JP2015533130A

JP2015533130A - 膵管腺癌の個別化療法のための新規手法

Info

Publication number: JP2015533130A
Application number: JP2015536021A
Authority: JP
Inventors: トーマスアイゼンクリスティアン; トルンプアンドレアス; ロナルトシュプリックマルティン
Original assignee: ハイ−シュテムゲマインヌートツィヒェゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2015-11-19
Also published as: WO2014056627A1; EP2906220A1; US20150290193A1; HK1213500A1; CA2886601A1

Abstract

本発明は、膵管腺癌（PDAC)の治療に対する新規手法に関する。本発明は特に、新規PDACサブタイプ特異的阻害剤に関し、そして前記阻害剤を含む組成物を利用し、治療剤に対するPDACサブタイプ特異的感受性を活用する治療方法に関する。

Description

発明の技術分野
本発明は、膵管腺癌 (pancreatic ductal adenocarcinoma)（ＰＤＡＣ）の治療に対する新規手法に関する。本発明は特に、ＰＤＡＣサブタイプ特異的阻害剤に関し、そして前記阻害剤を含む組成物を利用し、治療剤に対するＰＤＡＣサブタイプ特異的感受性を活用する治療方法に関する。

発明の背景
個別化腫瘍学は、将来癌患者が治療される方法に革命をもたらす可能性を秘めている。実体の異なる癌は、治療応答と臨床的転帰をしばしば決定するシグナル伝達の特異的活性化を含む分子的差異に基づいて、サブクラスに分割することができる。乳癌、肺癌および結腸癌を含む種々の癌について、そのようなサブタイプの同定やコホートへの患者の層別化は、既にサブタイプ特異的な方法で患者を治療するために臨床診療に応用されている。

ＰＤＡＣは最も頻度の高い膵臓癌であり、米国および欧州における癌による死亡の第４の原因である。ほとんどの患者は１２ヶ月以内に死亡し、予後後５年間の生存はわずか２％である。２０００年のゲムシタビンと２００５年のエルロチニブの承認以来、ＰＤＡＣの治療においてほとんど進展がなかった。さらに、標的化療法を用いる最近の治験は、ほとんど又は全く利益を示していない。

ＰＤＡＣはいまだに単一の癌として分類され、臨床的にそのように扱われる。しかし、最近３つのＰＤＡＣサブタイプ（古典的サブタイプ、間葉系様サブタイプ、外分泌様サブタイプ）の存在が示唆された（Collisson, E. A., Sadanandam, A., Olson, P., Gibb, W. J., Truitt, M., Gu, S. D., Cooc, J., Weinkle, J., Kim, G. E., Jakkula, L., et al. (2011). Subtypes of pancreatic ductal adenocarcinoma and their differing responses to therapy. Nat Med 17, 500-U140）。これらのサブタイプの同定は、患者の検体からの微小解剖された上皮細胞中の比較遺伝子発現解析に基づいていた。

ＰＤＡＣのサブタイプの存在は、治療剤に対する感受性に関するサブタイプ間の特異的な差異の可能性を提起する。ＰＤＡＣサブタイプに特異的な脆弱性は、ＰＤＡＣの新規個別化治療手法の開発のために決定的かもしれない。患者の層別化に基づく改善されたＰＤＡＣ治療方法に対する大きな必要性は、いまだに満たされていない。

ＰＤＡＣ患者の薬物感受性を予測する以前の試みは、患者の検体から得られた遺伝子発現プロファイルの分析又はモデル細胞株の解析に依存していた。両方の手法とも、特異的な薬物感受性を正確に予測するマーカーの同定に関して限界がある。

患者検体から得られたＲＮＡはしばしば、腫瘍細胞に由来するＲＮＡと、線維芽細胞や免疫細胞などの周囲の腫瘍間質に由来したものとの混合物である。従って得られた遺伝子発現プロファイルはしばしば解釈が困難で、腫瘍細胞中の発現を反映していない可能性がある。

培養細胞株は、間質を含まない腫瘍ＲＮＡ源を提供し、従ってこの特定の細胞内の遺伝子発現プロファイルと薬物感受性のより高感度な検出を可能にする。ＰＤＡＣについてこれまで利用可能な細胞株は、元の腫瘍の分子表現型と表現プロファイルを正確に表すものではないという制限を有する。利用可能な細胞株が３つの記載されたサブタイプのうち２つのみを包含し、３つ目の外分泌様サブタイプは説明されていないことが証明されたため、この制限は特に明らかである（Collisson et al., 前掲）。すなわち、すべてのＰＤＡＣサブタイプについて薬剤感受性を予測し試験することはこれまで困難であり、従ってＰＤＡＣサブタイプ特異的な治療スキームの開発はまだ可能になっていない。

