JP2016044216A - Natural rubber latex solution for rna extraction, transportation method and/or storage method of the solution, and rna extraction method using the solution - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液、該ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送方法および保存方法、ならびに該ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出する方法に関する。 The present invention relates to a natural rubber latex solution for RNA extraction, a method for transporting and storing the natural rubber latex solution for RNA extraction, and a method for extracting RNA from the natural rubber latex solution for RNA extraction.
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）により採取することにより得られる。 At present, natural rubber (a kind of polyisoprenoid) used in industrial rubber products is obtained by harvesting from Hevea brasiliensis.
天然ゴムは、主にゴムノキの乳管と呼ばれる細胞内で生産されるラテックス中に天然ゴム粒子として存在し、これを加工することにより製造される。天然ゴム粒子を含むラテックス（以下、天然ゴムラテックスとする）の採取は、一般的に、ゴムノキの幹に溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管から流出するラテックスを回収することにより行われている。 Natural rubber exists as natural rubber particles in latex produced mainly in cells called rubber tree milk ducts, and is produced by processing them. Collection of latex containing natural rubber particles (hereinafter referred to as natural rubber latex) is generally made by damaging (trapping) the trunk of rubber tree and collecting the latex flowing out from the cut milk duct. Has been done.
天然ゴムは乳管細胞内で生合成されていることは知られているが（例えば非特許文献１参照）、その生合成機構はいまだ未解明な部分が多く、早期の解明が期待されており、天然ゴムラテックス中のＲＮＡを解析することは天然ゴムの生合成機構解明において有効である。しかしながら、ＲＮＡは非常に分解されやすい物質であり、効率的に天然ゴムラテックス中のＲＮＡを抽出する方法は確立されていない。天然ゴムの生合成機構の早期解明のためにも効率的な抽出方法の確立が求められている。 Although natural rubber is known to be biosynthesized in breast duct cells (see, for example, Non-Patent Document 1), the biosynthetic mechanism is still largely unexplained, and early elucidation is expected. Analyzing RNA in natural rubber latex is effective in elucidating the biosynthesis mechanism of natural rubber. However, RNA is a substance that is very easily degraded, and a method for efficiently extracting RNA in natural rubber latex has not been established. Establishment of an efficient extraction method is also required for early elucidation of the biosynthetic mechanism of natural rubber.
本発明は、天然ゴムラテックスからＲＮＡを効率的に抽出することができるＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液、該ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送方法および保存方法、ならびに該ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出する方法を提供することを目的とする。 The present invention relates to a natural rubber latex solution for RNA extraction capable of efficiently extracting RNA from natural rubber latex, a method for transporting and storing the natural rubber latex solution for RNA extraction, and a natural rubber latex solution for RNA extraction. It aims at providing the method of extracting RNA from.
本発明者は、鋭意検討の結果、天然ゴムラテックス中に存在するポリフェノールや多糖類、天然ゴム粒子などが効率的なＲＮＡ抽出を阻害していること、特に天然ゴム粒子が凝集することによりＲＮＡの抽出効率が大幅に低下することを見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the present inventor has found that polyphenols and polysaccharides present in natural rubber latex, natural rubber particles, and the like inhibit efficient RNA extraction, in particular, due to aggregation of natural rubber particles, It has been found that the extraction efficiency is greatly reduced, and further studies have been made to complete the present invention.
すなわち、本発明は、天然ゴムラテックス、ｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を含有するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液であり、前記緩衝液の含有量が天然ゴムラテックス１００質量部に対して５０質量部以下であり、前記ＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度が５００〜５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬであるＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液に関する。 That is, the present invention is a natural rubber latex solution for RNA extraction containing natural rubber latex, a pH 5-9 buffer and an RNA-degrading enzyme inhibitor, and the content of the buffer is 100 parts by weight of natural rubber latex. And a natural rubber latex solution for RNA extraction in which the concentration of the RNase inhibitor is 500 to 5000 units / mL.
さらに、天然ゴム粒子の凝集阻害剤を含有することが好ましい。 Furthermore, it is preferable to contain a natural rubber particle aggregation inhibitor.
前記天然ゴム粒子の凝集阻害剤として、０．５ｍＭ以上の酸化防止剤を含有することが好ましい。 As the natural rubber particle aggregation inhibitor, 0.5 mM or more of an antioxidant is preferably contained.
前記緩衝液の含有量が１２質量部以下であることが好ましい。 It is preferable that the content of the buffer solution is 12 parts by mass or less.
また、前記のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる凍結工程、ならびに凍結した前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、輸送する輸送工程および／または保存する保存工程を含むＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法に関する。 The RNA extraction natural rubber latex solution includes a freezing step of freezing the RNA extraction natural rubber latex solution, and a transporting step and / or a storage step of storing the frozen natural rubber latex solution for RNA extraction. The present invention relates to a method for transporting and / or storing the product.
前記のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる温度が−２５℃以下であることが好ましく、−７５℃以下であることがより好ましい。 The temperature for freezing the natural rubber latex solution for RNA extraction is preferably −25 ° C. or lower, and more preferably −75 ° C. or lower.
また、前記のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程を含む天然ゴムラテックスのＲＮＡ抽出方法に関する。 The present invention also relates to an RNA extraction method for natural rubber latex, which includes an RNA extraction step for extracting RNA from the natural rubber latex solution for RNA extraction.
さらに、前記の輸送および／または保存方法を適用した後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程を含む天然ゴムラテックスのＲＮＡ抽出方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to an RNA extraction method for natural rubber latex, which includes an RNA extraction step for extracting RNA from the natural rubber latex solution for RNA extraction after applying the transport and / or storage method.
前記ＲＮＡ抽出工程の前に、前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液から遠心分離によりゴム成分を分離、除去する工程を含むことが好ましい。 Prior to the RNA extraction step, it is preferable to include a step of separating and removing the rubber component from the natural rubber latex solution for RNA extraction by centrifugation.
前記ＲＮＡ抽出工程が、ホットフェノール法によるＲＮＡ抽出工程であることが好ましい。 The RNA extraction step is preferably an RNA extraction step by a hot phenol method.
本発明の天然ゴムラテックスにｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を所定量含有するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液および該溶液を用いた本発明のＲＮＡ抽出方法によれば、天然ゴムラテックスからＲＮＡを効率的に抽出することができる。 According to the natural rubber latex solution for RNA extraction containing a predetermined amount of a pH 5-9 buffer and an RNA-degrading enzyme inhibitor in the natural rubber latex of the present invention, and the RNA extraction method of the present invention using the solution, the natural rubber latex RNA can be efficiently extracted from.
また、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法によれば、ＲＮＡの抽出効率を悪化させることなく輸送および／または保存することができるため、本発明の輸送および／または保存後もＲＮＡを効率的に抽出することができる。 Further, according to the method for transporting and / or storing the natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention, it can be transported and / or stored without deteriorating the RNA extraction efficiency. RNA can be efficiently extracted even after storage.
