared. Thereby, it is possible to relatively calculate the content of the specific measurement target component between the samples for mass spectrometry.
以上の構成とする本発明の質量分析装置は、高分解能質量分析装置を用いてm/z値を測定するので、m/z値に基づいて測定対象物質を特定することができる。したがって、本発明の質量分析装置は、測定対象物質の保持時間の情報によることなく、質量分析データを容易に処理することができる。 Since the mass spectrometer of the present invention configured as described above measures the m / z value using a high-resolution mass spectrometer, the substance to be measured can be specified based on the m / z value. Therefore, the mass spectrometer of the present invention can easily process the mass spectrometry data without depending on the retention time information of the measurement target substance.
本発明の質量分析装置において、測定対象成分の種類と含有量が既知の参照用試料の質量分析データをデータベースとして前記情報処理部３０に格納してもよい。このようなデータベースを備えることで、情報処理部３０が質量分析用試料の質量分析データと参照用試料の質量分析データとを比較し、質量分析用試料の測定対象成分の含有量の絶対値を算出ことができる。 In the mass spectrometer of the present invention, the mass analysis data of the reference sample whose type and content of the measurement target component are known may be stored in the information processing unit 30 as a database. By providing such a database, the information processing unit 30 compares the mass spectrometry data of the mass spectrometry sample with the mass spectrometry data of the reference sample, and calculates the absolute value of the content of the measurement target component of the mass spectrometry sample. Can be calculated.
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の質量分析データの処理方法、質量分析方法、及び質量分析装置を開示する。 The present invention further discloses the following mass spectrometry data processing method, mass spectrometry method, and mass spectrometry apparatus with respect to the above-described embodiments.
＜１＞質量分析データの処理方法であって、
（ａ）質量分析用試料に含まれる測定対象成分を分離し、
（ｂ）高分解能質量分析装置を用いて、分離した測定対象成分それぞれをイオン化して精密質量及びイオン強度を測定し、
（ｃ）得られた精密質量及びイオン強度のデータから、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去し、
（ｄ）質量分析用試料ごとに測定した全てのイオン強度の情報を精密質量ごとに蓄積して、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを得、
（ｅ）得られた質量分析データを少なくとも２つの質量分析用試料間で比較し、精密質量の一致又は不一致を検知し、
（ｆ）前記少なくとも２つの質量分析用試料間で、精密質量が一致するイオン強度同士の差分又は比を算出し、質量分析データの比較及び解析を行う、
質量分析データの処理方法。
<1> A method for processing mass spectrometry data,
(A) separating the measurement target component contained in the sample for mass spectrometry,
(B) Using a high-resolution mass spectrometer, each separated component to be measured is ionized to measure accurate mass and ionic strength,
(C) From the obtained accurate mass and ionic strength data, information derived from the isotope of the measurement target component and information derived from noise are removed,
(D) Accumulating all ionic strength information measured for each sample for mass spectrometry for each accurate mass, obtaining mass spectrometry data including information on the precise mass and ionic strength of each measurement target component,
(E) comparing the obtained mass spectrometry data between at least two mass spectrometry samples to detect coincidence or inconsistency of the exact mass;
(F) calculating the difference or ratio between the ion intensities having the same exact mass between the at least two samples for mass spectrometry, and comparing and analyzing the mass spectrometry data;
Method for processing mass spectrometry data.
＜２＞前記工程（ａ）において、各測定対象成分間の極性差に基づいて測定対象成分を分離する、前記＜１＞項に記載の質量分析データの処理方法。
＜３＞前記工程（ａ）において、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ又はキャピラリー電気泳動装置、好ましくは液体クロマトグラフ、を用いて測定対象成分を分離する、前記＜１＞又は＜２＞項に記載の質量分析データの処理方法。
＜４＞前記工程（ｂ）において、分離した測定対象成分をエレクトロスプレーイオン化法に付してイオン化する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の質量分析データの処理方法。
＜５＞前記高分解能質量分析装置が、測定対象成分の精密質量を小数点以下４桁以上のオーダーで測定する、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の質量分析データの処理方法。
＜６＞前記高分解能質量分析装置が、FT/ICR-MSタイプの分析装置、FT-Orbitrapタイプの分析装置、又はHigh-Ref-TOFタイプの分析装置である、前記＜５＞項に記載の質量分析データの処理方法。
＜７＞前記質量分析データが、m/z軸−イオン強度軸の２次元平面のマスクロマトグラムである、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の質量分析データの処理方法。
＜８＞前記質量分析データが、各測定対象物質のm/z値とイオン強度とを列記したリスト形式のデータである、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の質量分析データの処理方法。
＜９＞精密質量の情報を取得するタイミングごとに、質量分析データから、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去する、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の質量分析データの処理方法。
＜１０＞前記工程（ｆ）において、前記質量分析データにおいて精密質量が一致すると判断された測定対象成分に由来するクロマトグラフの面積を算出し、算出した面積を比較して、質量分析データの比較及び解析を行う、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の質量分析データの処理方法。
＜１１＞前記測定対象成分が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖、脂肪酸、及び有機酸からなる群より選ばれる少なくとも１種、好ましくは、タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種、である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の質量分析データの処理方法。
＜１２＞前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の質量分析データの処理方法に基づき、少なくとも２つの質量分析用試料間で、測定対象成分それぞれの量を比較する方法。
<2> The method of processing mass spectrometry data according to <1>, wherein in the step (a), the measurement target component is separated based on a polarity difference between the measurement target components.