発明の課題
本発明の課題は、サブタイプ特異的薬剤感受性を活用する、ＰＤＡＣの改善された治療方法を提供することであった。特に本発明によって、ＰＤＡＣサブタイプ特異的阻害剤を含む組成物を利用するＰＤＡＣの個別化療法のための新規方法の開発が意図される。かかるＰＤＡＣサブタイプ特異的阻害剤は、サブタイプ特異的薬剤治療コホートへの患者の層別化を含む、改善されたＰＤＡＣ治療の大きな必要性を満たし得る。

発明の概要
驚くべきことに、古典的ＰＤＡＣサブタイプの、及び間葉系様サブタイプの特定のＰＤＡＣの明白な脆弱性は、これらのＰＤＡＣサブタイプの新規な患者特異的モデルを使用して同定することができることが見いだされた。これらのインビトロ及びインビボモデルはヒトの疾患を忠実に再現し、古典的及び間葉系様ＰＤＡＣサブタイプの一部の分子的分類と性状解析を可能にする。インビボで腫瘍開始活性を保持し、元の腫瘍サブタイプに関連する遺伝子発現パターンを保持する安定なＰＤＡＣ細胞株は、遺伝子セット濃縮分析［Gene-Set Enrichment Analysis（ＧＳＥＡ）］を用いて薬剤感受性と標的化可能経路を同定するのに使用することができる。さらに、驚くべきことに、確立されたサブタイプ特異的脆弱性に基づいて、ＰＤＡＣサブタイプ特異的阻害剤を同定することが初めて可能であった。新規ＰＤＡＣモデルを使用するインビトロの薬物スクリーニングは、ＰＤＡＣのために一般的に使用される化学療法とＰＤＡＣの治療用の治療剤とに対する感受性に関する顕著なサブタイプ間特異的差異を明らかにし、患者の層別化の必要性を示している。従ってこの新たに同定されたＰＤＡＣサブタイプ特異的阻害剤は、大きく改善されたＰＤＡＣ治療のための個別化療法手法の確立に有用となり得る可能性がある。

したがって一の態様において、本発明は、古典的サブタイプのＰＤＡＣ、及び／又はＳｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性である（Src inhibitor sensitivity predictor-positive）ＰＤＡＣサブタイプの治療における使用のためのＳｒｃ阻害剤に関する。

別の態様において、本発明は、古典的サブタイプのＰＤＡＣ、又はＳｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療方法であって、Ｓｒｃ阻害剤をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法に関する。

別の態様において、本発明は、（ａ）古典的サブタイプのＰＤＡＣ、及び／又は（ｂ）Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療における使用のためのＳｒｃ阻害剤であって、第二の化学治療剤と併用される、前記Ｓｒｃ阻害剤に関する。

別の態様において、本発明は、（ａ）古典的サブタイプのＰＤＡＣ、又は（ｂ）Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療のための併用治療方法であって、それを必要とする患者にＳｒｃ阻害剤を第二の治療剤と組み合わせて投与するステップを含む、前記方法に関する。