＜ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液＞
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、天然ゴムラテックスに中性領域の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を所定量含有することを特徴とする。なお、本明細書中の天然ゴムラテックスとは後述する植物から採取されたものであり、採取後、何も処理を行っていない天然ゴムラテックスを意味する。すなわち、後述の緩衝液の含有量は、植物から採取した天然ゴムラテックス（未処理）１００質量部に対して添加する緩衝液の量を意味する。
<Natural rubber latex solution for RNA extraction>
The natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention is characterized in that the natural rubber latex contains a predetermined amount of a buffer solution in the neutral region and an RNase inhibitor. In addition, the natural rubber latex in this specification is collected from the plant mentioned later, and means the natural rubber latex which has not been processed after the collection. That is, the content of the buffer solution described later means the amount of the buffer solution added to 100 parts by mass of natural rubber latex (untreated) collected from the plant.
前記天然ゴムラテックスの由来としては、天然ゴムを生合成して産出する植物であれば特に限定されない。例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｌｅｉｐｃａｒｐａｆ．ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（ＳｏｌｉｄａｇｏｇｉｇａｎｔｅａＡｉｔ．ｖａｒ．ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａＦｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｖｅｎｕｓｔｕｍＨ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｈｏｎｄｏｅｎｓｅＮａｋａｉ）、カントウタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍＤａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｌｅＷｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（ＦｉｃｕｓｐｕｍｉｌａＬ．）、イヌビワ（ＦｉｃｕｓｅｒｅｃｔａＴｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（ＦｉｃｕｓａｍｐｅｌａｓＢｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（ＦｉｃｕｓｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓＭｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（ＦｉｃｕｓｉｒｉｓａｎａＥｌｍ．）、ガジュマル（ＦｉｃｕｓｍｉｃｒｏｃａｒｐａＬ．ｆ．）、オオバイヌビワ（ＦｉｃｕｓｓｅｐｔｉｃａＢｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、およびＰａｒｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール、およびロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。 The origin of the natural rubber latex is not particularly limited as long as it is a plant produced by biosynthesizing natural rubber. For example, Hevea spp such as Hevea brasiliensis (Hevea brasiliensis); Carduus (Sonchusoleraceus), Sonchus Asper (Sonchusasper), Sonchus spp such Hachijouna (Sonchusbrachyotus); goldenrod (Solidagoaltissima), goldenrod (Solidagovirgaureasubsp.asiatica), Miyama goldenrod (Solidagovirgaureasubsp.Leipcarpa ), Kiligamia Ginosa (Soridagovirgaureassubsp. Leipcarpaf. Paludosa), Ganoderma (Soridagovirgaureassubsp. Gigant) a), Solidago species such as Solidago gigantea (SolidagogiganteaAit.var.leiophyllaFernald); sunflower (Helianthusannuus), Shirota et sunflower (Helianthusargophyllus), Helianthus Atororubensu (Helianthusatrorubens), Hime sunflower (Helianthusdebilis), Kohimawari (Helianthusdecapetalus), Giant Sunflower (Helianthusgiganteus ) Genus Helianthus; Dandelion (Taraxacum), Ezo Dandelion (Taraxacumvenustum H. Koidz), Shinano Dandelion (Taraxacumhonden) seNakai), Kanto dandelion (TaraxacumplatycarpumDahlst), Kansai dandelion (Taraxacumjaponicum), dandelion (TaraxacumofficinaleWeber), Taraxacum genus, such as Russian dandelion (Taraxacumkoksaghyz);. figs (Ficuscarica), India rubber tree (Ficuselastica), Ficus pumila (FicuspumilaL), Ficus (FicuserectaThumb .), FicusampelasBurm.f., FucusbenguetensisMerr., FicusirisanaElm., Gajumaru (F) cusmicrocarpaL. f. ), Pseudohya genus (FussepticaBurm.f.), Fisbenghalensis, etc .; Is mentioned. Among them, it is preferably a plant belonging to at least one genus selected from the group consisting of the genus Hevea, Sonchus, Taraxacum, and Parhenium, and selected from the group consisting of Para rubber tree, Nogeshi, Guayule, and Russian dandelion It is more preferable that it is at least one kind.
天然ゴムラテックスの採取方法は特に限定されず、従来からのゴムノキなどの幹に溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管から流出するラテックスを回収する方法などとすることができる。 The method for collecting the natural rubber latex is not particularly limited, and a conventional method such as a method of collecting a latex flowing out from a cut milk duct by scratching (tapping) a trunk such as rubber tree in a groove shape. .
また、天然ゴムラテックスを採取する時間帯は特に限定されないが、恒常的な転写を示すＲＮＡの抽出が目的であれば、ラテックスの量を確保できる日の出前に採取することが望ましい。しかし、目的遺伝子によっては、外部の刺激（光、温度、ホルモン応答など）によりＲＮＡの転写量が増減することから、目的とする遺伝子の転写に合わせた時間帯に採取すればよい。 Further, the time zone for collecting the natural rubber latex is not particularly limited, but if the purpose is to extract RNA exhibiting constant transcription, it is desirable to collect it before sunrise when the amount of latex can be secured. However, depending on the target gene, the amount of RNA transcription increases or decreases due to external stimuli (light, temperature, hormonal response, etc.), and therefore it may be collected in a time zone that matches the transcription of the target gene.
天然ゴムラテックスの固形分濃度は、２５〜６０ｗ／ｖ％が好ましく、３５〜５０ｗ／ｖ％がより好ましい。固形分濃度が２５ｗ／ｖ％未満の場合は、遠心分離後にゴム層がうまく形成されず、ゴム粒子の除去率が低下する傾向がある。また、６０ｗ／ｖ％を超える場合は、ラテックス粘度が高まり、天然ゴムラテックスの採取が困難となる恐れがある。 The solid rubber latex has a solid content concentration of preferably 25-60 w / v%, more preferably 35-50 w / v%. When the solid content concentration is less than 25 w / v%, the rubber layer is not well formed after centrifugation, and the rubber particle removal rate tends to decrease. On the other hand, if it exceeds 60 w / v%, the latex viscosity increases, and it may be difficult to collect natural rubber latex.
