JP2015532092A

JP2015532092A - 幹細胞増殖を活性化し、および負の影響に対する幹細胞の耐性を向上させる方法。

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Publication number: JP2015532092A
Application number: JP2015534426A
Authority: JP
Inventors: エレナウラディミロヴナオルロヴァ; エフゲニーイリチマエフスキー; ウラディミールコンスタンチノヴィッチクラブコフ
Original assignee: エレナウラディミロヴナオルロヴァ; エフゲニーイリチマエフスキー; ウラディミールコンスタンチノヴィッチクラブコフ; ゼリスコアレクセイパブロヴィッチ
Priority date: 2012-10-02
Filing date: 2012-10-02
Publication date: 2015-11-09
Also published as: WO2014054959A1; US20150315563A1; KR20150054949A; AU2012391527A1; AU2012391527B2

Abstract

本発明は、バイオテクノロジー、医薬、薬理学、細胞生物学、および生物工学の分野に関するものであり、様々な分化段階の幹細胞および前駆細胞ならびに様々な組織の有糸分裂後の成熟細胞を利用する生物学および医薬の他部門においても利用可能であり、特にヒトおよび／または動物のドナーまたは自己免疫性幹細胞から生体移植片を急速発達させるために利用できる。本発明が目的とする技術的成果は、幹細胞増殖の活性化ならびにヒトおよび動物の幹細胞の負の影響に対する耐性の向上であり、高周波電磁界の負の影響とは無関係である。技術的成果は、細胞培養物を弱い低周波数磁界で処理することにより達成される。提案する方法は、以下を特徴とする：１）．ヒト幹細胞を、代表的には所定の細胞の培養物が倍加する期間の半期、例えば２４時間、弱い磁界に曝してから培養すると、細胞数が増加し、細胞数の増加は、２．５倍を超える（無処置の細胞でかかる倍加の全長期間に等しい４８時間の培養で）。２）．ＳＱＵＩＤ型磁力計で測定されるとおりの幹細胞の初代培養物の自己磁気照射の振幅の拡大、このことは、培養物の活動の活発化を示す。３．ヒト幹細胞を、代表的には所定の細胞の培養物が倍加する期間の半期、弱い磁界に曝すと、それらは、アポトーシスの発現という面で２倍安定化し、主に細胞周期のＧ１相で同調する。３）．ヒト幹細胞を、代表的には所定の細胞の培養物が倍加する期間の半期、弱い磁界に曝すと、それらは、アポトーシスの発現という面で安定性が２倍向上し、主に細胞周期のＧ１相で同調する。【選択図】なし

Description

本発明は、バイオテクノロジー、医薬、薬理学、細胞生物学、および生物工学の分野に関するものであり、様々な分化段階の幹細胞および前駆細胞ならびに様々な組織の有糸分裂後の成熟細胞を利用する生物学および医薬の他部門においても利用可能であり、特にヒトおよび／または動物のドナーまたは自己免疫性幹細胞から生体移植片を急速発達させるために利用できる。

提案する方法は、幹細胞増殖を活性化することならびにヒトおよび動物組織の負の影響に対する幹細胞の耐性を向上させることを目的とする。

現在、様々な方法で植物および動物の細胞に生物物理学的影響を与える多数の技術的手段が存在する（ロシア特許第２３３２８４１号、２００８年９月１０日出願；ロシア特許第２３１４８４４号、２００８年１月２０日出願；ロシア特許第２１７４８５０号、２００１年１０月２０日出願；ロシア特許第２０４９５０１号、１９９５年１２月１０日出願；ロシア特許第２１５８１４７号、２０００年１０月２７日出願）（特許文献１〜５）。上記の発明全てに共通する一般的な欠点は、影響を与える期間（３日以上）、方法が多段階からなること、および生体材料への影響が極度な負荷を伴うことである。

