JP2016003192A - Buffer solution and purification method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料液中から精製すべき精製タンパク質を精製する際に溶出液として用いられる緩衝液、および、かかる緩衝液を溶出液として用いて試料液中から精製タンパク質を精製する精製方法に関するものである。 The present invention relates to a buffer solution used as an eluent when purifying a purified protein to be purified from a sample solution, and a purification method for purifying a purified protein from a sample solution using such a buffer solution as an eluent. It is.
近年、血漿中に含まれる抗体(天然の抗体)や、遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される組換え融合タンパク質(人工の抗体)等のタンパク質を試料液中から精製する精製方法として、吸着剤(クロマトグラフィー担体)にハイドロキシアパタイト、フッ素アパタイトのようなリン酸カルシウム系化合物を用いたハイドロキシアパタイト法が提案されている(例えば、特許文献1参照。)。 In recent years, as a purification method for purifying proteins such as antibodies (natural antibodies) contained in plasma and recombinant fusion proteins (artificial antibodies) produced by living genetically engineered host cells from a sample solution A hydroxyapatite method using a calcium phosphate compound such as hydroxyapatite or fluorapatite as an adsorbent (chromatographic carrier) has been proposed (for example, see Patent Document 1).
このハイドロキシアパタイト法では、一般的に、吸着剤に吸着させた精製すべきタンパク質(精製タンパク質)および他のタンパク質(夾雑タンパク質)を含む夾雑物のうち、精製タンパク質のみを溶出液を用いて流出液中に溶出させ、夾雑物を吸着剤に吸着させたままとして、流出液を回収する溶離方法が用いられる。 In this hydroxyapatite method, generally, out of contaminants including a protein to be purified (purified protein) adsorbed on an adsorbent and other proteins (contaminated protein), only the purified protein is used as an effluent. An elution method is used in which the effluent is recovered while leaving the contaminants adsorbed on the adsorbent.
この溶離方法では、溶出液として、例えば、低濃度のリン酸緩衝液に塩化ナトリウムのような溶離剤を添加した緩衝液が用いられる。しかしながら、塩化ナトリウム(溶離剤)を含む緩衝液を用いると、塩化ナトリウムのナトリウムイオンと、リン酸カルシウム系化合物が備えるリン酸基が有する水素イオンとがイオン交換し、その結果、溶出液のpHが急激に低下する。そのため、リン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤が溶解することに起因して吸着剤が変質・劣化し、その結果、吸着剤(担体)としての機能が早期に低下するという問題があった。 In this elution method, for example, a buffer solution in which an eluent such as sodium chloride is added to a low-concentration phosphate buffer is used as the eluent. However, when a buffer solution containing sodium chloride (eluent) is used, the sodium ion of sodium chloride and the hydrogen ion of the phosphate group of the calcium phosphate compound are ion-exchanged, resulting in a rapid elution pH. To drop. For this reason, the adsorbent composed of the calcium phosphate compound is dissolved, so that the adsorbent is altered and deteriorated. As a result, there is a problem that the function as the adsorbent (carrier) is rapidly reduced.
なお、pHの低下を抑制するには、溶出液中におけるリン酸濃度を上げることが考えられるが、この場合、精製タンパク質の他に、夾雑物が溶出するようになることから、精製タンパク質の精製率の向上を図るためには好ましくない。また、MES緩衝液、HEPES緩衝液のようなグッドバッファーを用いる方法も考えられるが、グッドバッファーは、高価でありコスト高となるため、スケールが小さいラボレベルには適するものの、スケールが大きい工業レベルには適しない。 In order to suppress the decrease in pH, it is conceivable to increase the concentration of phosphoric acid in the eluate. In this case, contaminants will be eluted in addition to the purified protein. It is not preferable for improving the rate. Although a method using a good buffer such as MES buffer or HEPES buffer is also conceivable, the good buffer is expensive and expensive, so it is suitable for a laboratory level with a small scale, but an industrial level with a large scale. Not suitable for.
本発明の目的は、試料液中から精製すべき精製タンパク質をリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤を用いて精製する際に、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制することができる、溶出液として用いられる緩衝液、および、かかる緩衝液を溶出液として用いた試料液中から精製タンパク質を精製する精製方法を提供することにある。 It is an object of the present invention to suppress alteration and deterioration of an adsorbent over a long period of time when purifying a purified protein to be purified from a sample solution using an adsorbent composed of a calcium phosphate compound. Another object of the present invention is to provide a buffer used as an eluate and a purification method for purifying a purified protein from a sample solution using the buffer as an eluent.
このような目的は、下記(1)〜(7)の本発明により達成される。
(1) 少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に吸着した、精製すべき精製タンパク質を、前記担体から選択的に溶出させる際に溶出液として用いられる緩衝液であって、
リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有することを特徴とする緩衝液。
Such an object is achieved by the present inventions (1) to (7) below.
(1) A buffer used as an eluent when selectively purifying a purified protein to be purified, adsorbed on a carrier composed of a calcium phosphate compound at least on its surface, from the carrier,
A buffer comprising at least one of phosphoric acid and a salt thereof and at least one of a compound having a carboxy group and a salt thereof.
この緩衝液を溶出液として用いることにより、試料液中から精製すべき精製タンパク質をリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤を用いて精製する際に、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制することができる By using this buffer solution as an eluent, when the purified protein to be purified from the sample solution is purified using an adsorbent composed of a calcium phosphate compound, this adsorbent is altered and deteriorated over a long period of time. Can be suppressed
(2) 当該緩衝液のpHは、5.5以上、8.0未満である上記(1)に記載の緩衝液。 (2) The buffer solution according to (1), wherein the pH of the buffer solution is 5.5 or more and less than 8.0.
これにより、精製タンパク質の変質(変性)を防止することができ、その特性が変化するのを防止することができる。また、担体の変質(溶解等)を好適に防止することができ、吸着装置における分離能の変化を長期に亘って防止することもできるため、目的とするタンパク質を長期に亘って高精度に精製することができる。 Thereby, quality change (denaturation | denaturation) of purified protein can be prevented, and it can prevent that the characteristic changes. In addition, alteration of the carrier (dissolution, etc.) can be suitably prevented, and changes in the separation capacity in the adsorption apparatus can be prevented over a long period of time, so that the target protein can be purified with high accuracy over a long period of time. can do.
(3) 前記リン酸およびその塩の合計の含有量は、1.0mM以上、400mM以下である上記(1)または(2)に記載の緩衝液。 (3) The buffer solution according to (1) or (2), wherein the total content of the phosphoric acid and the salt thereof is 1.0 mM or more and 400 mM or less.
これにより、担体に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。 Thereby, it can suppress or prevent more accurately that the foreign substance adsorb | sucked to a support | carrier is eluted with a refined protein.
(4) 前記カルボキシ基を有する化合物およびその塩の合計の含有量は、0.1M以上、5M以下である上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の緩衝液。 (4) The buffer according to any one of (1) to (3), wherein the total content of the compound having a carboxy group and a salt thereof is 0.1 M or more and 5 M or less.
これにより、担体に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。 Thereby, it can suppress or prevent more accurately that the foreign substance adsorb | sucked to a support | carrier is eluted with a refined protein.
(5) 前記カルボキシ基を有する化合物は、炭素を2つ以上備える脂肪族カルボン酸である上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の緩衝液。 (5) The buffer solution according to any one of (1) to (4), wherein the compound having a carboxy group is an aliphatic carboxylic acid having two or more carbon atoms.
(6) 前記精製タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、
または組換え融合タンパク質である上記(1)ないし(5)のいずれかに記載の緩衝液。
(6) The purified protein is a natural antibody having an immunoglobulin constant domain,
Or the buffer solution in any one of said (1) thru | or (5) which is a recombinant fusion protein.
本発明の緩衝液および精製方法は、天然の抗体、または組換え融合タンパク質の精製に好適に適用される。 The buffer and the purification method of the present invention are suitably applied to the purification of natural antibodies or recombinant fusion proteins.
