JP2015529219A - Ｕｂｅ２ｔペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents

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Abstract

がんに対するペプチドワクチンを本明細書に記載する。特に、ＣＴＬを誘起するＵＢＥ２Ｔに由来するエピトープペプチドを提供する。そのようなペプチドを標的とする単離されたＣＴＬおよびＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞、ならびに抗原提示細胞またはＣＴＬを誘導するための方法も提供する。本発明はさらに、ＵＢＥ２Ｔに由来するそのようなエピトープペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む薬学的組成物を提供する。さらに、本発明は、ＵＢＥ２Ｔに由来するエピトープペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくは該ペプチドを提示する抗原提示細胞、または本発明の薬学的組成物を使用して、がん（腫瘍）を治療および／もしくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）（すなわち、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ））する、ならびに／または術後のその再発を予防するための方法、ならびにＣＴＬを誘導するための方法、抗腫瘍免疫を誘導するための方法を提供する。

Description

本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん療法の分野に関する。特に本発明は、がんワクチンとして有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬物に関する。
優先権
本出願は、２０１２年９月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／６９９，５５０号の恩典を主張し、その全体の内容が参照により本明細書に組み入れられる。
ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、主として免疫学的アプローチによって発見されている（非特許文献１、非特許文献２）。これらのＴＡＡのうちのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
好ましいＴＡＡは、がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡである。そのようなＴＡＡを免疫療法の標的として用いることにより、療法によって誘発される免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、突然変異、または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳述されているリスクが最小限に抑えられ得る。したがって、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、進行中の様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる開発およびひいては臨床応用が保証される（非特許文献３〜非特許文献１０）。現在までに、これらのＴＡＡ由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながら、これらのがんワクチンの治験においては低い客観的奏効率しか観察されていない（非特許文献１１〜非特許文献１３）。したがって、免疫療法の標的としての新規ＴＡＡが依然として必要とされている。
ＵＢＥ２Ｔ（ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｔ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２Ｔ）：典型的アミノ酸配列は、配列番号：６５に示す；典型的ヌクレオチド配列は、配列番号：６４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４１７６）に示す）は、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）の一つである。ＵＢＥ２Ｔは、ヒト線維芽細胞においてその発現が血清刺激によって上方制御される遺伝子の一つであることが報告された（非特許文献１４）。ファンコニ貧血経路において、ＵＢＥ２Ｔは、ＦＡＮＣＬと結合し、ＦＡＮＣＤ２のＤＮＡ損傷誘発モノユビキチン化に欠かせない（非特許文献１５、非特許文献１６）。最近の研究では、ＵＢＥ２Ｔは乳がんにおいて高頻度で上方制御され、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメインタンパク質（ＢＡＲＤ１）複合体（ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＩＮＧ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）と相互作用して共局在することが見出された。これらの研究でのノーザンブロッティング解析により、ＵＢＥ２Ｔの転写物が、乳がん細胞株において、かなり高いレベルで検出されるが、重要器官においてはほとんど検出されないことが明らかになった。さらに、がん細胞株におけるｓｉＲＮＡによる内因性ＵＢＥ２Ｔのノックダウンは、これら細胞株の増殖を有意に抑制することが示された（特許文献１、特許文献２、非特許文献１７）。
WO2005/029067 WO2009/001562
Boon T, Int J Cancer 1993, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004, 10(9): 909-15 Iyer VR et al., Science 1999, 283: 83-7 Machida YJ et al., Mol Cell 2006, 23: 589-96 Alpi A et al., Mol Cell Biol 2007, 27: 8421-30 Ueki T et.al., Cancer Res. 2009, 69: 8752-60
本発明は、免疫療法の適切な標的として役立つ可能性のある新規ペプチドの発見に少なくとも一部基づいている。ＴＡＡは一般に免疫系によって「自己」として認識され、そのため多くの場合は自然免疫原性を有しないため、適切な標的の発見は依然として極めて重要である。
そのため、本発明は、少なくとも部分的には、ＵＢＥ２Ｔ由来のペプチドの中でＵＢＥ２Ｔ特異的ＣＴＬを誘導する能力を有する特異的エピトープペプチドの同定を対象としている。
本明細書に開示された結果は、同定されたペプチドが、ＵＢＥ２Ｔを発現する細胞に対して、強力かつ特異的な免疫応答を誘導することができる、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることを実証する。
したがって、インビトロ、エクスビボもしくはインビボでＣＴＬを誘導するために用いることができ、またはがん、その例には、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍が含まれるがこれらに限定されないがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与するために用いることができるＵＢＥ２Ｔ由来ペプチドを提供することは本発明の１つの目的である。好ましいペプチドは、ノナペプチドおよびデカペプチドであり、より好ましくは、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するノナペプチドおよびデカペプチドである。これらのうち、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが特に好ましい。
本発明はまた、得られる改変ペプチドが元の未改変ペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有する改変ペプチドも企図する。１つの態様において、元のペプチドが９ｍｅｒ（配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、２９、３０、３２、３６、３８および４１）の場合、改変ペプチドのサイズは、好ましくは９〜４０アミノ酸の範囲、例えば９〜２０アミノ酸の範囲、例えば９〜１５アミノ酸の範囲である。同様に、元のペプチドが１０ｍｅｒ（配列番号：１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８）の場合、改変ペプチドのサイズは、好ましくは１０〜４０アミノ酸の範囲、例えば１０〜２０アミノ酸の範囲、例えば１０〜１５アミノ酸の範囲である。
本発明はさらに、本発明のペプチドのいずれか１種をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含する。これらのポリヌクレオチドは、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導または調製するために使用され得る。本発明のペプチドと同様に、そのようなＡＰＣはがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与され得る。
対象に投与された場合、本発明のペプチドは、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するように、ＡＰＣの表面上に提示され得る。したがって、本発明の１つの目的は、本発明の１種もしくは複数種のペプチドもしくはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む剤または組成物を提供することである。剤または組成物はＣＴＬを誘導するために使用され得る。そのような剤または組成物は、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその転移もしくは術後のその再発の予防に用いることができる。本発明によって企図されるがんの例には、限定されないが、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍が含まれる。
本発明はさらに、本発明の１種または複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物または剤を企図する。薬学的組成物は、好ましくはがんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその転移もしくは術後のその再発の予防における使用のために製剤化される。本発明のペプチドもしくはポリヌクレオチドの代わりにまたはそれに加えて、本発明の薬学的剤または組成物は、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣおよび／またはエクソソームを有効成分として含み得る。
本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、対象由来のＡＰＣを本発明のペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することにより、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と本発明のペプチドとの複合体を表面上に提示するＡＰＣを誘導するために用いることができる。そのようなＡＰＣは、標的ペプチドをその表面上に提示する細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導する能力を有し、がん免疫療法に有用である。したがって、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法、ならびにそのような方法によって得られるＡＰＣを包含する。
加えて、本発明はまた、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための剤または組成物を包含し、そのような剤または組成物は、本発明のいずれかのペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
ＣＴＬを誘導するための方法を提供することは本発明のさらなる目的であり、そのような方法は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエクソソームと共培養する段階、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドもしくはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを導入する段階であって、該ＴＣＲは、細胞表面上に提示された本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することができる、段階を含む。そのような方法によって得られるＣＴＬは、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍を例に含むがこれらに限定されないがんの治療および／または予防において用いられ得る。したがって、本発明はまた、上記に記載の方法によって得られたＣＴＬも包含する。
ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明はさらに、本発明のペプチドを標的とする単離されたＣＴＬを提供する。そのようなＣＴＬはまた、細胞表面上の本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識することができる（または、に結合することができる）ＣＴＬとしても定義され得る。これらのＡＰＣおよびＣＴＬは、がん免疫療法に用いることができる。
必要とする対象において、がんに対する免疫応答を誘導するための方法を提供することは、本発明のさらに別の目的であり、そのような方法は、本発明のペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチド、それを提示するＡＰＣまたはエクソソーム、および本発明のペプチドをその表面上に提示する細胞を認識することができるＣＴＬの中から選択された少なくとも１つの成分を含む剤または組成物を対象に投与する段階を含む。
本発明の１つの局面は、医薬として使用するための、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドを含む組成物に関する。
本発明の適用性は、これらに限定はされないが、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍を例に含むがんのような、ＵＢＥ２Ｔの過剰発現に関連する、またはＵＢＥ２Ｔの過剰発現から生じる多数の疾患のいずれにも及ぶ。
さらに具体的には、本発明は以下を提供する：
［１］以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含む、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチド：
（ａ）ＵＢＥ２Ｔの免疫学的活性断片のアミノ酸配列；
（ｂ）ＵＢＥ２Ｔの免疫学的活性断片のアミノ酸配列において、１個、２個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加されているアミノ酸配列、
該ペプチドによって誘導されるＣＴＬは、ＵＢＥ２Ｔ由来の断片を提示する細胞に対して特異的な細胞傷害活性を有する；
［２］以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含む、［１］に記載のペプチド：
（ａ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、２個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加されているアミノ酸配列；
改変ペプチドのサイズは、好ましくは９〜４０アミノ酸の範囲（例えば９〜２０アミノ酸の範囲）であり、例えば９〜１５アミノ酸の範囲である；
［３］以下の（ｉ）または（ｉｉ）のオリゴペプチドである、［２］に記載のペプチド：
（ｉ）以下の特徴の一方もしくは両方を有するペプチド：
（ａ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくは２７のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンもしくはトリプトファンで置換されている；および
（ｂ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくは２７のアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンで置換されている；
（ｉｉ）以下の特徴の一方もしくは両方を有するペプチド：
（ａ）配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６もしくは５８のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンもしくはメチオニンで置換されている；および
（ｂ）配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６もしくは５８のアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸が、バリンもしくはロイシンで置換されている；
［４］ノナペプチドまたはデカペプチドである、［１］から［３］のいずれか一項に記載のペプチド；
［５］配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、［４］に記載のペプチド；
［６］［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；
［７］以下からなる群より選択される少なくとも１種の有効成分を含む、ＣＴＬを誘導するための組成物：
（ａ）［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチド；
（ｂ）［６］に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；および
（ｄ）［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；
［８］がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、以下からなる群より選択される少なくとも１種の有効成分を含む薬学的組成物：
（ａ）［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチド；
（ｂ）［６］に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；および
（ｅ）［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドを提示する細胞を認識することができるＣＴＬ；
［９］ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象に投与するために製剤化される、［８］に記載の薬学的組成物；
［１０］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣを、［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドと接触させる段階、および
（ｂ）［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階；
［１１］以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［５］のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と［１］〜［５］のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエクソソームと共培養する段階；および
（ｃ）ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、該サブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上の［１］〜［５］のいずれか一項に記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することができる、段階；
［１２］ＨＬＡ抗原と［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ；
［１３］［１０］に記載の方法によって誘導される、［１２］に記載のＡＰＣ；
［１４］［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ；
［１５］［１１］に記載の方法によって誘導される、［１４］に記載のＣＴＬ；
［１６］［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、がんに対する免疫応答を対象において誘導する方法；
［１７］［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的活性断片；
［１８］［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター；
好ましくは、ベクターは、該ペプチドの発現に適したベクター（発現ベクターと称される）であり、例えば、コードヌクレオチド配列が、プロモーター配列のベクター下流に挿入され、かつ該プロモーター配列に動作可能に連結されている。「動作可能に連結される」という用語は、ヌクレオチド配列が、インビトロまたはベクターが導入される宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現が許容されるように、プロモーター配列（制御配列）に連結されていることを意味することを意図する；
［１９］［１８］に記載のベクターまたは本明細書に記載の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞；
［２０］［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチド、［６］に記載のポリヌクレオチド、または［１７］に記載の抗体もしくはその免疫学的活性断片を含む、診断キット；ならびに
［２１］ＵＢＥ２Ｔ由来の断片を提示する細胞に対して特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導する能力を有するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（ｉ）元のアミノ酸配列に対して１個、２個または数個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入および／または付加することによって改変されたアミノ酸配列からなる候補配列を提供する段階であって、該元のアミノ酸配列は、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択される、段階；
（ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔ以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも実質的に有意な相同性（または配列同一性）を有さない候補配列を選択する段階；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で選択された候補配列からなるペプチドを抗原提示細胞と接触させる段階；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）の抗原提示細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞と接触させる段階；および
（ｖ）ＣＴＬ誘導能が、元のアミノ酸配列からなるペプチドと同じであるかまたはそれよりも高いペプチドを特定する段階。
［２２］［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチドを含む薬学的組成物。
［２３］医薬として使用するための［１］から［５］のいずれか一項に記載のペプチド。
［２４］医薬として使用するための［６］に記載のポリヌクレオチドまたは［１８］に記載のベクター。
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
図１−１は、ＵＢＥ２Ｔ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるインターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイの結果を示す、一連の写真（ａ）〜（ｌ）から構成される。ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）で刺激したウェル番号＃８（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）で刺激したウェル番号＃１（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３３（配列番号：４）で刺激したウェル番号＃６（ｃ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３８（配列番号：６）で刺激したウェル番号＃６（ｄ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４３（配列番号：１１）で刺激したウェル番号＃４（ｅ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０６（配列番号：１２）で刺激したウェル番号＃２（ｆ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）で刺激したウェル番号＃６（ｇ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０５（配列番号：１５）で刺激したウェル番号＃３（ｈ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３０（配列番号：１７）で刺激したウェル番号＃２（ｉ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３１（配列番号：１９）で刺激したウェル番号＃１（ｊ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３３（配列番号：２０）で刺激したウェル番号＃３（ｋ）、およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−９９（配列番号：２１）で刺激したウェル番号＃６（ｌ）におけるＣＴＬはそれぞれ、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの写真のウェル上の四角は、対応するウェルからの細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示す。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１２４（配列番号：３）で刺激したＣＴＬからは、特異的ＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｒ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
