JP2016007176A - Method for amplifying and detecting nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料に含まれる標的核酸を特異的に増幅し、検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for specifically amplifying and detecting a target nucleic acid contained in a sample.
ウイルス感染症の検査において、試料中に含まれるウイルス核酸を検出する方法を採用する場合、一般に前記試料中に含まれるウイルス核酸が極微量であることから、前記ウイルス核酸を増幅し検出する方法が用いられる。 In the case of adopting a method for detecting a viral nucleic acid contained in a sample in the inspection of a viral infection, since the amount of the viral nucleic acid contained in the sample is generally extremely small, there is a method for amplifying and detecting the viral nucleic acid. Used.
核酸を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が広く知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有する一組のプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下で、熱変性−プライマーアニール−伸長反応からなるサイクルを繰り返し行なうことによってＤＮＡを増幅する方法である。また標的核酸がＲＮＡの場合、逆転写酵素によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲ法を行なう、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法が知られている。しかし、ＰＣＲ法およびＲＴ−ＰＣＲ法は急激に何度も反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。 As a method for amplifying a nucleic acid, a polymerase chain reaction method (PCR method) is widely known. This method repeats a cycle consisting of heat denaturation-primer annealing-extension reaction in the presence of a pair of primers having a sequence complementary to or homologous to a part of a specific base sequence in the target DNA and a thermostable DNA polymerase. It is a method of amplifying DNA by performing. In addition, when the target nucleic acid is RNA, a so-called RT-PCR method is known in which a PCR method is performed after cDNA is once synthesized by reverse transcriptase. However, the PCR method and the RT-PCR method need to raise and lower the reaction temperature a number of times rapidly, which has been a barrier for labor saving and cost reduction of the reaction apparatus at the time of automation.
一方、ＲＮＡを標的として一定温度で核酸を増幅する方法としてＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）といった方法が知られている。これらの方法は、反応温度を昇降させることなく一定温度で核酸が増幅するため、簡便に核酸を増幅することができる。そのため自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化ができる点で好ましい方法といえる。しかしながら標的核酸がＤＮＡの場合、これらの方法による核酸増幅は困難であった。
On the other hand, methods such as NASBA method (
特許文献５では、トリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素が有する鎖置換活性を用いることで、ＮＡＳＢＡ法によるＤＮＡの増幅および検出を実現している。しかしながら操作が煩雑（３７℃で２時間保温後、−２０℃に凍結し、その後ＥＬＯＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ ＯｌｉｇｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で検出）であり、最小検出感度も１０６コピー／テストと不十分であった。 In Patent Document 5, amplification and detection of DNA by the NASBA method are realized by using the strand displacement activity of avian myeloblastoma virus (AMV) reverse transcriptase. However, the operation was complicated (freeze to -20 ° C after incubation at 37 ° C for 2 hours, and then detected by ELISA (Enzyme Linked Oligosorbent Assay) method), and the minimum detection sensitivity was 10 6 copies / test and insufficient. .
本発明の課題は、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法において、試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法を提供することにある。 The subject of the present invention is a method for amplifying RNA at a constant temperature such as NASBA method, TMA method, TRC method, etc., the target nucleic acid contained in the sample is highly specific regardless of the type of nucleic acid (DNA / RNA), It is an object of the present invention to provide a method capable of amplifying with high sensitivity, speed, and simplicity.
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、温度を上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことで、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅することができることを見出し、本発明の完成に至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have a sequence that is homologous or complementary to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side. The temperature is increased after the step of synthesizing DNA homologous or complementary to the target nucleic acid from the complementary or homologous strand of the target nucleic acid using a primer and an enzyme having RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase activity. In addition, by performing the step of converting the synthesized DNA into a single-stranded nucleic acid, the nucleic acid can be amplified with high specificity, high sensitivity, quickness, and simpleness regardless of the type of nucleic acid (DNA / RNA). The headline, the present invention has been completed.
すなわち本発明の第一の態様は、以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）温度を上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）前記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第二の態様は、以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）温度を上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）前記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第三の態様は、以下の（１）から（９）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）温度を上昇させることで、前記（３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（８）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（９）前記（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第四の態様は、標的核酸が二本鎖核酸であり、かつ（１）の工程の前に、温度を上昇させることで前記標的核酸を一本鎖核酸とする工程を行なう、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の増幅方法である。
That is, the first aspect of the present invention is a method for amplifying a target nucleic acid, comprising the following steps (1) to (7).
(1) a first primer having a sequence homologous to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing DNA homologous to the target nucleic acid from the complementary strand of the target nucleic acid using an enzyme (2) A step of increasing the temperature to convert the DNA synthesized in (1) above into a single-stranded DNA ( 3) From the single-stranded DNA obtained in (2) above, using a second primer having a sequence complementary to a part of the target nucleic acid and an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity, the 5 ′ end A step of synthesizing a double-stranded DNA to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added (4) RNA polymerase activity corresponding to the promoter sequence Step (5) of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (3) above, using the second primer and the enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity, Synthesizing cDNA complementary to the target nucleic acid from the RNA transcript of (4),
(6) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(7) A step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (6) as a template. The second aspect of the present invention includes the following steps (1) to (7): A method for amplifying a target nucleic acid.
(1) a second primer having a sequence complementary to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase activity Step of synthesizing DNA complementary to target nucleic acid from target nucleic acid using enzyme (2) Step of increasing temperature to make DNA synthesized in (1) above as single-stranded DNA (3) Target Using a first primer having a sequence homologous to a part of the nucleic acid and an enzyme having a DNA-dependent DNA polymerase activity, RNA on the 5 ′ end side from the single-stranded DNA obtained in the above (2) A step of synthesizing double-stranded DNA to which a promoter sequence of an enzyme having polymerase activity is added (4) an enzyme having RNA polymerase activity corresponding to the promoter sequence; (5) step of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (3) above, using the first primer and an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity (4) ) Synthesizing cDNA homologous to the target nucleic acid from the RNA transcript of
(6) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(7) A step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (6) as a template. The third aspect of the present invention includes the following steps (1) to (9): A method for amplifying a target nucleic acid.