(7) 前記精製タンパク質を含む複数種のタンパク質を含有する試料液中から、前記精製タンパク質を分離する分離方法であって、
前記担体を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に、前記試料液を供給する供給工程と、
上記(1)ないし(6)のいずれかに記載の緩衝液を前記装置内に供給して、前記装置内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記精製タンパク質を精製する分画工程とを有することを特徴とする精製方法。
(7) A separation method for separating the purified protein from a sample solution containing a plurality of types of proteins including the purified protein,
A supply step of supplying the sample solution into an apparatus in which the carrier is filled in at least a part of a filling space;
The buffer solution according to any one of the above (1) to (6) is supplied into the device, and the effluent flowing out from the device is fractionated by a predetermined amount. And a fractionation step of purifying the purified protein in the fraction effluent.
これにより、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制しつつ、試料液中から精製タンパク質を精製することができる。 As a result, the purified protein can be purified from the sample solution while suppressing alteration and deterioration of the adsorbent over a long period of time.
本発明の緩衝液によれば、試料液中から精製すべき精製タンパク質をリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤を用いて精製する際に、この吸着剤の変質・劣化を長期に亘って抑制することができる。 According to the buffer solution of the present invention, when the purified protein to be purified from the sample solution is purified using the adsorbent composed of the calcium phosphate compound, the alteration / deterioration of the adsorbent is suppressed over a long period of time. be able to.
したがって、かかる緩衝液を用いた本発明の精製方法によれば、目的とするタンパク質を長期に亘って高精度に精製することができる。 Therefore, according to the purification method of the present invention using such a buffer solution, the target protein can be purified with high accuracy over a long period of time.
以下、本発明の緩衝液および精製方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
なお、本発明の緩衝液および精製方法を説明するのに先立って、好適な実施形態を説明するにあたり、説明に使用する用語を以下に定義する。
Hereinafter, preferred embodiments of the buffer and the purification method of the present invention will be described in detail.
Prior to describing the buffer solution and the purification method of the present invention, the terms used in the description are defined below in describing the preferred embodiment.
「抗体」とは、タンパク質またはタンパク質複合体であり、それぞれが、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメイン、および少なくとも1つの免疫グロブリン定常ドメインを含むものをいう。また、「抗体」は、一本鎖抗体、二量体抗体、またはいずれかの高次タンパク質複合体であってよく、これにはヘテロ二量体抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。 “Antibody” refers to a protein or protein complex, each containing at least one immunoglobulin variable domain and at least one immunoglobulin constant domain. Also, the “antibody” may be a single chain antibody, a dimeric antibody, or any higher protein complex, including but not limited to heterodimeric antibodies. is not.
「免疫グロブリン定常ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のCL、CH1、CH2、CH3またはCH4ドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言い、抗体のFc部もこれに含まれる。(例えば、Charles A Hasemann and J.Donald Capra,免疫グロブリン:構造と機能,William E.Paul編,Fundamental Immunology,第2版,209,210−218(1989)参照。)。
“Immunoglobulin constant domain” refers to an immunoglobulin domain that is identical or substantially similar to a C L ,
「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のVLまたはVHドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言う。なお、本発明では、実質的類似性を判定するための免疫グロブリン可変ドメインの生物学的活性は、抗原結合性である。 An “immunoglobulin variable domain” refers to an immunoglobulin domain that is the same or substantially similar to a VL or VH domain from a human or animal origin. In the present invention, the biological activity of an immunoglobulin variable domain for determining substantial similarity is antigen binding.
「吸着剤(担体)」とは、固体支持体に固定した少なくとも1種類の分子、またはそれ自体が固体である少なくとも1種類の分子で構成され、各種クロマトグラフィーを実施するために用いられるものであり、本発明では、少なくとも表面がリン酸カルシム系化合物で構成される。 “Adsorbent (carrier)” is composed of at least one kind of molecule immobilized on a solid support or at least one kind of molecule that is itself a solid, and is used for performing various types of chromatography. In the present invention, at least the surface is composed of a calcium phosphate-based compound.
次に、本発明の精製方法に用いられる吸着装置、すなわち、本発明の緩衝液を溶出液として用いたタンパク質の精製に用いられる吸着装置(分離装置)の一例について説明する。 Next, an example of an adsorption apparatus used in the purification method of the present invention, that is, an adsorption apparatus (separation apparatus) used for protein purification using the buffer solution of the present invention as an eluent will be described.
<吸着装置>
図1は、本発明で用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図1中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
<Adsorption device>
FIG. 1 is a longitudinal sectional view showing an example of an adsorption device used in the present invention. In the following description, the upper side in FIG. 1 is referred to as “inflow side” and the lower side is referred to as “outflow side”.
ここで、流入側とは、精製すべき精製タンパク質(目的物質)を精製(分離)する際に、試料液(精製タンパク質を含有する液体)および溶出液としての緩衝液等の液体を、吸着装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記液体が流出液として吸着装置内から流出する側のことを言う。 Here, the inflow side means that when purifying (separating) the purified protein (target substance) to be purified, the sample solution (liquid containing the purified protein) and a liquid such as a buffer solution as an eluent are adsorbed by the adsorption device. The outflow side is the side opposite to the inflow side, that is, the side from which the liquid flows out from the adsorbing device as the outflow liquid.
図1に示す吸着装置1は、カラム2と、吸着剤(充填剤)3と、2枚のフィルタ部材4、5とを有している。
The
カラム2は、カラム本体21と、このカラム本体21の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ(蓋体)22、23とで構成されている。
The
カラム本体21は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体21を含めカラム2を構成する各部(各部材)の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
The column
カラム本体21には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材4、5を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ22、23が螺合により装着される。
In the
このような構成のカラム2では、カラム本体21と各フィルタ部材4、5とにより、吸着剤充填空間20が画成されている。そして、この吸着剤充填空間20の少なくとも一部に(本実施形態では、ほぼ満量で)、吸着剤(担体)3が充填されている。
In the
吸着剤充填空間20の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、試料液1mLに対して、0.05〜100mL程度が好ましく、0.1〜100mL程度がより好ましく、0.5〜50mL程度がさらに好ましい。
The volume of the
また、カラム2では、カラム本体21に各キャップ22、23を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
Further, the
これらキャップ22、23のほぼ中央には、それぞれ、流入管24および流出管25が液密に固着(固定)されている。この流入管24およびフィルタ部材4を介して吸着剤3に、試料液(液体)が供給される。また、吸着剤3に供給された試料液は、吸着剤3同士の間(間隙)を通過して、フィルタ部材5および流出管25を介して、カラム2外へ流出する。
An
各フィルタ部材4、5は、それぞれ、吸着剤充填空間20から吸着剤3が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材4、5は、それぞれ、例えば、ガラス焼結体、金属あるいはポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体(連通孔を有するスポンジ状多孔質体)、織布、メッシュ等で構成されている。
Each of the
また、吸着装置1は、吸着剤3として少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものを備えている。
Moreover, the adsorption |
かかる吸着剤3には、試料液中に含まれる、目的とする精製タンパク質が有する固有の吸着(担持)力で特異的に吸着するため、この吸着力の差に応じて、精製タンパク質と、この精製タンパク質とは異なる他の夾雑タンパク質等の夾雑物(不純物)とが分離・精製される。
Since the
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、例えば、ハイドロキシアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2)、TCP(Ca3(PO4)2)、Ca2P2O7、Ca(PO3)2、DCPD(CaHPO4・2H2O)、Ca4O(PO4)2や、これらの一部が他の原子または原子団で置換されたもの等が挙げられ、これらのうちの1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。
As the calcium phosphate-based compound is not particularly limited, for example, hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4) 6 (OH) 2), TCP (Ca 3 (PO 4) 2), Ca 2 P 2
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものが好ましい。特に、ハイドロキシアパタイトは、生体を構成する成分に近いため、精製タンパク質を吸着・分離する際に、かかる精製タンパク質が変質(変性)するのを好適に防止することができる。さらに、ハイドロキシアパタイトは、それが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたものであるのが好ましい。フッ素原子で置換されたハイドロキシアパタイト(以下、「フッ素アパタイト」と言う)は、その結晶構造中にフッ素原子(フッ素イオン)が存在することにより、カルシウム原子(カルシウムイオン)のフッ素アパタイトからの離脱をより確実に防止することができる。また、かかるフッ素アパタイトで吸着剤3の少なくとも表面付近を構成することにより、吸着剤3の強度がさらに向上する。なお、以下では、ハイドロキシアパタイトおよびフッ素原子で置換されたハイドロキシアパタイトを、総称して「アパタイト」と言うこともある。
Among these, the calcium phosphate compound preferably has hydroxyapatite as a main component. In particular, since hydroxyapatite is close to a component constituting a living body, it is possible to suitably prevent the purified protein from being altered (denatured) when adsorbed / separated purified protein. Furthermore, the hydroxyapatite is preferably one in which at least a part of the hydroxyl group it has is substituted with a fluorine atom. Hydroxyapatite substituted with a fluorine atom (hereinafter referred to as “fluorapatite”) has a fluorine atom (fluorine ion) present in the crystal structure, and thus the calcium atom (calcium ion) is released from the fluorine apatite. It can prevent more reliably. Moreover, the strength of the
また、少なくとも表面付近をリン酸カルシウム系化合物で構成することにより、高い強度を有する吸着剤3を得ることができる。このため、吸着剤3が自重により容易に変形・崩壊等することを好適かつ長期にわたって防止することができる。したがって、吸着剤充填空間20内の下部に充填された吸着剤3が崩壊等して、吸着装置1に目詰まりが生じるのを防止することができる。その結果、多量の試料液の処理、すなわち、試料液中から精製すべき精製タンパク質を確実に分離することができるようになる。
Moreover, the
以上のような吸着剤3の形態(形状)は、図1に示すように、粒子状(顆粒状)のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状(小塊状)、ブロック状(例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状、モノリス)等とすることもできる。なお、吸着剤3を粒子状とすることにより、その表面積を増大させることができ、タンパク質の分離特性の向上を図ることができる。 The form (shape) of the adsorbent 3 as described above is preferably particulate (granular) as shown in FIG. 1, but in addition, for example, pellet (small block), block (for example, Alternatively, a porous body in which adjacent pores communicate with each other, a honeycomb shape, a monolith, or the like can be used. In addition, by making the adsorbent 3 particulate, the surface area thereof can be increased, and the protein separation characteristics can be improved.