天然ゴムラテックスは、分散質である天然ゴム粒子が水に分散した不均一系であり、成分の多くは天然ゴム粒子であるが、それ以外にもポリフェノール、多糖類、蛋白質などのその他成分が含まれており、ＲＮＡもその他成分として天然ゴムラテックス中に含まれている。通常のＲＮＡ抽出方法では、ＲＮＡが不安定となる塩基性になることを防ぐため、ＲＮＡ抽出用溶液を酸性側に調整するが、天然ゴムラテックスは酸性環境下で凝集するという性質がある。ゴム粒子が凝集してしまうと、その後、遠心分離などによるゴム粒子とＲＮＡを含む水層との分離が非常に困難となり、効率的なＲＮＡ抽出を妨げる要因となっている。 Natural rubber latex is a heterogeneous system in which natural rubber particles, which are dispersoids, are dispersed in water. Many of the components are natural rubber particles, but other components such as polyphenols, polysaccharides, and proteins are also included. RNA is also contained in natural rubber latex as another component. In a normal RNA extraction method, the RNA extraction solution is adjusted to the acidic side in order to prevent RNA from becoming unstable and basic, but natural rubber latex has the property of aggregating in an acidic environment. If the rubber particles are aggregated, separation of the rubber particles from the aqueous layer containing RNA by centrifugation or the like becomes very difficult thereafter, which is a factor that hinders efficient RNA extraction.
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、前記中性領域の緩衝液を含有することにより、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液が、ＲＮＡが不安定となる塩基性になること、およびゴム粒子が凝集する酸性になることを併せて防ぐことができる。 The natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention contains the buffer solution in the neutral region, so that the natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention becomes basic that makes RNA unstable, and It is possible to prevent the rubber particles from being aggregated and becoming acidic.
前記緩衝液のｐＨは５．０以上であり、６．０以上が好ましく、７．２以上がより好ましい。５．０未満の場合は、ゴム粒子が凝集しやすくなりＲＮＡの抽出効率が低下する傾向がある。また、該ｐＨは９．０以下であり、８．０以下が好ましく、７．８以下がより好ましい。９．０を超える場合は、溶液中のＲＮＡが不安定となりＲＮＡの抽出効率が低下する傾向がある。なかでも、ｐＨ７．５の緩衝液とすることが最も好ましい。 The pH of the buffer solution is 5.0 or more, preferably 6.0 or more, and more preferably 7.2 or more. If it is less than 5.0, the rubber particles tend to aggregate and the RNA extraction efficiency tends to decrease. The pH is 9.0 or less, preferably 8.0 or less, more preferably 7.8 or less. When it exceeds 9.0, RNA in the solution tends to be unstable and RNA extraction efficiency tends to decrease. Of these, it is most preferable to use a pH 7.5 buffer.
天然ゴムラテックスが含有する緩衝液の成分としては、中性の緩衝液であって、前記ｐＨの範囲で緩衝能を発揮し得る成分であれば特に限定されない。例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液がゴム粒子の凝固に対する影響が少ないという理由から好ましい。 The component of the buffer solution contained in the natural rubber latex is not particularly limited as long as it is a neutral buffer solution and can exhibit a buffer capacity in the above pH range. For example, Tris buffer solution, phosphate buffer solution, HEPES buffer solution and the like can be mentioned. Of these, Tris buffer is preferable because it has little influence on the coagulation of rubber particles.
緩衝液の天然ゴムラテックス１００質量部に対する含有量は、５０質量部以下であり、２０質量部以下がより好ましく、１２質量部以下がさらに好ましい。５０質量部を超える場合は、溶液中のＲＮＡ濃度が薄くなり過ぎ、抽出効率が低下する傾向がある。また、該含有量は５質量部以上が好ましく、１０質量部以上がより好ましい。５質量部未満の場合は、緩衝能が不十分となり、ＲＮＡが不安定となり抽出効率が低下する傾向がある。 Content with respect to 100 mass parts of natural rubber latex of a buffer solution is 50 mass parts or less, 20 mass parts or less are more preferable, and 12 mass parts or less are more preferable. When it exceeds 50 parts by mass, the RNA concentration in the solution becomes too thin, and the extraction efficiency tends to decrease. The content is preferably 5 parts by mass or more, and more preferably 10 parts by mass or more. When the amount is less than 5 parts by mass, the buffer capacity becomes insufficient, the RNA becomes unstable, and the extraction efficiency tends to decrease.
また、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液中の緩衝成分の濃度は、０．００１Ｍ以上が好ましく、０．０１Ｍ以上がより好ましく、０．０５Ｍ以上がより好ましい。０．００１Ｍ未満の場合は、緩衝能が不十分となり、ＲＮＡが不安定となり抽出効率が低下する傾向がある。また、緩衝成分の濃度は、１．０Ｍ以下が好ましく、０．５Ｍ以下がより好ましく、０．２５Ｍ以下がさらに好ましく、０．１Ｍ以下が特に好ましい。１．０Ｍを超える場合は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の効果が低下する恐れがある。 The concentration of the buffer component in the natural rubber latex solution for RNA extraction is preferably 0.001M or more, more preferably 0.01M or more, and more preferably 0.05M or more. If it is less than 0.001M, the buffer capacity is insufficient, RNA becomes unstable, and the extraction efficiency tends to decrease. Further, the concentration of the buffer component is preferably 1.0 M or less, more preferably 0.5 M or less, further preferably 0.25 M or less, and particularly preferably 0.1 M or less. If it exceeds 1.0 M, the effect of the RNase inhibitor may be reduced.
天然ゴムラテックス中にも、ＲＮＡを分解するＲＮＡ分解酵素（リボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ）が存在する。該ＲＮＡ分解酵素や、後の工程での混入の恐れが高いＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解を阻害するため、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液はＲＮＡ分解酵素阻害剤を含有する。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、特に限定されず、通常のＲＮＡ抽出などに用いられるＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いることができる。 In natural rubber latex, there are RNA degrading enzymes (ribonucleases, RNases) that degrade RNA. The natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention contains an RNA-degrading enzyme inhibitor in order to inhibit RNA degradation by the RNA-degrading enzyme or an RNA-degrading enzyme that is highly likely to be mixed in later steps. The RNase inhibitor is not particularly limited, and an RNase inhibitor used for normal RNA extraction or the like can be used.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液中のＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度は、５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以上であり、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以上が好ましい。５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ未満の場合は、ＲＮＡ分解酵素の阻害効果が弱く、ＲＮＡの抽出効率が低下する傾向がある。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度は、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以下であり、２０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以下が好ましい。５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬを超える場合は、コストが高くなり、コストに見合った効果が得られない傾向がある。 The concentration of the RNase inhibitor in the natural rubber latex solution for RNA extraction is 500 units / mL or more, preferably 1000 units / mL or more. If it is less than 500 units / mL, the inhibitory effect of RNase is weak and the RNA extraction efficiency tends to decrease. The concentration of the RNase inhibitor is 5000 units / mL or less, preferably 2000 units / mL or less. When it exceeds 5000 units / mL, the cost increases, and there is a tendency that an effect corresponding to the cost cannot be obtained.
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、さらに天然ゴム粒子の凝集阻害剤を含有することが、ＲＮＡの抽出効率がさらに向上するという理由から好ましい。 It is preferable that the natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention further contains a natural rubber particle aggregation inhibitor because the RNA extraction efficiency is further improved.