本発明の方法に最も近いのは、ロシア特許第２４０５５９９号（２０１０年１２月１０日出願）（特許文献６）である。特許文献６の方法は、生物対象に、測定量のパラメーターで外部から電磁界を照射することを含む。照射は、生きている生命体において、赤色骨髄の解剖学的部位の領域に、エネルギー流の表面密度が範囲０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ^２であり、変調周波数変化範囲４〜１０Ｈｚで振幅変調した、範囲３５〜８０ＧＨｚの超高周波の電磁照射により行われる。エネルギー流密度は、０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ^２である。この方法は、生命体において赤色骨髄細胞の増殖および分化のプロセスを同時刺激することで、赤色骨髄の幹細胞発達の活性化を提供する。

この発明の欠点は、ＧＨｚ周波数の電磁照射が、生物学的対象にとって、特に、幹細胞の核タンパク質に保存されている遺伝情報を保有している生物学的対象にとって危険な影響を与えることである。幹細胞の核タンパク質に保存されている遺伝情報は、他の細胞と異なり厳密に保存されている。

ロシア特許第２３３２８４１号ロシア特許第２３１４８４４号ロシア特許第２１７４８５０号ロシア特許第２０４９５０１号ロシア特許第２１５８１４７号ロシア特許第２４０５５９９号

Ｖ．Ｖ．Ｌｅｄｎｙｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒｅｍｅｌｙｗｅａｋａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｔａｒｇｅｔｓ．Ｉｎｔｈｅｂｏｏｋ：Ｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆｇｅｏ−ｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．２００３，１３０−１３６Ｅ．Ｖ．Ｏｒｌｏｖａ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｔｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎｐａｒｔｉｃｕｌａｒｉｔｉｅｓｏｆｃｅｌｌｆａｔｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｓｉｎｍｉｔｏｔｉｃｓｐｉｎｄｌｅｓｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｎｉｃｈｅｃｏｍｐｌｅｘ．ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｍａｇａｚｉｎｅＭｅｄｌｉｎｅ．ｒｕ，２００９，ｐ．１０．ｐ．１１３−１２６ＣｒｏｏｐＪＭ１９９３．Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：１−３２

本発明が目的とする技術的成果は、高周波電磁界の負の影響を伴わない、幹細胞増殖の活性化ならびにヒトおよび動物の幹細胞の負の影響に対する耐性の向上である。

この技術的成果は、細胞培養物を低周波磁界で処理することにより達成される。提案する方法は、作用因子を特徴とする。この作用因子は、地球の磁界と共線的である弱い交番磁界であり、一方、磁気誘導Ｂおよび周波数ｆは、Ｖ．Ｖ．Ｌｅｄｎｙｅｖが提唱する式により決定される（Ｖ．Ｖ．Ｌｅｄｎｙｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒｅｍｅｌｙｗｅａｋａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｔａｒｇｅｔｓ．Ｉｎｔｈｅｂｏｏｋ：Ｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆｇｅｏ−ｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．２００３，１３０−１３６）（非特許文献１）
В＝В_ＤＣ＋Ｂ_ＡＣｃｏｓ２ｆｔ、
式中、В_ＤＣおよびＢ_ＡＣは、それぞれ、恒久的な（地球の磁界による）磁気誘導の値であって、磁界の可変要素であり（磁界発生装置により設定される）、ｆは、可変要素の周波数である。また、細胞中のСа^２＋イオンが共振することが既知である交番磁界の周波数ｆは、ｆ＝２５〜４２Ｈｚの範囲から選択された。

本発明で使用する低周波数磁界は、共振および破壊性を特徴とせず、張力値が地球の磁界に匹敵するとともに地球の磁界と共線的である。

本方法の技術的成果が達成されたことは、提案する方法に基づき照射されたヒト幹細胞が、多数の細胞内プロセスを活性化させること、具体的には、細胞膜の分極、全細胞の双極子モーメントの変化、中心小体倍加プロセスの活性化（加速）、ならびに紡錘体配向の変化および幹細胞因子の構造的および機能的変化を特徴とするという事実によって証明され［Ｅ．Ｖ．Ｏｒｌｏｖａ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｔｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎｐａｒｔｉｃｕｌａｒｉｔｉｅｓｏｆｃｅｌｌｆａｔｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｓｉｎｍｉｔｏｔｉｃｓｐｉｎｄｌｅｓｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｎｉｃｈｅｃｏｍｐｌｅｘ．ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｍａｇａｚｉｎｅＭｅｄｌｉｎｅ．ｒｕ，２００９，ｐ．１０．ｐ．１１３−１２６］（非特許文献２）、これらの活動の組み合わせは、幹細胞の分化の方向を定めるとともに、定めた方向での増殖を加速させる。

ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に、交番磁界（Ｂ_ＡＣ＝８９．４ｍｃＴｌ；周波数ｆ＝３７．１Ｈｚ）を、細胞維持温度３７℃で２４時間（倍加の標準期間の半期）照射する（А−酸化環境下、明茶色）と、低周波数磁界の影響を与えずに処理した細胞（Ｂ−条件環境下、α−ＭＥＭの標準色を有する）と比較して、細胞数が増加することを示す。ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に、交番磁界（Ｂ_ＡＣ＝８９．４ｍｃＴｌ；周波数ｆ＝３７．１Ｈｚ）を、細胞維持温度３７℃で２４時間（倍加の標準期間の半期）照射する（А−酸化環境下、明茶色）と、低周波数磁界の影響を与えずに処理した細胞（Ｂ−条件環境下、α−ＭＥＭの標準色を有する）と比較して、細胞数が増加することを示す。提案する方法に従って処理した幹細胞培養物のフローサイトメトリーの結果を示す。А−対照、Ｂ−提案する方法で処理した後の培養物。提案する方法に従って処理した幹細胞培養物のフローサイトメトリーの結果を示す。А−対照、Ｂ−提案する方法で処理した後の培養物。電気泳動およびＰＣＲ産物の結果を示す。電気泳動およびＰＣＲ産物の結果を示す。電気泳動およびＰＣＲ産物の結果を示す。

ヒト脂肪（「Ｂｉｏｌｏｔ」社、ＳＰｂ）から単離した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）で、実験を行った。これらの細胞の倍加期間は、最初は、約４８時間であった。第３世代の細胞を採取して、これらの細胞にとって標準のα−МЕМ培地を含むТ_２５培養フラスコに入れた。以下の実験を行った：実験細胞および対照細胞は、それぞれ、２００，０００個／ｍｌで用いた。

実験中、地球の静磁界（В_ＤＣ＝４８．６ｍｃＴｌ）をなんとか測定し；および磁化システムの助けを借りて、交番磁界を以下のとおり設定した：上述した式に基づき、Ｂ_ＡＣ＝８９．４ｍｃＴｌ；周波数ｆ＝３７．１Ｈｚ、地磁界と共線的である：
В＝В_ＤＣ＋Ｂ_ＡＣｃｏｓ２ｆｔ（式中、Ｂ_ＡＣ［Ｔｌ］外部磁界の大きさ；ｆ［Ｈｚ］外部磁界の周波数）；照射時間２４時間、細胞維持温度３７℃。

記載される実験では、細胞を、最大密度近くまで増殖した極限条件下の実験細胞に混ぜた。そのような条件下での顕微鏡観察から、樹状シュートの数が減少することおよび細胞がカラム内に整列することという効果が明らかになり、この所見は、細胞が線維芽細胞に分化していくための支度を初めて視覚的に明らかにするものである（すなわち、作り出された負の条件が存在し、その条件は、処理した細胞により、幹細胞の特徴が失われる可能性を、増加させるものである）。弱磁界に２４時間曝露（СО_２インキュベーターの外で、рН環境の安定化を行わずに）させると、細胞の樹状シュートの数が幹細胞の所定培養物の標準の基礎レベルよりも増加することが明らかになった、すなわち樹状突起の最大分岐形成および細胞拡散が、酸化された環境であっても存在した（図１Ａ）。この実験では、細胞数が２．８倍に増加した、すなわち、標準的ではない培養条件にも関わらず、培養物の増殖が加速した（図１）。