粒子状の吸着剤3の平均粒径は、特に限定されないが、0.5〜150μm程度であるのが好ましく、10〜80μm程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤3を用いることにより、前記フィルタ部材5の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤3の表面積を十分に確保することができる。
The average particle diameter of the
次に、このような吸着装置(分離装置)1を用いて、試料液中に含まれる目的とするタンパク質を精製する精製方法(本発明の精製方法)について説明する。 Next, a purification method (purification method of the present invention) for purifying a target protein contained in a sample solution using such an adsorption device (separation device) 1 will be described.
<精製方法>
本実施形態の精製方法は、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成された充填剤(担体)を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる吸着装置1内に、精製すべき精製タンパク質を含有する試料液を供給する供給工程(第1の工程)と、吸着装置1内に、本発明の緩衝液を供給して、吸着装置1内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、精製タンパク質を分離する分画工程(第2の工程)とを有する。
<Purification method>
In the purification method of the present embodiment, the purified protein to be purified is contained in the
以下、この精製方法について詳述する。
なお、以下では、目的とする精製タンパク質として、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質を含有する試料液から精製する場合を代表に説明する。
Hereinafter, this purification method will be described in detail.
In the following, a case where the target purified protein is purified from a sample solution containing an immunoglobulin constant domain and containing a natural antibody or a recombinant fusion protein will be described as a representative.
[1] 供給工程
まず、精製すべき精製タンパク質を含有する試料液を用意した後、この試料液を、吸着剤(充填剤)3に供給することで接触させる。
[1] Supplying step First, after preparing a sample solution containing the purified protein to be purified, this sample solution is contacted by supplying it to the adsorbent (filler) 3.
[1−1]まず、精製すべき精製タンパク質(目的物質)を含有する試料液を用意する。 [1-1] First, a sample solution containing a purified protein (target substance) to be purified is prepared.
この精製タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメイン(例えば、抗体のFc部)を有するタンパク質またはそのタンパク質の複合体であり、例えば、かかるタンパク質が産生されるように遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される。 This purified protein is a protein having an immunoglobulin constant domain (eg, the Fc portion of an antibody) or a complex of the protein, and is produced, for example, by a host cell that has been genetically engineered to produce such a protein. Is done.
この場合、精製タンパク質が産生されるように細胞を遺伝子工学的に処理する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Ausabel et al.編(1990),Current Protocols in Molecular Biology(Willey,ニューヨーク)参照。)。 In this case, methods for genetically engineering cells to produce purified protein are well known in the art (eg, Ausubel et al. Ed. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Willey, NY)). )reference.).
なお、精製タンパク質は、1以上の免疫グロブリン定常ドメインを有するものであればよく、1個または2個以上の免疫グロブリン可変ドメインを有するものであってもよく、免疫グロブリン可変ドメインを有しないものであってもよい。 The purified protein only needs to have one or more immunoglobulin constant domains, may have one or more immunoglobulin variable domains, and does not have immunoglobulin variable domains. There may be.
さらに、精製タンパク質は、天然タンパク質(天然の抗体)または組換え融合タンパク質であってもよく、組換え融合タンパク質としては、例えば、抗体のFc部を有するものが挙げられ、非抗体タンパク質であってもよい。 Further, the purified protein may be a natural protein (natural antibody) or a recombinant fusion protein, and examples of the recombinant fusion protein include those having the Fc part of an antibody, which are non-antibody proteins. Also good.
組換え融合タンパク質の具体例としては、1以上の免疫グロブリン定常ドメイン(例えば、抗体のFc部)と、下記のタンパク質のいずれかと同一または実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。 Specific examples of recombinant fusion proteins include those comprising one or more immunoglobulin constant domains (eg, the Fc portion of an antibody) and a protein that is the same or substantially similar to any of the following proteins.
この精製タンパク質としては、例えば、flt3リガンド(国際特許出願WO94/28391参照。)、CD40リガンド(米国特許第6,087,329号参照。)、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Fasリガンド、NF−κBの受容体アクチベーターに対するリガンド(RANKL)、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL、国際特許出願WO97/01633参照。)、胸腺ストローマ由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF、オーストラリア特許No.588819参照。)、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、RANTES、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン1〜18、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子(TNF)、白血病阻害因子、オンコスタチン−M、ならびに細胞表面分子ELKおよびHekに対する種々のリガンド(例えば、eph関連キナーゼまたはLERKSに対するリガンド)等が挙げられる。 Examples of the purified protein include flt3 ligand (see International Patent Application WO94 / 28391), CD40 ligand (see US Pat. No. 6,087,329), erythropoietin, thrombopoietin, calcitonin, Fas ligand, NF-κB. Ligand for receptor activator (RANKL), tumor necrosis factor (TNF) -related apoptosis-inducing ligand (TRAIL, see International Patent Application WO 97/01633), thymic stroma-derived lymphopoietin, granulocyte colony-stimulating factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (See GM-CSF, Australian Patent No. 588819), mast cell growth factor, stem cell growth factor, epidermal growth factor, RANTES, growth hormone, insulin, insulinotropin, insulin Growth factor, parathyroid hormone, interferon, nerve growth factor, glucagon, interleukins 1-18, colony stimulating factor, lymphotoxin-β, tumor necrosis factor (TNF), leukemia inhibitory factor, oncostatin-M, and cell surface molecule ELK And various ligands for Hek (for example, ligands for eph-related kinases or LERKS) and the like.
また、組換え融合タンパク質の具体例としては、1以上の免疫グロブリン定常ドメイン(例えば、抗体のFc部)と、前記精製タンパク質のいずれかに対する受容体またはそのような受容体と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。 Also, specific examples of recombinant fusion proteins include one or more immunoglobulin constant domains (eg, the Fc portion of an antibody) and a receptor for any of the purified proteins or substantially similar to such a receptor. The thing containing protein is mentioned.