図１−２は、ＵＢＥ２Ｔ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるインターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイの結果を示す、一連の写真（ｍ）〜（ｒ）から構成される。ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１５４（配列番号：２２）で刺激したウェル番号＃７（ｍ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１０５（配列番号：２３）で刺激したウェル番号＃８（ｎ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１１５（配列番号:２４）で刺激したウェル番号＃１（ｏ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１７７（配列番号：２５）で刺激したウェル番号＃４（ｐ）、およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−４４（配列番号：２７）で刺激したウェル番号＃７（ｑ）におけるＣＴＬはそれぞれ、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの写真のウェル上の四角は、対応するウェルからの細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示す。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１２４（配列番号：３）で刺激したＣＴＬからは、特異的ＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｒ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
図２−１は、ＵＢＥ２Ｔ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す、一連の写真（ａ）〜（ｌ）から構成される。ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）で刺激したウェル番号＃４（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−３０（配列番号：３０）で刺激したウェル番号＃５（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０６（配列番号：３２）で刺激したウェル番号＃７（ｃ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−４９（配列番号：３６）で刺激したウェル番号＃５（ｄ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）で刺激したウェル番号＃３（ｅ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３２（配列番号：４１）で刺激したウェル番号＃４（ｆ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）で刺激したウェル番号＃６（ｇ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−６（配列番号：４９）で刺激したウェル番号＃７（ｈ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０６（配列番号：５１）で刺激したウェル番号＃８（ｉ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）で刺激したウェル番号＃２（ｊ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３０（配列番号：５３）で刺激したウェル番号＃１（ｋ）、およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）で刺激したウェル番号＃８（ｌ）におけるＣＴＬはそれぞれ、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの写真のウェル上の四角は、対応するウェルからの細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示す。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１６１（配列番号：２８）で刺激したＣＴＬからは、特異的ＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｏ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
図２−２は、ＵＢＥ２Ｔ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す、一連の写真（ｍ）〜（ｏ）から構成される。ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−２９（配列番号：５６）で刺激したウェル番号＃５（ｍ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３８（配列番号：５８）で刺激したウェル番号＃３（ｎ）におけるＣＴＬはそれぞれ、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。これらの写真のウェル上の四角は、対応するウェルからの細胞を、ＣＴＬ株を樹立するために増殖させたことを示す。対照的に、典型的な陰性データの例として、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１６１（配列番号：２８）で刺激したＣＴＬからは、特異的ＩＦＮ−γ産生が認められなかった（ｏ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
図３は、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）（ｃ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−４４（配列番号：２７）（ｄ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｄ）から構成される。ＣＴＬが産生したＩＦＮ−γの量はＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。結果は、それぞれのペプチドでの刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証する。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は、応答細胞（ＣＴＬ株）および刺激細胞の数の比を示す。
図４は、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）（ｂ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）（ｃ）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈によって樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｃ）から構成される。結果は、それぞれのペプチドでの刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証する。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は、応答細胞（ＣＴＬクローン）および刺激細胞の数の比を示す。
図５は、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）（ｃ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）（ｄ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）（ｅ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｅ）から構成される。ＣＴＬが産生したＩＦＮ−γの量はＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、それぞれのペプチドでの刺激によって樹立されたＣＴＬ株が、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証する。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は、応答細胞（ＣＴＬ株）および刺激細胞の数の比を示す。
図６は、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）（ｃ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）（ｄ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）（ｅ）で刺激したＣＴＬ株からの限界希釈によって樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｅ）から構成される。結果は、それぞれのペプチドでの刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証する。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。Ｒ／Ｓ比は、応答細胞（ＣＴＬクローン）および刺激細胞の数の比を示す。
図７は、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２または全長ＵＢＥ２Ｔ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）を用いて樹立されたＣＴＬクローンは、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２（三角）またはＵＢＥ２Ｔ（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
図８は、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１または全長ＵＢＥ２Ｔ遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）を用いて樹立されたＣＴＬ株は、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。一方、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角）またはＵＢＥ２Ｔ（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のいかなる方法および材料も用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、これらの記載が説明のものにすぎず、限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことも理解されるべきである。さらに、本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図しない。
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する権利を与えられないと承認するものとしては解釈されるべきではない。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例証するためのものであり、限定することは意図しない。
Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に別段の指定のない限り「少なくとも１つ」を意味する。
物質（例えばペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して使用する「単離された」および「精製された」という用語は、該物質が、そうでなければ天然源中に含まれ得る少なくとも１種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製されたペプチドは、細胞材料、例えば糖質、脂質、またはペプチドが由来する細胞もしくは組織源からの他の混入タンパク質を実質的に含まないかまたは化学合成される場合には化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないペプチドを指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ペプチドが、それが単離された細胞または組換え産生された細胞の細胞成分から分離されたペプチドの調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないペプチドは、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量ベースで）未満の異種タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも称する）を有するポリペプチドの調製物を含む。ペプチドを組換え産生する場合、ペプチドは、好ましくは、培養培地も実質的に含まず、培養培地をペプチド調製物の容量の約２０％、１０％、または５％未満で有するペプチドの調製物を含む。ペプチドを化学合成によって生成する場合、ペプチドは、好ましくは、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、ペプチドの合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質をペプチド調製物の容量の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量ベースで）未満で有するペプチドの調製物を含む。特定のペプチド調製物が単離または精製されたペプチドを含むことは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後の単一バンドの出現によって示すことができる。好ましい態様において、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離または精製される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であり得るか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であり得るアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書で用いる「オリゴペプチド」という用語は、２０アミノ酸残基またはそれ未満、典型的には１５アミノ酸残基またはそれ未満のアミノ酸残基から構成されるペプチドを指す。本明細書で用いられるように、「ノナペプチド」という用語は９アミノ酸残基から構成されるペプチドを指し、「デカペプチド」という用語は１０アミノ酸残基から構成されるペプチドを指す。
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸はＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれであってもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記で記載されてもよい。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、一般に受け入れられている１文字コードで記載される。
「剤」および「組成物」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を指す。そのような用語は、修飾語「薬学的」（「薬学的剤」および「薬学的組成物」におけるように）に関連して使用される場合には、有効成分および担体を構成する非活性成分を含む生成物、ならびに任意の２つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、１つもしくは複数の成分の解離から、または１つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から、直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明との関連において、「薬学的剤」および「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と薬学的または生理学的に許容される担体を混合することによって生成された任意の生成物を指す。
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的活性または生理的活性のある、剤または組成物中の物質を指す。特に、薬学的な剤または組成物との関連において、「有効成分」という用語は、目的の薬理学的効果を示す物質を指す。例えば、がんの治療または予防に用いるための薬学的な剤または組成物の場合、剤または組成物中の有効成分は、がん細胞および／または組織に対して直接的または間接的に、少なくとも１つの生物学的作用または生理的作用をもたらし得る。好ましくは、そのような作用には、がん細胞増殖を減少させることまたは阻害すること、がん細胞および／またはがん組織を損傷または殺傷することなどが含まれ得る。典型的には、有効成分の間接的効果は、がん細胞を認識または殺傷することができるＣＴＬの誘導である。製剤化される前には、「有効成分」は「バルク」、「原薬」、または「原体」とも称することができる。
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、および封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質または媒体を意味する。
いくつかの態様において、本発明の薬学的剤または組成物は、特にワクチンとして用いられる。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という用語は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を改善、増強および／または誘導する機能を有する剤または組成物を指す。
別段の定めのない限り、「がん」という用語は、ＵＢＥ２Ｔ遺伝子を過剰発現するがんまたは腫瘍を指し、その例には、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
別段の定めのない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「ＨＬＡ−Ａ２４」という用語は、典型的には、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊２４０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊２４０３、ＨＬＡ−Ａ＊２４０４、ＨＬＡ−Ａ＊２４０７、ＨＬＡ−Ａ＊２４０８、ＨＬＡ−Ａ＊２４２０、ＨＬＡ−Ａ＊２４２５およびＨＬＡ−Ａ＊２４８８が含まれるが、これらに限定されないサブタイプを指す。
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的には、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、ＨＬＡ−Ａ＊０２０５、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２１０、ＨＬＡ−Ａ＊０２１１、ＨＬＡ−Ａ＊０２１３、ＨＬＡ−Ａ＊０２１６、ＨＬＡ−Ａ＊０２１８、ＨＬＡ−Ａ＊０２１９、ＨＬＡ−Ａ＊０２２８およびＨＬＡ−Ａ＊０２５０が含まれるが、これらに限定されないサブタイプを指す。
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「キット」という用語は、試薬と他の材料との組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または材料の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
対象または患者との関連において、本明細書で用いる「対象の（または患者の）ＨＬＡ抗原はＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である」という語句は、対象または患者がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原遺伝子をホモ接合的またはヘテロ接合的に保有し、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原が対象または患者の細胞においてＨＬＡ抗原として発現していることを指す。
本発明の方法および組成物ががんの「治療」との関連において有用である限り、治療が、対象におけるがんの大きさ、広がり、または転移能の減少、生存期間の延長、術後再発の抑制などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」と見なされる。
治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、がんの形成が遅延されるもしくは妨げられるか、またはがんの臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の腫瘍の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。
本発明の方法および組成物ががんの「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」との関連において有用である限り、そのような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的療法を含み得る。
本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害、術後のがんの再発の抑制、ならびに生存期間の延長などの事象をもたらすいかなる活動も含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減または安定した疾患を含む。
本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において抗体は広義で使用され、具体的には完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を示す。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。
ＩＩ．ペプチド
以下に詳細に記載する本発明のペプチドは、「ＵＢＥ２Ｔペプチド」または「ＵＢＥ２Ｔポリペプチド」と称される場合もある。
ＵＢＥ２Ｔ由来のペプチドがＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＵＢＥ２Ｔ（配列番号：６５）由来のペプチドを解析して、それらが、一般的に見られるＨＬＡアリルであるＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２（Ｄａｔｅ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７：９３−１０１，１９９６；Ｋｏｎｄｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：４３０７−１２，１９９５；Ｋｕｂｏ ＲＴ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：３９１３−２４，１９９４）によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した。
ＵＢＥ２Ｔ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２４に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下の候補ペプチドを同定した:配列番号：１、２および４から２７。
さらに、これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した：ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３３（配列番号：４）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３８（配列番号：６）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４３（配列番号：１１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０６（配列番号：１２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０５（配列番号：１５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３０（配列番号：１７）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３１（配列番号：１９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３３（配列番号：２０）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−９９（配列番号：２１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１５４（配列番号：２２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１０５（配列番号：２３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１１５（配列番号：２４）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１７７（配列番号：２５）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−４４（配列番号：２７）。