このように、選択した範囲での低周波磁界を上記の初期値とともに用いて細胞を処理すると、ヒト幹細胞の培養物増殖を２．８倍加速するだけでなく、ｐＨの負への移動の影響を最小限にすることで、増殖および分化の支援にもなる。言い換えると、この与えられた系は、その系自身の安定化を選択する（系（細胞）のエンタルピーが最少になる）ためのある種の条件を実現し、その結果、系の自発的障害（例えば、最適ではない処理体制により引き起こされるもの）も最少化される。超伝導量子干渉計（ＳＱＵＩＤ）により記録された幹細胞初代培養物の自己照射の振幅の増加は、それらの活動の亢進を証明する。

図２からわかるとおり、処理された幹細胞は、アポトーシスから受ける影響が少なくなり、細胞周期の段階間の移行をより同調して起こす。

本発明者らは、ヒト幹細胞が倍加するときの半分の期間中、交番磁界で増殖を活性化した後の、そのような細胞培養物の特徴となる、遺伝子発現の結果も分析した。本発明者らは、細胞周期制御、増殖、分化プロセス、および細胞死に関与する遺伝子発現を調べるため、対照細胞および実験細胞で、以下のｍＲＮＡのレベルを比較した：サイクリンＤ１（公式記号：ＣＣＮＤ１）、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）、ｐ２１／ｗａｆ（ＣＤＫＮ１Ａ）、ＥｒｂＢ３（ＥＲＢＢ３）、ｋｉ６７（ＭＫＩ６７）、ＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１）、ｐ１６（ＣＤＫＮ２Ａ）、ｐ２７／ｋｉｐ（ＣＤＫＮ１Ｂ）、ＹＢ１（ＹＢＸ１）、ｂａｘ（ＢＡＸ）、ｂａｋ（ＢＡＫ１）、ｂｃｌＸＬ（ＢＣＬ２Ｌ１）、ｂｃｌ２（ＢＣＬ２）、ｆｏｓ（ＦＯＳ）、ｍｙｃ（ＭＹＣ）、ｒａｓ（ＨＲＡＳ１）、ｂａｇ（ＢＡＧ１）。

全ＲＮＡ単離。分析用に、対照細胞および実験細胞の懸濁液（約１０〜１２×１０^６）を用意した。細胞を、４０００ｇで１０分間遠心した。細胞ペレットを、溶解液（４Ｍのイソチオシアン酸グアニジン、０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム、０．５％のサルコシル、０．１Ｍのメルカプトエタノール含有）２ｍｌに再懸濁させた。次いで、ｐＨが４．４の１Ｍの酢酸ナトリウムを１／１０の量で加えた。撹拌してから、同体積のフェノール（水で平衡化したもの）および１．５倍体積のクロロホルムおよびイソアミルアルコール（２４：１）を加えた。混合物を、ボルテックスし、８±２℃で１５分間インキュベートした。次に、試験管を、スイングバケットローターに入れて、冷却しながら４０００ｇで２０分間遠心した。上相を、別の試験管に移した。これに、同体積のフェノール／クロロホルム（２：１）を加えて、ボルテックスし、再び４０００ｇで２０分間遠心した。上相に、同体積のイソプロピルアルコールを加え、−２０℃で一晩静置した。次いで、４０００ｇで２０分間遠心し、（ペレットを８０％エタノールで洗い、水１００ｍｃｌに溶解させて、ピロ炭酸ジエチルで処理した。ＲＮＡ溶液に、１／２０体積の４ＭのＬｉＣｌおよび２倍体積のエタノールを加えた。単離したＲＮＡは、−２０℃で貯蔵した。単離したＲＮＡの濃度は、Ｓｍａｒｔｓｐｅｃｐｌｕｓスペクトロフォトメーター（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。