(1) A step of synthesizing cDNA complementary to the target nucleic acid from the target RNA using a second primer having a sequence complementary to a part of the target nucleic acid and an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity ( 2) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(3) Using a first primer having a sequence homologous to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity The step of synthesizing double-stranded DNA from the single-stranded DNA obtained in the above (2) (4) By raising the temperature, it has RNA polymerase activity on the 5 ′ end side synthesized in the above (3) Step of converting DNA added with enzyme promoter sequence into single-stranded DNA (5) Single-stranded DNA obtained in (4) above using second primer and enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing double-stranded DNA to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added at the 5 ′ end side (6) RN corresponding to the promoter sequence Step (7) of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (5) above using an enzyme having polymerase activity (7) Using a second primer and an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing cDNA complementary to the target nucleic acid from the RNA transcript of (6),
(8) Degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having RNase H activity (generation of single-stranded DNA)
(9) A step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (8) as a template. In the fourth aspect of the present invention, the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid, and ( The amplification method according to any one of the first to third aspects, wherein the step of converting the target nucleic acid into a single-stranded nucleic acid by increasing the temperature is performed before the step 1).
また本発明の第五の態様は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の増幅方法である。 According to a fifth aspect of the present invention, the enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity, the enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity, and the enzyme having RNase H activity are AMV reverse transcriptases. The amplification method according to any one of the first to fourth aspects.
さらに本発明の第六の態様は、ＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の増幅方法にさらに含んでなる、標的核酸の検出方法である。 Furthermore, in the sixth aspect of the present invention, from the first step, the step of detecting using an oligonucleotide probe that changes in fluorescence characteristics as compared to before formation when a complementary double strand is formed with a part of the RNA transcript. A method for detecting a target nucleic acid, further comprising the amplification method according to any one of the fifth aspect.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明における標的核酸とは、試料中に含まれる一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのうち、本発明の増幅方法により増幅される領域のことをいう。 The target nucleic acid in the present invention refers to a region of a single-stranded or double-stranded DNA or RNA contained in a sample that is amplified by the amplification method of the present invention.
本発明において、相補的な配列を有するとは、標的核酸に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、相同的な配列を有するとは、標的核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。ここでいうストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール（商品名）、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが共存する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件下でハイブリダイズ可能な条件があげられる。 In the present invention, having a complementary sequence means having a sequence capable of hybridizing to a target nucleic acid under stringent conditions, and having a homologous sequence means having a sequence complementary to the target nucleic acid. Having a sequence that can hybridize under stringent conditions. The stringent conditions mentioned here can be selected from known conditions and are not particularly limited. For example, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide, 0.1% bovine serum The conditions under which albumin, 0.1% Ficoll (trade name), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), 150 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate coexist, Examples include conditions that allow hybridization under the nucleic acid amplification conditions described in the Examples of the specification.
本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。なお第一または第二のプライマーに付加するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列は、本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応した配列を用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合の一例として、配列番号１１に記載の配列からなるＴ７プロモータがあげられる。 Examples of the enzyme having RNA polymerase activity used in the present invention include bacteriophage-derived T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase or derivatives thereof widely used in molecular biological experiments. The promoter sequence of the enzyme having RNA polymerase activity to be added to the first or second primer may be a sequence corresponding to the enzyme having RNA polymerase activity used in the present invention, and T7 RNA is used as the enzyme having RNA polymerase activity. An example of using a polymerase is a T7 promoter consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 11.
本発明ではＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の他に、少なくともＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素も用いる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよく、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素またはこれらの誘導体は、前述した三つの酵素活性の全てを有しているため好ましく、中でもＡＭＶ逆転写酵素またはその誘導体が好ましい。 In the present invention, in addition to the enzyme having RNA polymerase activity, an enzyme having at least RNA-dependent DNA polymerase activity, an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity, and an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity are also used. As the enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity, the enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity, and the enzyme having RNase H activity, an enzyme having several activities may be used. These enzymes may be used. AMV reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase, HIV reverse transcriptase or a derivative thereof is preferable because it has all of the above three enzyme activities, and among them, AMV reverse transcriptase or a derivative thereof is preferable.
本発明の核酸増幅方法は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、温度を上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことを特徴としている。温度を上昇させる条件は、二本鎖核酸を解離可能な温度条件とすればよく、二本鎖核酸が二本鎖ＤＮＡの場合は６０℃以上とすればよいが、８０℃以上とすると好ましく、８５℃以上とするとさらに好ましい。温度を上昇させる操作に特に限定はなく、例えばヒートブロックを用いた温度上昇があげられる。また温度を上昇させる操作を行なう際、さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）といった溶媒の極性を下げる薬剤などを添加することで、二本鎖核酸の解離を促進してもよい。前記薬剤を添加した場合の温度条件は、４０℃以上であればよく、４５℃以上（例えば４６℃）であればさらによい。なお二本鎖核酸の解離は、二本鎖核酸の長さ、二本鎖核酸のＧＣ含量、溶媒中の塩濃度などによって影響を受けることが知られており、これらを最適化することで二本鎖核酸の解離を促進してもよい。二本鎖核酸が解離する条件の例として、本明細書の実施例に記載の条件があげられる。 The nucleic acid amplification method of the present invention comprises a primer having a sequence homologous to or complementary to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added at the 5 ′ end, and RNA-dependent or DNA-dependent After the step of synthesizing DNA homologous or complementary to the target nucleic acid from the complementary strand or homologous strand of the target nucleic acid using an enzyme having DNA polymerase activity, the temperature is increased and one of the synthesized DNAs It is characterized by performing a step of forming a chain nucleic acid. The condition for raising the temperature may be a temperature condition at which the double-stranded nucleic acid can be dissociated. If the double-stranded nucleic acid is a double-stranded DNA, it may be 60 ° C. or higher, preferably 80 ° C. or higher, More preferably, it is 85 ° C. or higher. There is no particular limitation on the operation for raising the temperature, and for example, a temperature rise using a heat block can be mentioned. Further, when performing the operation of increasing the temperature, the dissociation of the double-stranded nucleic acid may be promoted by adding an agent that lowers the polarity of the solvent, such as dimethyl sulfoxide (DMSO). The temperature condition when the chemical is added may be 40 ° C. or higher, and more preferably 45 ° C. or higher (eg, 46 ° C.). The dissociation of double-stranded nucleic acid is known to be affected by the length of double-stranded nucleic acid, the GC content of double-stranded nucleic acid, the salt concentration in the solvent, etc. Dissociation of the double-stranded nucleic acid may be promoted. Examples of conditions for dissociating double-stranded nucleic acids include the conditions described in the examples of the present specification.