<3> In the step (a), a measurement target component is separated using a gas chromatograph, a liquid chromatograph, or a capillary electrophoresis apparatus, preferably a liquid chromatograph, according to the item <1> or <2>. Method for processing mass spectrometry data.
<4> The method for processing mass spectrometry data according to any one of <1> to <3>, wherein, in the step (b), the separated measurement target component is ionized by electrospray ionization.
<5> The mass spectrometry data processing according to any one of <1> to <4>, wherein the high-resolution mass spectrometer measures the accurate mass of the measurement target component in an order of four or more digits after the decimal point. Method.
<6> The high resolution mass spectrometer according to <5>, wherein the high resolution mass spectrometer is an FT / ICR-MS type analyzer, an FT-Orbitrap type analyzer, or a High-Ref-TOF type analyzer. Method for processing mass spectrometry data.
<7> The mass spectrometry data processing method according to any one of <1> to <6>, wherein the mass spectrometry data is a two-dimensional plane mass chromatogram of m / z axis-ion intensity axis. .
<8> The mass spectrometry according to any one of <1> to <6>, wherein the mass spectrometry data is data in a list format in which m / z values and ionic strengths of each measurement target substance are listed. How to process the data.
<9> Any one of the above <1> to <8>, wherein information derived from the isotope of the component to be measured and information derived from noise are removed from the mass analysis data at each timing of obtaining accurate mass information A method for processing mass spectrometry data according to item 1.
<10> In the step (f), the area of the chromatograph derived from the measurement target component determined to have the exact mass in the mass analysis data is calculated, and the calculated areas are compared to compare the mass analysis data. And the method of processing mass spectrometry data according to any one of <1> to <9>, wherein the analysis is performed.
<11> The measurement target component is at least one selected from the group consisting of proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, sugar chains, fatty acids, and organic acids, preferably selected from the group consisting of proteins, peptides, and amino acids. The method for processing mass spectrometry data according to any one of <1> to <10>, which is at least one kind.
<12> A method for comparing the amount of each component to be measured between at least two samples for mass spectrometry based on the method for processing mass spectrometry data according to any one of <1> to <11>.
＜１３＞分離した測定対象成分をイオン化する、イオン化部、
前記イオン化部によりイオン化された測定対象成分の精密質量及びイオン強度を高分解能で測定し、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを検出する、質量分析部、及び
前記質量分析部により得られた質量分析データの比較及び解析を行う、情報処理部、
を有し、
前記情報処理部が、
前記質量分析部が検出した質量分析データから測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去し、
続けて、質量分析用試料ごとに全てのイオン強度の情報を精密質量ごとに蓄積して、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを作製し、
作製した質量分析データを少なくとも２つの質量分析用試料間で比較し、精密質量の一致又は不一致を検知し、
前記少なくとも２つの質量分析用試料間で、精密質量が一致するイオン強度同士の差分又は比を算出し、質量分析データの比較及び解析を行う、
質量分析装置。
<13> an ionization unit that ionizes the separated measurement target component;
A mass analysis unit that measures the accurate mass and ion intensity of the measurement target component ionized by the ionization unit with high resolution, and detects mass spectrometry data including information on the accurate mass and ion intensity of each measurement target component; and An information processing unit that compares and analyzes mass spectrometry data obtained by the mass analysis unit,
Have
The information processing unit
The information derived from the isotope of the measurement target component and the information derived from noise are removed from the mass spectrometry data detected by the mass spectrometer,
Next, for each sample for mass spectrometry, information on all ionic strengths is accumulated for each accurate mass, and mass spectrometry data including information on the accurate mass and ionic strength of each measurement target component is created.