図１は、免疫組織化学的マーカーを使用して、ＰＤＡＣのＳｒｃ阻害剤感受性を予測する方法のフローチャートを示し、腫瘍試料中のＳｒｃ阻害剤感受性の予測は、２つのマーカーを使用して、免疫組織化学的方法により行われる（方法１）。図２は、Ｓｒｃ阻害剤感受性の遺伝子特性（gene signature）に基づく予測を使用して、ＰＤＡＣのＳｒｃ阻害剤感受性を予測する方法のフローチャートを示し、感受性は、遺伝子発現プロファイリングとＳＲＣ−ＳＰ予測因子特性を使用して、腫瘍試料中で決定される（方法２）。図３は、ＰＤＡＣ細胞株モデルに由来するＲＮＡからＳｒｃ阻害剤感受性を予測するための、ＳＲＣ−ＳＰ特性の有用性を証明する。感受性予測のためのＳＲＣ−ＳＰ特性に基づく方法は、ＰＤＡＣ患者に由来する１２の個々の細胞株に適用された。表は、予測されたＳｒｃ阻害剤感受性と実験的に決定されたＳｒｃ阻害剤感受性との比較を示す。実施例３に記載のようにアッセイした時、デサチニブ及びサルカチニブについてのＩＣ₅₀が＜１μＭである場合、細胞はＳｒｃ阻害剤感受性であると分類された。カットオフ：ＦＤＲ０．２：正しいクラスの予測：１００％（１２／１２）。図４は、患者由来の腫瘍異種移植片からのＲＮＡからＳｒｃ阻害剤感受性を予測するための、ＳＲＣ−ＳＰ特性の有用性を証明する。感受性予測のためのＳＲＣ−ＳＰ特性に基づく方法は、ＰＤＡＣ患者に由来する１２の個々の細胞株に適用された。表は、予測されたＳｒｃ阻害剤感受性と実験的に決定されたＳｒｃ阻害剤感受性との比較を示す。実施例３に記載のようにアッセイした時、デサチニブ及びサルカチニブについてのこれらの由来細胞株のＩＣ₅₀が＜１μＭである場合、腫瘍はＳｒｃ阻害剤感受性であると分類された。カットオフ：ＦＤＲ０．２：正しいクラスの予測：８３％（１０／１２）。図５は、デサチニブ及びサルカチニブに対するＰＤＡＣ由来細胞株のＩＣ₅₀値を示す。感受性予測は、方法１の免疫組織化学染色に基づいて行われた。図６は、デサチニブ及びサルカチニブに対するＰＤＡＣ由来細胞株のＩＣ₅₀値を示す。感受性予測は、感受性予測因子特性を使用する遺伝子発現に基づく方法に基づいて行われた（方法２）。図７は、行われたインビボ薬剤感受性アッセイの実験の概要を示す。図８は、未処理の腫瘍と比較した、デサチニブ単独で又はゲムシタビンと併用した場合の効果を比較しているインビボ薬剤試験からのデータを示す。デサチニブ単独は、感受性であると予測された腫瘍において腫瘍増殖を顕著に遅延させた。デサチニブとゲムシタビンの併用は感受性ＰＤＡＣにおいて腫瘍退縮を招いたが、他の２つの腫瘍では、この併用はゲムシタビン単独より顕著に良好な効果はなかった。図９は、未処理の腫瘍と比較した、デサチニブ単独で又はゲムシタビンと併用した場合の効果を比較しているインビボ薬剤試験からのデータを示す。デサチニブ単独は、感受性であると予測された腫瘍において腫瘍増殖を顕著に遅延させた。デサチニブとゲムシタビンの併用は感受性ＰＤＡＣにおいて腫瘍退縮を招いたが、他の２つの腫瘍では、この併用はゲムシタビン単独より顕著に良好な効果はなかった。図１０は、未処理の腫瘍と比較した、デサチニブ単独で又はゲムシタビンと併用した場合の効果を比較しているインビボ薬剤試験からのデータを示す。デサチニブ単独は、感受性であると予測された腫瘍において腫瘍増殖を顕著に遅延させた。デサチニブとゲムシタビンの併用は感受性ＰＤＡＣにおいて腫瘍退縮を招いたが、他の２つの腫瘍では、この併用はゲムシタビン単独より顕著に良好な効果はなかった。図１１は、ＧＳＥＡにより得られたＳｒｃ阻害剤に対する感受性を予測する特性についての、ＧＳＥＡ解析のＦＤＲ値を示す。ＧＳＥＡは、インビトロの異種移植片ＰＤＡＣモデルからの発現プロフィールについて行われた。図１２は、Ｓｒｃ阻害剤に対する、Collisson et al.により記載された３つのＰＤＡＣサブタイプのインビトロの異なる感受性を示す。細胞株は、記載されている（Collisson et al., 前掲）ように、ＰＤａｓｓｉｎｅｒを使用してＰＤＡＣサブタイプに割り当てられた。古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、他のサブタイプより有意に高い感受性（低いＩＣ₅₀値）を有する。

発明の詳細な説明
本発明は、本明細書中の以下の発明の詳細な説明及び実施例を参照することによってより容易に理解され得る。

一の態様において、本発明は、（ａ）古典的サブタイプのＰＤＡＣ、及び／又は（ｂ）Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療における使用のためのＳｒｃ阻害剤に関する。

別の態様において、本発明は、（ａ）古典的サブタイプのＰＤＡＣ、又は（ｂ）Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療であって、Ｓｒｃ阻害剤をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法に関する。

本明細書において、「Ｓｒｃ」はタンパク質（「細胞Ｓｒｃ」であるためｃ−Ｓｒｃとも呼ばれる）に関し、これは、プロト癌遺伝子ＳＲＣによりコードされるチロシンキナーゼであり、しばしば過剰発現され悪性腫瘍において高度に活性化されている。Ｓｒｃは、キナーゼファミリーのメンバーである（いわゆる「Ｓｒｃファミリー」）。このファミリーの追加のメンバーは、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ、Ｂｌｋ、Ｙｒｋ、及びｃ−Ｙｅｓである。