本発明における天然ゴム粒子の凝集阻害剤とは、含有することで天然ゴム粒子の凝集を阻害する性質を発揮するものであれば、本発明の効果が損なわれない限り特に限定されない。このような凝集阻害剤としては、酸化防止剤、界面活性剤などが挙げられる。 The aggregation inhibitor of natural rubber particles in the present invention is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not impaired as long as it exhibits the property of inhibiting aggregation of natural rubber particles when contained. Examples of such aggregation inhibitors include antioxidants and surfactants.
なかでも酸化防止剤は、本発明者が、酸化により茶変した天然ゴムラテックスが、茶変していないものに比べて天然ゴム粒子の凝集が起こりやすい傾向があることを見出し、天然ゴム粒子の凝集阻害剤として効果を発揮することを見出したものであり、前記の天然ゴムラテックス、中性の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤に加えて含有することで、ＲＮＡ抽出効率をさらに向上させることができる。 Among these, as for the antioxidant, the present inventor has found that natural rubber latex that has been browned by oxidation tends to agglomerate natural rubber particles compared to those that have not been browned. It has been found that it exhibits an effect as an aggregation inhibitor, and it can be further improved in RNA extraction efficiency by containing it in addition to the natural rubber latex, neutral buffer and RNase inhibitor. it can.
前記酸化防止剤としては、それ自体がＲＮＡの分解を促進するようなものでなければ、特に限定されないが、メルカプト基を有するものが好ましく、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）やβ−メルカプトエタノールなどが挙げられる。なかでも、酸化防止能力が高く、少量の添加で済むため、ゴム粒子への影響が少ないという点で、ＤＴＴが特に好ましい。 The antioxidant is not particularly limited as long as it does not itself promote the degradation of RNA, but is preferably one having a mercapto group, such as dithiothreitol (DTT, Dithiothreitol) or β-mercapto. Examples include ethanol. Among them, DTT is particularly preferable in that it has a high antioxidant ability and only needs to be added in a small amount, so that it has little influence on the rubber particles.
酸化防止剤を含有する場合のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液中の濃度は、０．５ｍＭ以上が好ましく、１．０ｍＭ以上がより好ましく、２．０ｍＭ以上がさらに好ましい。濃度が０．５ｍＭ未満の場合は酸化防止剤を含有することによる効果が得られ難い傾向がある。また、酸化防止剤の濃度は、１０ｍＭ以下が好ましく、８ｍＭ以下がより好ましく、５ｍＭ以下がさらに好ましい。濃度が１０ｍＭを超える場合は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の効果が低下する恐れがある。 When the antioxidant is contained, the concentration in the natural rubber latex solution for RNA extraction is preferably 0.5 mM or more, more preferably 1.0 mM or more, and further preferably 2.0 mM or more. When the concentration is less than 0.5 mM, the effect of containing an antioxidant tends to be difficult to obtain. Further, the concentration of the antioxidant is preferably 10 mM or less, more preferably 8 mM or less, and further preferably 5 mM or less. When the concentration exceeds 10 mM, the effect of the RNase inhibitor may be reduced.
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、天然ゴムラテックスに、前記の所定の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤、必要に応じて天然ゴム粒子の凝集阻害剤などを添加するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製工程により調製される。なお、該調製工程は必要に応じて撹拌などを含んでよい。 The natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention is a natural rubber for RNA extraction in which the above-mentioned predetermined buffer solution, RNase inhibitor, and aggregation inhibitor of natural rubber particles, if necessary, are added to natural rubber latex. Prepared by a latex solution preparation process. In addition, this preparation process may include stirring etc. as needed.
天然ゴムラテックスの採取から前記調製工程を行うまでの時間は、本発明の効果が損なわれない限り特に限定されないが、天然ゴムラテックスをゴムノキから採取した後、３０分以内が好ましく、１０分以内がより好ましい。３０分を超える場合は酸化やＲＮＡの分解が進行してしまい、ＲＮＡ抽出効率が低下する傾向がある。 The time from the collection of the natural rubber latex to the preparation step is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not impaired, but is preferably within 30 minutes after the natural rubber latex is collected from the rubber tree, and within 10 minutes. More preferred. If it exceeds 30 minutes, oxidation and RNA degradation proceed, and the RNA extraction efficiency tends to decrease.
＜輸送方法および保存方法＞
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法は、前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる凍結工程、ならびに凍結した前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、輸送する輸送工程および／または保存する保存工程を含むことを特徴とする。
<Transportation and storage method>
The method for transporting and / or storing the natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention includes a freezing step of freezing the natural rubber latex solution for RNA extraction, and a transporting step of transporting the frozen natural rubber latex solution for RNA extraction. And / or a storage step of storing.
本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送方法は、ゴムノキから採取した天然ゴムラテックスを採取した場所（例えば、タイ、マレーシアなどの農場であるが、特に限定されない）から、凍結させたＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、ＲＮＡ抽出作業を行う場所まで輸送する方法である。 The method for transporting the natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention is the extraction of frozen RNA from the place where the natural rubber latex collected from rubber tree is collected (for example, farms in Thailand, Malaysia, etc., but not particularly limited). This is a method of transporting the natural rubber latex solution for use to a place where RNA extraction work is performed.
また、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存方法とは、ゴムノキから採取した天然ゴムラテックスを採取してから、凍結させたＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、ＲＮＡ抽出作業を行う時まで保存する方法や、前記輸送の後にＲＮＡ抽出作業を行う時まで保存する方法である。なお、輸送の後保存する場合であって、保存工程で添加する成分などがある場合は、一度融解させてから添加すればよい。 The method for preserving the natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention refers to the time when the natural rubber latex solution collected from rubber tree is collected and then the frozen natural rubber latex solution for RNA extraction is subjected to RNA extraction work. It is a method of preservation or a method of preservation until RNA extraction work is performed after the transportation. In addition, when it is preserved after transportation and there are components to be added in the preservation step, it may be added after being melted once.
前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液は、天然ゴムラテックスにｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を含有させた溶液であるが、さらに凍結させることにより溶液のｐＨ変化、ＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解を防ぐことができ、ＲＮＡの抽出効率を悪化させることなく輸送および／または保存することができる。 The natural rubber latex solution for RNA extraction is a solution in which a natural rubber latex contains a pH 5-9 buffer solution and an RNA-degrading enzyme inhibitor. The solution is further frozen to change the pH of the solution, and RNA by the RNA-degrading enzyme. Can be prevented, and can be transported and / or stored without deteriorating RNA extraction efficiency.