Compare the created mass spectrometry data between at least two mass spectrometry samples, detect exact mass match or mismatch,
Calculate the difference or ratio between the ionic strengths of which the exact masses match between the at least two mass spectrometry samples, and compare and analyze the mass spectrometry data.
Mass spectrometer.
＜１４＞前記の、分離した測定対象成分が、極性差に基づいて分離したものである、前記＜１３＞項に記載の質量分析装置。
＜１５＞測定対象成分を分離するための分離手段、好ましくはガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ又はキャピラリー電気泳動装置、より好ましくは液体クロマトグラフ、をさらに備える、前記＜１３＞又は＜１４＞項に記載の質量分析装置。
＜１６＞前記イオン化部が、分離した測定対象成分をエレクトロスプレーイオン化法によりイオン化する、前記＜１３＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載の質量分析装置。
＜１７＞前記質量分析部が、測定対象成分の精密質量を小数点以下４桁以上のオーダーで測定する、前記＜１３＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載の質量分析装置。
＜１８＞前記質量分析部が、FT/ICR-MSタイプの分析計、FT-Orbitrapタイプの分析計、又はHigh-Ref-TOFタイプの分析計である、前記＜１７＞項に記載の質量分析装置。
＜１９＞前記情報処理部が、前記質量分析データとして、m/z軸−イオン強度軸の２次元平面のマスクロマトグラムを作製する、前記＜１３＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の質量分析装置。
＜２０＞前記情報処理部が、前記質量分析データとして、各測定対象物質のm/z値とイオン強度とを列記したリスト形式のデータを作製する、前記＜１３＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の質量分析装置。
＜２１＞精密質量の情報を取得するタイミングごとに、質量分析データから、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去する、前記＜１３＞〜＜２０＞項に記載の質量分析装置。
＜２２＞前記情報処理部が、前記質量分析データにおいて精密質量が一致すると判断された測定対象成分に由来するクロマトグラフの面積を算出し、算出した面積を比較して、質量分析データの比較及び解析を行う、前記＜１３＞〜＜２１＞のいずれか１項に記載の質量分析装置。
＜２３＞前記情報処理部が、測定対象成分の種類と含有量が既知の参照用試料の質量分析データをデータベースとして備える、前記＜１３＞〜＜２２＞のいずれか１項に記載の質量分析装置。
＜２４＞前記質量分析装置が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖鎖、脂肪酸、及び有機酸からなる群より選ばれる少なくとも１種、好ましくは、タンパク質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種、の質量分析装置である、前記＜１３＞〜＜２３＞のいずれか１項に記載の質量分析装置。
<14> The mass spectrometer according to <13>, wherein the separated measurement target component is separated based on a polarity difference.
<15> The <13> or <14>, further comprising a separation means for separating the measurement target component, preferably a gas chromatograph, a liquid chromatograph or a capillary electrophoresis apparatus, more preferably a liquid chromatograph. Mass spectrometer.
<16> The mass spectrometer according to any one of <13> to <15>, wherein the ionization unit ionizes the separated measurement target component by an electrospray ionization method.
<17> The mass spectrometer according to any one of <13> to <16>, wherein the mass spectrometer measures the accurate mass of the component to be measured in an order of four or more digits after the decimal point.
<18> The mass spectrometry according to <17>, wherein the mass spectrometer is an FT / ICR-MS type analyzer, an FT-Orbitrap type analyzer, or a High-Ref-TOF type analyzer. apparatus.
<19> The information processing unit according to any one of <13> to <18>, wherein the information processing unit creates a mass chromatogram of a two-dimensional plane of m / z axis-ion intensity axis as the mass analysis data. Mass spectrometer.
<20> The information processing unit creates, as the mass spectrometry data, data in a list format in which m / z values and ionic strengths of the respective substances to be measured are listed. 2. The mass spectrometer according to item 1.
<21> The information described in <13> to <20> above, wherein information derived from the isotope of the measurement target component and information derived from noise are removed from the mass analysis data at each timing of obtaining accurate mass information. Mass spectrometer.