本明細書において、「ＰＤＡＣ」は、最も一般的なタイプの膵臓癌である膵管腺癌を指し、これは、これらの腫瘍の９５％を占め、膵臓の外分泌成分内で発生する。これは典型的には、顕微鏡検査で適度に分化しているかあまり分化していない腺構造を特徴とする。

本発明において、「膵臓癌」は、形質転換細胞に由来し、膵臓を形成する組織で発生する癌を指す。

本発明において、用語「古典的ＰＤＡＣ」は、その遺伝子発現プロファイルに基づいて、Collisson et al. (2011)により同定されたＰＤＡＣサブタイプを指す。この研究では、腫瘍試料を３つのサブタイプ（古典的、間葉系様、外分泌様）に分類することを可能にする６２−遺伝子パネルが考案された。

間葉系様ＰＤＡＣサブタイプの腫瘍は、異常な紡錘体形成を伴う豊富な有糸分裂と、大細胞質及び異形性（すなわち異常形態の）から多形性（すなわち種々の形の）の核を有する細胞とを特徴とする、あまり分化していない腫瘍を生じさせる。

古典的または外分泌様ＰＤＡＣサブタイプは、核の大きさとクロマチン構造の唯一の適度な変化を有する中程度のサイズの新生物管構造の、より分化した増殖パターンを有する腫瘍を生じさせる。

これらの３つのタイプを代表する腫瘍モデルを使用して、ケラチン８１及びビメチンは間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞のマーカーであることが証明でき、ここで、（ｉ）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１つまたはそれ以上の転写因子、（ｉｉ）ＨＮＦ−１Ａにより制御される１つまたはそれ以上の標的遺伝子、特に表２に記載されているＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び（ｉｉｉ）カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）、特にＨＮＦ−１Ａ及びＨＮＦ−１Ｂは、外分泌様サブタイプの細胞のマーカーであり、ここで、古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、（ｉ）ケラチン８１及び／又はビメチン、及び（ｉｉ）ＨＮＦ−１Ａ及び／又はＨＮＦ−１Ｂの欠如を特徴とする。

特定の実施態様において、古典的サブタイプのＰＤＡＣは、バイオマーカーであるケラチン８１とＨＮＦ−１Ａおよび／またはＨＮＦ−１Ｂ、特にケラチン８１およびＨＮＦ−１Ａの特異的な発現の欠如を測定することにより同定される。

特定の実施態様において、古典的サブタイプのＰＤＡＣは、（ｉ）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される転写因子、（ｉｉ）ＨＮＦ−１Ａにより制御される１つまたはそれ以上の標的遺伝子、特に表２に記載されているＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び（ｉｉｉ）カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）から選択される、１つまたはそれ以上の追加のバイオマーカーの特異的発現の欠如を測定することにより同定される。

本発明において、用語「特異的発現」は、１つまたはそれ以上の比較試料と比較した、試料中のンパク質又は転写体の検出を指す。５００個の解析腫瘍細胞のうちで、少なくとも１つの腫瘍細胞が非特異的対照抗体で観察されたシグナルより高いシグナルを示し、比較試料中に、試験されたマーカーの陽性シグナルが検出されない場合は、試験されたマーカーの発現は試料に対して特異的であると見なされる。

本発明では、解析のための用語「特異的な発現」は、全試料中の特定のＲＮＡ転写体の量の検出を指すことができる。ｍＲＮＡの相対量は、これを１つ又はそれ以上の適した標準物質（例えば、ハウスキーピング遺伝子ベータ−アクチンまたはＧＡＰＤＨ）と比較することによって、定量的（例えば定量ＲＴ−ＰＣＲによって）に行うことができる。あるいは、発現は、他の腫瘍試料または正常な非癌性組織と比較することによって決定することができる。転写体の相対発現が、すでに決定されたカットオフより大きい（例えば、１．５倍、２倍、５倍または１０倍）場合、発現は、その試料に対して特異的であると見なされる。

本発明において、用語「欠如」は、（前々段落に記載のように測定される）試料中のマーカー陽性腫瘍細胞の割合を指す。試料の５００個の解析した腫瘍細胞において、試験したマーカーのシグナルを有する細胞が検出されない場合、マーカーはその試料中で「欠如」していると見なされる。あるいは、（前段落に記載のように測定される）転写体のレベルがあらかじめ決定されたカットオフより小さい場合、その転写体は試料から「欠如」していると見なされる。