ＵＢＥ２Ｔ由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下の候補ペプチドを同定した：配列番号：２９から６３。
さらに、これらのペプチドをパルスした（負荷した）樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬの樹立に成功した：ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−３０（配列番号：３０）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０６（配列番号：３２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−４９（配列番号：３６）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３２（配列番号：４１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−６（配列番号：４９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０６（配列番号：５１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３０（配列番号：５３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−２９（配列番号：５６）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３８（配列番号：５８）。
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書におけるこれらの結果は、ＵＢＥ２ＴがＣＴＬによって認識される抗原であること、および上記のペプチドがＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２によって拘束されるＵＢＥ２Ｔのエピトープペプチドであることを実証している。
したがって、好ましい態様において、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７のアミノ酸配列を有するペプチドは、誘導前にＨＬＡ−Ａ２４を有すると同定された対象においてＣＴＬを誘導するために使用され得る。同様に、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列を有するペプチドは、誘導前にＨＬＡ−Ａ２を有すると同定された対象においてＣＴＬを誘導するために使用され得る。
ＵＢＥ２Ｔ遺伝子は、例えば膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍を含むがん細胞およびがん組織において過剰発現され、ほとんどの正常器官においては発現されないため、免疫療法の優れた標的となる。したがって、本発明は、ＵＢＥ２Ｔ由来のＣＴＬ認識エピトープに対応するノナペプチド（９個のアミノ酸残基から構成されるペプチド）およびデカペプチド（１０個のアミノ酸残基から構成されるペプチド）を提供する。あるいは、本発明は、ＣＴＬを誘導することができるペプチドであって、ＵＢＥ２Ｔの免疫学的活性断片から構成される、単離されたペプチドを提供する。いくつかの態様において、本発明は、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。好ましい態様において、本発明のペプチドは、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中から選択されるアミノ酸配列を含むノナペプチドまたはデカペプチドである。本発明のペプチドの好ましい例として、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
本発明のペプチド、特に本発明のノナペプチドおよびデカペプチドは、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。具体的な付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するペプチド、特にＵＢＥ２Ｔ由来のペプチド（例えば、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列を含むペプチド）を包含する。そのようなペプチドは、例えば、約４０アミノ酸未満であり、多くの場合は約２０アミノ酸未満であり、通常は約１５アミノ酸未満である。より具体的には、そのようなペプチドのサイズは、好ましくは１０〜４０アミノ酸の範囲（例えば１０〜２０アミノ酸の範囲）であり、例えば１０〜１５アミノ酸の範囲である。
一般的に、ペプチドにおける１個、２個、または数個のアミノ酸の改変はペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のペプチドの所望の機能を増強することさえあることが知られている。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、付加、欠失、および／または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物学的活性を保持することが知られている（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８４，８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９８２，１０：６４８７−５００；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８２，７９：６４０９−１３）。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ１個、２個、または数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されている、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有する。言い換えると、元のペプチドのＣＴＬ誘導能を改変ペプチドが保持するという条件で、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能と、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列との両方を有する。
当業者は、単一のアミノ酸またはアミノ酸配列全体のわずかな割合を変更する、アミノ酸配列に対する個々の改変（すなわち、欠失、挿入、付加および／または置換）が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。したがって、それらは慣例的に「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により、元のタンパク質と類似の機能を有するタンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存することが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば：疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９８４を参照されたい）。
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドとみなされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元の未改変ペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＵＢＥ２Ｔの多型変異体、種間相同体、およびアリル由来のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除すべきではない。
より高い結合親和性を達成するために、本発明のペプチドに対してアミノ酸残基を挿入、置換、および／または付加してもよく、あるいは本発明のペプチドからアミノ酸残基を欠失させてもよい。必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、当業者は好ましくは少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸のみを改変（すなわち、欠失、挿入、付加および／または置換）する。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個、３個、またはそれ未満を意味する。改変されるアミノ酸の割合は、例えば３０％またはそれ未満、好ましくは２０％またはそれ未満、より好ましくは１５％またはそれ未満、さらにより好ましくは１０％またはそれ未満、例えば１〜５％であり得る。
がん免疫療法との関連で用いられる場合、本発明のペプチドは、ＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエクソソームの表面上に提示され得る。したがって、ＣＴＬを誘導するだけでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を保有するペプチドを選択することが好ましい。その目的のために、ペプチドをアミノ酸残基の置換、挿入、欠失および／または付加によって改変して、ＨＬＡ抗原に対する改善された結合親和性を有する改変ペプチドを生じさせることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（Ｋｕｂｏ ＲＴ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４，１５２：３９１３−２４；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ＨＧ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９５，４１：１７８−２２８；Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４，１５５：４３０７−１２；Ｆａｌｋ Ｋ， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９１ Ｍａｙ ２３；３５１（６３２４）：２９０−６．）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入してもよい。
例えば、高いＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を保有するペプチドは、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはトリプトファンで置換されたＮ末端から２番目のアミノ酸を有する傾向がある。同様に、Ｃ末端アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、またはメチオニンで置換されたペプチドも高いＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を保有する傾向がある。したがって、ＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を高めるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸を、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンもしくはトリプトファンで置換されている、および／またはＣ末端がロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンで置換されている、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明に包含される。同様に、本発明は、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７において１個、２個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであって、（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンもしくはトリプトファンである；および（ｂ）Ｃ末端アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンである、との特徴の一方または両方を有するペプチドを包含する。好ましい態様において、本発明のペプチドは、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７のアミノ酸配列においてＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されている、および／またはＣ末端アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンもしくはメチオニンで置換されているアミノ酸配列を含む。
同様に、高いＨＬＡ−Ａ２結合親和性を保有するペプチドは、ロイシンもしくはメチオニンで置換されたＮ末端から２番目のアミノ酸および／またはバリンもしくはロイシンで置換されたＣ末端のアミノ酸を有する傾向がある。したがって、ＨＬＡ−Ａ２結合親和性を高めるために、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシンもしくはメチオニンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をバリンもしくはロイシンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明に包含される。同様に、本発明は、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８において１個、２個または数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであって、（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンである、および（ｂ）Ｃ末端アミノ酸がバリンもしくはロイシンである、との特徴の一方または両方を有するペプチドを包含する。好ましい態様において、本発明のペプチドは、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＣ末端アミノ酸がバリンもしくはロイシンで置換されているアミノ酸配列を含む。
末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）またはｇｐ１００（２０９−２１７）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元のものと同等であるかまたはより優れた機能を有し得ることを実証している（Ｚａｒｅｍｂａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，４５７０−４５７７，１９９７、Ｈｏｆｆｍａｎｎ ＴＫ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）；１６８（３）：１３３８−４７．，Ｄｉｏｎｎｅ ＳＯ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００３）５２：１９９−２０６、およびＤｉｏｎｎｅ ＳＯ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２００４）５３，３０７−３１４）。
本発明はまた、１個、２個または数個のアミノ酸の付加を本発明のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に対する付加とし得ることも企図する。ＣＴＬ誘導能を有するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
例えば、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む１５、１４、１３、１２、１１、または１０未満のアミノ酸長の単離されたペプチドを提供する：
（ｉ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列、
（ｉｉ）以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉ）のアミノ酸配列：
（ａ）前記配列番号のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそのアミノ酸であるように改変されている、ならびに
（ｂ）前記配列番号のＣ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそのアミノ酸であるように改変されている、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号：２９、３０、３２、３６、３８および４１からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列、
（ｉｖ）以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉｉｉ）のアミノ酸配列：
（ａ）前記配列番号のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそのアミノ酸であるように改変されている、ならびに
（ｂ）前記配列番号のＣ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそのアミノ酸であるように改変されている。
さらに本発明はまた、ＣＴＬ誘導能を有し、かつ以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む１５、１４、１３、１２、または１１未満のアミノ酸長の単離されたペプチドも提供する：
（ｉ'）配列番号：１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列、
（ｉｉ'）以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉ'）のアミノ酸配列：
（ａ）前記配列番号のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそのアミノ酸であるように改変されている、ならびに
（ｂ）前記配列番号のＣ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそのアミノ酸であるように改変されている。
（ｉｉｉ'）配列番号：４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１個、２個、または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列、
（ｉｖ'）以下の特徴の一方または両方を有する、（ｉｉｉ'）のアミノ酸配列：
（ａ）前記配列番号のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそのアミノ酸であるように改変されている、ならびに
（ｂ）前記配列番号のＣ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であるか、またはそのアミノ酸であるように改変されている。
これらのペプチドは、これらのペプチドをＡＰＣと接触させ、またはＡＰＣに導入した場合、ＡＰＣにおいてプロセッシングされてＡＰＣ上に（ｉ）から（ｉｖ）および（ｉ'）から（ｉｖ'）からなる群より選択されるペプチドが提示される。
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて最初に相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドでさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を全く伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるために、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、効果的であると予測されるが、高い結合親和性の存在を指標として選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の有無についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ＡＰＣを試験ペプチドで刺激した後、ＡＰＣをＣＤ８陽性Ｔ細胞と混合してＣＴＬを誘導し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００， ６１（８）：７６４−７９，Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｂｏｏｋｓ，Ｌｉｎｋｏｕｔ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ａ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ＤＲ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ： ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ（Ｈ）ｒｅｓｐｏｎｓｅに記載されているもの）を用いることができる。あるいは、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射活性からＣＴＬの細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有する細胞の存在下で、ＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。
上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが、元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、より好ましくは、必要なＨＬＡ結合能を保持する限り、他のペプチドに連結させることもできる。「他の」適切なペプチドの例には、本発明のペプチドまたは他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれる。本発明のペプチドは、直接的またはリンカーを介して間接的に「別の」ペプチドに連結させることができる。ペプチド間リンカーは当技術分野で周知であり、例えばＡＡＹ（Ｄａｆｔａｒｉａｎ ＰＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ２００７，５：２６）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ ＲＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，１６５：７３０８−７３１５）、またはＫ（Ｏｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ Ｒｅｓ．６２，１４７１−１４７６、Ｋａｗａｍｕｒａ ＫＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，１６８：５７０９−５７１５）を含む。
上記の連結ペプチドを本明細書では「ポリトープ」と称し、これはすなわち、様々な配置（例えば、連鎖状、重複）で一緒に連結され得る、２つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性または免疫応答刺激性ペプチドの群である。ポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）を標準的な免疫化プロトコールで例えば動物に投与して、免疫応答の促進、増強、および／または誘発における該ポリトープの有効性を試験することができる。
ペプチドを直接的にまたは隣接配列の使用により連結して、ポリトープを形成することができ、ポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２（１３）：５８４５−５８４９，１９９５；Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１２）：１２８０−１２８４，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（２）：８２２−８２６，１９９６； Ｔａｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １７１（１）：２９９−３０６，１９９０を参照されたい）。様々な数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製することができ、ＣＴＬによる認識について、および免疫応答の増大における有効性について試験することができる。
本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが、元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。好適な物質の例には、例えば：ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。このような種類の修飾は、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与するために、またはペプチドを安定化するために実施することができる。
例えば、ペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のペプチドに対して適合することもできる。ペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ １９８６，１１：２９１−３０２を参照されたい）。
さらに、上述したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基により置換、欠失、挿入および／または付加されている改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。例示的方法は以下の段階を含む：
ａ：本発明のペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入および／または付加する段階、
ｂ：段階ａで改変されたペプチドの活性を測定する段階、および
ｃ：元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
好ましくは、アッセイされるペプチドの活性は、ＣＴＬ誘導能である。
好ましい態様において、本発明は、ＵＢＥ２Ｔ由来の断片を提示する細胞に対して特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導するための能力を有するペプチドのスクリーニングの方法を提供し、その方法は以下の段階を含む：