温度を上昇させたままの状態を維持すると、プライマーと一本鎖核酸とがアニールせず、標的核酸の増幅が進まないため、一本鎖核酸とする工程を行なった後は、プライマーと一本鎖核酸とがアニールする条件まで温度まで下降させる。温度を下降させる操作に特に限定はなく、例えば反応容器を氷水につける操作や、等温増幅法を実施する温度に保温したヒートブロックに反応容器を載置する操作があげられる。なおプライマーと一本鎖核酸とのアニールは、反応温度、溶媒の極性、プライマーの長さ、プライマーのＧＣ含量、溶媒中の塩濃度などによって影響を受けることが知られており、これらを最適化することでアニールを促進してもよい。 If the temperature is kept elevated, the primer and the single-stranded nucleic acid will not anneal, and the amplification of the target nucleic acid will not proceed. The temperature is lowered to a temperature at which the strand nucleic acid is annealed. The operation for lowering the temperature is not particularly limited, and examples thereof include an operation for placing the reaction vessel on ice water and an operation for placing the reaction vessel on a heat block kept at a temperature at which the isothermal amplification method is performed. It is known that annealing of primer and single-stranded nucleic acid is affected by reaction temperature, solvent polarity, primer length, primer GC content, salt concentration in the solvent, etc. By doing so, annealing may be promoted.
本発明の増幅方法は、鋳型核酸の形態により異なる。鋳型核酸が標的核酸の相補鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ａ−１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（Ａ−２）温度を上昇させることで、前記（Ａ−１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ａ−３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ａ−４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ａ−５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ａ−６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ａ−７）前記（Ａ−６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。鋳型核酸が標的核酸の相同鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ｂ−１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（Ｂ−２）温度を上昇させることで、前記（Ｂ−１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ｂ−３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｂ−４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ｂ−５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｂ−６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｂ−７）前記（Ｂ−６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。鋳型核酸が一本鎖ＲＮＡの相同鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ｃ−１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｃ−３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−４）温度を上昇させることで、前記（Ｃ−３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ｃ−５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ｃ−７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｃ−８）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｃ−９）前記（Ｃ−８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。
The amplification method of the present invention varies depending on the form of the template nucleic acid. As an example of the amplification method when the template nucleic acid is a complementary strand of the target nucleic acid,
(A-1) a first primer having a sequence homologous to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing DNA homologous to the target nucleic acid from the complementary strand of the target nucleic acid using an enzyme having the above (A-2) By increasing the temperature, one DNA synthesized in the above (A-1) Step (A-3) obtained by the step (A-2) using a second primer having a sequence complementary to a part of the target nucleic acid and an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing double-stranded DNA in which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added to the 5 ′ end side from the single-stranded DNA (A-4) Step of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (A-3) above using an enzyme having NA polymerase activity (A-5) Second primer and RNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing cDNA complementary to the target nucleic acid from the RNA transcript of (A-4) using an enzyme having
(A-6) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(A-7) A method including a step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (A-6) as a template. As an example of the amplification method when the template nucleic acid is a homologous strand of the target nucleic acid,
(B-1) a second primer having a sequence complementary to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase activity Step (B-2) of synthesizing DNA complementary to the target nucleic acid from the target nucleic acid using the enzyme having the above: (B-2) By raising the temperature, the DNA synthesized in the above (B-1) (B-3) one obtained in (B-2) above using a first primer having a sequence homologous to a part of the target nucleic acid and an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity Step (B-4) of synthesizing double-stranded DNA having a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity on the 5 ′ end side from the strand DNA (B-4) A step of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (B-3) above using an enzyme having a merase activity (B-5) a first primer and an RNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing cDNA homologous to the target nucleic acid from the RNA transcript of (B-4) using an enzyme having
(B-6) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(B-7) A method including a step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (B-6) as a template. As an example of the amplification method when the template nucleic acid is a homologous strand of single-stranded RNA,
(C-1) Using a second primer having a sequence complementary to a part of the target nucleic acid and an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity, cDNA complementary to the target nucleic acid is synthesized from the target RNA. Step (C-2) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(C-3) a first primer having a sequence homologous to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity Using the single-stranded DNA obtained in (C-2) above, the step of synthesizing double-stranded DNA (C-4) by increasing the temperature, the 5 ′ synthesized in (C-3) The step of converting the DNA having the promoter sequence of the enzyme having RNA polymerase activity on the terminal side into single-stranded DNA (C-5), using the second primer and the enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity, A step of synthesizing double-stranded DNA to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side from the single-stranded DNA obtained in C-4) (C-6) Step of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (C-5) above using an enzyme having RNA polymerase activity corresponding to the promoter sequence (C-7) Second primer, and RNA A step of synthesizing cDNA complementary to the target nucleic acid from the RNA transcript of (C-6) using an enzyme having dependent DNA polymerase activity;
(C-8) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having RNase H activity (generation of single-stranded DNA)
(C-9) A method comprising a step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (C-8) as a template.
なお標的核酸が二本鎖核酸の場合は、前記二本鎖核酸を含む溶液の温度を上昇させて、一本鎖核酸とする工程を行なった後、当該一本鎖核酸の態様に応じて、前記（Ａ−１）、前記（Ｂ−１）、前記（Ｃ−１）のいずれかの工程を行なえばよい。なお前記工程は、例えば、試料からの標的核酸の抽出工程といった予備操作における最終工程で、標的核酸を含む溶液をヒートブロック上で加温させることで行なってよい。 In addition, when the target nucleic acid is a double-stranded nucleic acid, after increasing the temperature of the solution containing the double-stranded nucleic acid to form a single-stranded nucleic acid, according to the embodiment of the single-stranded nucleic acid, Any one of the steps (A-1), (B-1), and (C-1) may be performed. In addition, you may perform the said process by heating the solution containing a target nucleic acid on a heat block at the last process in preliminary operations, such as the extraction process of the target nucleic acid from a sample, for example.