本発明において、用語「Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプ」は、ＧＳＥＡ−アルゴリズム（Subramanian, A., Tamayo, P., Mootha, V. K., Mukherjee, S., Ebert, B. L., Gillette, M. A., Paulovich, A., Pomeroy, S. L., Golub, T. R., Lander, E. S., and Mesirov, J. P. (2005). Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550). Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550）について入力されたような、ランク付けされた遺伝子リストを使用する遺伝子発現解析で陽性と記録される腫瘍細胞を特徴とするサブタイプを指す。本発明において、「陽性と記録される」は、０．２００未満の偽発見率（「ＦＤＲ」）を有することを意味する。

特定の実施態様において、遺伝子発現解析は、表１に示す３０遺伝子のセットを使用して、実施例４に記載されるように行われる。

本発明者らはさらに、古典的なＰＤＡＣサブタイプの細胞および間葉系様ＰＤＡＣサブタイプの特定の細胞は、Ｓｒｃの阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプに属するが、間葉系様ＰＤＡＣサブタイプの残りの細胞並びに外分泌様サブタイプの細胞は、Ｓｒｃ−阻害剤耐性（Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子陰性ＰＤＡＣサブタイプ）であることを見いだした。

特定の実施態様において本発明は、古典的サブタイプのＰＤＡＣの治療における使用のためのＳｒｃ阻害剤に関する。

特定の実施態様において本発明は、Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療における使用のためのＳｒｃ阻害剤に関する。

特定の実施態様において、Ｓｒｃ阻害剤は、ダサチニブ (Dasatinib)（ＢＭＳ−３５４８２５）、ボスチニブ (Bosutinib)（ＳＫＩ−６０６）、およびサラカチニブ (Saracatinib)（ＡＺＤ０５３０）から選択され、特にダサチニブである。

別の態様において本発明は、第二のキレート剤と組合せた、（ａ）古典的サブタイプのＰＤＡＣ、及び／又は（ｂ）Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療における使用のためのＳｒｃ阻害剤に関する。

別の態様において本発明は、（ａ）古典的サブタイプのＰＤＡＣ、又は（ｂ）Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの併用治療の方法であって、Ｓｒｃ阻害剤をこれを必要とする患者に第二のキレート剤と組合せて投与するステップを含む方法に関する。

ある実施態様において、第二の治療剤は化学療法剤である。特定の実施態様において、化学療法剤は、ゲムシタビン、フルオロウラシル（５−ＦＵまたはｆ５Ｕ）およびその誘導体、および白金化合物から選択され、特にオキサリプラチンである。特定の実施態様において、化学療法剤はゲムシタビンである。

特定の実施態様において、ＰＤＡＣは切除可能である。特定のかかる実施態様において、Ｓｒｃの阻害剤、および任意に第二の化学療法剤は、原発性癌の手術除去後に投与される。

実施例１：ＰＤＡＣサブタイプ特異的遺伝子セットの濃縮と脆弱性の評価
治療で利用できるであろうＰＤＡＣサブタイプとサブタイプ経路の濃縮を同定するために、まず遺伝子セット濃縮解析を使用して、既に記載されている（Collisson et al., 前掲）ように６２−ＧｅｎｅＰＤＡｓｓｉｇｎｅｒを使用してサブタイプを同定した。次に、安定なＰＤＡＣ細胞株の遺伝子発現プロフィールを、６７００個を超える遺伝子セットのＢｒｏａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭＳｉｇデータベースに対して比較した。７０個超の原発性ＰＤＡＣ腫瘍試料から得られたＲＮＡ発現データの２つの公に利用可能なデータセットを解析に含めた。安定なＰＤＡＣ細胞株から、ｍｉＲＮＡｅａｓｙキット（Qiagen, Hilden）を用いて総ＲＮＡを単離した。Illumina BeadChip Technologyを使用して、遺伝子発現解析を行った（ＨｕｍａｎＨＴ−１２）。標準化した（normalized）データについての遺伝子セット濃縮解析を、既に記載されている（Subramanian et al.、前掲）ように行った。

低いＦＤＲ比率で示される２つの公に入手可能なデータセットと比較した、関連遺伝子セットの検出と、公のデータセットの１つのみにおける特性の存在の検出とにおいて、安定なＰＤＡＣ細胞株由来の特性は、より高感度で強固であった。この解析は、古典的サブタイプにおいて濃縮されていたＳｒｃ／Ｂｃｒ−Ａｂｌ阻害剤であるデサチニブに対する感受性を予測する遺伝子セットを明らかにし、一方、逆に他の２つのサブタイプではより高い耐性が予測された。