（ｉ）元のアミノ酸配列に対して、１個、２個または数個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入および／または付加することによって改変されたアミノ酸配列からなる候補配列を提供する段階であって、元のアミノ酸配列は、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択される、段階；
（ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔ以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも実質的に有意な相同性（または配列同一性）を有さない候補配列を選択する段階；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）において選択された候補配列からなるペプチドを抗原提示細胞と接触させる段階；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）の抗原提示細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞と接触させる段階；および
（ｖ）ＣＴＬ誘導能が、元のアミノ酸配列からなるペプチドと同じであるかまたはそれよりも高いペプチドを特定する段階。
ＩＩＩ．ＵＢＥ２Ｔペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後、ペプチドを単離、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、１個または複数個のＤ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の組み込みが含まれる。
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、該合成に採用され得る従来のペプチド合成法には、以下のものが含まれる：
（ｉ）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；
（ｉｉ）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）、丸善、１９７５；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）、丸善、１９８５；
（ｖ）医薬品の開発 続第１４巻（ペプチド合成）（日本語）、広川書店、１９９１；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Ｂａｒａｎｙ Ｇ．＆Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｖｏｌ．２，"Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，１００−１１８。
あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を採用して、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｊ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９７７，１３２：３４９−５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．）１９８３，１０１：３４７−６２）。例えば、最初に、目的のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。そのようなベクターおよび宿主細胞もまた、本発明によって提供される。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を採用して、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然ＵＢＥ２Ｔ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４１７６（配列番号：６４））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に表されている。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。当技術分野において周知の通り、ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適切に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。当業者は、非天然塩基もまたポリヌクレオチドに含まれ得ることを認識する。
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってもよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによって本発明のポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、本発明のポリヌクレオチドを増幅することもできる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）。あるいは、Ｂｅａｕｃａｇｅ ＳＬ ＆ Ｉｙｅｒ ＲＰ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８：２２２３−３１１；Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １９８４，３：８０１−５に記載されている固相技法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを合成することもできる。
Ｖ．エクソソーム
本発明はさらに、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成される複合体を自身の表面上に提示する、エクソソームと称される細胞内小胞を提供する。エクソソームは、例えば公表特許公報特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエクソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ＊２４０２ならびにＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６が広く一般的であり、したがってこれらは日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現するＨＬＡ−Ａ２４型またはＨＬＡ−Ａ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊０２０６などのサブタイプもまた使用される。典型的には、臨床において、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを得るために、天然のＵＢＥ２Ｔ部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加を行うことができる。
本発明のエクソソームに対してＨＬＡ−Ａ２４型のＨＬＡ抗原を用いる場合、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが特に有用である。
あるいは、本発明のエクソソームに対してＨＬＡ−Ａ２型のＨＬＡ抗原を用いる場合、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが特に有用である。
いくつかの態様において、本発明のエクソソームは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体を自身の表面上に提示する。典型的な態様において、本発明のエクソソームは、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）と、ＨＬＡ−Ａ２４との複合体を自身の表面上に提示する。他の態様において、本発明のエクソソームは、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）と、ＨＬＡ−Ａ２との複合体を自身の表面上に提示する。
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間で形成される複合体を自身の表面上に提示する単離された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してもよく、単独で、または本発明のペプチド、エクソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして適している。
例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって、本発明のＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エクソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。段階ｂによって得られるＡＰＣは、限定されないが、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍などのがんを治療および／または予防するためのワクチンとして製剤化および投与することができる。
本発明との関連において、抗原提示細胞を誘導し得る薬学的組成物を製造するために本発明のペプチドを利用することができる。本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供し、該方法は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む。
本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドの使用を提供する。
本発明の一局面によれば、本発明のＡＰＣはＣＴＬ誘導能を有する。ＡＰＣとの関連において、「ＣＴＬ誘導能」という語句は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と接触した場合にＣＴＬを誘導するＡＰＣの能力を指す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を増強するＡＰＣの能力を含む。特に、本発明のＡＰＣはＵＢＥ２Ｔ特異的ＣＴＬを誘導する能力を有する。ＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などの、この分野において従来より実施されている様々な方法が含まれ、それらを使用することができる。より具体的には、Ｒｅｅｖｅｓ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６，５６：５６７２−７；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ＬＨ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８，１６１：５６０７−１３；Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９６，１８４：４６５−７２；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を経て部分ペプチドが提示される。
いくつかの態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する。典型的な態様において、本発明のＡＰＣは、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）と、ＨＬＡ−Ａ２４との複合体を自身の表面上に提示する。他の態様において、本発明のＡＰＣは、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）と、ＨＬＡ−Ａ２との複合体を自身の表面上に提示する。
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれか１種に対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれか１種によって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、（２）対象由来のＡＰＣおよびＣＤ８陽性Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）こと、（３）ＣＤ８陽性Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原とペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエクソソームとインビトロで接触させること、または（４）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドもしくはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドをＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入すること（そのようなサブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上の本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することができる）、によって得ることができる。そのようなＡＰＣまたはエクソソームは上記の方法によって調製することができる。（４）の方法の詳細は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において以下に記載する。
本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ単独で投与することができ、または効果を調節する目的で本発明のペプチド、ＡＰＣもしくはエクソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、がん細胞のようなＵＢＥ２Ｔを内因的に発現する細胞、またはＵＢＥ２Ｔ遺伝子をトランスフェクトした細胞であってよく、かつ本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的として機能し得る。
いくつかの態様において、本発明のＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示する細胞を認識するＣＴＬである。ＣＴＬとの関連において、「細胞を認識する」という語句は、細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体にそのＴＣＲを介して結合し、その細胞に対して特異的な細胞傷害活性を示すことを指す。本明細書において、「特異的細胞傷害活性」は、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示する細胞に対して細胞傷害活性を示すが、他の細胞には示さないことを指す。したがって、本発明のペプチドを提示する細胞に対する特異的細胞傷害活性を示すＣＴＬは、本発明に含まれる。
典型的な態様において、本発明のＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４を介して配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）を提示する細胞を認識することができる。好ましい態様において、本発明のそのようなＣＴＬは、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ２４を発現する細胞（例えばＨＬＡ−Ａ２４陽性がん細胞）を認識することができ、そのような細胞に対して細胞傷害活性を示すことができる。
他の態様において、本発明のＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２を介して配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）を提示する細胞を認識することができる。好ましい態様において、本発明のそのようなＣＴＬは、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞（例えばＨＬＡ−Ａ２陽性がん細胞）を認識することができ、そのような細胞に対して細胞傷害活性を示すことができる。
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチド（そのようなサブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上のＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体に結合することができる）を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＵＢＥ２Ｔを発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の１種または複数種のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットのα鎖およびβ鎖のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５およびＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１，３２８８（２００３））。例えば、ＴＣＲを解析するためにはＰＣＲ法が好ましい。解析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５'側プライマーとしての５'−Ｒプライマー（５'−ｇｔｃｔａｃｃａｇｇｃａｔｔｃｇｃｔｔｃａｔ−３'）（配列番号：６６）および３'側プライマーとしてのＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー（５'−ｔｃａｇｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇｃａｇｃｇｔ−３'）（配列番号：６７）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー（５'−ｔｃａｇａａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇａｃ−３'）（配列番号：６８）またはＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（５'−ｃｔａｇｃｃｔｃｔｇｇａａｔｃｃｔｔｔｃｔｃｔｔ−３'）（配列番号：６９）であってよいが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、本発明のペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、本発明のペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該ポリヌクレオチドまたはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞（ＣＤ８陽性Ｔ細胞など）、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする容易に入手可能な組成物を提供する。
本発明のペプチドに対する特異的ＴＣＲは、ＴＣＲがＴ細胞の表面上に提示された場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示している標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に与えることができる受容体である。上記複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、好ましい方法の例には、例えば、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いるＨＬＡ多量体染色解析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、細胞表面上にＴＣＲを発現するＴ細胞がそのＴＣＲによって細胞を認識すること、およびシグナルが細胞内に伝達されることを確認することができる。上述したＴＣＲが、そのＴＣＲがＴ細胞表面上に存在する場合にＴ細胞に細胞傷害活性を付与することができることの確認もまた、公知の方法によって行うことができる。好ましい方法には、例えば、クロム放出アッセイのような標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が含まれる。
また、本発明は、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドの形質導入によって調製されるＣＴＬを提供する。該ＴＣＲサブユニットによって形成されるＴＣＲは、ＵＢＥ２Ｔペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４との関連において、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７のアミノ酸配列を有するペプチド、およびまた、ＨＬＡ−Ａ２との関連において、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列を有するペプチド、に結合することができる。
形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる（例えば、Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３４５２−３４６１（１９８９））。本発明のＣＴＬは、療法または防御を必要としている患者におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方に有用な免疫原性組成物を形成するために用いることができる（ＷＯ２００６／０３１２２１参照、その内容は参照により本明細書に組み入れられる）。
ＩＸ．薬学的剤または薬学的組成物
本発明はまた、以下の中より選択される少なくとも１種の有効成分を含む薬学的剤または薬学的組成物を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のそのようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のＡＰＣ；
（ｄ）本発明のエクソソーム；および
（ｅ）本発明のＣＴＬ。
ＵＢＥ２Ｔの発現は、その例には、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍を含むがこれらに限定されないがんにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって、本発明は、がんの治療および／もしくは予防のため、ならびに／または術後のその再発の予防のために製剤化される薬学的組成物または薬学的剤であって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも１種を有効成分として含む、薬学的組成物または薬学的剤を提供する。あるいは、薬学的組成物あるいは薬学的剤として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエクソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれか１種を標的とする前述のＣＴＬもまた、本発明の薬学的組成物または薬学的剤の有効成分として用いることができる。
したがって、本発明は、以下の中より選択される少なくとも１種の有効成分を含む剤または組成物を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のそのようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のＡＰＣ；
（ｄ）本発明のエクソソーム；および
（ｅ）本発明のＣＴＬ。
薬学的剤または薬学的組成物において、そのような有効成分は治療的または薬学的に効果的な量で存在する。
本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、ワクチンとしても使用される。本発明との関連において、「ワクチン」という語句（「免疫原性組成物」とも称される）は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を改善、増強および／または誘導する機能を有する剤または組成物を指す。換言すると、本発明は、対象においてがんに対する免疫応答を誘導するための薬学的剤または薬学的組成物を提供する。そのような剤または組成物におけるペプチドの量は、ＵＢＥ２Ｔを発現するがんを保持する対象において免疫学的応答を有意に増強または刺激するのに効果的な量であり得る。
本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんを治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。いくつかの態様において、本発明の薬学的剤または薬学的組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化することができる。
別の態様において、本発明はまた、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防するための薬学的組成物または薬学的剤の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；および
（ｅ）本発明のＣＴＬ。
あるいは、本発明はさらに、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防において使用するための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；および
（ｅ）本発明のＣＴＬ。
あるいは、本発明はさらに、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防するための薬学的組成物または薬学的剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分とともに、薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；および
（ｅ）本発明のＣＴＬ。
別の態様において、本発明はまた、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防するための薬学的組成物または薬学的剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；および
（ｅ）本発明のＣＴＬ Ｔ細胞。
別の態様において、本発明はまた、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防するための方法であって、以下の中より選択される少なくとも１種の有効成分を対象に投与する段階を含む方法を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；および