<22> The information processing unit calculates an area of a chromatograph derived from a measurement target component determined to have an accurate mass in the mass analysis data, compares the calculated areas, and compares the mass analysis data and The mass spectrometer according to any one of <13> to <21>, wherein the analysis is performed.
<23> The mass spectrometry according to any one of <13> to <22>, wherein the information processing unit includes, as a database, mass spectrometry data of a reference sample whose type and content of a measurement target component are known. apparatus.
<24> The mass spectrometer is at least one selected from the group consisting of proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, sugar chains, fatty acids, and organic acids, preferably selected from the group consisting of proteins, peptides, and amino acids. The mass spectrometer according to any one of <13> to <23>, which is at least one kind of mass spectrometer.
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on an Example, this invention is not limited to this.
以下の実施例において、ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」ともいう）の酵素消化物（Waters社製、商品番号：186002325）及び酵母エノラーゼ（以下、「Enolase」ともいう）の酵素消化物（Waters社製、商品番号：186002329）の混合物の分析には、液体クロマトグラフィー（以下、「LC」ともいう）としてnanoAcquity UPLC System with 2D Technology（商品名、Waters社製）を、質量分析計（以下、「MS」ともいう）としてLTQ Ortbitrap Velos（商品名、Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。
LC条件及びMS条件は、以下に示す通りである。
In the following examples, an enzyme digest of bovine serum albumin (hereinafter also referred to as “BSA”) (manufactured by Waters, product number: 186002325) and an enzyme digest of yeast enolase (hereinafter also referred to as “Enolase”) (Waters) In the analysis of the mixture manufactured by the company, product number: 186002329), nanoAcquity UPLC System with 2D Technology (trade name, manufactured by Waters) was used as a liquid chromatography (hereinafter, also referred to as “LC”). LTQ Ortbitrap Velos (trade name, manufactured by Thermo Fisher Scientific) was used as “MS”.
LC conditions and MS conditions are as shown below.
（１）LC条件
装置：nanoAcquity UPLC（Waters社製）
トラップカラム：Nano Ease Xbridge BEH130 C18（商品名）、
粒子径５μｍ、内径０．３ｍｍ×長さ５０ｍｍ（Waters社製）
試料ロード溶液：０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸含有アセトニトリル＝９８：２
試料注入後、５μＬ／ｍｉｎで３分間洗浄
分離カラム：nanoAcquity UPLC BEH130 C18（商品名）、
粒子径１．７μｍ、内径０．１ｍｍ×長さ１００ｍｍ（Waters社製）
溶離液Ａ：０．１％ギ酸水溶液
溶離液Ｂ：０．１％ギ酸含有アセトニトリル
流速：４００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：溶離液Ｂ ５％（０〜１分）→４０％（１２０分）→
９５％（１２１〜１３０分）→５％（１３１〜１４０分）
注入量：１μＬ
カラム温度：３５℃
(1) LC condition equipment: nanoAcquity UPLC (Waters)
Trap column: Nano Ease Xbridge BEH130 C18 (trade name),
Particle diameter 5μm, inner diameter 0.3mm x length 50mm (Waters)
Sample load solution: 0.1% formic acid aqueous solution: 0.1% formic acid-containing acetonitrile = 98: 2
After sample injection, wash separation column at 5 μL / min for 3 minutes: nanoAcquity UPLC BEH130 C18 (trade name),
Particle diameter 1.7 μm, inner diameter 0.1 mm × length 100 mm (manufactured by Waters)
Eluent A: 0.1% formic acid aqueous solution Eluent B: 0.1% formic acid-containing acetonitrile Flow rate: 400 nL / min
Gradient: Eluent B 5% (0-1 min) → 40% (120 min) →
95% (121-130 minutes) → 5% (131-140 minutes)
Injection volume: 1 μL
Column temperature: 35 ° C
（２）MS条件
イオン化法：ナノエレクトロスプレーイオン化（nano ESI）法
スプレーチップ：Pico Tip NanoSpray Emitter FS360-50-15-N（商品名）
外径３６０μｍ、先端外径５０μｍ、内径１５μｍ（New Objective）
極性：Positive
スプレー電圧：１，８００Ｖ
キャピラリー温度：２５０℃
Range（FT-MS）：m/z ３００〜１，２５０
質量分解能：６０，０００（at m/z 400）
MS/MS（IT-MS）：衝突誘起解離（CID）法
Data dependent scan：Ｔｏｐ１５
Exclusion time：１８０ｓ
Range（IT-MS）：m/z １００〜２，０００
Collision Energy（CE）：３５
(2) MS condition ionization method: Nano electrospray ionization (nano ESI) method Spray tip: Pico Tip NanoSpray Emitter FS360-50-15-N (trade name)
Outer diameter 360μm, tip outer diameter 50μm, inner diameter 15μm (New Objective)
Polarity: Positive
Spray voltage: 1,800V
Capillary temperature: 250 ° C
Range (FT-MS): m / z 300-1,250
Mass resolution: 60,000 (at m / z 400)
MS / MS (IT-MS): Collision-induced dissociation (CID) method
Data dependent scan: Top15
Exclusion time: 180s
Range (IT-MS): m / z 100-2,000
Collision Energy (CE): 35
各タンパク質の酵素消化物の同定には、データベースとしてSwiss-Prot（http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html）を、データベース検索エンジンとしてMASCOT Server（Matrix Science）を、解析ソフトとしてProteome Discoverer（Thermo Fisher Scientific）を使用した。
検索条件は、以下に示すとおりである。
For identification of enzymatic digests of each protein, analyze Swiss-Prot (http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html) as a database and MASCOT Server (Matrix Science) as a database search engine. Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific) was used as software.