実施例２：インビトロ薬剤スクリーニング
予測されたサブタイプ特異的経路依存性と薬剤感受性に基づいて、サブタイプ特異的薬剤を発見するためのインビトロスクリーニングを行った。遺伝子発現解析により同定される経路を標的化するために選択される化合物を用いて、小スケール阻害スクリーニングをまとめた。選択された化合物を、すべての安定なＰＤＡＣ細胞株について試験した。９６ウェルプレート中の８，０００細胞／ウェルを１０μＭの化合物とインキュベートした。７２時間後、Cell Titer Blue（Promega, Mannheim）を使用して細胞増殖を測定した。生の測定値をＺ値に変換し、プレート中に均一に分布している陽性対照と陰性対照とを使用して、増殖阻害パーセントを算出した。

ゲムシタビンは、Sigmaから得た。すべての残りの化合物は、Enzo Life Sciences (Farmingdale) から得た。１００ｍＭのストック濃度を、水を含まないＤＭＳＯ中で調製した。ゲムシタビンは１ｍＭで無菌緩衝化食塩水に溶解した。

スクリーニングにより、デサチニブに対する古典的サブタイプの予測される感受性が確認された。より正確な薬剤感受性プロフィールを得るために、これらの標的化物質を使用して、安定な細胞株を用量増加試験に供した。ＩＣ₅₀の計算のために、選択された化合物の３倍連続希釈物を４重測定で７２時間インキュベートしてスクリーニングし、次に、細胞生存能力を、既に記載されているようにCellTiterBlueを使用して評価した。各個体個々のプレート上に存在する陽性対照と陰性対照に対して生のデータを標準化して、GraphPad Prism (Graph Pad Software, La Jolla)を使用してＩＣ₅₀値を計算した。

示差的感受性を、インビトロで確認した。外分泌様ＰＤＡＣ細胞と間葉系様ＰＤＡＣ細胞の両方とも、デサニニブに対して比較的耐性であり、古典的サブタイプは１０，０００倍超低いＩＣ₅₀値を示し、これは、治療関連範囲である。

実施例３：インビトロのＩＣ ₅₀ 値の測定
ＩＣ₅₀の計算のために、選択された化合物の連続希釈物を４重測定でスクリーニングした。簡潔には、９６ウェルプレートに個々の化合物を添加する２４時間前に、８０００細胞／ウェルを接種した。７２時間インキュベート後、既に記載されているようにCellTiterBlue (Promega, Mannheim) を使用して細胞生存能力を評価した。生データは、各個々のプレート上に存在する陽性対照と陰性対照に対して標準化した。GraphPad Prism (Graph Pad Software, La Jolla)を使用してＩＣ₅₀値を計算した。デサチニブとサラカチニブはLC Laboratories, (Woburn)から得た。１００ｍＭのストック濃度は、水を含まないＤＭＳＯ中で調製した。

実施例４：ｍＲＮＡ発現を使用するＳｒｃ−阻害剤感受性の予測
ＰＤＡＣ細胞株又は腫瘍異種移植片からmiRNAeasy kit (Qiagen, Hilden)を使用して総ＲＮＡを単離した。遺伝子発現解析をIllumina BeadChip Technology（ＨｕｍａｎＨＴ−１２）を用いて行った。その関連するシグナル強度を有する遺伝子の生じるリストを、クオンタイル（quantile）標準化を使用して標準化し、ＧＳＥＡアルゴリズムの入力として使用した（Subramanian et al.、前掲）。標準化は方法の感度と特異性とを上昇させるが、ＧＳＥＡはまた、あらかじめ標準化を行わなくてもうまく行うこともできる。各リストを、図３に記載した感度予測因子特性（ＳＲＣ−ＳＰ）に対して別々に比較した。ＦＤＲカットオフ値０．２００は、試料をＳｒｃ−阻害剤感受性又は耐性に正確に分類するのに最適であると測定された。ＦＤＲ＜０．２００を与える試料は感受性であると予測され、一方ＦＤＲ＞０．２００は耐性を予測する。

実施例５：インビボ薬剤スクリーニング
ダサチニブに対する腫瘍の示差的応答を、ヒトＰＤＡＣのサブタイプ特異的マウスモデルでさらに検討した。感受性サブタイプ又は耐性サブタイプのいずれかの移植されたヒト腫瘍をそれぞれが担持する３群のマウスを、ダサチニブ単独で又は化学療法剤ゲムシタビンと併用して治療した。