本発明の増幅方法で増幅した標的核酸（ＲＮＡ転写産物）を検出することで、試料中に含まれる標的核酸の有無を検出することができるが、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをあらかじめ添加し、当該蛍光特性の変化を蛍光分光光度計で経時的に測定すると、試料中に含まれる標的核酸の増幅と検出を一段階かつ密閉容器内で行なえるため、好ましい。 By detecting the target nucleic acid (RNA transcript) amplified by the amplification method of the present invention, the presence or absence of the target nucleic acid contained in the sample can be detected, but two complementary to the amplified target nucleic acid. When an oligonucleotide probe whose fluorescence characteristics change compared to before formation is added when a strand is formed and the change in fluorescence characteristics is measured over time with a fluorescence spectrophotometer, amplification and detection of the target nucleic acid contained in the sample Can be carried out in one step and in a closed container.
本発明の増幅方法は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、温度を上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことを特徴としている。本発明により、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法であっても、標的核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、高特異的、高感度、迅速、簡便に標的核酸を増幅することができる。 The amplification method of the present invention comprises a primer having a sequence homologous or complementary to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and an RNA-dependent or DNA-dependent DNA After the step of synthesizing DNA homologous or complementary to the target nucleic acid from the complementary strand or homologous strand of the target nucleic acid using an enzyme having polymerase activity, the temperature is increased and the synthesized DNA is single-stranded. It is characterized by performing a step of making a nucleic acid. According to the present invention, even in a method of amplifying RNA at a constant temperature such as NASBA method, TMA method, TRC method, regardless of the type of target nucleic acid (DNA / RNA), it is highly specific, highly sensitive, quick and simple. The target nucleic acid can be amplified.
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。なお本実施例で使用したプライマー／プローブの、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０）における位置関係を図１に示す。 Hereinafter, although an embodiment of the present invention is described in detail using an example, this example is for explaining an embodiment of the present invention and does not limit the present invention. The positional relationship of the primers / probes used in this example in hepatitis B virus (HBV) DNA (GenBank No. AB014370) is shown in FIG.
実施例１ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のゲノムＤＮＡの調製
ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社より購入した不活化ウイルスより、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、当該キットのマニュアルに従い抽出することで、ＨＢＶ ＤＮＡ溶液を得た。以降、抽出試料中に含まれるＨＢＶ ＤＮＡのコピー数は、抽出効率を１００％とし、１ＩＵを約６コピーとして計算した。
Example 1 Preparation of Hepatitis B Virus (HBV) Genomic DNA HBV was extracted from an inactivated virus purchased from ZeptoMetrix using QIAamp DNA Blood Mini Kit (manufactured by QIAGEN) according to the manual of the kit. A DNA solution was obtained. Thereafter, the copy number of HBV DNA contained in the extracted sample was calculated assuming that the extraction efficiency was 100% and 1 IU was about 6 copies.
実施例２ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号９に記載の配列の５’末端から１７番目のＧと１８番目のＡの間、および配列番号１０に記載の配列の５’末端から５番目のＴと６番目のＡの間に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させた、オキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図２）。
Example 2 Production of Intercalating Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe 5 of the sequence described in SEQ ID NO: 9 by the method of Ishiguro et al. (Ishiguro, T. et al, Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997 (1996)). Oxazole yellow is bonded via a linker between the 17th G and the 18th A from the end and between the 5th T and the 6th A from the 5 ′ end of the sequence shown in SEQ ID NO: 10. An oxazole yellow labeled nucleic acid probe was prepared (FIG. 2).
実施例３ 等温増幅法によるＨＢＶ ＤＮＡの検出
下記に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの組合せ（以下、オリゴヌクレオチド組合せという）を用いて、等温増幅法によるＨＢＶ ＤＮＡの検出を試みた。
（１）実施例１で調製したＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを、注射用水を用いて１６７ＩＵ／５μＬ、１６．７ＩＵ／５μＬ、１．６７ＩＵ／５μＬまたは０．１６７ＩＵ／５μＬとなるよう希釈し、これらをウイルスＤＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに前記ウイルスＤＮＡ溶液５μＬを添加した。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、以下の（Ａ）から（Ｃ）に示す組合せを使用した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後の反応液（３０μＬ）における最終濃度］
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
１９ｍＭ 塩化マグネシウム
６１．７ｍＭ 塩化カリウム
各０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
１μＭ 第一のプライマー
１μＭ 第二のプライマー
３６ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）
１０．５％ ＤＭＳＯ
［オリゴヌクレオチド組合せ］
（Ａ）第一のプライマー：配列番号２（配列番号１の５’末端側にＴ７プロモータ配列（配列番号１１）を付加したもの）、第二のプライマー：配列番号７、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号９
（Ｂ）第一のプライマー：配列番号４（配列番号３の５’末端側にＴ７プロモータ配列（配列番号１１）を付加したもの）、第二のプライマー：配列番号８、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１０
（Ｃ）第一のプライマー：配列番号６（配列番号５の５’末端側にＴ７プロモータ配列（配列番号１１）を付加したもの）、第二のプライマー：配列番号８、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ：配列番号１０
（３）上記の反応液を４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、下記の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
［酵素液の組成］
２５ｗｔ％ グリセロール
４００ｍＭ トレハロース
２００ｍＭ 塩化カリウム
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ 耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
Example 3 Detection of HBV DNA by Isothermal Amplification Method Isothermal amplification method using a combination of a first primer, a second primer and an intercalating fluorescent dye-labeled nucleic acid probe (hereinafter referred to as an oligonucleotide combination) shown below. Attempted to detect HBV DNA by.
(1) Hepatitis B virus DNA prepared in Example 1 is diluted with water for injection to 167 IU / 5 μL, 16.7 IU / 5 μL, 1.67 IU / 5 μL, or 0.167 IU / 5 μL. Used as a viral DNA sample.