前記輸送方法および保存方法における凍結工程は、本発明のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を凍結させる工程である。すなわち、該凍結工程はＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製工程の後であって、輸送工程および保存工程の前に行う工程である。該凍結工程を行う場合の、天然ゴムラテックスの採取から凍結工程を開始するまでの時間は、本発明の効果が損なわれない限り特に限定されないが、天然ゴムラテックスをゴムノキから採取した後、１時間以内が好ましく、３０分以内が好ましく、１０分以内が好ましい。１時間を過ぎる場合は酸化やＲＮＡの分解が進行してしまい、ＲＮＡ抽出効率が低下する傾向がある。 The freezing step in the transportation method and the storage method is a step of freezing the natural rubber latex solution for RNA extraction of the present invention. That is, the freezing step is a step performed after the preparation step of the natural rubber latex solution for RNA extraction and before the transport step and the storage step. When the freezing step is performed, the time from the collection of the natural rubber latex to the start of the freezing step is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not impaired, but 1 hour after the natural rubber latex is collected from the rubber tree Within 30 minutes, preferably within 30 minutes, and preferably within 10 minutes. When it exceeds 1 hour, oxidation and RNA degradation proceed, and the RNA extraction efficiency tends to decrease.
前記凍結工程において凍結させる温度は、−２０℃以下が好ましく、−７５℃以下がより好ましい。−２０℃より高い場合は、ラテックスが十分に凍結しない恐れがある。また、凍結させる温度の下限は特に限定されず、通常−１９６℃以上であればよい。 The temperature for freezing in the freezing step is preferably −20 ° C. or lower, more preferably −75 ° C. or lower. If it is higher than −20 ° C., the latex may not be sufficiently frozen. Moreover, the minimum of the temperature to freeze is not specifically limited, Usually, what is necessary is just -196 degreeC or more.
前記輸送工程としては特に限定されず、飛行機などによる空路、自動車や鉄道などによる陸路、船舶による海路のいずれによる輸送でもよいが、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の凍結状態を維持したまま輸送する必要があり、凍結させた温度以下を維持して輸送することが好ましい。 The transport process is not particularly limited, and may be transported by an air route such as an airplane, a land route such as an automobile or a railroad, or a sea route by a ship, but it is necessary to transport the natural rubber latex solution for RNA extraction while maintaining the frozen state. It is preferable to transport while maintaining the temperature below the frozen temperature.
また、前記保存工程は凍結したＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の凍結状態を維持できるものであれば特に限定されず、フリーザー、ドライアイス、液体窒素などを用いて保存することができる。保存温度は凍結状態を維持できる温度であれば特に限定されないが、凍結させた温度以下が好ましい。 Moreover, the said preservation | save process will not be specifically limited if it can maintain the frozen state of the frozen natural rubber latex solution for RNA extraction, It can preserve | save using a freezer, dry ice, liquid nitrogen, etc. The storage temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which the frozen state can be maintained, but is preferably equal to or lower than the frozen temperature.
＜抽出方法＞
本発明のＲＮＡ抽出方法は、前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程を含むことを特徴とする。また、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液には、前記の輸送および／または保存方法を適用した後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液も含む。
<Extraction method>
The RNA extraction method of the present invention includes an RNA extraction step of extracting RNA from the natural rubber latex solution for RNA extraction. The natural rubber latex solution for RNA extraction also includes the natural rubber latex solution for RNA extraction after applying the above transportation and / or storage method.
前記ＲＮＡの抽出工程としては特に限定されず、従来行われているＲＮＡの抽出工程を採用することができる。例えばチオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法などを採用することができる。また、例えば、市販品であるＲＮｅａｓｙ ＭＩＮＩ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）などのキットを用いた抽出工程としてもよい。なかでも、一度に多くの量を処理できるという理由からホットフェノール法とすることが好ましい。 The RNA extraction step is not particularly limited, and a conventional RNA extraction step can be employed. For example, a guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation method, a hot phenol method, a guanidine hydrochloric acid method, an acidic guanidine thiocyanate / phenol / chloroform method, and the like can be employed. For example, it is good also as an extraction process using kits, such as RNeasy MINI Kit (made by QIAGEN) which is a commercial item. Among them, the hot phenol method is preferable because a large amount can be processed at a time.
本発明のＲＮＡ抽出方法は、前記ＲＮＡ抽出工程を行う前に、前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液から遠心分離によりゴム成分を分離、除去する工程を行うことが好ましい。この工程を行うことにより、ゴム粒子を含む層とＲＮＡを含有する水層とに分離することができ、ゴム粒子を除去することができるため、ＲＮＡの抽出効率が向上する。 In the RNA extraction method of the present invention, it is preferable to perform a step of separating and removing a rubber component from the natural rubber latex solution for RNA extraction by centrifugation before performing the RNA extraction step. By performing this step, it is possible to separate into a layer containing rubber particles and an aqueous layer containing RNA, and the rubber particles can be removed, so that RNA extraction efficiency is improved.
前記遠心分離の遠心速度は特に限定されないが、２００００×ｇ以上が好ましく、小さなゴム粒子も分離することができることから５００００×ｇ以上がより好ましい。 The centrifugal speed of the centrifugal separation is not particularly limited, but is preferably 20000 × g or more, and more preferably 50000 × g or more because small rubber particles can be separated.
遠心分離を行う温度は特に限定されないが、ＲＮＡの分解を防ぐという理由から、１℃以上が好ましく、３℃以上がより好ましい。また、１０℃以下が好ましく、５℃以下がより好ましい。なかでも、遠心分離を行う温度は４℃が特に好ましい。 The temperature at which the centrifugation is performed is not particularly limited, but is preferably 1 ° C. or higher, and more preferably 3 ° C. or higher, for the reason of preventing RNA degradation. Moreover, 10 degrees C or less is preferable and 5 degrees C or less is more preferable. Among them, the temperature at which the centrifugation is performed is particularly preferably 4 ° C.
遠心分離を行う時間は特に限定されないが、ゴム粒子の除去精度を高める観点から、３０分間以上が好ましく、４５分間以上がより好ましい。また、ＲＮＡの分解を防ぐという理由からは９０分間以下が好ましく、６０分間以下がより好ましい。 The time for performing the centrifugation is not particularly limited, but is preferably 30 minutes or more, and more preferably 45 minutes or more from the viewpoint of improving the removal accuracy of the rubber particles. Moreover, 90 minutes or less are preferable and 60 minutes or less are more preferable from the reason of preventing decomposition | disassembly of RNA.
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例などで用いる天然ゴムラテックスは全て共通し、タイにおけるＨｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のものを氷冷しながら採取後、何も処理を行わず、そのまま使用した。また実験に用いる器具はＲＮＡ分解酵素の混入を防ぐため、適切な方法によりＲＮＡ分解酵素除去処理を行い、さらに作業者は手袋とマスクを着用したうえで操作を行った。 The present invention will be described based on examples, but the present invention is not limited to the examples. The natural rubber latex used in the examples and the like is common, and a material derived from Hevea brasiliensis in Thailand was collected while being ice-cooled, and then used as it was without any treatment. Moreover, in order to prevent mixing of RNA-degrading enzyme, the instrument used for experiment performed the RNA-degrading enzyme removal process by an appropriate method, and also the operator operated after wearing gloves and a mask.