前記受容体としては、両形態のTNFR(p55およびp75と呼ばれる)、I型およびII型インターロイキン−1受容体(EP特許No.0 460 846、米国特許第4,968,607号および米国特許第5,767,064号参照。)、インターロイキン−2受容体、インターロイキン−4受容体(EP特許No.0 367 566および米国特許第5,856,296号参照。)、インターロイキン−15受容体、インターロイキン−17受容体、インターロイキン−18受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Mおよび白血病阻害因子に対する受容体、NF−κBの受容体アクチベーター(RANK、米国特許第6,271,349号参照。)、TRAILに対する受容体(TRAIL受容体1、2、3および4を含む)、ならびにデスドメインを含む受容体、例えば、Fasまたはアポトーシス誘導受容体(AIR)等が挙げられる。
The receptors include both forms of TNFR (referred to as p55 and p75), type I and type II interleukin-1 receptors (EP Patent No. 0 460 846, US Pat. No. 4,968,607 and US Pat. No. 5,767,064), interleukin-2 receptor, interleukin-4 receptor (see EP Patent No. 0 367 566 and US Pat. No. 5,856,296), interleukin-15. Receptor, interleukin-17 receptor, interleukin-18 receptor, granulocyte macrophage colony stimulating factor receptor, granulocyte colony stimulating factor receptor, receptor for oncostatin-M and leukemia inhibitory factor, NF-κB Receptor activator (see RANK, US Pat. No. 6,271,349), TRAIL Receptors (including the
さらに、組換え融合タンパク質の具体例としては、1以上の免疫グロブリン定常ドメイン(例えば、抗体のFc部)と、分化抗原(CDタンパク質と呼ばれる)もしくは分化抗原または分化抗原と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。 In addition, specific examples of recombinant fusion proteins include one or more immunoglobulin constant domains (eg, the Fc portion of an antibody) and a differentiation antigen (referred to as a CD protein) or a differentiation antigen or a protein that is substantially similar to a differentiation antigen. The thing containing is mentioned.
前記分化抗原としては、Leukocyte Typing VI(Proceedings of the VIth International Workshop and Conference,Kishimoto,Kikutani et al.編,日本,神戸,1996)に示されており、具体的には、CD27、CD30、CD39、CD40、およびそれらに対するリガンド(CD27リガンド、CD30リガンド、など)が挙げられる。 The differentiation antigen is shown in Leukocyte Type VI (Proceedings of the VITH International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., Ed., Japan, Kobe, 1996). CD40, and ligands for them (CD27 ligand, CD30 ligand, etc.).
なお、幾つかのCD抗原は、TNF受容体ファミリーの1種であり、これには41BBリガンドおよびOX40も含まれる。上記リガンドは、41BBリガンドおよびOX40リガンドと同様にTNFファミリーの1種である。 Some CD antigens are members of the TNF receptor family, including 41BB ligand and OX40. The ligand is a member of the TNF family similar to the 41BB ligand and the OX40 ligand.
その例には、少なくとも1つの免疫グロブリン定常ドメインと、下記のタンパク質のいずれかもしくはそれらのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に類似するタンパク質の全体または一部とを含む組換え融合タンパク質が挙げられ、例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、VIII因子、IX因子、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質A−I、グロビン、IL−2アンタゴニスト、α−1アンチトリプシン、TNF−α変換酵素、前記酵素のいずれかに対するリガンド、ならびに他の多数の酵素およびそれらのリガンドが挙げられる。 Examples include recombinant fusion proteins comprising at least one immunoglobulin constant domain and all or part of a protein substantially similar to any of the following proteins or their ligands or any of these: For example, members of the metalloproteinase-disintegrin family, various kinases, glucocerebrosidase, superoxide dismutase, tissue plasminogen activator, factor VIII, factor IX, apolipoprotein E, apolipoprotein AI, globin, IL -2 antagonists, α-1 antitrypsin, TNF-α converting enzyme, ligands for any of the enzymes, and numerous other enzymes and their ligands.
さらに、精製タンパク質としては、抗体(天然の抗体)またはその一部、およびキメラ抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン定常ドメインが1以上のネズミ免疫グロブリン可変ドメインに結合した抗体、またはそのフラグメントであってもよいし、抗体と細胞傷害性物質または発光物質とを含む結合体であってもよい。細胞傷害性物質または発光物質としては、メイタンシン(maytansine)誘導体(例えば、DM1);エンテロトキシン(例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン);ヨウ素同位体(例えば、I−125);テクニウム同位体(例えば、Tc−99m);シアニン蛍光色素(例えば、Cy5.5.18);およびリボソーム不活性化タンパク質(例えば、ボーガニン(bouganin)、ゲロニン(gelonin)、またはサポリン−S6(saporin−S6))等が挙げられる。 Furthermore, purified proteins may include antibodies (natural antibodies) or portions thereof, and chimeric antibodies, such as antibodies in which human immunoglobulin constant domains are linked to one or more murine immunoglobulin variable domains, or fragments thereof. Alternatively, it may be a conjugate containing an antibody and a cytotoxic substance or a luminescent substance. Cytotoxic or luminescent substances include maytansine derivatives (eg DM1); enterotoxins (eg staphylococcal enterotoxins); iodine isotopes (eg I-125); technium isotopes (eg Tc-99m ); Cyanine fluorescent dyes (eg, Cy5.5.18); and ribosome inactivating proteins (eg, bouganin, gelonin, or saporin-S6).
なお、抗体、抗体/細胞毒素結合体、または抗体/発光団結合体としては、例えば、前記タンパク質および/または下記抗原のうちいずれか1種類またはその組合わせを認識するものが挙げられ、抗原としては、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、IL−1α、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−8、IL−10、IL−2受容体、IL−4受容体、IL−6受容体、IL−13受容体、IL−18受容体サブユニット、PDGF−β、VEGF、TGF、TGF−β2、TGF−β1、EGF受容体、VEGF受容体、C5補体、IgE、腫瘍抗原CA125、腫瘍抗原MUCI、PEM抗原、LCG(肺癌に関連して発現する遺伝子産物)、HER−2、腫瘍関連糖タンパク質TAG−72、SK−1抗原、結腸癌および/または膵臓癌の患者血清中に高濃度で存在する腫瘍関連エピトープ、胸部、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺および/または腎臓癌細胞、および/または黒色腫、グリオーマもしくは神経芽細胞に発現する癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍壊死コア、インテグリンα4β7、インテグリンVLA−4、B2インテグリン、TRAIL受容体1、2、3および4、RANK、RANKリガンド、TNF−α、接着分子VAP−1、上皮細胞接着分子(EpCAM)、細胞間接着分子−3(ICAM−3)、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質gpIIb/IIIa、心臓ミオシンH鎖、副甲状腺ホルモン、rNAPc2(VIIa因子−組織因子の阻害薬)、MHC I、癌胎児性抗原(CEA)、α−フェトプロテイン(AFP)、腫瘍壊死因子(TNF)、CTLA−4(細胞傷害性Tリンパ球関連抗原である)、Fc−γ−1受容体、HLA−DR 10β、HLA−DR抗原、L−セレクチン、IFN−γ、呼吸系発疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)および黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aures)等が挙げられる。 Examples of the antibody, antibody / cytotoxin conjugate, or antibody / luminophore conjugate include those that recognize any one or a combination of the above proteins and / or the following antigens. , CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α IL-1β, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 receptor, IL-4 receptor, IL-6 receptor, IL-13 receptor, IL-18 receptor Subunit, PDGF-β, VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, EGF receptor, VEGF receptor, C5 complement, IgE, tumor antigen C In serum of patients with A125, tumor antigen MUCI, PEM antigen, LCG (gene product expressed in association with lung cancer), HER-2, tumor-associated glycoprotein TAG-72, SK-1 antigen, colon cancer and / or pancreatic cancer Tumor-associated epitopes present in high concentrations in breast, colon, squamous cells, prostate, pancreas, lung and / or kidney cancer cells, and / or cancer-associated epitopes or proteins expressed in melanoma, glioma or neuroblast, Tumor necrosis core, integrin α4β7, integrin VLA-4, B2 integrin, TRAIL receptors 1, 2, 3 and 4, RANK, RANK ligand, TNF-α, adhesion molecule VAP-1, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), cells Interadhesion molecule-3 (ICAM-3), leucointegrin adhesin, platelet sugar tamper GpIIb / IIIa, cardiac myosin heavy chain, parathyroid hormone, rNAPc2 (factor VIIa-tissue factor inhibitor), MHC I, carcinoembryonic antigen (CEA), α-fetoprotein (AFP), tumor necrosis factor (TNF) CTLA-4 (which is a cytotoxic T lymphocyte-related antigen), Fc-γ-1 receptor, HLA-DR 10β, HLA-DR antigen, L-selectin, IFN-γ, respiratory rash virus, human immunity Examples include deficiency virus (HIV), hepatitis B virus (HBV), Streptococcus mutans and Staphylococcus aures.