（ｅ）本発明のＣＴＬ。
本発明によれば、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが、対象においてＨＬＡ−Ａ２４およびＵＢＥ２Ｔを発現するがんに対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープペプチドであることが見いだされた。同様に、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが、対象においてＨＬＡ−Ａ２およびＵＢＥ２Ｔを発現するがんに対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることが見いだされた。したがって、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む薬学的組成物または薬学的剤は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である対象への投与のために特に適している。一方、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む薬学的組成物または薬学的剤は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的組成物または薬学的剤にも当てはまる。
本発明の薬学的組成物または薬学的剤により治療および／または予防することができるがんは限定されず、ＵＢＥ２Ｔが関与する全ての種類のがんを含み、それらの例には、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有する他のペプチド、該他のペプチドをコードする他のポリヌクレオチド、該他のペプチドを提示する他の細胞等を含み得る。がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有する、そのような「他の」ペプチドの例には、限定はされないが、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）由来のペプチドが含まれる。
必要に応じて、本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、他の治療物質が、例えば本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エクソソーム、ＡＰＣ、ＣＴＬのいずれかなどの本発明の有効成分の抗腫瘍効果を阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症物質、鎮痛剤、化学療法薬等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的組成物と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的組成物の量は、例えば、使用する薬理学的組成物の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に依存する。
本明細書において具体的に言及される成分に加えて、本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、対象となる製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的な他の物質も含み得ることが理解されるべきである。
本発明の一態様において、本発明の薬学的組成物または薬学的剤を、例えばがんなどの治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキット中に包装することができる。製品は、ラベルを有する本発明の薬学的組成物または薬学的剤のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、組成物または剤が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
本発明の薬学的組成物または薬学的剤を含むキットは、上記の容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明を記載した添付文書を含む、商業上の観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
必要に応じて、有効成分を含む１個または複数個の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、本発明の薬学的な組成物または剤を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的組成物
本発明のペプチドは、薬学的組成物または薬学的剤として直接投与してもよく、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化してもよい。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、抗がん目的に用いることができる。
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２つまたはそれ以上を含む組み合わせにおいて調製することができる。ペプチドはカクテルでもよく、または標準的な技法を用いて互いに結合させてもよい。例えば、ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチドとして発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成される複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を対象から取り出し、その後、本発明のペプチドによって刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを得てもよい。これらのＡＰＣは、対象においてＣＴＬを誘導するために対象に再び投与することができ、結果として腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増大させることができる。
有効成分として本発明のいずれかのペプチドを含む、がんの治療および／または予防のための薬学的組成物または薬学的剤は、細胞性免疫を効率的に確立するようにアジュバントもまた含み得る。あるいは、本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、他の有効成分と共に投与してもよく、または顆粒内へ製剤化することによって投与してもよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強するいかなる化合物、物質または組成物も指す。本明細書において企図されるアジュバントには、文献（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＧ，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９４，７：２７７−８９）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルジョン等が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。好ましい塩の例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、アミンとの塩、有機酸（酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩、および、無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸など）との塩が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という語句は、その化合物の生物学的な有効性および特性を保持し、かつ、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機または有機の酸または塩基との反応によって得られる塩を指す。
いくつかの態様において、本発明の薬学的組成物または薬学的剤は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。脂質の他の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Ｄｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９８９，３４２：５６１−４を参照されたい）。
適切な投与方法の例としては、必ずしも限定はされないが、経口、および皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹膜および静脈内注射等、ならびに全身投与または標的部位の近傍への局所投与が含まれる。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドの、薬学的または治療的に効果的な量を、ＵＢＥ２Ｔを発現するがんの治療を必要としている対象に投与することができる。あるいは、ＣＴＬを介した免疫学的応答を増強もしくは刺激するため、および／またはＵＢＥ２Ｔを発現するがんもしくは腫瘍に対するＣＴＬを誘導するために十分な本発明のペプチドの量が、ＵＢＥ２Ｔを発現しているがんを保持している対象に投与可能である。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜３０ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日〜数ヶ月に１度、例えば１週間に一度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的組成物
本発明の薬学的組成物または薬学的剤はまた、本発明のペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現することを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばＴｈｏｍａｓ ＫＲ＆Ｃａｐｅｃｃｈｉ ＭＲ，Ｃｅｌｌ １９８７，５１：５０３−１２を参照されたい）。例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２４７：１４６５−８；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５１：４５６−６０に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Ｓｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ ２０００，６：６６−７１；Ｓｈｅｄｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ２０００，６８： ７９３−８０６； Ｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｖｏ ２０００，１４：５７１−８５を参照されたい。
ポリヌクレオチドの患者内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９９３，１２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ １９９３，３３：５７３−９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６０：９２６−３２；Ｍｏｒｇａｎ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９３，６２：１９１−２１７；Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９３，１１（５）：１５５−２１５を参照されたい。本発明に適用可能な、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９３）；およびＫｒｉｅｇｅｒのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０）に記載されている。
投与は、経口、または皮内、皮下、静脈内、筋肉内、骨内、もしくは腹膜注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が使用される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。ポリヌクレオチドの、薬学的または治療的に効果的な量を、ＵＢＥ２Ｔを発現するがんの治療を必要としている対象に投与することができる。あるいは、ＣＴＬを介した免疫学的応答を増強もしくは刺激するため、および／またはＵＢＥ２Ｔを発現するがんもしくは腫瘍に対するＣＴＬを誘導するために十分な本発明のポリヌクレオチドの量が、ＵＢＥ２Ｔを発現しているがんを保持している対象に投与可能である。適切な担体または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された適切な細胞におけるポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調整することができ、これは通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜３０ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日に１度から数か月に１度、例えば週に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適宜選択することができる。
Ｘ．ペプチド、ポリヌクレオチド、エクソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法：
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、ＡＰＣおよびＣＴＬを調製または誘導するために使用可能である。本発明のエクソソームおよびＡＰＣもまた、ＣＴＬを調製または誘導するために使用可能である。ペプチド、ポリヌクレオチド、エクソソームおよびＡＰＣは、それらのＣＴＬ誘導能を他の化合物が阻害しない限り、該他の化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的組成物または薬学的剤のいずれかを用いてＣＴＬを調製または誘導することができる。それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に説明するように、ＡＰＣを調製または誘導することもできる。
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階、および
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階。
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有することから、好ましくはＤＣを用いることができる。本発明のペプチドのいずれか１種を、単独で、あるいは本発明の１種もしくは複数種の他のペプチドおよび／またはＵＢＥ２Ｔ以外のＴＡＡ由来の１種もしくは複数種のＣＴＬ誘導性ペプチドと組み合わせて用いることができる。
一方、本発明のペプチドを対象に投与すると、ＡＰＣは、ペプチドとインビボで接触し、その結果、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって、本発明の方法は、本発明のペプチドを対象に投与して、対象の体内でＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導することを含み得る。同様に、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与すると、本発明のペプチドがインビボで発現してＡＰＣと接触し、その結果、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが対象の体内で誘導される。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与して、対象の体内でＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導することを含み得る。「発現可能な形態」という語句は、「ＩＸ．薬学的剤または薬学的組成物（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的剤または薬学的組成物」の章に上述されている。
さらに、本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入してＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導することを含み得る。例えば、方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階、および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを段階ａにおいて回収されたＡＰＣに導入する段階。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように行うことができる。
あるいは本発明は、以下の段階のうちの１つを含み得る、ＵＢＥ２Ｔに対するＣＴＬ活性を特異的に誘導し得る抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製するための方法を提供する：
（ａ）ＡＰＣを、本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
あるいは本発明は、以下の中より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法を提供する：
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
好ましい態様において、本発明は、以下の段階のうちの１つを含む、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導または調製する方法を提供する：
（ａ）ＨＬＡ−Ａ２４を発現するＡＰＣを、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、またはそれらの改変ペプチドと、インビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはそれらの改変ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＨＬＡ−Ａ２４を発現するＡＰＣに導入する段階。
上記の方法によって誘導されたＡＰＣは、ＨＬＡ−Ａ２４を介してそのようなペプチドを自身の表面上に提示し、ＨＬＡ−Ａ２４およびＵＢＥ２Ｔを発現する細胞に対して特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導することができる。
別の態様において、本発明は、以下の段階のうちの１つを含む、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導または調製する方法を提供する：
（ａ）ＨＬＡ−Ａ２を発現するＡＰＣを、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、またはそれらの改変ペプチドと、インビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、またはそれらの改変ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＡＰＣに導入する段階。
上記の方法によって誘導されたＡＰＣは、ＨＬＡ−Ａ２を介してそのようなペプチドを自身の表面上に提示し、ＨＬＡ−Ａ２およびＵＢＥ２Ｔを発現する細胞に対して特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導することができる。
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法は、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用するＡＰＣは、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原を発現するＡＰＣであってよい。そのようなＡＰＣは、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から当技術分野において周知の方法によって調製することができる。本発明の方法によって誘導したＡＰＣは、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原（ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２抗原）との複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣであってよい。対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明の方法によって誘導したＡＰＣを対象に投与する場合、対象は、好ましくは、ＡＰＣが由来する同一の対象である。しかしながら、対象は、該対象がＡＰＣドナーと同一のＨＬＡ型を有する限り、ＡＰＣドナーと異なる対象でもよい。
別の態様において、本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用するための剤または組成物を提供し、そのような剤または組成物は、本発明の１種または複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
別の態様において、本発明は、ＡＰＣを誘導するために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
あるいは本発明は、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣの誘導に使用するための本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリペプチドをさらに提供する。
（２）ＣＴＬを誘導する方法
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはエクソソームもしくはＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導するための方法を提供する。
本発明はまた、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチド（そのようなサブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上の本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識（に結合）することができる）を使用してＣＴＬを誘導するための方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導するための方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含み得る：
ａ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞と接触させる段階
ｂ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエクソソームと接触させる段階；および
ｃ：ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチド（そのようなサブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上の本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識（に結合）することができる）を、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエクソソームを対象に投与すると、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、ＵＢＥ２Ｔを発現するがん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエクソソームを対象に投与する段階を含み得る。
あるいはＣＴＬは、それらをエクスビボまたはインビトロで用いることによって誘導することもでき、ＣＴＬを誘導した後、活性化ＣＴＬを対象に戻すことができる。例えば、方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階、
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階、および
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性Ｔ細胞と共培養する段階。
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性Ｔ細胞と共培養するＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、したがってＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示する任意のＡＰＣを包含する。
前述のＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエクソソームを任意に利用し得る。すなわち、本発明は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエクソソームおよびＣＤ８陽性Ｔ細胞を共培養する段階を含み得る。そのようなエクソソームは、「Ｖ．エクソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。本発明の方法において適切なＡＰＣおよびエクソソームは、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２との複合体を自身の表面上に提示する。
例えば、ＨＬＡ−Ａ２４と配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）との複合体をその表面上に提示するＡＰＣまたはエクソソームは、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４およびＵＢＥ２Ｔを発現する細胞に対して特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導するために利用し得る。同様に、ＨＬＡ−Ａ２と配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド（またはその改変ペプチド）との複合体をその表面上に提示するＡＰＣまたはエクソソームは、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２およびＵＢＥ２Ｔを発現する細胞に対して特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導するために利用し得る。