＜実施例１＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
１０分前に採取した天然ゴムラテックス９ｍＬに、２０ｍＭのＤＴＴおよび５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｉｎ（プロメガ株式会社製のリボヌクレアーゼ阻害剤）を含有する１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を１ｍＬ（天然ゴムラテックス１００質量部に対して１１質量部）添加し、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを調製した。
<Example 1>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction 1 mL of Tris buffer (pH 7.) containing 20 mM DTT and 5000 units / mL RNasin (a ribonuclease inhibitor manufactured by Promega Corporation) in 9 mL of natural rubber latex collected 10 minutes ago. 5 mL of 5) was added (11 parts by mass with respect to 100 parts by mass of natural rubber latex) to prepare a natural rubber latex solution A for RNA extraction.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを、ドライアイス（−７９℃凍結）を用いて凍結させた。天然ゴムラテックスの採取から凍結開始までの時間は１５分であった。そして、凍結させた溶液は、ドライアイスで凍結を維持させたまま、タイから日本へは空路、日本国内は陸路による輸送で、ＲＮＡ抽出作業を行う場所まで輸送した。タイから発送後、４日後に日本に到着した。溶液の凍結状態を維持するために、輸送途中にドライアイスの追加を行った。
Transport of Natural Rubber Latex Solution for RNA Extraction Natural rubber latex solution A for RNA extraction was frozen using dry ice (freezing at −79 ° C.). The time from collection of natural rubber latex to the start of freezing was 15 minutes. The frozen solution was transported to the place where RNA extraction work was performed by air transportation from Thailand to Japan and land transportation in Japan while maintaining freezing with dry ice. Arrived in Japan 4 days after shipping from Thailand. In order to maintain the frozen state of the solution, dry ice was added during transportation.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ａを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内にフリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
Storage of natural rubber latex solution for RNA extraction Solution A after transportation was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. Within thirty minutes after thawing, the sample was frozen in a freezer (-80 ° C. frozen) and stored again for 2 months.
ゴム粒子の分離、除去
２箇月保存後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａ１０ｍＬを、４５分、４℃、２００００×ｇで遠心分離した。遠心分離後、上層に分離されたゴム粒子層にスパチュラ穴を開け、水層を採取し定量した。水層が白く濁っていない（ゴム粒子が残っていない）ことを確認し、次の操作に進んだ。
Separation and removal of rubber particles The natural rubber latex solution A for RNA extraction after storage for 2 months was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. 10 mL of the natural rubber latex solution A for RNA extraction after thawing was centrifuged at 20000 × g at 4 ° C. for 45 minutes. After centrifugation, a spatula hole was made in the rubber particle layer separated into the upper layer, and the aqueous layer was collected and quantified. After confirming that the water layer was not white and cloudy (no rubber particles remained), proceeded to the next operation.
ＲＮＡの抽出
採取した水層の内６ｍＬを別容器に移し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液を１ｍＬ、予め６５℃に加温した水飽和フェノールを１２ｍＬ添加し、混合した。そして、６５℃で５分間インキュベートした後、ボルテックスにより溶液を撹拌した。撹拌後、１０分、室温（２３℃）、７０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新しい容器に採取した。採取した上清にフェノール：クロロホルム（５０：５０）を１２ｍＬ添加し、２分間振盪後、１０分、室温（２３℃）、７０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新しい容器に採取した。採取した上清にクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を１２ｍＬ添加し、２分間振盪後、１０分、室温（２３℃）、７０００ｒｐｍで遠心分離し上清を新しい容器に採取した。さらに、上清に３Ｍ酢酸ナトリウムを１．２ｍＬ、イソプロパノールを１３ｍＬ添加し、ボルテックスで撹拌の後、−２０℃で３０分インキュベートし、１０分、４℃、５０００×ｇで遠心分離した。沈殿を７０％エタノールで１ｍＬで２度洗浄し、乾燥させたのち、０．２ｍＬのＲＮａｓｅフリーの水に溶解させることで抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Extraction of RNA 6 mL of the collected aqueous layer was transferred to another container, 5 mL of 100 mM sodium acetate buffer, 1 mL of 10% SDS solution, and 12 mL of water-saturated phenol preheated to 65 ° C. were added and mixed. And after incubating for 5 minutes at 65 degreeC, the solution was stirred by vortex. After stirring, the mixture was centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes at room temperature (23 ° C.), and the supernatant was collected in a new container. 12 mL of phenol: chloroform (50:50) was added to the collected supernatant, shaken for 2 minutes, centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes at room temperature (23 ° C.), and the supernatant was collected in a new container. 12 mL of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) was added to the collected supernatant, shaken for 2 minutes, centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes at room temperature (23 ° C.), and the supernatant was collected in a new container. Furthermore, 1.2 mL of 3M sodium acetate and 13 mL of isopropanol were added to the supernatant, stirred by vortexing, incubated at −20 ° C. for 30 minutes, and centrifuged at 4 ° C. and 5000 × g for 10 minutes. The precipitate was washed twice with 1 mL of 70% ethanol, dried, and then dissolved in 0.2 mL of RNase-free water to obtain an extracted RNA solution.
＜実施例２＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａの調製、輸送および保存を行った。
<Example 2>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Storage of natural rubber latex solution for RNA extraction Preparation, transportation and storage of natural rubber latex solution A for RNA extraction were carried out in the same manner as in Example 1. It was.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
２箇月保存後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。ゴム粒子の分離、除去を行わず、解凍後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａ６ｍＬに、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液を１ｍＬ、予め６５℃に加温した水飽和フェノールを１２ｍＬ添加し、混合した。凝集したゴムを除去し、その後の操作は実施例１と同様に行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation and removal of rubber particles Extraction of RNA The natural rubber latex solution A for RNA extraction after storage for 2 months was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. Without separating and removing rubber particles, 5 mL of 100 mM sodium acetate buffer solution, 1 mL of 10% SDS solution, and 12 mL of water saturated phenol preheated to 65 ° C. Added and mixed. The aggregated rubber was removed, and the subsequent operation was performed in the same manner as in Example 1 to obtain an extracted RNA solution.
＜実施例３＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＤＴＴを含有しない１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外は実施例１と同様にＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｂを調製した。
<Example 3>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction Natural rubber latex solution B for RNA extraction was prepared in the same manner as in Example 1 except that 1M Tris buffer (pH 7.5) containing no DTT was used.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｂを用いたこと以外は、実施例１と同様に輸送した。
Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Transport was performed in the same manner as in Example 1 except that the natural rubber latex solution B for RNA extraction was used.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ｂを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に、終濃度が２．０ｍＭとなるようにＤＴＴを添加し、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
Storage of natural rubber latex solution for RNA extraction Solution B after transport was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. Within 30 minutes after thawing, DTT was added to a final concentration of 2.0 mM, placed in a freezer (−80 ° C. frozen), frozen again, and stored for 2 months.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation of rubber particles and extraction of removed RNA In the same manner as in Example 1, separation and removal of rubber particles and extraction of RNA were performed to obtain an extracted RNA solution.