コホート２０ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ（ＮＳＧ）マウスの皮下に、５×１０⁵個の細胞を注入することによってＰＡＣＯ腫瘍を樹立した。腫瘍が約２００ｍｍ³のサイズに達した後、マウスを各１０匹の２群（対照、ゲムシタビン、デサチニブ、又はこれらの併用）に無作為化した。ゲムシタビンを０．８％緩衝化食塩水に溶解させ、週に２回１２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。デサチニブはクエン酸塩／クエン酸緩衝液（ｐＨ３）で調製し、毎日２５ｍｇ／ｋｇを強制経口投与した。腫瘍の体積は、週に２回キャリパー測定値から決定し、式（長さ×高さ×幅）×（π／６）に従って計算した。実験の開示時に計算された体積に対して、個々の腫瘍について相対腫瘍増殖を計算した。すべての動物の飼育と手順は、ドイツの法的規制に従い、政府の審査委員会（Baden-Wuerttemberg, Germany）によりあらかじめ認可された。

実験スキームの概要は図８〜１０に示される。腫瘍サイズは、治療の開始日に対して標準化した相対体積として表される。示したように、単独で使用される場合、デサチニブは、古典的サブタイプの腫瘍にのみ有意な増殖阻害効果を有した。ゲムシタビン単独はすべての３つのサブタイプの腫瘍に対して増殖阻害効果を示したが、腫瘍増殖の完全な停止には至らなかった。ダサチニブをゲムシタビンと組み合わせて使用した時、元の腫瘍サイズと比較してサイズの低下は、古典的サブタイプの腫瘍でのみ観察され、併用した場合は、ゲムシタビン単独より大きな効果は無く、外分泌様サブタイプにおいては腫瘍増殖を上昇さえさせた。

実施例６：免疫組織化学法による腫瘍サブタイプの測定
ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料（３μｍ〜５μｍの切片）を脱パラフィン化し、そして再水和した。ｐＨ６（Dako標的回収溶液、Dako, Glostrup）の蒸気釜中で１５分間沸騰させて抗原を回収し、３０分間放冷し、蒸留水で洗浄した。Linaris アビジン／ビオチンブロッキングキット (Vector Labs, Burlingame) を製造業者の説明書に従って使用して、非特異結合をブロックした。スライドを一次抗体と３０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％ツイーン２０を有するＰＢＳ）で洗浄し、Dako REAL Detection Systemを使用して適切な二次抗体と２０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ストレプトアビジンＨＲＰとインキュベーション（室温で２０分間）した後、スライドをＡＥＣ（Dako）で発色させ、ヘマトキシリンで対染色した。染色は、２つの別々の切片に、又は１つの切片上の２つの別々の領域に、それぞれＨＮＦ−１およびケラチン８１について行った。

染色の評価：サブタイプの割り当てのための染色の評価では、腫瘍細胞のみが考慮される。各試料について５００個の腫瘍細胞が評価される。観察されたシグナルが、比較可能な試料上でのアイソタイプ対照抗体で観察されるバックグランド染色と明確に区別できる場合には、シグナルは陽性と見なされる。少なくとも１つの腫瘍細胞が明らかに検出可能な細胞内シグナルを示す場合、試料はケラチン８１について陽性と見なされる。腫瘍細胞の少なくとも１つが明らかに検出可能な核染色を示す場合、試料はＨＮＦ−１について陽性と見なされる。サブタイプは以下のように測定される：
ケラチン８１陽性／ＨＮＦ−１陰性：間葉系様サブタイプ
ケラチン８１陰性／ＨＮＦ−１陽性：外分泌様サブタイプ
ケラチン８１陰性／ＨＮＦ−１陰性：古典的サブタイプ
ケラチン８１陽性／ＨＮＦ−１陽性：未定