逆転写反応。エチルアルコールに沈んだＲＮＡペレット（１０ｍｇ）を、８０％エタノール１ｍｌで洗い、水１２．ｍｃｌ．に溶解させた。試験管に、１０ｍＭのオリゴｄＴを１ｍｃｌ加え、７０℃で５分間インキュベートした。氷上で５分間冷却してから、混合物を室温に１５分間放置した。次いで、逆転写用に、５×緩衝液を４ｍｃｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰを２ｍｃｌ、逆転写酵素ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を１ｍｃｌ加えた。反応は、４２℃で１時間行った。試料は、−２０℃で貯蔵した。

ポリメラーゼ連鎖反応法：
調べる遺伝子の増幅は、以下の成分の混合物中：
１０×Ｔａｑ緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）−２ｍｃｌ
２５ｍＭのＭｇＣｌ_２−１．６ｍｃｌ１０ｍＭのｄＮＴＰ−０．４ｍｃｌ１０ｍＭのプライマー１−０．２ｍｃｌ１０ｍＭのプライマー２−０．２ｍｃｌＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／ｍｃｌ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）−１ｍｃｌ
ＤＮＡ（逆転写産物）３ｍｃｌ
水−１．６ｍｃｌ
以下の条件下：

ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒグラジエント機能搭載増幅器（エッペンドルフ）にて、行った。

ＰＣＲを行うためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび条件の選択は、プログラムＯｌｉｇｏ４．０を用いて行った。ＰＣＲを行うため、以下のプライマーを用いた：
サイクリンＤ１５’ＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＴＧＣＧＡＧＧ３’
サイクリンＤ２５’ＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＧＧＴＧＴＡＧＡＴＧＣＡ３’
サイクリンＥ１５’ＡＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧ３’
サイクリンＥ２５’ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＴＧ３’
Ｐ２１１５’ＣＴＴＣＧＧＣＣＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧ３’
Ｐ２１２５’ＣＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＣ３’
ＥｒｂＢ１５’ＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＣ３’
ＥｒＢ２５’ＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＧＡＧＧ３’
Ｋｉ６７１５’ＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧ３’
Ｋｉ６７２５’ＣＡＴＴＴＴＣＡＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＡＴＣＡＡＴＡＡ３’
ＭＤＲ１５’ＴＴＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＡＡＡＴＴＧＧＣ３’
ＭＤＲ２５’ＧＴＴＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＴＴＣＣＴＧＣ３’
Ｐ１６１５’ＣＣＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＡＧＡＡＣ３’
Ｐ１６２５’ＣＣＴＡＧＡＣＧＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣ３’
Ｐ２７１５’ＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣ３’
Ｐ２７２５’ＧＧＣＡＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＧ３’
ＹＢ１５’ＴＣＣＣＡＣＣＴＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＣ３’
ＹＢ２５’ＴＡＧＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧ３’
Ｂｃｌ２１５’ＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣ３’
Ｂｃｌ２２５’ＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＡ３’
Ｂａｘ１５’ＴＴＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧ３’
Ｂａｘ２５’ＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＣＧＧＧＧＧＧＡＧＴＣ３’
Ｂａｋ１５’ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧＧＣＡＡＧＧ３’
Ｂａｋ２５’ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＣＴＣＡＴＡＧＧＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣＣＧ３’
ＢｃｌＸ１５’ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧ３’
ＢｃｌＸ２５’ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＧＣＴＧＴＣＣＣ３’
Ｂａｇ１５’ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧ３’
Ｂａｇ２５’ＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＧＣＣＡＴＧＧ３’
Ｆｏｓ１５’ＡＧＡＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＧ３’
Ｆｏｓ２５’ＡＡＧＴＣＡＴＣＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＧＴＣＴＴＣＡ３’
Ｍｙｃ１５’ＡＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＴＡ３’
Ｍｙｃ２５’ＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＡＡ３’
Ｒａｓ１５’ＧＡＣＧＡＡＴＡＴＧＡＣＣＣＣＡＣＡＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣ３’
Ｒａｓ２５’ＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＧＣ３’

試料中に等量の核酸が含まれていることを確認するため、アクチン遺伝子を関連プライマーで増幅することを利用した：
アクチン１ＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧアクチン２ＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧ

ＰＣＲ産物の電気泳動および定量化。ＰＣＲ反応産物を、６％ポリアクリルアミドゲル（組成：１．４ｍｌの３０％ＡＡ溶液、１．４ｍｌの５×ＴＢＥ緩衝液、４．２ｍｌの蒸留水、３０ｍｃｌの１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、２０ｍｃｌのＴＥＭＥＤ）に添加し、１×ＴＢＥ緩衝液（０．０８９Ｍのトリス、０．０８９Ｍのホウ酸、０．００２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中、２０ｍＡで４０分間分離させた。溶液を臭化エチジウム（１ｍｇ／ｍｌ）で染色してから、ゲルを撮影し、ＴｏｔａｌＬａｂＶ２．０１．ｖを用いて、標準試料と比較して定量化した。この目的のため、相補ＤＮＡを既知濃度で含む標準試料を、ポリアクリルアミドゲル上で滴定した。ゲルをスキャンしてから、ＴｏｔａｌＬａｂＶ２．０１．ｖを用いて、各バンドの強度を定量測定した。次いで、試験した増幅産物の相対量を規定する検量線を引いた。

対照細胞（１）および実験細胞（２）について図３（Ａ）に示す結果の定量から、以下の遺伝子のｍＲＮＡ量に変化が観測された：
ｋｉ６７−４倍に増加；
ｐ２７−２倍に増加；
ｂａｘ−１．５倍に増加；
ｂｃｌＸ−１．５倍に増加；
ｂｃｌ２−２倍に増加；
ｆｏｓ−２倍に増加；
ｂａｇ−１．７倍に増加。

すなわち、抗アポトーシス性遺伝子の活性化は、アポトーシス促進性遺伝子（ｂａｘ）よりも明らかであるが、アポトーシスタンパク質ＢａｘおよびＢａｋが、抗アポトーシス性タンパク質（例えば、ＢｃｌＸおよびＢｃｌ２）とのアポトーシス集合体を安定的に阻止し得ることを考慮しなくてはならない。

そのうえさらに、実験細胞では、ｍＲＮＡ遺伝子であるＭＤＲおよびｂａｋの合成が示された（図３Ｂを参照）。ＭＤＲの発現増加は、哺乳類細胞培養物の薬剤耐性と関係する［ＣｒｏｏｐＪＭ１９９３．Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：１−３２］（非特許文献３）。

この実験では、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ｐ２１（ＷＡＦ）、ＥｒｂＢ３、ｐ１６、ＹＢ１、ｍｙｃ、ｒａｓの遺伝子発現は、変わらないままであり（図３Ｃを参照）、このことは、上記のとおりに活性化された幹細胞に、腫瘍細胞へと形質転換する能力がないことを示す（もしそのような可能性があれば、上記系列のサイクリンの活性化が起こる）。

したがって、技術的成果の達成が証明される：
１．ヒト幹細胞を、代表的には所定の細胞の培養物が倍加する期間の半期、例えば２４時間、弱い磁界に曝してから培養すると、細胞数が増加し、細胞数の増加は、２．５倍を超える（無処置の細胞でかかる倍加の全長期間に等しい４８時間の培養で）。
２．ＳＱＵＩＤ型磁力計で測定されるとおりの幹細胞の初代培養物の自己磁気照射の振幅の拡大、このことは、培養物の活動の活発化を示す。
３．ヒト幹細胞を、代表的には所定の細胞の培養物が倍加する期間の半期、弱い磁界に曝すと、それらは、アポトーシスの発現という面で２倍安定化し、主に細胞周期のＧ１相で同調する。

Claims

処理した幹細胞の増殖を活性化させ、かつ負の影響に対する耐性を向上させる方法であって、該幹細胞への交番磁界の影響を示唆するものであり、該交番磁界が地球の磁界と共線でかけられている事実を特徴とする、方法。
前記交番磁界は、２５〜４２Ｈｚの範囲内に設定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記交番磁界の振幅は、地球の磁界の規模に匹敵するものであり、該振幅は７５〜１１０ｍｃＴｌの範囲内に設定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法