このような精製タンパク質を含有する試料液には、この精製タンパク質の他、これ以外の夾雑物(混入物)が含まれ、この夾雑物としては、例えば、DNA、RNA、免疫グロブリン定常ドメインを有するタンパク質(精製タンパク質)以外のタンパク質(夾雑タンパク質)等の生体高分子が挙げられる。 Such a purified protein-containing sample solution contains impurities (contaminants) other than this purified protein. Examples of such impurities include DNA, RNA, and immunoglobulin constant domains. Examples thereof include biopolymers such as proteins (contaminating proteins) other than proteins (purified proteins).
より具体的には、夾雑物としては、精製タンパク質が遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される場合、宿主細胞に由来する、DNA、RNAおよび免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質(夾雑タンパク質)等が挙げられ、また、タンパク質が天然の抗体である場合、血漿中に含まれるアルブミン、βグロブリン、αグロブリンのような免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質(夾雑タンパク質)等が挙げられる。 More specifically, when the purified protein is produced by a genetically engineered host cell, the contaminant is a protein that does not have DNA, RNA, or immunoglobulin constant domain derived from the host cell (contaminant protein). In addition, when the protein is a natural antibody, a protein having no immunoglobulin constant domain (contaminating protein) such as albumin, β globulin, and α globulin contained in plasma is included.
なお、本実施形態で用意する試料液としては、精製すべき精製タンパク質の他、夾雑物が含まれるものであればよく、予め、夾雑物の一部が除去されたものであってもよい。 In addition, the sample solution prepared in the present embodiment may be any sample solution as long as it contains impurities in addition to the purified protein to be purified, and may be obtained by removing a part of the impurities in advance.
試料液中から予め夾雑物を除去する方法としては、例えば、プロテインA等の結合性タンパク質が固体支持体に固定化された固定化部材を備えるものを吸着剤として用いたアフィニティークロマトグラフィー処理が挙げられる。 Examples of the method for removing contaminants from the sample solution in advance include affinity chromatography using, as an adsorbent, a material having an immobilizing member in which a binding protein such as protein A is immobilized on a solid support. It is done.
なお、本実施形態では、上記のような夾雑物を除去する方法を試料液に適用したとしても、その全てが試料液中から除去されることはなく、夾雑物のうちの少なくとも一部は、試料液中に残存することとする。 In this embodiment, even if the method for removing contaminants as described above is applied to the sample solution, not all of the contaminants are removed from the sample solution, and at least some of the contaminants are It will remain in the sample solution.
[1−2]次に、得られた試料液を、流入管24およびフィルタ部材4を介して吸着剤3に供給して、カラム2(吸着装置1)内を通過させて、吸着剤3に接触させる。
[1-2] Next, the obtained sample solution is supplied to the
これにより、吸着剤3に対して吸着能が精製タンパク質(精製すべき目的物質)や、このタンパク質以外の夾雑タンパク質の中でも吸着剤3に対して比較的吸着能の高いものは、カラム2内に保持される。そして、吸着剤3に対して吸着能の低い夾雑タンパク質や、タンパク質以外の夾雑物は、フィルタ部材5および流出管25を介してカラム2内から流出する。
As a result, a purified protein (target substance to be purified) that adsorbs to the
[2] 分画工程
次に、吸着装置1の流入管24からカラム2内に、精製タンパク質を流出させるための溶出液(洗浄液)を供給する。そして、カラム2内から流出管25を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画(採取)する。これにより、吸着剤3に吸着している目的とする精製タンパク質と、それ以外の夾雑物(夾雑タンパク質等)とは、それぞれが有する吸着剤3に対する吸着力の差に応じて、各分画内に溶出した状態で回収(分離)される。
[2] Fractionation step Next, an eluate (washing solution) for flowing the purified protein is supplied from the
そのため、目的とする精製タンパク質が溶出した分画を分画液として回収することで、精製タンパク質が精製される。 Therefore, the purified protein is purified by collecting the fraction from which the target purified protein is eluted as a fraction.
ここで、カラム2内に供給する溶出液として、例えば、リン酸緩衝液に塩化ナトリウムのような溶離剤を添加したものを用いると、塩化ナトリウムのナトリウムイオンと、吸着剤3を構成するリン酸カルシウム系化合物が備えるリン酸基が有する水素イオンとがイオン交換する。その結果、前述の通り、溶出液のpHが急激に低下するため、リン酸カルシウム系化合物が溶解することに起因して吸着剤3が変質・劣化し、その結果、吸着剤(担体)3としての機能が早期に低下するという問題があった。
Here, as an eluent supplied into the
これに対して、本発明では、カラム2内に供給する溶出液として、リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有する緩衝液が用いられる。すなわち、本発明では、溶離剤として、塩化ナトリウムに代えて、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方を含む緩衝液が用いられる。
On the other hand, in the present invention, a buffer solution containing at least one of phosphoric acid and a salt thereof and at least one of a compound having a carboxy group and a salt thereof as an eluent supplied into the
このように、溶出液(緩衝液)として、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方を含むものを用いることで、塩化ナトリウムを含む場合と同様に、イオン交換により溶出液のpHが低下することとなるが、この際、カルボキシ基を有する化合物(およびその塩)のカルボキシ基が低pH(4.0〜6.0程度)の領域において緩衝能を有しているため、溶出液のpHの低下を抑制することができる。そのため、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤3が溶解することに起因する吸着剤3の変質・劣化を的確に抑制することができることから、吸着剤(担体)3を長期に亘って繰り返し使用することができる。
Thus, by using an eluate (buffer solution) containing at least one of a compound having a carboxy group and a salt thereof, the pH of the eluate can be reduced by ion exchange as in the case of containing sodium chloride. In this case, since the carboxy group of the compound having a carboxy group (and its salt) has a buffering capacity in the region of low pH (about 4.0 to 6.0), the eluate The decrease in pH can be suppressed. For this reason, the adsorbent (carrier) 3 can be maintained over a long period of time because the alteration / deterioration of the
カルボキシ基を有する化合物としては、特に限定されないが、例えば、脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸の他、アミノ酸等が挙げられる。 Although it does not specifically limit as a compound which has a carboxy group, For example, amino acids other than aliphatic carboxylic acid and aromatic carboxylic acid are mentioned.
また、芳香族カルボン酸としては、フタル酸、トリメリット酸、ピロメリット酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸等が挙げられ、これらのうち1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。 Moreover, examples of the aromatic carboxylic acid include phthalic acid, trimellitic acid, pyromellitic acid, benzophenone tetracarboxylic acid, and the like, and one or more of these can be used in combination.
脂肪族カルボン酸としては、特に限定されないが、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、琥珀酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、ドデカンジオン酸、ピメリン酸等が挙げられ、これらのうち1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。 The aliphatic carboxylic acid is not particularly limited, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, caproic acid, caprylic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, fumaric acid, Maleic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, sebacic acid, dodecanedioic acid, pimelic acid and the like can be mentioned, and one or more of these can be used in combination.