実施例７：組織マイクロアレイ中のマーカー発現と患者生存の相関
サブタイプ特異的な治療手法と組合せた患者の層別化はますます重要になってきており、すでにいくつかのタイプの癌で治療の有効性を改善することが証明されている。しかしこれまで、ＰＤＡＣ患者を臨床的に意味のある群に層別化する試みは、まちまちの結果を与えている（Stathis, A., and Moore, M. J. (2010). Advanced pancreatic carcinoma: current treatment and future challenges. Nat Rev Clin Oncol 7, 163-172）。これは、単一のマーカーによる手法を複雑にする、少なくとも３つのサブタイプの存在に一部起因しているかも知れない。２つのマーカーのセットでは、ＰＡＣＯモデルですべての３つのＰＤＡＣサブタイプを明確に特定することができる。２５８人のＰＤＡＣ患者のコホートへのこれらのマーカーの適用は、非重複染色を確認しており、患者群に適用された時の我々の２つのマーカーセットの頑強性を示唆している。これは、我々が患者の大きなコホートを３つの群［ＨＮＦ１Ａ／Ｂ陽性（外分泌様）、ケラチン８１（ＫＲＴ８１）陽性（ＱＭ−ＰＤＡ）、及び２重陰性（古典的）］に層別化することを可能にした。我々は、３群間で全体的生存率の有意差を見いだした。ＫＲＴ８１陽性患者は最悪の予後（平均ＯＳ＝１６．５ヶ月）を有し、ＨＮＦ−１Ａ／Ｂ陽性患者は最良の結果（平均ＯＳ＝４３．５ヶ月）を有し、２重陰性患者は中間の結果（平均ＯＳ＝２６．３ヶ月）を有していた。従って我々のマーカーは、ＰＤＡＣ患者の臨床的に意味のある層別化を初めて可能にし、容易に日常的な診断に取り込むことができ、ＰＤＡＣ患者の層別化が、現在の及び新規治療法の指針となる可能性を提供することができる。

Charite大学病院ベルリンで１９９１年〜２００６年の間にＰＤＡＣのための部分的な膵頭十二指腸切除術を受けた患者から、組織マイクロアレイを構築した。バイオマーカー解析のためのこの腫瘍コホートの使用は、Charite大学倫理委員会（ＥＡ１／０６／２００４）によって承認されている。患者の特徴は、図４に要約されている。

既に記載されている（Weichert, W., Roske, A., Gekeler, V., Beckers, T., Ebert, M. P., Pross, M., Dietel, M., Denkert, C., and Rocken, C. (2008). Association of patterns of class I histone deacetylase expression with patient prognosis in gastric cancer: a retrospective analysis. The lancet oncology 9, 139-148）ように、ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織試料を使用して、組織マイクロアレイを作成した。簡単に説明すると、パラフィンの「ドナー」ブロックの３つの形態学的に代表的な領域が選択された。各組織から、これらの領域を代表する直径０．６ｍｍの３つの組織円柱を打ち抜き、特注の機器（Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA）を使用して、新しい「受容者」パラフィンブロックに正確に配列した。

表１：ＳＲＣ−ＳＰ予測因子に含まれる遺伝子のリスト。表１は、Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子ＳＲＣ−ＳＰで使用された３０の遺伝子を示す（実施例４を参照）。遺伝子リストは、新規なＰＤＡＣ細胞株に由来する遺伝子発現パターンからまとめられた。Ｓｒｃ阻害剤感受性と耐性ＰＤＡＣ細胞株間で最も高い示差的発現を示した３０の遺伝子を、分類に含めた。

Claims

古典的サブタイプのＰＤＡＣ、及び／又はＳｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療における使用のためのＳｒｃ阻害剤。
古典的サブタイプのＰＤＡＣ、又はＳｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療方法であって、Ｓｒｃ阻害剤をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法。
（ａ）古典的サブタイプのＰＤＡＣ、及び／又は（ｂ）Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療における使用のためのＳｒｃ阻害剤であって、第二の化学治療剤と併用される、前記Ｓｒｃ阻害剤。
（ａ）古典的サブタイプのＰＤＡＣ、又は（ｂ）Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療のための併用治療方法であって、それを必要とする患者にＳｒｃ阻害剤を第二の治療剤と組み合わせて投与するステップを含む、前記方法。
前記第二の治療剤が化学治療剤であって、特に、ゲムシタビン、フルオロウラシルおよびそれらの誘導体、並びに白金化合物、特にオキサリプラチンからなる群から選択される化学治療剤である、請求項３に記載のＳｒｃ阻害剤、又は請求項４に記載の方法。
前記治療が古典的サブタイプのＰＤＡＣの治療である、請求項１、３及び５のいずれか１項に記載のＳｒｃ阻害剤、又は請求項２、４及び５のいずれか１項に記載の方法。
前記治療がＳｒｃ阻害剤感受性予測因子が陽性であるＰＤＡＣサブタイプの治療である、請求項１、３及び５のいずれか１項に記載のＳｒｃ阻害剤、又は請求項２、４及び５のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｓｒｃ阻害剤が、ダサチニブ、ボスチニブ及びサラカチニブから選択され、特にダサチニブである、請求項１、３及び５〜７のいずれか１項に記載のＳｒｃ阻害剤、又は請求項２、４及び５〜７のいずれか１項に記載の方法。