(2) 20 μL of the reaction solution having the following composition was dispensed into a 0.5 mL capacity PCR tube (GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, manufactured by PerkinElmer), and 5 μL of the viral DNA solution was added thereto. The following combinations (A) to (C) were used as oligonucleotide combinations.
[Composition of reaction solution: concentration is final concentration in reaction solution (30 μL) after addition of enzyme solution]
60 mM Tris-HCl (pH 8.6)
19 mM Magnesium chloride 61.7 mM Potassium chloride 0.3 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Each 3 mM ATP, CTP, UTP, GTP
3.4 mM ITP
1 μM
10.5% DMSO
[Oligonucleotide combination]
(A) First primer: SEQ ID NO: 2 (added with T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 11) on the 5 ′ end side of SEQ ID NO: 1), second primer: SEQ ID NO: 7, intercalator fluorescent dye label Nucleic acid probe: SEQ ID NO: 9
(B) First primer: SEQ ID NO: 4 (added with T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 11) on the 5 ′ end side of SEQ ID NO: 3), second primer: SEQ ID NO: 8, intercalator fluorescent dye label Nucleic acid probe: SEQ ID NO: 10
(C) First primer: SEQ ID NO: 6 (with T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 11) added to the 5 ′ end of SEQ ID NO: 5), second primer: SEQ ID NO: 8, intercalating fluorescent dye label Nucleic acid probe: SEQ ID NO: 10
(3) After the above reaction solution was kept at 46 ° C. for 5 minutes, 5 μL of enzyme solution having the following composition, which was kept at 46 ° C. for 2 minutes in advance, was added.
[Composition of enzyme solution]
25 wt% glycerol 400 mM trehalose 200 mM potassium chloride 6.4 U AMV reverse transcriptase 142 U thermostable T7 RNA polymerase (WO 2010/016621)
(4) Subsequently, using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function capable of directly measuring the PCR tube, the reaction solution is reacted at a constant temperature of 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm) of the reaction solution is changed over time. It was measured. The time when the enzyme was added was defined as 0 minute, and the case where the fluorescence intensity ratio of the reaction solution exceeded 1.2 was defined as (+) determination, and the time at that time was defined as detection time.
結果を表１に示す。等温増幅法により、前記（Ａ）の組合せでは１６７ＩＵ／テスト（１０００コピー／テストに相当）までのＨＢＶ ＤＮＡを、前記（Ｂ）および（Ｃ）の組合せでは１６．７ＩＵ／テスト（１００コピー／テストに相当）までのＨＢＶ ＤＮＡを、それぞれ２０分以内に検出することができた。 The results are shown in Table 1. By isothermal amplification, HBV DNA up to 167 IU / test (corresponding to 1000 copies / test) in the combination (A), 16.7 IU / test (100 copies / test) in the combination (B) and (C) HBV DNA can be detected within 20 minutes.
実施例４ 本発明の増幅方法によるＨＢＶ ＤＮＡの検出（その１）
実施例３において等温増幅法によりＨＢＶ ＤＮＡの検出が確認できた、前記（Ａ）から（Ｃ）のオリゴヌクレオチド組合せを用いて、ＰＣＲ法と等温増幅法とを組み合わせたＨＢＶ ＤＮＡの検出を試みた。
（１）１．０μＭの第一のプライマーと１．０μＭの第二のプライマーと０．７５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとを含む１５μＬのＰＣＲ溶液に、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加後、９４℃で１０秒−５５℃で３０秒−７２℃で２０秒からなるＰＣＲを１サイクルまたは２サイクル実施した。
（２）以下の組成となるよう反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに（１）の反応液５μＬを添加した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後の反応液（３０μＬ）における最終濃度］
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ 塩化マグネシウム
９５ｍＭ 塩化カリウム
各０．４３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
１．２μＭ 第一のプライマー
１．２μＭ 第二のプライマー
３６ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）
１０．５％ ＤＭＳＯ
（３）（２）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例３（３）に記載の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
Example 4 Detection of HBV DNA by the amplification method of the present invention (Part 1)
In Example 3, detection of HBV DNA was confirmed by the isothermal amplification method. Using the oligonucleotide combinations (A) to (C), an attempt was made to detect HBV DNA by combining the PCR method and the isothermal amplification method. .
(1) Into a 15 μL PCR solution containing 1.0 μM first primer, 1.0 μM second primer and 0.75 U Taq DNA polymerase, 5 μL of the viral DNA sample prepared in Example 3 (1) After the addition of PCR, PCR consisting of 94 ° C. for 10 seconds to 55 ° C. for 30 seconds to 72 ° C. for 20 seconds was performed for 1 cycle or 2 cycles.
(2) 20 μL of the reaction solution was dispensed into a 0.5 mL PCR tube (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, manufactured by PerkinElmer) so that the following composition was obtained, and 5 μL of the reaction solution of (1) was added thereto. .
[Composition of reaction solution: concentration is final concentration in reaction solution (30 μL) after addition of enzyme solution]
60 mM Tris-HCl (pH 8.65)
19 mM magnesium chloride 95 mM potassium chloride 0.43 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Each 3 mM ATP, CTP, UTP, GTP
3.4 mM ITP
1.2 μM first primer 1.2 μM second primer 36 nM intercalator fluorescent dye-labeled nucleic acid probe (prepared in Example 2)
10.5% DMSO
(3) After the reaction solution of (2) was kept at 46 ° C. for 5 minutes, 5 μL of an enzyme solution having the composition described in Example 3 (3), which was kept warm at 46 ° C. for 2 minutes in advance, was added.
(4) Subsequently, using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function capable of directly measuring the PCR tube, the reaction solution is reacted at a constant temperature of 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm) of the reaction solution is changed over time. It was measured. The time when the enzyme was added was defined as 0 minute, and the case where the fluorescence intensity ratio of the reaction solution exceeded 1.2 was defined as (+) determination, and the time at that time was defined as detection time.