さらに、ＣＴＬは、ＴＣＲサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチド（そのようなサブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上の本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することができる）を、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入することによって誘導することができる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章に上述したように行うことができる。
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法は、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。ＣＴＬの誘導に用いるＣＤ８陽性Ｔ細胞は、対象から得たＰＢＭＣから当技術分野において周知の方法によって調製することができる。好ましい態様において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のためのドナーは、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象であってよい。本発明の方法によって誘導したＣＴＬは、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識し得るＣＴＬであってよい。そのようなＣＴＬは、本発明のペプチドを自身の表面上に提示する細胞に対して特異的細胞傷害活性を示すことができ、したがってＵＢＥ２Ｔを発現する細胞（例えばがん細胞）に対して特異的細胞傷害活性を示すことができる。対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明の方法によって誘導したＣＴＬを対象に投与する場合、対象は、好ましくは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が由来する同一の対象である。しかしながら、対象は、対象がＣＤ８陽性Ｔ細胞ドナーと同一のＨＬＡ型を有する限り、ＣＤ８陽性Ｔ細胞ドナーと異なる対象でもよい。
加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導するための薬学的組成物または薬学的剤を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む方法または工程を提供する。
別の態様において、本発明は、ＣＴＬを誘導するための剤または組成物であって、本発明の１種もしくは複数種のペプチド、１種もしくは複数種のポリヌクレオチド、１種もしくは複数種のＡＰＣ、および／または１種もしくは複数種のエクソソームを含む剤または組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、ＣＴＬの誘導のために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣまたはエクソソームの使用を提供する。
あるいは本発明は、ＣＴＬの誘導に用いられる本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣまたはエクソソームをさらに提供する。
ＸＩ．免疫応答を誘導する方法
さらに本発明は、ＵＢＥ２Ｔに関連する疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患には、がんが含まれ、その例には、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む剤または組成物を投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエクソソームまたはＡＰＣの投与も企図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的剤または薬学的組成物」の項、特に本発明の薬学的組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエクソソームおよびＡＰＣは、上記「Ｖ．エクソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エクソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法」の（１）および（２）の項において詳述している。
本発明はまた、がんに対する免疫応答を誘導するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含み得る方法を提供する。
あるいは、本発明の方法は、以下を含む本発明のワクチンまたは薬学的組成物もしくは薬学的剤を投与する段階を含み得る：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
（ｄ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；または
（ｅ）本発明のＣＴＬ。
本発明との関連において、ＵＢＥ２Ｔを過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。そのようながんの例には、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。したがって、前述の有効成分のいずれかを含むワクチンまたは薬学的組成物もしくは薬学的剤を投与する前に、治療すべき対象から回収したがん性細胞または組織において、ＵＢＥ２Ｔの発現レベルが、同じ対象から回収した正常な細胞または組織と比較して上昇しているかどうかを確認することが好ましい。したがって１つの態様において、本発明は、ＵＢＥ２Ｔを（過剰）発現するがんの治療が必要とされる患者においてＵＢＥ２Ｔを（過剰）発現するがんを治療するための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から得られた生物学的試料中のＵＢＥ２Ｔの発現レベルを決定する段階；
ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔの発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｅ）の中より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＵＢＥ２Ｔを過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
あるいは本発明は、ＵＢＥ２Ｔを過剰発現するがんを有する対象へ投与することができる、上記の（ａ）〜（ｅ）の中より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のペプチドで治療すべき対象を同定するための方法であって、対象由来の生物学的試料中のＵＢＥ２Ｔの発現レベルを決定する段階を含み、発現レベルが、該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象が本発明のペプチドで治療され得るがんを有し得ることが示される方法を提供する。
さらに、好ましい態様において、対象におけるＨＬＡ型は、本発明のペプチドの投与前に同定され得る。例えば、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２４を有すると同定された対象に投与される。あるいは、配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２を有すると同定された対象に投与される。
ＵＢＥ２Ｔの転写産物または翻訳産物を含みうる限り、対象由来の任意の細胞または組織をＵＢＥ２Ｔ発現レベルの測定に使用することができる。適切な試料の例には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞、またはがん性組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含む。さらに、必要に応じて、得られた身体組織および体液から細胞を精製し、その後これを対象由来試料として用いてもよい。
本発明によれば、対象から得られた生物学的試料中のＵＢＥ２Ｔの発現レベルを決定することができる。ＵＢＥ２Ｔの発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで決定することができる。例えば、ＵＢＥ２ＴのｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイにおいて行うことができる。アレイの使用は、ＵＢＥ２Ｔの発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、ＵＢＥ２Ｔの配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＵＢＥ２ＴのｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識で標識してもよく、ＵＢＥ２Ｔの発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によりプライマーを用いて、ＵＢＥ２Ｔの転写産物を定量してもよい。そのようなプライマーは、ＵＢＥ２Ｔの入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＵＢＥ２ＴのｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加によって達成してもよい。
本発明のプローブまたはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、少なくとも約２０００、１０００、５００、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５の連続する、ＵＢＥ２Ｔ配列を含む核酸のセンス鎖ヌクレオチド配列、またはＵＢＥ２Ｔ配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、またはそれらの配列の天然の変異体とハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。特に、例えば、好ましい態様において、５〜５０の長さを有するオリゴヌクレオチドを、検出すべき遺伝子を増幅するためのプライマーとして用いることができる。より好ましくは、ＵＢＥ２Ｔ遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、特定のサイズ、一般には１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーによって検出することができる。サイズは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチドの範囲であってよく、プローブおよびプライマーのサイズは５〜１０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、および２５〜３０ヌクレオチドの範囲にわたってよい。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの長さは、１５〜２５ヌクレオチドから選択することができる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いることによって遺伝子を検出するためのアッセイ手順、装置、または試薬は、周知である（例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＰＣＲ）。これらのアッセイにおいて、プローブまたはプライマーはタグまたはリンカー配列も含み得る。さらに、プローブまたはプライマーは、検出可能な標識または捕捉することができる親和性リガンドで修飾することができる。あるいは、ハイブリダイゼーションに基づく検出手順において、数百（例えば、約１００〜２００）塩基から数千（例えば、約１０００〜２０００）塩基長を有するポリヌクレオチドも、プローブに用いることができる（例えば、ノーザンブロッティングアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ解析）。
あるいは、本発明の方法によって治療すべき対象の同定のために、ＵＢＥ２Ｔの翻訳産物を検出することができる。例えば、ＵＢＥ２Ｔタンパク質（配列番号：６５）の量を測定することができる。翻訳産物としてＵＢＥ２Ｔタンパク質の量を測定する方法の例として、ＵＢＥ２Ｔタンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＵＢＥ２Ｔタンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に用いることができる。これらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、任意の方法を使用して、そのような抗体およびそれらの等価物を調製することができる。
ＵＢＥ２Ｔの発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＵＢＥ２Ｔタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色の強度を測定してもよい。すなわちこの測定では、強度の染色により、ＵＢＥ２Ｔタンパク質の存在／レベルの増加が示され、それと同時にＵＢＥ２Ｔの高発現レベルが示される。
対象由来の試料におけるＵＢＥ２Ｔ遺伝子の発現レベルは、その発現レベルが、ＵＢＥ２Ｔの対照レベル（例えば、正常細胞中の発現レベル）から例えば１０％、２５％、もしくは５０％上昇するか；または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合に、上昇していると判定され得る。
対照レベルは、健常対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に決定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から得られた正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態が判明している対象に由来する試料中のＵＢＥ２Ｔの予め決定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の一局面によれば、生物学的試料中のＵＢＥ２Ｔの発現レベルを、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生物学的試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＵＢＥ２Ｔ遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値＋／−２Ｓ．Ｄ．または平均値＋／−３Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが細胞のがん性状態または非がん性状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
ＵＢＥ２Ｔの発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合、その対象は、本発明の薬学的組成物または剤を投与することにより治療すべきがんを有する対象であると同定され得る。
本発明はまた、前述の薬学的組成物または薬学的剤を用いたがんの治療のための対象を選択する方法を提供し、その方法は以下の段階を含む：
ａ）がんを有する対象から得られた生物学的試料中のＵＢＥ２Ｔの発現レベルを決定する段階；
ｂ）段階ａ）で決定したＵＢＥ２Ｔの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；および
ｃ）ＵＢＥ２Ｔの発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、本発明の薬学的組成物または剤によるがんの治療のために該対象を選択する段階。
いくつかの態様において、そのような方法はさらに、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２からなる群より選択されるＨＬＡを有する対象を、上記で定義した段階ａ）からｃ）の後または前に同定する段階を含み得る。本発明によるがん治療法は、ＵＢＥ２Ｔを過剰発現するがんに罹患しており、かつＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２を有する対象にとって好適である。ＨＬＡタイピングの方法は、当業者には周知である。例えば、ＨＬＡアリルのタイピングのためのＰＣＲに基づいた方法が周知である。各々のＨＬＡ分子に特異的な抗体はまた、対象のＨＬＡ型を同定するための適切な手段である。
１つの態様において、本発明はさらに、本発明の１つまたは複数のペプチドを含む診断キットを提供する。
がんは、対象由来の試料（血液など）において、本発明のペプチドを使用して、本発明のペプチドに対する抗体を検出することによって診断することができる。
対象由来の試料（血液試料など）が、本発明のペプチドに対する抗体を含み、抗体の量が、対照レベルと比較してカットオフ値よりも高いと判定される場合、対象は、がんに罹患している疑いがある。
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合するＨＬＡ分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびＨＬＡ分子を使用して抗原特異的ＣＴＬを検出するための方法が既に確立されている（例えば、Ａｌｔｍａｎ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６，２７４（５２８４）：９４−６）。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出するための検出法に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を適用することができ、それによってがんの再発および／または転移のより早期の発見が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む薬学的組成物もしくは薬学的剤を適用できる対象を選択するために、または薬学的組成物もしくは薬学的剤の治療効果を評価するために、これを用いることができる。
具体的には、公知の方法に従って（例えば、Ａｌｔｍａｎ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６，２７４（５２８４）：９４−６を参照されたい）、放射標識されたＨＬＡ分子と本発明のペプチドとのオリゴマー複合体（例えば、四量体など）を調製することができる。この複合体を使用して、例えば、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを定量することによって、診断を行うことができる。
本発明はさらに、本発明のペプチドを使用することによって、対象の免疫学的応答を評価するための方法および診断用の剤を提供する。本発明の１つの態様において、本発明のペプチドは、対象の免疫応答を評価し、または予測する試薬として使用される。評価される免疫応答は、免疫原（すなわち、本発明のペプチド）を免疫担当細胞とインビトロまたはインビボで接触させることにより誘導される。好ましい態様において、免疫学的応答を評価するための免疫担当細胞は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の中より選択し得る。そのような解析に用いられるアッセイ系には、四量体染色アッセイ、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの比較的最近の技術開発が含まれる。好ましい態様において、ペプチド試薬と接触させる免疫担当細胞は、樹状細胞を含む抗原提示細胞であってよい。
例えば、本発明のペプチドを四量体染色アッセイにおいて使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異的ＣＴＬを直接に可視化し（例えば、Ｏｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３−２１０６，１９９８；およびＡｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １７４：９４−９６，１９９６を参照されたい）、末梢血単核細胞の試料中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を測定することができる。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下に記載するように作製することができる。
ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて、３分子複合体を生成する。この複合体において、該重鎖のカルボキシル末端の前もってタンパク質中に作製した部位をビオチン化する。次にストレプトアビジンを該複合体に添加して、３分子複合体およびストレプトアビジンから構成される四量体を形成する。蛍光標識ストレプトアビジンの手法によって、この四量体を使用して、抗原特異的細胞を染色することができる。次いで、この細胞を例えばフローサイトメトリーによって同定することができる。そのような解析を、診断または予後予測目的に使用することができる。この手順によって同定された細胞を治療目的に使用することもできる。
本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を用いて抗体を作製するために使用することもでき（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい）、この抗体は、がんを診断またはモニターするための試薬として有用であり得る。そのような抗体は、ＨＬＡ分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体を含み得る。
本発明のペプチドおよび組成物はさらなる用途をいくつか有し、そのうちの一部を本明細書に記載する。例えば、本発明は、ＵＢＥ２Ｔポリペプチドの発現を特徴とする障害を診断または検出するための方法を提供する。
例えば、フルオレセイン標識ＨＬＡ多量体複合体で染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法によって診断を行うことができる（例えば、Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０３３０）。細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイもまた提供されている。四量体染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイはすべてが、より慣例的なアッセイより少なくとも１０倍高感度であるようである（Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：１７７；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９；Ｄｕｎｂａｒ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３）。五量体（例えば、ＵＳ２００４−２０９２９５Ａ）、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）（例えば、ＷＯ０２／０７２６３１）およびストレプタマー（ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ）（例えば、Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６．６３１−６３７（２００２））を使用することもできる。
例えば、いくつかの態様において、本発明は、本発明のＵＢＥ２Ｔペプチドの少なくとも１つが投与された対象の免疫学的応答を診断または評価するための方法を提供し、該方法は以下の段階を含む：
（ａ）免疫原を、該免疫原に対して特異的なＣＴＬの誘導に適した条件下で免疫担当細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）で誘導されたＣＴＬの誘導レベルを検出または決定する段階；および
（ｃ）対象の免疫学的応答をＣＴＬ誘導レベルと相関させる段階。
本発明において、免疫原は、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列を有するＵＢＥ２Ｔペプチド、および、そのようなアミノ酸配列が、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸置換により改変されたＵＢＥ２Ｔペプチドのうちの少なくとも１つである。一方、免疫原特異的ＣＴＬの誘導に適した条件は当技術分野において周知である。例えば、免疫担当細胞を、免疫原特異的ＣＴＬを誘導するために免疫原の存在下でインビトロで培養してもよい。免疫原特異的ＣＴＬを誘導する目的で、任意の刺激因子を細胞培養物に添加してもよい。例えば、ＩＬ−２は、ＣＴＬ誘導のための好ましい刺激因子である。
いくつかの態様において、ペプチドがん療法によって治療される対象の免疫学的応答をモニターまたは評価する段階は、治療前、治療中、および／または治療後に行うことができる。一般に、がん療法プロトコール中、免疫原性ペプチドは、治療される対象に繰り返し投与される。例えば、免疫原性ペプチドを３〜１０週間にわたって毎週投与してもよい。したがって、対象の免疫学的応答は、がん療法プロトコール中に評価またはモニターされ得る。あるいは、がん療法に対する免疫学的応答を評価またはモニターする段階が、療法プロトコールの完了時であってよい。
本発明によれば、免疫原特異的ＣＴＬの誘導が対照と比較して増強されていることにより、評価または診断される対象が、投与された免疫原に対して免疫学的に応答したことが示される。免疫学的応答を評価するための適した対照には、例えば、免疫担当細胞をペプチドと接触させていない場合、または、いかなるＵＢＥ２Ｔペプチドとも異なるアミノ酸配列（例えば、ランダムなアミノ酸配列）を有する対照ペプチドと接触させている場合のＣＴＬ誘導レベルが含まれ得る。
ＸＩＩ．抗体
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチド以外のペプチドには結合しない（または、弱く結合する）。