＜参考例１＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを調製した。
<Reference Example 1>
Preparation of Natural Rubber Latex Solution for RNA Extraction Natural rubber latex solution A for RNA extraction was prepared in the same manner as in Example 1.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａを、凍結させずに４℃を維持して、タイから日本へは空路、日本国内は陸路による輸送で、ＲＮＡ抽出作業を行う場所まで輸送した。タイから発送後、４日後に日本に到着した。
Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Keeping natural rubber latex solution A for RNA extraction at 4 ° C without freezing, RNA extraction work is performed by air transportation from Thailand to Japan and by land transportation in Japan. Shipped to location. Arrived in Japan 4 days after shipping from Thailand.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ａ（輸送工程で凍結なし）を、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
Storage of natural rubber latex solution for RNA extraction Solution A after transport (no freezing in the transport process) was placed in a freezer (-80 ° C freezing), frozen, and stored as such for 2 months.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation of rubber particles and extraction of removed RNA In the same manner as in Example 1, separation and removal of rubber particles and extraction of RNA were performed to obtain an extracted RNA solution.
＜参考例２＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮａｓｉｎを含有しない１００Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたこと以外は実施例１と同様にＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｃを調製した。
<Reference Example 2>
Preparation of Natural Rubber Latex Solution for RNA Extraction Natural rubber latex solution C for RNA extraction was prepared in the same manner as in Example 1 except that 100 M Tris buffer (pH 7.5) containing no RNasin was used.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｃを用いたこと以外は、実施例１と同様に輸送した。
Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Transport was performed in the same manner as in Example 1 except that the natural rubber latex solution C for RNA extraction was used.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ｃを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に、終濃度が５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるようにＲＮａｓｉｎを添加し、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
Storage of Natural Rubber Latex Solution for RNA Extraction Solution C after transport was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. Within 30 minutes after thawing, RNasin was added to a final concentration of 500 units / mL, placed in a freezer (freezing at −80 ° C.), frozen again, and stored for 2 months.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation of rubber particles and extraction of removed RNA In the same manner as in Example 1, separation and removal of rubber particles and extraction of RNA were performed to obtain an extracted RNA solution.
＜実施例４＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａの調製および輸送を行った。
<Example 4>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Preparation and transportation of natural rubber latex solution A for RNA extraction were carried out in the same manner as in Example 1.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ａを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に、ＤＴＴの終濃度が１．５ｍＭとなるように、５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｉｎを含有する１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍＬ添加し、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
Storage of natural rubber latex solution for RNA extraction Solution A after transportation was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. Within 30 minutes after thawing, 3.5 mL of 100 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 500 units / mL of RNasin is added so that the final concentration of DTT is 1.5 mM, and the freezer (freeze at −80 ° C. is used). ) And frozen again and stored for 2 months.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation of rubber particles and extraction of removed RNA In the same manner as in Example 1, separation and removal of rubber particles and extraction of RNA were performed to obtain an extracted RNA solution.
＜参考例３＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａの調製および輸送を行った。
<Reference Example 3>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Preparation and transportation of natural rubber latex solution A for RNA extraction were carried out in the same manner as in Example 1.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ａを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に冷蔵庫（４℃）に入れて、そのまま２箇月間保存した。
Storage of natural rubber latex solution for RNA extraction Solution A after transportation was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. Within thirty minutes after thawing, it was placed in a refrigerator (4 ° C.) and stored for 2 months.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation of rubber particles and extraction of removed RNA In the same manner as in Example 1, separation and removal of rubber particles and extraction of RNA were performed to obtain an extracted RNA solution.
＜参考例４＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ａの調製および輸送を行った。
<Reference Example 4>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Preparation and transportation of natural rubber latex solution A for RNA extraction were carried out in the same manner as in Example 1.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ｃを、３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。解凍後３０分以内に、ＲＮａｓｉｎの終濃度が３７０ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように、２０ｍＭのＤＴＴを含有する１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍＬ添加し、フリーザー（−８０℃凍結）に入れて再度、凍結させ、そのまま２箇月間保存した。
Storage of Natural Rubber Latex Solution for RNA Extraction Solution C after transport was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. Within 30 minutes after thawing, 3.5 mL of 100 mM Tris buffer (pH 7.5) containing 20 mM DTT is added so that the final concentration of RNasin becomes 370 units / mL, and the freezer (freeze at −80 ° C.) is added. It was frozen again and stored for 2 months.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
実施例１と同様に、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation of rubber particles and extraction of removed RNA In the same manner as in Example 1, separation and removal of rubber particles and extraction of RNA were performed to obtain an extracted RNA solution.
＜比較例１＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
１２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３６ｍＬ添加したこと以外は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを調製した。ＤＴＴ、ＲＮａｓｉｎの終濃度も同じになるように調製した。
<Comparative Example 1>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction Natural rubber latex solution D for RNA extraction was prepared in the same manner as in Example 1 except that 36 mL of 125 mM Tris buffer (pH 7.5) was added. The final concentrations of DTT and RNasin were also adjusted to be the same.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを用いたこと以外は、実施例１と同様に輸送、保存、ゴム粒子の分離、除去およびＲＮＡの抽出を行った。
Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Separation of stored rubber particles of natural rubber latex solution for RNA extraction, extraction of removed RNA Transport in the same manner as in Example 1 except that natural rubber latex solution D for RNA extraction was used. Storage, rubber particle separation, removal and RNA extraction were performed.
＜比較例２＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
１２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３６ｍＬ添加したこと以外は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを調製した。ＤＴＴ、ＲＮａｓｉｎの終濃度も同じになるように調製した。
<Comparative Example 2>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction Natural rubber latex solution D for RNA extraction was prepared in the same manner as in Example 1 except that 36 mL of 125 mM Tris buffer (pH 7.5) was added. The final concentrations of DTT and RNasin were also adjusted to be the same.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを用いたこと以外は、実施例１と同様に輸送および保存を行った。
Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Storage of natural rubber latex solution for RNA extraction Transport and storage were performed in the same manner as in Example 1 except that the natural rubber latex solution D for RNA extraction was used.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
２箇月保存後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄを３０℃の水に容器ごと浸けることで急速に解凍させた。ゴム粒子の分離、除去を行わず、解凍後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｄ６ｍＬに、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液を１ｍＬ、予め６５℃に加温した水飽和フェノールを１２ｍＬ添加し、混合した。凝集したゴムを除去し、その後の操作は実施例１と同様に行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation and removal of rubber particles Extraction of RNA The natural rubber latex solution D for RNA extraction after storage for 2 months was rapidly thawed by immersing the container in water at 30 ° C. Without separating and removing the rubber particles, the natural rubber latex solution for RNA extraction D6 mL after thawing, 5 mL of 100 mM sodium acetate buffer, 1 mL of 10% SDS solution, 12 mL of water saturated phenol preheated to 65 ° C. Added and mixed. The aggregated rubber was removed, and the subsequent operation was performed in the same manner as in Example 1 to obtain an extracted RNA solution.