Search conditions are as follows.
（３）タンパク質データベースサーチ
解析ソフトウエア：Proteome discoverer ver．1.3
検索エンジン：Mascot ver．2.3
データベース：Swiss-Prot 2012/02
Enzyme：Trypsin
Static modification：Carbamidomethyl（C）
Variable modification：Oxidation（M）
Maximum missed cleavage：1
Precursor Mass tolerance：±10ppm
Fragment Mass tolerance：±0.8Da
(3) Protein database search analysis software: Proteome discoverer ver. 1.3
Search engine: Mascot ver. 2.3
Database: Swiss-Prot 2012/02
Enzyme: Trypsin
Static modification: Carbamidomethyl (C)
Variable modification: Oxidation (M)
Maximum missed cleavage ： 1
Precursor Mass tolerance: ± 10ppm
Fragment Mass tolerance: ± 0.8 Da
（４）タンパク質同定条件
FDR：５％
Peptide Rank：１
(4) Protein identification conditions
FDR: 5%
Peptide Rank: 1
前記BSAの酵素消化物と前記Enolaseの酵素消化物２ｎｍｏｌ相当をそれぞれ、０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸含有アセトニトリル＝９８：２（体積比）の混液４０μＬに溶解し、各酵素処理物の溶液を調製した。調製した２つの溶液を体積比で１：２、１：５、１：１０、２：１、５：１、又は１０：１の比で混合し、分析用試料を調製した。調製した分析用試料を前記（１）及び（２）の条件下でLC-MSへ供した。 The enzyme digest of BSA and the enzyme digest of Enolase corresponding to 2 nmol are dissolved in 40 μL of a 0.1% formic acid aqueous solution: 0.1% formic acid-containing acetonitrile = 98: 2 (volume ratio) and treated with each enzyme. A product solution was prepared. The two prepared solutions were mixed at a volume ratio of 1: 2, 1: 5, 1:10, 2: 1, 5: 1, or 10: 1 to prepare a sample for analysis. The prepared analytical sample was subjected to LC-MS under the conditions (1) and (2).
前記分析用試料に含まれる酵素処理物（ペプチド）について、MASCOT Serverを用いて検索を行った。その結果、BSA由来のペプチドとして２２種、Enolase由来のペプチドとして２５種が同定された。
上記の計４７種のペプチドについて、下記に示す解析を行った。
The enzyme-treated product (peptide) contained in the analysis sample was searched using MASCOT Server. As a result, 22 types of BSA-derived peptides and 25 types of Enolase-derived peptides were identified.
The analysis shown below was performed on the above 47 peptides in total.
取得したLC-MSデータに対して、Thermo Fisher Scientific社独自の.raw形式から、汎用形式である.mzXMLへとファイル形式を変換した。ファイル形式の変換は、汎用ソフトウエアであるReAdWを使用した。 For the obtained LC-MS data, the file format was converted from Thermo Fisher Scientific's original .raw format to the general-purpose format .mzXML. ReAdW, a general-purpose software, was used for file format conversion.