本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後予測のアッセイにおいて使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＵＢＥ２Ｔががんにおいて同じく発現または過剰発現する限り、がんの治療、診断、および／または予後予測において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体（例えば、一本鎖抗体）は、ＵＢＥ２Ｔの発現が関与するがんの治療において治療的に使用することができ、そのようながんの例には、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
本発明はまた、ＵＢＥ２Ｔタンパク質（配列番号：６５）、または配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む、ＵＢＥ２Ｔタンパク質の断片を、検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイを提供する。本発明との関連において、ＵＢＥ２Ｔポリペプチドと結合する抗体は、好ましくは配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する。抗体の結合特異性は、阻害試験で確認することができる。すなわち、解析される抗体と全長ＵＢＥ２Ｔポリペプチドとの間の結合が、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８のアミノ酸配列からなる任意の断片の存在下で阻害される場合、この抗体が該断片に特異的に結合することが示される。本発明との関連において、そのような免疫学的アッセイは、様々な種類の放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ技法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光測定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
免疫学的であるが非抗体性の関連アッセイには、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）およびＭＨＣ結合アッセイが含まれ得る。加えて、本発明は、ＵＢＥ２Ｔを発現するがんを検出し得る免疫学的画像化法を企図し、その例には、本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されない。そのようなアッセイは、ＵＢＥ２Ｔを発現するがんの検出、モニタリング、および予後予測において臨床的に使用され、そのがんの例には、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体として任意の形態で用いることができ、これには、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体がさらに含まれ得る。
本発明の抗体は、配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを認識し得る。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明との関連において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド（例えば、９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒ）を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が周知である。ＫＬＨとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
あるいは、本発明のペプチドをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドを、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
任意の哺乳動物を抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させることができる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、４〜２１日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンＧまたはＭは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させる他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
公知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ７３：３−４６（１９８１））の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭６３−１７６８８号）。
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＬＴＤ （１９９０）により英国で刊行された、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照されたい）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドに結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９−８３（１９８８））。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：２９６８−７６（１９９４）；Ｂｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １７８：４７６−９６（１９８９）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １７８：４９７−５１５（１９８９）；Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １２１：６５２−６３（１９８６）；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １２１：６６３−９（１９８６）；Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９：１３２−７（１９９１）を参照されたい）。
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１））。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号に記載されている。
上記のようにして得られた抗体は、均質になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８））。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインＡカラムには、例えば、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ． Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。本発明の抗体の活性を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてもよい。
ＸＩＩＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のポリヌクレオチド、特にＤＮＡを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のポリヌクレオチドを投与するために使用することができる。
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等を用いることができる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、およびｐＴ７もまた上記のベクターと同様に、ｃＤＮＡのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを本発明のペプチドの産生に用いる場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１ Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−６（１９８９）；ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：２４２２−７（１９９２））、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−３（１９８８））、Ｔ７プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステム」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この場合、宿主は好ましくはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６９：４３７９（１９８７））である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８（１７）：５３２２（１９９０））、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）を、本発明のペプチドの産生に使用することができる。
ベクターをＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８（１９７９））、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：５３２２（１９９０））、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。
本発明の実施または試験にあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法、および材料を記載する。本明細書に挙げたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例証するためのものであり、限定することは意図しない。
実験１
材料および方法
細胞株
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性Ｂリンパ芽球様細胞株であるＴＩＳＩは、ＩＨＷＧ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から購入した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性Ｂリンパ芽球様細胞株であるＴ２、およびアフリカミドリザル腎細胞株であるＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入した。
ＵＢＥ２Ｔ由来ペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子と結合するＵＢＥ２Ｔ
由来の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、「ＮｅｔＭＨＣ３．２」結合予測サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ／）（Ｂｕｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．，２００３ Ｎｏｖ，６２（５）：３７８−８４）、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，２００３ Ｍａｙ，１２（５）：１００７−１７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４ Ｊｕｎ １２；２０（９）：１３８８−９７）および「ＢＩＭＡＳ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ）（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４，１５２（１）：１６３−７５，Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００１，９８（６）：１８７２−８１）を用いて予測した。これらのペプチドは、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｅｘａｓ）により、標準的な固相合成法に従って合成され、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製された。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシドに２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Ｎａｋａｈａｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３，６３（１４）：４１１２−８）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２あるいはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非働化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。７日間の培養後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃で３時間、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０μｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣをＸ線照射（２０Ｇｙ）により不活化し、ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し、各ウェルは、０．５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ＩＵ／ｍｌまで添加した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＴＩＳＩ細胞またはペプチドパルスしたＴＳ細胞に対してＣＴＬを試験した（Ｔａｎａｋａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００１，８４（１）：９４−９；Ｕｍａｎｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００１，８４（８）：１０５２−７；Ｕｃｈｉｄａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４，１０（２４）：８５７７−８６；Ｓｕｄａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００６，９７（５）：４１１−９；Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００５，９６（８）：４９８−５０６）。
ＣＴＬ増殖手順
Ｒｉｄｄｅｌｌら（Ｗａｌｔｅｒ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９５ ３３３（１６）：１０３８−４４；Ｒｉｄｄｅｌｌ ＳＲ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９６，２（２）：２１６−２３）によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Ｔａｎａｋａ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００１，８４（１）：９４−９；Ｕｍａｎｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００１，８４（８）：１０５２−７；Ｕｃｈｉｄａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４，１０（２４）：８５７７−８６；Ｓｕｄａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００６，９７（５）：４１１−９；Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００５，９６（８）：４９８−５０６）。
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においてＣＴＬ０．３個、１個、および３個／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、ＩＬ−２の最終濃度が１２５Ｕ／ｍｌに到達するように該培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた（Ｕｃｈｉｄａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４，１０（２４）：８５７７−８６； Ｓｕｄａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００６，９７（５）：４１１−９；Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００５，９６（８）：４９８−５０６）。
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＴＩＳＩ細胞またはペプチドパルスしたＴ２細胞（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２のいずれか一方または両方を強制的に発現する細胞の樹立
ＵＢＥ２Ｔ、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅産物を発現ベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＵＢＥ２Ｔヌル、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２ヌル、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１ヌル細胞株であるＣＯＳ７細胞に該ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
結果
がんにおけるＵＢＥ２Ｔ発現の上昇
ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて様々ながんから得られた包括的遺伝子発現プロファイルデータは、ＵＢＥ２Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４１７６（配列番号：６４））の発現が上昇していることを示した。ＵＢＥ２Ｔ発現は、２４例中２４例の膀胱がん、５０例中４４例の乳がん、１５例中１４例の子宮頸がん、１２例中１２例の胆管細胞がん、１６例中９例のＣＭＬ、９例中９例の大腸がん、４７例中３１例の食道がん、８例中５例の胃がん、２例中２例のびまん性胃がん、２７例中２３例のＮＳＣＬＣ、３例中３例のリンパ腫、１６例中９例の骨肉腫、７例中３例の卵巣がん、３例中３例の膵がん、２３例中２１例の前立腺がん、１２例中１２例のＳＣＬＣ、２６例中１１例の軟部組織腫瘍および９例中７例の精巣腫瘍において、対応する正常組織と比較して確実に上昇していた（表１）。
Figure 2015529219
ＵＢＥ２Ｔ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの予測
表２ａおよび表２ｂは、ＨＬＡ−Ａ２４に結合するＵＢＥ２Ｔの９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドを結合親和性の高い順に示す。ＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する可能性のある合計２７種のペプチドを、エピトープペプチドを決定するために選択し、調べた。
Figure 2015529219
Figure 2015529219
 開始位置は、ＵＢＥ２ＴのＮ末端からのアミノ酸残基数を示す。
結合スコアおよび解離定数［Ｋｄ（ｎＭ）］は、「ＢＩＭＡＳ」および「ＮｅｔＭＨＣ３．２」よりそれぞれ導き出している。
ＵＢＥ２Ｔ由来のＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの予測
表３ａおよび表３ｂは、ＨＬＡ−Ａ０２結合性のＵＢＥ２Ｔの９ｍｅｒペプチドおよび１０ｍｅｒペプチドを結合親和性の高い順に示す。ＨＬＡ−Ａ０２結合能を有する可能性のある合計３６種のペプチドを、エピトープペプチドを決定するために選択し、調べた。
Figure 2015529219
Figure 2015529219
 開始位置は、ＵＢＥ２ＴのＮ末端からのアミノ酸残基数を示す。
結合スコアおよび解離定数［Ｋｄ（ｎＭ）］は、「ＢＩＭＡＳ」および「ＮｅｔＭＨＣ３．２」よりそれぞれ導き出している。
ＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２拘束性のＵＢＥ２Ｔ由来予測ペプチドによるＣＴＬ誘導
ＵＢＥ２Ｔ由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載されるプロトコールに従って作製した。ペプチド特異的なＣＴＬ活性をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出した（図１）。ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）で刺激したウェル番号＃８（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）で刺激したウェル番号＃１（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３３（配列番号：４）で刺激したウェル番号＃６（ｃ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３８（配列番号：６）で刺激したウェル番号＃６（ｄ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４３（配列番号：１１）で刺激したウェル番号＃４（ｅ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０６（配列番号：１２）で刺激したウェル番号＃２（ｆ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）で刺激したウェル番号＃６（ｇ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０５（配列番号：１５）で刺激したウェル番号＃３（ｈ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３０（配列番号：１７）で刺激したウェル番号＃２（ｉ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３１（配列番号：１９）で刺激したウェル番号＃１（ｊ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３３（配列番号：２０）で刺激したウェル番号＃３（ｋ）、およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−９９（配列番号：２１）で刺激したウェル番号＃６（ｌ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１５４（配列番号：２２）で刺激したウェル番号＃７（ｍ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１０５（配列番号：２３）で刺激したウェル番号＃８（ｎ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１１５（配列番号：２４）で刺激したウェル番号＃１（ｏ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１７７（配列番号：２５）で刺激したウェル番号＃４（ｐ）、およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−４４（配列番号：２７）で刺激したウェル番号＃７（ｑ）は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を実証することが示された。一方で、表２ａおよび表２ｂに示される他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊２４０２との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドによる刺激では、特異的なＣＴＬ活性が検出されなかった。典型的な陰性データの例として、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１２４（配列番号：３）により刺激されたＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生が示されなかった（ｒ）。結果として、ＵＢＥ２Ｔ由来の１７種のペプチドが強力なＣＴＬを誘導できるペプチドとして選択されたことが示された。
ＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１拘束性のＵＢＥ２Ｔ由来予測ペプチドによるＣＴＬ誘導
ＵＢＥ２Ｔ由来のそれらのペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を検出した（図２）。ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）で刺激したウェル番号＃４（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−３０（配列番号：３０）で刺激したウェル番号＃５（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０６（配列番号：３２）で刺激したウェル番号＃７（ｃ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−４９（配列番号：３６）で刺激したウェル番号＃５（ｄ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）で刺激したウェル番号＃３（ｅ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３２（配列番号：４１）で刺激したウェル番号＃４（ｆ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）で刺激したウェル番号＃６（ｇ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−６（配列番号：４９）で刺激したウェル番号＃７（ｈ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０６（配列番号：５１）で刺激したウェル番号＃８（ｉ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）で刺激したウェル番号＃２（ｊ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３０（配列番号：５３）で刺激したウェル番号＃１（ｋ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）で刺激したウェル番号＃８（ｌ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−２９（配列番号：５６）で刺激したウェル番号＃５（ｍ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３８（配列番号：５８）で刺激したウェル番号＃３（ｎ）は、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を実証することが示された。一方、表３ａおよび３ｂに示されるその他のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドでの刺激では、特異的なＣＴＬ活性が検出されなかった。典型的な陰性データの例として、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１６１（配列番号：２８）で刺激したＣＴＬからは特異的ＩＦＮ−γ産生が示されなかった（ｏ）。結果として、ＵＢＥ２Ｔに由来する１４種のペプチドが、強力なＣＴＬを誘導することができるペプチドとして選択されたことが示された。