結果を表２に示す。前記（Ａ）から（Ｃ）の組合せを用いて、ＰＣＲを１サイクル以上行ない、その後等温増幅を行なうことで、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ ＤＮＡを１０分以内に検出することができた。すなわち等温増幅を行なう前に温度を上昇させる操作を行なうことで、非常に高感度な検出系を構築できることがわかる。 The results are shown in Table 2. Using the combination of (A) to (C), PCR is performed for 1 cycle or more, and then isothermal amplification is performed, so that HBV DNA up to 1.67 IU / test (corresponding to 10 copies / test) is within 10 minutes. Could be detected. That is, it can be seen that a highly sensitive detection system can be constructed by performing an operation of increasing the temperature before performing isothermal amplification.
実施例５ 本発明の増幅方法によるＨＢＶ ＤＮＡの検出（その２）
実施例４ではＰＣＲ法（温度サイクル）と等温増幅法とを組み合わせることで、ＨＢＶ ＤＮＡを高感度に検出することを実現したが、温度サイクルの代わりに一定温度で加熱してもＨＢＶ ＤＮＡを高感度に検出できるか検討した。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、前記（Ａ）から（Ｃ）の組合せを用いた。
（１）１．０μＭの第一のプライマーと１．０μＭの第二のプライマーと０．７５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとを含む１５μＬのＰＣＲ溶液に、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加後、ヒートブロックを用いて９４℃で２分間加熱した。
（２）実施例３（２）に記載の組成となるよう反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに（１）の反応液５μＬを添加した。
（３）（２）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例３（３）に記載の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
Example 5 Detection of HBV DNA by the amplification method of the present invention (Part 2)
In Example 4, by combining the PCR method (temperature cycle) and the isothermal amplification method, it was possible to detect HBV DNA with high sensitivity. However, the HBV DNA can be increased even when heated at a constant temperature instead of the temperature cycle. We examined whether it could be detected by sensitivity. The oligonucleotide combinations (A) to (C) were used.
(1) Into a 15 μL PCR solution containing 1.0 μM first primer, 1.0 μM second primer and 0.75 U Taq DNA polymerase, 5 μL of the viral DNA sample prepared in Example 3 (1) After adding, the mixture was heated at 94 ° C. for 2 minutes using a heat block.
(2) Dispense 20 μL of the reaction solution into a 0.5 mL capacity PCR tube (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, manufactured by PerkinElmer) so as to have the composition described in Example 3 (2). 5 μL of the reaction solution was added.
(3) After the reaction solution of (2) was kept at 46 ° C. for 5 minutes, 5 μL of an enzyme solution having the composition described in Example 3 (3), which was kept warm at 46 ° C. for 2 minutes in advance, was added.
(4) Subsequently, using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function capable of directly measuring the PCR tube, the reaction solution is reacted at a constant temperature of 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm) of the reaction solution is changed over time. It was measured. The time when the enzyme was added was defined as 0 minute, and the case where the fluorescence intensity ratio of the reaction solution exceeded 1.2 was defined as (+) determination, and the time at that time was defined as detection time.
結果を表３に示す。前記（Ａ）から（Ｃ）の組合せを用いて、９４℃で加熱し、その後等温増幅を行なうことで、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ ＤＮＡを１０分以内に検出することができた。すなわち温度サイクルの代わりに一定温度で加熱しても、非常に高感度な検出系を構築できることがわかる。 The results are shown in Table 3. By using the combination of (A) to (C) above, heating at 94 ° C., followed by isothermal amplification, the HBV DNA up to 1.67 IU / test (equivalent to 10 copies / test) can be obtained within 10 minutes. I was able to detect it. That is, it can be seen that a highly sensitive detection system can be constructed even if heating is performed at a constant temperature instead of a temperature cycle.
実施例６ 本発明の増幅方法によるＨＢＶ ＤＮＡの検出（その３）
実施例５では等温増幅を行なう前に一定温度で加熱する操作を行なうことで、ＨＢＶ ＤＮＡを高感度に検出することを実現したが、前記操作における好ましい加熱温度の範囲を検討した。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、前記（Ｂ）の組合せを用いた。
（１）１．０μＭの第一のプライマー（配列番号４）と１．０μＭの第二のプライマー（配列番号８）と０．７５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとを含む１０μＬのＰＣＲ溶液に、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加後、ヒートブロックを用いて９４℃、９０℃、８５℃、８０℃または４６℃で２分間加熱した。
（２）以下の組成となるよう反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに（１）の反応液５μＬを添加した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度］
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ 塩化マグネシウム
９５ｍＭ 塩化カリウム
各０．４３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
１．２μＭ 第一のプライマー（配列番号４）
１．２μＭ 第二のプライマー（配列番号８）
３６ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（
配列番号１０）
１０．５％ ＤＭＳＯ
（３）（２）の反応液を、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例３（３）に記載の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
Example 6 Detection of HBV DNA by the amplification method of the present invention (part 3)
In Example 5, it was possible to detect HBV DNA with high sensitivity by performing an operation of heating at a constant temperature before performing isothermal amplification. However, a preferable range of heating temperature in the above operation was examined. As the oligonucleotide combination, the combination (B) was used.
(1) Into a 10 μL PCR solution containing 1.0 μM first primer (SEQ ID NO: 4), 1.0 μM second primer (SEQ ID NO: 8) and 0.75 U Taq DNA polymerase, Example 3 After adding 5 μL of the viral DNA sample prepared in (1), it was heated at 94 ° C., 90 ° C., 85 ° C., 80 ° C. or 46 ° C. for 2 minutes using a heat block.
(2) 20 μL of the reaction solution was dispensed into a 0.5 mL PCR tube (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, manufactured by PerkinElmer) so that the following composition was obtained, and 5 μL of the reaction solution of (1) was added thereto. .
[Composition of reaction solution: concentration is final concentration after addition of enzyme solution (in 30 μL)]
60 mM Tris-HCl (pH 8.65)
19 mM magnesium chloride 95 mM potassium chloride 0.43 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Each 3 mM ATP, CTP, UTP, GTP
3.4 mM ITP
1.2 μM first primer (SEQ ID NO: 4)
1.2 μM second primer (SEQ ID NO: 8)
36 nM intercalating fluorescent dye-labeled nucleic acid probe (prepared in Example 2) (
SEQ ID NO: 10)
10.5% DMSO
(3) 5 μL of an enzyme solution having the composition described in Example 3 (3), which was previously incubated at 46 ° C. for 2 minutes, was added to the reaction solution of (2).