.mzXML形式に変換したデータは、R ver．3.0.1（http://www.r-project.org/）を用いて解析した。解析には、CRAN（The Comprehensive R Archive Network、http://cran.r-project.org/）及びBioconductor（http://www.bioconductor.org/）から配信されるパッケージを使用した（mzR，doParallel，compiler，Matrix）。
解析方法の詳細は以下に示すとおりである。
Data converted to .mzXML format is R ver. Analysis was performed using 3.0.1 (http://www.r-project.org/). For analysis, packages distributed from CRAN (The Comprehensive R Archive Network, http://cran.r-project.org/) and Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) were used (mzR, doParallel, compiler, Matrix).
Details of the analysis method are as follows.
前記の.mzXMLデータから、保持時間、精密質量、及びイオン強度の３次元データを取得した。その際、各々の.mzXMLデータに対してm/zの間隔が0.0001、0.001、0.01又は0.1とした４種類の３次元データを取得した。m/zの範囲は300から1,250とした。
各々の３次元データを保持時間ごとに分割し、精密質量とイオン強度の２次元データを取得した。その２次元データを精密質量の降順に並び替えた。
前記の２次元データを順に走査して、イオン強度が０より大きい精密質量を探索した。該当する精密質量（ａ）にイオンが存在した場合、その精密質量よりも1/z（zはイオンの価数）±0.1（Da）だけm/z値の小さい精密質量（ｂ）に０より大きいイオン強度が存在するか確認した。以降、精密質量（ａ）及び（ｂ）のイオン強度の大小関係を比較し、質量分析データから同位体イオンおよび機械的ノイズの除去を行った。本実施例では、イオンの価数は２価および３価、４価又は５価と設定した。
From the above .mzXML data, three-dimensional data of retention time, accurate mass, and ionic strength were obtained. At that time, four types of three-dimensional data with m / z intervals of 0.0001, 0.001, 0.01, or 0.1 were acquired for each .mzXML data. The range of m / z was 300 to 1,250.
Each three-dimensional data was divided for each holding time, and two-dimensional data of accurate mass and ion intensity was acquired. The two-dimensional data was rearranged in descending order of precise mass.
The two-dimensional data was sequentially scanned to search for an accurate mass with an ionic strength greater than zero. If an ion exists in the exact mass (a), the exact mass (b) is less than 0 by 1 / z (z is the valence of the ion) ± 0.1 (Da) and the m / z value is smaller than the exact mass. It was confirmed whether a large ionic strength was present. Thereafter, the magnitude relationships of the ionic strengths of the accurate masses (a) and (b) were compared, and isotope ions and mechanical noise were removed from the mass analysis data. In this example, the valence of ions was set to be divalent, trivalent, tetravalent or pentavalent.
精密質量（ｂ）±0.1（Da）のイオン強度の和が０であった場合は、精密質量（ａ）のイオンをノイズと判定してデータから除去した。
精密質量（ｂ）±0.1（Da）のイオン強度の和が０より大きく、かつ精密質量（ａ）±0.1（Da）のイオン強度の和以上であった場合は、精密質量（ａ）を同位体イオンと判定してデータから除去した。その後、精密質量（ｂ）を基準に、精密質量（ｂ）±0.1（Da）のイオン強度の和と精密質量（ｂ）よりも1/z±0.1（Da）だけm/z値の小さい精密質量（ｃ）のイオン強度の和を比較した。以降、1/z±0.1（Da）だけm/z値の小さい精密質量のイオン強度が、０もしくは指定の値以下になるまで同様の操作を繰り返し、その時点で基準となった精密質量を主イオンとして保存した。本実施例では、基準の精密質量±0.1（Da）のイオン強度の和に対して、基準の精密質量から1/z±0.1（Da）だけm/z値の小さい精密質量のイオン強度が、１０分の１以下となった際に、以降の探索を中止し、基準の精密質量を主イオンとして保存した。
When the sum of the ionic strengths of the accurate mass (b) ± 0.1 (Da) was 0, the ions of the accurate mass (a) were determined as noise and removed from the data.
If the sum of the ionic strengths of the exact mass (b) ± 0.1 (Da) is greater than 0 and greater than or equal to the sum of the ionic strengths of the precise mass (a) ± 0.1 (Da), the exact mass (a) It was determined as body ions and removed from the data. Then, based on the exact mass (b), the sum of the ionic strengths of the exact mass (b) ± 0.1 (Da) and the precision with an m / z value smaller by 1 / z ± 0.1 (Da) than the exact mass (b) The sum of the ionic strengths of mass (c) was compared. Thereafter, the same operation is repeated until the ion intensity of the accurate mass with a small m / z value by 1 / z ± 0.1 (Da) becomes 0 or less than the specified value. Stored as ions. In this example, the ionic strength of the accurate mass whose m / z value is smaller by 1 / z ± 0.1 (Da) than the reference accurate mass with respect to the sum of the ionic strengths of the reference accurate mass ± 0.1 (Da), When it became 1/10 or less, the subsequent search was stopped and the reference accurate mass was stored as the main ion.