これらの中でも、カルボキシ基を有する化合物としては、炭素を2つ以上備える脂肪族カルボン酸(直鎖状飽和モノカルボン酸)、であることが好ましい。 Among these, the compound having a carboxy group is preferably an aliphatic carboxylic acid (linear saturated monocarboxylic acid) having two or more carbon atoms.
さらに、炭素を2つ以上備える脂肪族カルボン酸としては、酢酸であることが好ましい。ここで、酢酸の塩(酢酸塩)は、カルボキシ基を1つ有する1価の塩である。この酢酸塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有する溶離剤として機能すると推察されるため、緩衝液中に高濃度に含まれたとしても吸着剤3に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。
Furthermore, the aliphatic carboxylic acid having two or more carbons is preferably acetic acid. Here, the salt of acetic acid (acetate) is a monovalent salt having one carboxy group. Since this acetate salt is presumed to function as an eluent having an elution mechanism substantially similar to that of sodium chloride, contaminants adsorbed on the
なお、カルボキシ基を有する化合物の塩としては、例えば、かかる化合物のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。 In addition, as a salt of the compound which has a carboxy group, the sodium salt, potassium salt, ammonium salt, etc. of this compound are mentioned, for example.
また、カルボキシ基を有する化合物およびその塩の合計の含有量は、カルボキシ基を有する化合物およびその塩が溶離剤として機能する範囲、すなわち、精製すべき精製タンパク質が吸着剤3から選択的に溶出する範囲内に設定されていればよいが、例えば、好ましくは0.1M以上、5M以下に設定され、より好ましくは1M以上、2M以下に設定される。これにより、吸着剤3に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。
The total content of the compound having a carboxy group and its salt is within a range where the compound having a carboxy group and its salt function as an eluent, that is, the purified protein to be purified is selectively eluted from the
また、リン酸およびその塩のうち、リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム等が挙げられる。 Moreover, sodium phosphate, potassium phosphate, ammonium phosphate etc. are mentioned as phosphate among phosphoric acid and its salt.
さらに、リン酸およびその塩の合計の含有量は、特に限定されないが、例えば、好ましくは1.0mM以上、400mM以下に設定され、より好ましくは10mM以上、100mM以下に設定される。これにより、吸着剤3に吸着する夾雑物が精製タンパク質とともに溶出してしまうのをより的確に抑制または防止することができる。
Furthermore, although total content of phosphoric acid and its salt is not specifically limited, For example, Preferably it sets to 1.0 mM or more and 400 mM or less, More preferably, it sets to 10 mM or more and 100 mM or less. Thereby, it can suppress or prevent more accurately that the foreign material adsorbed to the
また、このような溶出液、すなわち、リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有する緩衝液は、そのpHが好ましくは5.5以上、8.0未満、より好ましくは6.5以上、7.5以下に設定される。これにより、精製すべき精製タンパク質の変質(変性)を防止することができ、その特性が変化するのを防止することができる。また、吸着剤(担体)3の変質(溶解等)を好適に防止することができ、吸着装置1における分離能の変化を長期に亘って防止することもできるため、目的とするタンパク質を長期に亘って高精度に精製することができる。
The pH of the eluate, that is, a buffer containing at least one of phosphoric acid and a salt thereof and at least one of a compound having a carboxy group and a salt thereof is preferably 5. It is set to 5 or more and less than 8.0, more preferably 6.5 or more and 7.5 or less. Thereby, alteration (denaturation) of the purified protein to be purified can be prevented, and changes in its characteristics can be prevented. In addition, alteration (dissolution, etc.) of the adsorbent (carrier) 3 can be suitably prevented, and a change in the separation ability in the
さらに、溶出液(緩衝液)の温度は、特に限定されないが、30〜50℃程度であるのが好ましく、35〜45℃程度であるのがより好ましい。これにより、精製タンパク質の変質(変性)を防止することができる。 Furthermore, the temperature of the eluate (buffer solution) is not particularly limited, but is preferably about 30 to 50 ° C, and more preferably about 35 to 45 ° C. Thereby, alteration (denaturation | denaturation) of purified protein can be prevented.
さらに、溶出液の流速は、0.1〜10mL/分程度であるのが好ましく、1〜5mL/分程度であるのがより好ましい。このような流速で、精製タンパク質の精製を行うことにより、分離操作(精製操作)に長時間を要することなく、精製タンパク質と夾雑物とを確実に分離すること、すなわち、高純度に精製タンパク質を精製することができる。 Furthermore, the flow rate of the eluate is preferably about 0.1 to 10 mL / min, and more preferably about 1 to 5 mL / min. By purifying the purified protein at such a flow rate, it is possible to reliably separate the purified protein and the contaminants without requiring a long time for the separation operation (purification operation), that is, to purify the purified protein with high purity. Can be purified.
以上のような操作により、所定の画分に、目的とする精製タンパク質が回収される。また、目的とする精製タンパク質が回収される画分とは異なる画分には、夾雑物が回収される。 By the operation as described above, the target purified protein is recovered in a predetermined fraction. Further, contaminants are collected in a fraction different from the fraction from which the target purified protein is collected.
以上、本発明の緩衝液および精製方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。 The buffer solution and purification method of the present invention have been described above, but the present invention is not limited to this.
例えば、本発明では、任意の目的で、工程[1]の前工程、各工程[1]、[2]同士の間に存在する中間工程、または工程[2]の後工程を追加するようにしてもよい。 For example, in the present invention, a pre-process of the process [1], an intermediate process existing between the processes [1] and [2], or a post-process of the process [2] is added for an arbitrary purpose. May be.
さらに、前記工程[1−1]において挙げた、夾雑物の一部を除去して精製タンパク質を粗精製する方法として、アフィニティークロマトグラフィー法を用いるのに代えて、吸着剤として陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂を備えるイオン交換クロマトグラフィー法を用いるようにしてもよい。 Furthermore, as a method for removing a part of the contaminants mentioned in the above step [1-1] and roughly purifying the purified protein, instead of using the affinity chromatography method, an anion exchange resin or An ion exchange chromatography method including a cation exchange resin may be used.
また、前記実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質を、精製タンパク質として精製する場合について説明したが、このようなタンパク質に限定されず、フィブリノゲン、ペプシノーゲンのような免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質を、本発明によれば精製タンパク質として精製することができる。 In the above embodiment, the case where a natural antibody or a recombinant fusion protein having an immunoglobulin constant domain is purified as a purified protein has been described. However, the present invention is not limited to such a protein, and fibrinogen, pepsinogen and the like. According to the present invention, a protein having no immunoglobulin constant domain can be purified as a purified protein.
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
・ハイドロキシアパタイトに対する溶出液の接触によるpHの影響
(実施例1A)
−1− まず、吸着装置として、ハイドロキシアパタイトビーズ(CHT TypeI、平均粒径40μm、HOYA Technosurgical社製)が吸着剤として約0.8g充填された、カラム(サイズφ4.0mm×100mm)を用意した。
Next, specific examples of the present invention will be described.
-Effect of pH due to contact of eluate on hydroxyapatite (Example 1A)
-1- First, as an adsorber, a column (size φ4.0 mm × 100 mm) in which about 0.8 g of hydroxyapatite beads (CHT Type I,
−2− 次に、平衡化液を0.5mL/minの流速で15CV供給し、次いで、溶出液を0.5mL/minの流速で10CV供給し、その後、洗浄液を0.5mL/minの流速で6.4CV供給して、カラム内から流出する流出液のpHを測定した。 -2- Next, 15 CV of the equilibration solution is supplied at a flow rate of 0.5 mL / min, then 10 CV of the eluate is supplied at a flow rate of 0.5 mL / min, and then the washing solution is supplied at a flow rate of 0.5 mL / min. Then, 6.4 CV was supplied, and the pH of the effluent flowing out from the column was measured.
なお、平衡化液には、10mMリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を、溶出液には、10mMリン酸ナトリウムと1M CH3COOHとを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を、さらに、洗浄液には、400mMリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を、それぞれ用いた。 The equilibration solution is a phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM sodium phosphate, and the eluate is a phosphate buffer (pH 6) containing 10 mM sodium phosphate and 1 M CH 3 COOH. 5) and a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing 400 mM sodium phosphate was used as the washing solution.