(4) Subsequently, using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function capable of directly measuring the PCR tube, the reaction solution is reacted at a constant temperature of 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm) of the reaction solution is changed over time. It was measured. The time when the enzyme was added was defined as 0 minute, and the case where the fluorescence intensity ratio of the reaction solution exceeded 1.2 was defined as (+) determination, and the time at that time was defined as detection time.
結果を表４に示す。８５℃以上で加熱すれば、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ ＤＮＡを検出できることがわかる。 The results are shown in Table 4. It can be seen that when heated above 85 ° C., HBV DNA up to 1.67 IU / test (equivalent to 10 copies / test) can be detected.
実施例７ 本発明の増幅方法によるＨＢＶ ＤＮＡの検出（その４）
実施例４から６では二本鎖ＤＮＡの合成にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いたが、本実施例ではＡＭＶ逆転写酵素が有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて二本鎖ＤＮＡの合成を行なった後、等温増幅法を適用させた。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、前記（Ｂ）の組合せを用いた。
（１）以下の組成となるよう反応液１９μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
［反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度］
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ 塩化マグネシウム
９５ｍＭ 塩化カリウム
各０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
１μＭ 第一のプライマー（配列番号４）
１μＭ 第二のプライマー（配列番号８）
３６ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（
配列番号１０）
１０．５％ ＤＭＳＯ
（２）（１）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、以下の組成の第一酵素液４μＬを添加した。
［第一酵素液の組成］
２５ｗｔ％ グリセロール
４００ｍＭ トレハロース
２００ｍＭ 塩化カリウム
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
（３）９４℃で２分間加熱し、４６℃に温度を下げてから２分後、以下の組成の第二酵素液２μＬを添加した。
［第二酵素液の組成］
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ 耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＯ２０１０／０１６６２１号）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
Example 7 Detection of HBV DNA by the amplification method of the present invention (Part 4)
In Examples 4 to 6, Taq DNA polymerase was used for double-stranded DNA synthesis. In this example, double-stranded DNA was synthesized using the DNA-dependent DNA polymerase activity of AMV reverse transcriptase. The isothermal amplification method was applied. As the oligonucleotide combination, the combination (B) was used.
(1) Disperse 19 μL of the reaction solution into a 0.5 mL PCR tube (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, manufactured by PerkinElmer) so as to have the following composition, and then prepare a viral DNA sample prepared in Example 3 (1). 5 μL was added.
[Composition of reaction solution: concentration is final concentration after addition of enzyme solution (in 30 μL)]
60 mM Tris-HCl (pH 8.65)
19 mM Magnesium chloride 95 mM Potassium chloride 0.3 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Each 3 mM ATP, CTP, UTP, GTP
3.4 mM ITP
1 μM first primer (SEQ ID NO: 4)
1 μM second primer (SEQ ID NO: 8)
36 nM intercalating fluorescent dye-labeled nucleic acid probe (prepared in Example 2) (
SEQ ID NO: 10)
10.5% DMSO
(2) After the reaction solution of (1) was kept at 46 ° C. for 5 minutes, 4 μL of the first enzyme solution having the following composition, which was kept warm at 46 ° C. for 2 minutes in advance, was added.
[Composition of the first enzyme solution]
25 wt% Glycerol 400 mM Trehalose 200 mM Potassium chloride 6.4 U AMV reverse transcriptase (3) Heated at 94 ° C. for 2 minutes, lowered to 46 ° C. and 2 minutes later, 2 μL of the second enzyme solution having the following composition was added. .
[Composition of the second enzyme solution]
6.4 U AMV reverse transcriptase 142 U thermostable T7 RNA polymerase (WO2010 / 016621)
(4) Subsequently, using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function capable of directly measuring the PCR tube, the reaction solution is reacted at a constant temperature of 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm) of the reaction solution is changed over time. It was measured. The time when the enzyme was added was defined as 0 minute, and the case where the fluorescence intensity ratio of the reaction solution exceeded 1.2 was defined as (+) determination, and the time at that time was defined as detection time.
結果を表５に示す。本発明の増幅方法において、二本鎖ＤＮＡの合成酵素（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）としてＡＭＶ逆転写酵素を用いても、１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）までのＨＢＶ ＤＮＡを１５分以内に検出できることがわかる。 The results are shown in Table 5. In the amplification method of the present invention, even when AMV reverse transcriptase is used as a double-stranded DNA synthase (DNA-dependent DNA polymerase), 15 HBV DNA up to 1.67 IU / test (corresponding to 10 copies / test) can be obtained. It can be detected within minutes.
実施例８ 本発明の増幅方法によるＨＢＶ ＤＮＡの検出（その５）
実施例７では二本鎖ＤＮＡの合成後、ＡＭＶ逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼを添加して等温増幅させたが、本実施例では、等温増幅させる前にＡＭＶ逆転写酵素をさらに添加した。なおオリゴヌクレオチド組合せとして、前記（Ｂ）の組合せを用いた。
（１）以下の組成となるよう反応液１７μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、実施例３（１）で調製したウイルスＤＮＡ試料５μＬを添加した。
（反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ 塩化マグネシウム
９５ｍＭ 塩化カリウム
各０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
１μＭ 第一のプライマー（配列番号４）
１μＭ 第二のプライマー（配列番号８）
３６ｎＭ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（実施例２で調製）（
配列番号１０）
１０．５％ ＤＭＳＯ
（２）（１）の反応液を、４６℃で５分間保温後、あらかじめ４６℃で２分間保温した、実施例７（２）に記載の組成からなる第一酵素液４μＬを添加した。
（３）９４℃で２分間加熱後、４６℃で２分間保温し、６．４ＵのＡＭＶ逆転写酵素を含む酵素液２μＬを添加して１５分反応させ、さらに実施例７（３）に記載の組成からなる第二酵素液２μＬを添加した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を（＋）判定とし、そのときの時間を検出時間とした。
Example 8 Detection of HBV DNA by the amplification method of the present invention (No. 5)
In Example 7, after synthesizing double-stranded DNA, AMV reverse transcriptase and RNA polymerase were added for isothermal amplification, but in this example, AMV reverse transcriptase was further added before isothermal amplification. As the oligonucleotide combination, the combination (B) was used.