取得したm/zの範囲に渡って前記の操作を繰り返し、精密質量とイオン強度の２次元データから同位体イオンと機械的ノイズを除去した。同様の操作を各保持時間の２次元データに対して実施した。
前記の方法に従って同位体イオン及び機械的ノイズを除去した上で、各保持時間のイオン強度を対応する精密質量軸へ蓄積し、保持時間を含まない質量分析データを構築した。
The above operation was repeated over the acquired m / z range, and isotope ions and mechanical noise were removed from two-dimensional data of accurate mass and ion intensity. The same operation was performed on the two-dimensional data for each holding time.
After removing isotope ions and mechanical noise according to the above method, the ion intensity of each retention time was accumulated on the corresponding accurate mass axis, and mass spectrometry data not including the retention time was constructed.
次に、前記Enolaseの酵素消化物と前記BSAの酵素消化物との混合比が１：２と２：１の分析用試料との間で、２次元データの精密質量（m/z値）が±１０ｐｐｍの誤差の範囲内で一致するマスクロマトグラフのイオン強度の差分を測定した。同様の操作を、前記Enolaseの酵素消化物と前記BSAの酵素消化物との混合比が１：５と５：１の分析用試料との間、及び前記Enolaseの酵素消化物と前記BSAの酵素消化物との混合比が１：１０と１０：１の分析用試料との間でも行った。
各マスクロマトグラフについて測定したイオン強度の差分が、前記Enolaseの酵素消化物と前記BSAの酵素消化物との混合比に従っている場合は「TRUE」と評価し、従っていない場合は「FALSE」と評価した。なお、元来存在量が少なかったペプチドに関しては、前記Enolaseの酵素消化物と前記BSAの酵素消化物との混合時に検出下限以下となることがあった。この場合については「ND」と評価した。なお、差分を計算する過程は、前記解析ソフトのプログラムにより自動化した。
その結果を表１及び２に示す。さらに、前記Enolaseの酵素消化物と前記BSAの酵素消化物との混合比が１：５と５：１の場合の各マスクロマトグラムを比較し、各ピークのイオン強度の差分を算出した結果を図６に示す。
Next, an accurate mass (m / z value) of the two-dimensional data is obtained between the analysis sample having a mixing ratio of the enzyme digest of Enolase and the enzyme digest of BSA of 1: 2 and 2: 1. The difference in ion intensity of the mass chromatographs that coincided within an error range of ± 10 ppm was measured. The same operation is performed between the sample for analysis having a mixing ratio of the enzyme digest of Enolase and the enzyme digest of BSA of 1: 5 and 5: 1, and the enzyme digest of Enolase and the enzyme of BSA. It was also performed between samples for analysis having a mixing ratio with the digest of 1:10 and 10: 1.
When the difference in the ionic strength measured for each mass chromatograph is in accordance with the mixing ratio of the enzyme digest of Enolase and the enzyme digest of BSA, it is evaluated as “TRUE”, otherwise it is evaluated as “FALSE”. . For peptides that were originally low in abundance, there were cases where the enzyme digest of Enolase and the enzyme digest of BSA were mixed and below the lower detection limit. In this case, it was evaluated as “ND”. The process of calculating the difference was automated by the analysis software program.
The results are shown in Tables 1 and 2. Furthermore, each mass chromatogram when the mixing ratio of the enzyme digest of Enolase and the enzyme digest of BSA is 1: 5 and 5: 1 is compared, and the difference between the ionic strengths of the peaks is calculated. As shown in FIG.
表１及び２に示すように、高分解能質量分析を用いてm/zの間隔が0.0001で精密質量を取得した場合は、測定対象とした全てのペプチドについて正しい量的関係を捉えることができた。これに対して、m/zの間隔が0.001、0.01、又は0.1で精密質量を取得した場合、２つの溶液の混合比を正しく反映しなかった。 As shown in Tables 1 and 2, when accurate mass was obtained with high resolution mass spectrometry and an m / z interval of 0.0001, the correct quantitative relationship could be captured for all peptides measured. . On the other hand, when the accurate mass was acquired at an m / z interval of 0.001, 0.01, or 0.1, the mixing ratio of the two solutions was not correctly reflected.