(比較例1A)
溶出液として、10mMリン酸ナトリウムと1M NaClとを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を用いたこと以外は、前記実施例1Aと同様にして、カラム内から流出する流出液のpHを測定した。
(Comparative Example 1A)
The pH of the effluent flowing out of the column was adjusted in the same manner as in Example 1A, except that a phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM sodium phosphate and 1 M NaCl was used as the eluent. It was measured.
その結果、図2に示す通り、比較例1Aでは、溶出液の供給にともないpHの低下が顕著に認められる結果を示したが、これに対して、実施例1Aでは、溶出液の供給にともなうpHの低下が、比較例1Aと比較して抑制された結果を示した。また、実施例1Aでは、pHが低下した後、比較例1Aと比較して少ない溶出液の供給で元のpH付近にまで戻る結果を示した。 As a result, as shown in FIG. 2, Comparative Example 1A showed a result that a decrease in pH was significantly observed with the supply of the eluate, whereas Example 1A was accompanied with the supply of the eluate. The results showed that the decrease in pH was suppressed as compared with Comparative Example 1A. Moreover, in Example 1A, after pH fell, the result returned to the original pH vicinity by supply of a little eluate compared with Comparative Example 1A was shown.
(実施例2A)
−1− まず、吸着装置として、ハイドロキシアパタイトビーズ(CHT TypeI、平均粒径40μm、HOYA Technosurgical社製)が吸着剤として約0.7g充填された、カラム(サイズ4mmI.D.×100mm)を用意した。
(Example 2A)
-1- First, as an adsorber, a column (
−2− 次に、溶出液を1.0mL/minの流速で10CV供給して、カラム内から流出する流出液のpHを測定した。 -2- Next, the eluate was supplied at 10 CV at a flow rate of 1.0 mL / min, and the pH of the effluent flowing out of the column was measured.
なお、溶出液には、5mM MES(2−モルホリノエタンスルホン酸)と、800mM NaClと、400mM ヒスチジンとを含む緩衝液(pH6.5)を用いた。 In addition, the buffer solution (pH 6.5) containing 5 mM MES (2-morpholino ethanesulfonic acid), 800 mM NaCl, and 400 mM histidine was used for the eluate.
(実施例3A)
溶出液として、5mM MES(2−モルホリノエタンスルホン酸)と、800mM NaClと、100mM ヒスチジンとを含む緩衝液(pH6.5)を用いたこと以外は、前記実施例2Aと同様にして、カラム内から流出する流出液のpHを測定した。
(Example 3A)
In the same manner as in Example 2A, except that a buffer solution (pH 6.5) containing 5 mM MES (2-morpholinoethanesulfonic acid), 800 mM NaCl, and 100 mM histidine was used as an eluent. The pH of the effluent flowing out from was measured.
(比較例2A)
溶出液として、5mM MES(2−モルホリノエタンスルホン酸)と、800mM NaClとを含む緩衝液(pH6.5)を用いたこと以外は、前記実施例2Aと同様にして、カラム内から流出する流出液のpHを測定した。
(Comparative Example 2A)
The effluent flowing out from the column in the same manner as in Example 2A, except that a buffer solution (pH 6.5) containing 5 mM MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) and 800 mM NaCl was used as the eluent. The pH of the liquid was measured.
その結果、図3に示す通り、比較例2Aでは、溶出液の供給にともないpHの低下が顕著に認められる結果を示したが、これに対して、実施例2A、3Aでは、溶出液の供給にともなうpHの低下が、比較例2Aと比較して抑制された結果を示し、特にこのような傾向は、400mMのヒスチジンを含有する実施例2Aにおいてより顕著に認められた。 As a result, as shown in FIG. 3, Comparative Example 2A showed a result in which a decrease in pH was remarkably observed with the supply of the eluate, whereas in Examples 2A and 3A, the supply of the eluate was shown. As a result, the decrease in pH was suppressed as compared with Comparative Example 2A, and this tendency was particularly noticeable in Example 2A containing 400 mM histidine.
・タンパク質等のハイドロキシアパタイトを用いた溶出液(緩衝液)による精製
[4STDの精製]
(実施例1B)
−1− まず、吸着装置として、ハイドロキシアパタイトビーズ(CHT TypeI、平均粒径40μm、HOYA Technosurgical社製)が吸着剤として約0.8g充填された、カラム(サイズφ4mm×100mm)を用意した。
・ Purification by eluate (buffer) using hydroxyapatite such as protein [4STD purification]
(Example 1B)
-1- First, as an adsorber, a column (size φ4 mm × 100 mm) in which about 0.8 g of hydroxyapatite beads (CHT Type I, average particle diameter of 40 μm, manufactured by HOYA Technosurgical) was packed as an adsorbent was prepared.
−2− 次に、カラム内に、10mMのNaPB(pH6.5)を1mL/minの流速で10分間供給することで洗浄して、カラム内を10mMリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)で平衡化した。 -2- Next, the column was washed by supplying 10 mM NaPB (pH 6.5) at a flow rate of 1 mL / min for 10 minutes, and a phosphate buffer solution containing 10 mM sodium phosphate ( Equilibrated at pH 6.5).
−3− 次に、前記工程−2−で得られたカラムに、ミオグロビン 5mg/mL、オバルブミン 10mg/mL、α−キモトリプシノーゲンA 5mg/mL、チトクロムC 5mg/mLとなるように、1mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)に溶解させた試料(4STD試料)50μLを供給した。
-3- Next, 1 mM phosphoric acid is added to the column obtained in the step 2-2 so that myoglobin is 5 mg / mL, ovalbumin 10 mg / mL, α-
−4− 次に、10mMリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を1mL/minの流速で3分間供給し、次いで、溶出液Aおよび溶出液Bを、それらの容量比が溶出液Bが0%〜100%に連続的に変化するように、1mL/minの流速で15分間供給し、その後、400mMリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を1mL/minの流速で7分間供給して、カラム内から流出する流出液を1mLずつ分画した。 -4- Next, a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing 10 mM sodium phosphate is supplied at a flow rate of 1 mL / min for 3 minutes, and then the eluate A and the eluate B are mixed at a volume ratio thereof. The eluate B is supplied at a flow rate of 1 mL / min for 15 minutes so that the eluate B continuously changes from 0% to 100%, and then a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing 400 mM sodium phosphate is added at 1 mL / min. Supplying for 7 minutes at a flow rate of min, the effluent flowing out from the column was fractionated by 1 mL.
なお、溶出液Aには、10mMリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を、溶出液Bには、10mMリン酸ナトリウムと1M CH3COOHとを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)をそれぞれ用いた。 The eluent A is a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing 10 mM sodium phosphate, and the eluent B is a phosphate buffer solution (containing 10 mM sodium phosphate and 1M CH 3 COOH). Each of pH 6.5) was used.
(参考例1B)
前記工程−4−において、溶出液Bとして、10mMリン酸ナトリウムと1M NaClとを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を用いた以外は、前記実施例1Bと同様にして、参考例1Bにおいて4STD試料を、吸着装置を用いて精製した。
(Reference Example 1B)
Reference Example 1B was carried out in the same manner as in Example 1B, except that a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing 10 mM sodium phosphate and 1M NaCl was used as eluent B in Step -4-. A 4STD sample was purified using an adsorber.
実施例1Bおよび参考例1Bにおける前記工程−4−において、それぞれ、測定された流出液の280nmにおける吸光度を図4に示す。 FIG. 4 shows the absorbance at 280 nm of the effluents measured in Step -4- in Example 1B and Reference Example 1B, respectively.
図4から明らかなように、実施例1Bと参考例1Bとの双方において、塩基性タンパク質、中性タンパク質、さらには酸性タンパク質の順でタンパク質が流出液中に溶出しており、酢酸およびその塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有していることが判った。 As is clear from FIG. 4, in both Example 1B and Reference Example 1B, proteins were eluted in the effluent in the order of basic protein, neutral protein, and acidic protein, and acetic acid and its salts. Was found to have almost the same elution mechanism as sodium chloride.