(1) Disperse 17 μL of the reaction solution into a 0.5 mL PCR tube (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, manufactured by PerkinElmer) so as to have the following composition, and then prepare a viral DNA sample prepared in Example 3 (1). 5 μL was added.
(Composition of reaction solution: concentration is final concentration after addition of enzyme solution (in 30 μL))
60 mM Tris-HCl (pH 8.65)
19 mM Magnesium chloride 95 mM Potassium chloride 0.3 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Each 3 mM ATP, CTP, UTP, GTP
3.4 mM ITP
1 μM first primer (SEQ ID NO: 4)
1 μM second primer (SEQ ID NO: 8)
36 nM intercalating fluorescent dye-labeled nucleic acid probe (prepared in Example 2) (
SEQ ID NO: 10)
10.5% DMSO
(2) After the reaction solution of (1) was kept at 46 ° C. for 5 minutes, 4 μL of the first enzyme solution having the composition described in Example 7 (2), which was kept warm at 46 ° C. for 2 minutes in advance, was added.
(3) After heating at 94 ° C. for 2 minutes, incubating at 46 ° C. for 2 minutes, adding 2 μL of an enzyme solution containing 6.4 U of AMV reverse transcriptase and reacting for 15 minutes, further described in Example 7 (3) 2 μL of the second enzyme solution having the composition was added.
(4) Subsequently, using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function capable of directly measuring the PCR tube, the reaction solution is reacted at a constant temperature of 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm) of the reaction solution is changed over time. It was measured. The time when the enzyme was added was defined as 0 minute, and the case where the fluorescence intensity ratio of the reaction solution exceeded 1.2 was defined as (+) determination, and the time at that time was defined as detection time.
結果を表６に示す。本発明の増幅方法において、等温増幅させる前にＡＭＶ逆転写酵素
をさらに添加することで、最小検出感度が０．１６７ＩＵ／テスト（１コピー／テストに相当）と、これまでの実施例と比較し向上した。また１．６７ＩＵ／テスト（１０コピー／テストに相当）の検出時間も、ＡＭＶ逆転写酵素を等温増幅前に添加しない実施例７（１１．１分）（表５）と比較し、向上（６．２分）していることがわかる。
The results are shown in Table 6. In the amplification method of the present invention, by further adding AMV reverse transcriptase before isothermal amplification, the minimum detection sensitivity is 0.167 IU / test (corresponding to 1 copy / test), compared with the previous examples. Improved. In addition, the detection time of 1.67 IU / test (corresponding to 10 copies / test) was also improved compared to Example 7 (11.1 minutes) (Table 5) in which AMV reverse transcriptase was not added before isothermal amplification (Table 5). .2 minutes).
Claims (6)
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）温度を上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）前記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程 A method for amplifying a target nucleic acid, comprising the following steps (1) to (7):
(1) a first primer having a sequence homologous to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing DNA homologous to the target nucleic acid from the complementary strand of the target nucleic acid using an enzyme (2) A step of increasing the temperature to convert the DNA synthesized in (1) above into a single-stranded DNA ( 3) From the single-stranded DNA obtained in (2) above, using a second primer having a sequence complementary to a part of the target nucleic acid and an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity, the 5 ′ end A step of synthesizing a double-stranded DNA to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added (4) RNA polymerase activity corresponding to the promoter sequence Step (5) of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (3) above, using the second primer and the enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity, Synthesizing cDNA complementary to the target nucleic acid from the RNA transcript of (4),
(6) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(7) A step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (6) as a template.
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）温度を上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）前記（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程 A method for amplifying a target nucleic acid, comprising the following steps (1) to (7):
(1) a second primer having a sequence complementary to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase activity Step of synthesizing DNA complementary to target nucleic acid from target nucleic acid using enzyme (2) Step of increasing temperature to make DNA synthesized in (1) above as single-stranded DNA (3) Target Using a first primer having a sequence homologous to a part of the nucleic acid and an enzyme having a DNA-dependent DNA polymerase activity, RNA on the 5 ′ end side from the single-stranded DNA obtained in the above (2) A step of synthesizing double-stranded DNA to which a promoter sequence of an enzyme having polymerase activity is added (4) an enzyme having RNA polymerase activity corresponding to the promoter sequence; (5) step of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (3) above, using the first primer and an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity (4) ) Synthesizing cDNA homologous to the target nucleic acid from the RNA transcript of
(6) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(7) A step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (6) as a template.
（１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）温度を上昇させることで、前記（３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（８）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（９）前記（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程 A method for amplifying a target nucleic acid, comprising the following steps (1) to (9):
(1) A step of synthesizing cDNA complementary to the target nucleic acid from the target RNA using a second primer having a sequence complementary to a part of the target nucleic acid and an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity ( 2) Step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA)
(3) Using a first primer having a sequence homologous to a part of a target nucleic acid to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added on the 5 ′ end side, and an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity The step of synthesizing double-stranded DNA from the single-stranded DNA obtained in the above (2) (4) By raising the temperature, it has RNA polymerase activity on the 5 ′ end side synthesized in the above (3) Step of converting DNA added with enzyme promoter sequence into single-stranded DNA (5) Single-stranded DNA obtained in (4) above using second primer and enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing double-stranded DNA to which a promoter sequence of an enzyme having RNA polymerase activity is added at the 5 ′ end side (6) RN corresponding to the promoter sequence Step (7) of synthesizing an RNA transcript from the double-stranded DNA obtained in (5) above using an enzyme having polymerase activity (7) Using a second primer and an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity A step of synthesizing cDNA complementary to the target nucleic acid from the RNA transcript of (6),
(8) Degrading RNA-DNA double-stranded RNA using an enzyme having RNase H activity (generation of single-stranded DNA)
(9) A step of synthesizing an RNA transcript in a chain manner using the single-stranded DNA obtained in (8) as a template
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