このように、本発明によれば、保持時間を利用せずに混合物の相対的な量関係を的確に把握できることがわかった。 Thus, according to this invention, it turned out that the relative quantity relationship of a mixture can be grasped | ascertained accurately, without utilizing holding time.
１０ 液体クロマトグラフ
１１ 高圧グラジエントポンプ
１２ オートインジェクター
１３ 分離カラム
２０ 高分解能質量分析装置
２１ イオン化部
２２ 質量分析部
３０ 情報処理部
ａ 溶離液
ｂ 質量分析用試料
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Liquid chromatograph 11 High pressure gradient pump 12 Autoinjector 13 Separation column 20 High resolution mass spectrometer 21 Ionization part 22 Mass analysis part 30 Information processing part a Eluent b Sample for mass spectrometry
Claims (7)
（ａ）質量分析用試料に含まれる測定対象成分を分離し、
（ｂ）高分解能質量分析装置を用いて、分離した測定対象成分それぞれをイオン化して精密質量及びイオン強度を測定し、
（ｃ）得られた精密質量及びイオン強度のデータから、測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去し、
（ｄ）質量分析用試料ごとに測定した全てのイオン強度の情報を精密質量ごとに蓄積して、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを得、
（ｅ）得られた質量分析データを少なくとも２つの質量分析用試料間で比較し、精密質量の一致又は不一致を検知し、
（ｆ）前記少なくとも２つの質量分析用試料間で、精密質量が一致するイオン強度同士の差分又は比を算出し、質量分析データの比較及び解析を行う、
質量分析データの処理方法。 A method of processing mass spectrometry data,
(A) separating the measurement target component contained in the sample for mass spectrometry,
(B) Using a high-resolution mass spectrometer, each separated component to be measured is ionized to measure accurate mass and ionic strength,
(C) From the obtained accurate mass and ionic strength data, information derived from the isotope of the measurement target component and information derived from noise are removed,
(D) Accumulating all ionic strength information measured for each sample for mass spectrometry for each accurate mass, obtaining mass spectrometry data including information on the precise mass and ionic strength of each measurement target component,
(E) comparing the obtained mass spectrometry data between at least two mass spectrometry samples to detect coincidence or inconsistency of the exact mass;
(F) calculating the difference or ratio between the ion intensities having the same exact mass between the at least two samples for mass spectrometry, and comparing and analyzing the mass spectrometry data;
Method for processing mass spectrometry data.
前記イオン化部によりイオン化された測定対象成分の精密質量及びイオン強度を高分解能で測定し、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度の情報を含む質量分析データを検出する、質量分析部、及び
前記質量分析部により得られた質量分析データの比較及び解析を行う、情報処理部、
を有し、
前記情報処理部が、
前記質量分析部が検出した質量分析データから測定対象成分の同位体に由来する情報及びノイズに由来する情報を除去し、
続けて、質量分析用試料ごとに全てのイオン強度の情報を精密質量ごとに蓄積して、各測定対象成分の精密質量及びイオン強度を含む質量分析データを作製し、
作製した質量分析データを少なくとも２つの質量分析用試料間で比較し、精密質量の一致又は不一致を検知し、
前記少なくとも２つの質量分析用試料間で、精密質量が一致するイオン強度同士の差分又は比を算出し、質量分析データの比較及び解析を行う、
質量分析装置。 An ionization unit that ionizes the separated measurement target component,
A mass analysis unit that measures the accurate mass and ion intensity of the measurement target component ionized by the ionization unit with high resolution, and detects mass spectrometry data including information on the accurate mass and ion intensity of each measurement target component; and An information processing unit that compares and analyzes mass spectrometry data obtained by the mass analysis unit,
Have
The information processing unit
The information derived from the isotope of the measurement target component and the information derived from noise are removed from the mass spectrometry data detected by the mass spectrometer,
Subsequently, information on all ionic strengths is accumulated for each accurate mass for each sample for mass spectrometry, and mass spectrometry data including the accurate mass and ionic strength of each measurement target component is prepared.
Compare the created mass spectrometry data between at least two mass spectrometry samples, detect exact mass match or mismatch,
Calculate the difference or ratio between the ionic strengths of which the exact masses match between the at least two mass spectrometry samples, and compare and analyze the mass spectrometry data.
Mass spectrometer.
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