[ウシ血清アルブミン(BSA)の精製]
(実施例2B)
前記工程−3−において、前記工程−2−で得られたカラムに、ウシ血清アルブミン 10mg/mLとなるように、1mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)に溶解させた試料(BSA試料)50μLを供給したこと以外は、前記実施例1Bと同様にして、参考例1BにおいてBSA試料を、吸着装置を用いて精製した。
[Purification of bovine serum albumin (BSA)]
(Example 2B)
A sample (BSA sample) dissolved in 1 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) so that bovine serum albumin is 10 mg / mL in the column obtained in the step -2- in the step -3- The BSA sample in Reference Example 1B was purified using an adsorption device in the same manner as in Example 1B except that 50 μL was supplied.
(参考例2B)
前記工程−4−において、溶出液Bとして、10mMリン酸ナトリウムと1M NaClとを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を用いた以外は、前記実施例2Bと同様にして、参考例2BにおいてBSA試料を、吸着装置を用いて精製した。
(Reference Example 2B)
Reference Example 2B was carried out in the same manner as in Example 2B, except that a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing 10 mM sodium phosphate and 1M NaCl was used as eluent B in Step -4-. The BSA sample was purified using an adsorber.
実施例2Bおよび参考例2Bにおける前記工程−4−において、それぞれ、測定された流出液の280nmにおける吸光度を図5に示す。 FIG. 5 shows the absorbances at 280 nm of the effluents measured in Example 4B and Reference Example 2B in step -4-.
図5から明らかなように、実施例2Bと参考例2Bとの双方において、溶出液Aおよび溶出液Bによる溶出ではBSAが流出液中には溶出しておらず、400mMリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を供給することで初めて流出液中に溶出しており、酢酸およびその塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有していることが判った。 As is apparent from FIG. 5, in both Example 2B and Reference Example 2B, BSA was not eluted in the effluent by elution with Eluent A and Eluent B, but phosphorous containing 400 mM sodium phosphate. Elution into the effluent was first made by supplying an acid buffer solution (pH 6.5), and it was found that acetic acid and its salt have almost the same elution mechanism as sodium chloride.
[人免疫グロブリン(抗体;IgG)の精製]
(実施例3B)
前記工程−3−において、前記工程−2−で得られたカラムに、IgG 2mg/mLとなるように、1mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)に溶解させた試料(IgG試料)50μLを供給したこと以外は、前記実施例1Bと同様にして、参考例3BにおいてDNA試料を、吸着装置を用いて精製した。
[Purification of human immunoglobulin (antibody; IgG)]
(Example 3B)
In the step -3-, 50 μL of a sample (IgG sample) dissolved in 1 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) was added to the column obtained in the step 2-2 so as to be IgG 2 mg / mL. A DNA sample in Reference Example 3B was purified using an adsorption device in the same manner as in Example 1B except that it was supplied.
(参考例3B)
前記工程−4−において、溶出液Bとして、10mMリン酸ナトリウムと1M NaClとを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を用いた以外は、前記実施例3Bと同様にして、参考例3BにおいてIgG試料を、吸着装置を用いて精製した。
(Reference Example 3B)
Reference Example 3B was carried out in the same manner as in Example 3B, except that a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing 10 mM sodium phosphate and 1M NaCl was used as eluent B in Step-4. IgG samples were purified using an adsorber.
実施例3Bおよび参考例3Bにおける前記工程−4−において、それぞれ、測定された流出液の280nmにおける吸光度を図6に示す。 FIG. 6 shows the absorbance at 280 nm of the effluent measured in Example 4B and Reference Example 3B in Step -4-.
図6から明らかなように、実施例3Bと参考例3Bとの双方において、溶出液Aおよび溶出液Bによる溶出により、IgGが流出液中に溶出しており、酢酸およびその塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有していることが判った。 As apparent from FIG. 6, in both Example 3B and Reference Example 3B, IgG was eluted in the effluent by elution with eluent A and eluent B, and acetic acid and its salt were sodium chloride. It was found that it has almost the same elution mechanism.
[サーモンDNAの精製]
(実施例4B)
前記工程−3−において、前記工程−2−で得られたカラムに、サーモンDNA1mg/mLとなるように、1mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)に溶解させた試料(DNA試料)50μLを供給したこと以外は、前記実施例1Bと同様にして、参考例4BにおいてDNA試料を、吸着装置を用いて精製した。
[Purification of salmon DNA]
(Example 4B)
In the step-3-, 50 μL of a sample (DNA sample) dissolved in 1 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) was added to the column obtained in the step-2- so that the salmon DNA was 1 mg / mL. A DNA sample in Reference Example 4B was purified using an adsorption device in the same manner as in Example 1B except that it was supplied.
(参考例4B)
前記工程−4−において、溶出液Bとして、10mMリン酸ナトリウムと1M NaClとを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を用いた以外は、前記実施例4Bと同様にして、参考例4BにおいてDNA試料を、吸着装置を用いて精製した。
(Reference Example 4B)
Reference Example 4B was carried out in the same manner as in Example 4B, except that a phosphate buffer solution (pH 6.5) containing 10 mM sodium phosphate and 1M NaCl was used as eluent B in Step -4-. The DNA sample was purified using an adsorption device.
実施例4Bおよび参考例4Bにおける前記工程−4−において、それぞれ、測定された流出液の280nmにおける吸光度を図7に示す。 FIG. 7 shows the absorbance at 280 nm of the effluent measured in Example 4B and Reference Example 4B in the step -4-.
図7から明らかなように、実施例4Bと参考例4Bとの双方において、溶出液Aおよび溶出液Bによる溶出ではDNAが流出液中には溶出しておらず、400mMリン酸ナトリウムを含むリン酸系緩衝液(pH6.5)を供給することで初めて流出液中に溶出しており、酢酸およびその塩は、塩化ナトリウムとほぼ同様の溶出機構を有していることが判った。 As is clear from FIG. 7, in both Example 4B and Reference Example 4B, DNA was not eluted in the effluent by elution with eluate A and eluent B, but phosphorous containing 400 mM sodium phosphate. Elution into the effluent was first made by supplying an acid buffer solution (pH 6.5), and it was found that acetic acid and its salt have almost the same elution mechanism as sodium chloride.
1 吸着装置
2 カラム
20 吸着剤充填空間
21 カラム本体
22、23 キャップ
24 流入管
25 流出管
3 吸着剤
4、5 フィルタ部材
DESCRIPTION OF
Claims (7)
リン酸およびその塩のうちの少なくとも一方と、カルボキシ基を有する化合物およびその塩のうちの少なくとも一方とを含有することを特徴とする緩衝液。 A buffer used as an eluent when selectively purifying a purified protein to be purified adsorbed on a carrier composed of a calcium phosphate compound at least on its surface;
A buffer comprising at least one of phosphoric acid and a salt thereof and at least one of a compound having a carboxy group and a salt thereof.
前記担体を、充填空間の少なくとも一部に充填してなる装置内に、前記試料液を供給する供給工程と、
請求項1ないし6のいずれか1項に記載の緩衝液を前記装置内に供給して、前記装置内から流出する流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記精製タンパク質を精製する分画工程とを有することを特徴とする精製方法。 A separation method for separating the purified protein from a sample solution containing a plurality of types of proteins including the purified protein,
A supply step of supplying the sample solution into an apparatus in which the carrier is filled in at least a part of a filling space;
A buffer solution according to any one of claims 1 to 6 is supplied into the device, and the effluent flowing out of the device is fractionated by a predetermined amount, whereby each fractionated fraction is separated. And a fractionation step of purifying the purified protein in the effluent of the water.
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Citations (2)
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JP2007238479A (en) * | 2006-03-07 | 2007-09-20 | Denka Seiken Co Ltd | Method of eluting organic matter adsorbed to hydroxyapatite and method for purifying organic matter using the elution method |
JP2011510303A (en) * | 2008-01-18 | 2011-03-31 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | Improved purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography |
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- 2014-06-16 JP JP2014123306A patent/JP2016003192A/en active Pending
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