＜比較例３＞
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の調製
ＤＴＴおよびＲＮａｓｉｎを含有しない１２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３６ｍＬ添加したこと以外は実施例１と同様に、ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｅを調製した。
<Comparative Example 3>
Preparation of natural rubber latex solution for RNA extraction Natural rubber latex solution E for RNA extraction was prepared in the same manner as in Example 1 except that 36 mL of 125 mM Tris buffer (pH 7.5) containing no DTT and RNasin was added.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｅを、凍結させずに４℃を維持して、タイから日本へは空路、日本国内は陸路による輸送で、ＲＮＡ抽出作業を行う場所まで輸送した。タイから発送後、４日後に日本に到着した。
Transport of natural rubber latex solution for RNA extraction Keeping natural rubber latex solution E for RNA extraction at 4 ° C without freezing, perform RNA extraction work by air transportation from Thailand to Japan and land transportation in Japan. Shipped to location. Arrived in Japan 4 days after shipping from Thailand.
ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の保存
輸送後の溶液Ｅを、冷蔵庫（４℃）に入れて、そのまま２箇月間保存した。
Storage of natural rubber latex solution for RNA extraction Solution E after transport was placed in a refrigerator (4 ° C.) and stored for 2 months.
ゴム粒子の分離、除去
ＲＮＡの抽出
ゴム粒子の分離、除去を行わず、解凍後のＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液Ｅ６ｍＬに、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を５ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液を１ｍＬ、予め６５℃に加温した水飽和フェノールを１２ｍＬ添加し、混合した。凝集したゴムを除去し、その後の操作は実施例１と同様に行い、抽出ＲＮＡ溶液を得た。
Separation of rubber particles and extraction of RNA Extraction of natural rubber latex solution for RNA extraction after thawing without separation and removal of rubber particles, 5 mL of 100 mM sodium acetate buffer, 1 mL of 10% SDS solution, 65 ° C. in advance 12 mL of water-saturated phenol heated to was added and mixed. The aggregated rubber was removed, and the subsequent operation was performed in the same manner as in Example 1 to obtain an extracted RNA solution.
得られた抽出ＲＮＡ溶液を用いて以下に示す方法により評価した。評価結果は表１に示す。また、表１には各実施例、参考例および比較例の概要を併せて表１に示す。なお、表１中の緩衝液含有量は天然ゴムラテックス１００質量部に対する含有量である。 The obtained extracted RNA solution was used for evaluation by the following method. The evaluation results are shown in Table 1. Table 1 also shows the summary of each example, reference example, and comparative example. In addition, buffer solution content in Table 1 is content with respect to 100 mass parts of natural rubber latex.
得られた各抽出ＲＮＡ溶液について下記の評価を行った。 The following evaluation was performed about each obtained extraction RNA solution.
ＲＮＡ純度
各抽出ＲＮＡ溶液の一部（１００μＬ）を分取し、分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）にて、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度を測定し、Ａ２６０ｎｍの値／Ａ２８０ｎｍの値を算出した。２６０ｎｍの値／Ａ２８０ｎｍの値が２．０に近いほど、抽出ＲＮＡ溶液中のＲＮＡ純度が高いことを示す。比較例２および３の結果は検出限界以下であり検出できなかった。
RNA purity A part (100 μL) of each extracted RNA solution was collected, and absorbance at 260 nm and 280 nm was measured with a spectrophotometer (manufactured by Thermo SCIENTIFIC), and a value of A260 nm / A280 nm was calculated. The closer the value of 260 nm / A280 nm is to 2.0, the higher the RNA purity in the extracted RNA solution. The results of Comparative Examples 2 and 3 were below the detection limit and could not be detected.
ＲＮＡ抽出効率
また、２６０ｎｍの吸光度から算出した各抽出ＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度から、各実施例、参考例および比較例において、天然ゴムラテックス１ｍＬ当たりから得られたＲＮＡ量（μｇ／ｍＬ−天然ゴムラテックス）を算出した。比較例２および３の結果は検出限界以下であり検出できなかった。
RNA extraction efficiency In addition, from the RNA concentration of each extracted RNA solution calculated from the absorbance at 260 nm, the RNA amount (μg / mL-natural rubber latex) obtained from 1 mL of natural rubber latex in each Example, Reference Example and Comparative Example. ) Was calculated. The results of Comparative Examples 2 and 3 were below the detection limit and could not be detected.
表１に示す結果より、天然ゴムラテックスにｐＨ５〜９の緩衝液およびＲＮＡ分解酵素阻害剤を所定量含有するＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を適切に、輸送、保存およびＲＮＡ抽出することで、天然ゴムラテックスからＲＮＡを効率的に抽出することができることがわかる。 From the results shown in Table 1, the natural rubber latex solution for RNA extraction containing a predetermined amount of a pH 5-9 buffer solution and an RNA-degrading enzyme inhibitor in natural rubber latex is appropriately transported, stored and extracted with RNA. It can be seen that RNA can be efficiently extracted from rubber latex.
Claims (11)
前記緩衝液の含有量が天然ゴムラテックス１００質量部に対して５０質量部以下であり、
前記ＲＮＡ分解酵素阻害剤の濃度が５００〜５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬであるＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液。 A natural rubber latex solution for RNA extraction containing a natural rubber latex, a pH 5-9 buffer and an RNase inhibitor;
The content of the buffer solution is 50 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of natural rubber latex,
A natural rubber latex solution for RNA extraction, wherein the concentration of the RNase inhibitor is 500 to 5000 units / mL.
凍結した前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液を、輸送する輸送工程および／または保存する保存工程を含むＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液の輸送および／または保存方法。 A freezing step for freezing the natural rubber latex solution for RNA extraction according to any one of claims 1 to 4, and a transporting step for transporting and / or storing a frozen natural rubber latex solution for RNA extraction. A method for transporting and / or storing a natural rubber latex solution for RNA extraction comprising:
前記ＲＮＡ抽出用天然ゴムラテックス溶液から遠心分離によりゴム成分を分離、除去する工程を含む請求項８または９記載のＲＮＡ抽出方法。 Before the RNA extraction step,
The RNA extraction method according to claim 8 or 9, comprising a step of separating and removing a rubber component from the natural rubber latex solution for RNA extraction by centrifugation.
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