ＵＢＥ２Ｔ由来ペプチドに対するＣＴＬ株およびクローンの樹立
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）で刺激したウェル番号＃８（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）で刺激したウェル番号＃１（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）で刺激したウェル番号＃６（ｃ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−４４（配列番号：２７）で刺激したウェル番号＃７における細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡによって測定した（図３）。ＣＴＬ株は、ペプチドパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証した。さらに、「材料および方法」に記載されるように、ＣＴＬクローンをＣＴＬ株から限界希釈によって樹立し、対応するペプチドをパルスしたＴＩＳＩ細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによって測定した。強力なＩＦＮ−γ産生が、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）（ｂ）、およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）（ｃ）により刺激されたＣＴＬクローンから観察された（図４）。
ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的なＣＴＬ活性を示した、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）で刺激したウェル番号＃４（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）で刺激したウェル番号＃３（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）で刺激したウェル番号＃６（ｃ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）で刺激したウェル番号＃２（ｄ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）で刺激したウェル番号＃８（ｅ）における細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによって測定した（図５）。ＣＴＬ株は、ペプチドパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことを実証した。さらに、「材料および方法」に記載されるように、ＣＴＬクローンをＣＴＬ株から限界希釈によって樹立し、対応するペプチドをパルスしたＴ２細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによって測定した。強力なＩＦＮ−γ産生が、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）（ａ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）（ｂ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）（ｃ）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）（ｄ）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）（ｅ）により刺激されたＣＴＬクローンから観察された（図６）。
ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２またはＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１を発現する標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）ペプチドに対する樹立ＣＴＬクローンを、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長ＵＢＥ２ＴとＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を発現する標的細胞のための特異的モデル）を刺激細胞として調製し、全長のＵＢＥ２ＴまたはＨＬＡ−Ａ＊２４０２のどちらか一方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として使用した。図７において、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）により刺激されたＣＴＬクローンは、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータは、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）ペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子とともに標的細胞上に提示され、ＣＴＬによって認識されることを明確に実証する。これらの結果は、ＵＢＥ２Ｔ由来のこのペプチドが、ＵＢＥ２Ｔを発現する腫瘍を有する患者にがんワクチンを適用するために利用可能であり得ることを示している。
ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）ペプチドに対する樹立ＣＴＬ株を、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長のＵＢＥ２ＴとＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を発現する標的細胞のための特異的モデル）を刺激細胞として調製し、全長のＵＢＥ２ＴまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のどちらか一方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として使用した。図８において、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）により刺激されたＣＴＬ株は、ＵＢＥ２ＴおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現するＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。したがって、これらのデータは、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）ペプチドが内因的にプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子とともに標的細胞上に提示され、ＣＴＬによって認識されることを明確に実証する。これらの結果は、ＵＢＥ２Ｔ由来のこのペプチドが、ＵＢＥ２Ｔを発現する腫瘍を有する患者にがんワクチンを適用するために利用可能であり得ることを示している。
抗原ペプチドの相同性解析
ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３３（配列番号：４）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３８（配列番号：６）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４３（配列番号：１１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０６（配列番号：１２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０５（配列番号：１５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３０（配列番号：１７）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３１（配列番号：１９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３３（配列番号：２０）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−９９（配列番号：２１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１５４（配列番号：２２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１０５（配列番号：２３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１１５（配列番号：２４）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１７７（配列番号：２５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−４４（配列番号：２７）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−３０（配列番号：３０）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０６（配列番号：３２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−４９（配列番号：３６）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３２（配列番号：４１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−６（配列番号：４９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０６（配列番号：５１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３０（配列番号：５３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−２９（配列番号：５６）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３８（配列番号：５８）により刺激されたＣＴＬは、有意かつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３３（配列番号：４）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３８（配列番号：６）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４３（配列番号：１１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０６（配列番号：１２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０５（配列番号：１５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３０（配列番号：１７）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３１（配列番号：１９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３３（配列番号：２０）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−９９（配列番号：２１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１５４（配列番号：２２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１０５（配列番号：２３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１１５（配列番号：２４）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１７７（配列番号：２５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−４４（配列番号：２７）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−３０（配列番号：３０）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０６（配列番号：３２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−４９（配列番号：３６）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３２（配列番号：４１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−６（配列番号：４９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０６（配列番号：５１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３０（配列番号：５３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−２９（配列番号：５６）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３８（配列番号：５８）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドに対して相同であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するために、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列について相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果により、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−６０（配列番号：１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４５（配列番号：２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３３（配列番号：４）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１３８（配列番号：６）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−４３（配列番号：１１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０６（配列番号：１２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−３（配列番号：１３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−９−１０５（配列番号：１５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３０（配列番号：１７）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３１（配列番号：１９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１３３（配列番号：２０）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−９９（配列番号：２１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１５４（配列番号：２２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１０５（配列番号：２３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１１５（配列番号：２４）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−１７７（配列番号：２５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ２４−１０−４４（配列番号：２７）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０７（配列番号：２９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−３０（配列番号：３０）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１０６（配列番号：３２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−４９（配列番号：３６）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３（配列番号：３８）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−９−１３２（配列番号：４１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−７０（配列番号：４８）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−６（配列番号：４９）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０６（配列番号：５１）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０２（配列番号：５２）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３０（配列番号：５３）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−１０１（配列番号：５５）、ＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−２９（配列番号：５６）およびＵＢＥ２Ｔ−Ａ０２−１０−３８（配列番号：５８）の配列は固有のものであることが示され、したがって、本発明者らが知る限り、これらの分子が、何らかの非関連分子に対する意図されない免疫学的応答を引き起こす可能性はほとんどない。結論として、本発明者らはＵＢＥ２Ｔ由来の新規ＨＬＡ−Ａ＊２４０２エピトープペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープペプチドを同定した。さらに、ＵＢＥ２Ｔのエピトープペプチドは、がん免疫療法に適していることが実証された。
本発明は、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、かつ幅広いがんの種類に対する適用性を有し得る、ＵＢＥ２Ｔ由来の新規エピトープペプチドを提供する。そのようなペプチドは、ＵＢＥ２Ｔに関連する疾患、例えばがん、特に、膀胱がん、乳がん、子宮頚がん、胆管細胞がん、ＣＭＬ、大腸がん、食道がん、胃がん、びまん性胃がん、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、ＳＣＬＣ、軟部組織腫瘍および精巣腫瘍に対するペプチドワクチンとして使用することができる。
本明細書において、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明しているが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。慣例的な実験を通して、当業者は、その境界および限界が添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変がその中でなされ得ることを容易に認識するであろう。

Claims (20)

  1. 細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含むペプチド：
    （ａ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列。
  2. 以下の（ｉ）または（ｉｉ）のオリゴペプチドである、請求項１に記載のペプチド：
    （ｉ）以下の特徴の一方または両方を有するペプチド：
    （ａ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンで置換されている；および
    （ｂ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７のアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンで置換されている；
    （ｉｉ）以下の特徴の一方または両方を有するペプチド：
    （ａ）配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンまたはメチオニンで置換されている；および
    （ｂ）配列番号：２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６または５８のアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸が、バリンまたはロイシンで置換されている。
  3. ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項１または２に記載のペプチド。
  4. 配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のペプチド。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  6. ＣＴＬを誘導するための組成物であって、以下からなる群より選択される少なくとも１種の有効成分を含む組成物：
    （ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド；
    （ｂ）請求項５に記載のポリヌクレオチド；
    （ｃ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを自身の表面上に提示する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）；および
    （ｄ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム。
  7. がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、以下からなる群より選択される少なくとも１種の有効成分を含む薬学的組成物：
    （ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド；
    （ｂ）請求項５に記載のポリヌクレオチド；
    （ｃ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣ；
    （ｄ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを自身の表面上に提示するエクソソーム；および
    （ｅ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを提示する細胞を認識することができるＣＴＬ。
  8. ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象への投与のために製剤化される、請求項７に記載の薬学的組成物。
  9. 以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法：
    （ａ）ＡＰＣを、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドと接触させる段階；および
    （ｂ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
  10. 以下からなる群より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法：
    （ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
    （ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエクソソームと共培養する段階；および
    （ｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、該サブユニットによって形成されるＴＣＲは、細胞表面上の請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に結合することができる、段階。
  11. ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたＡＰＣ。
  12. 請求項９に記載の方法によって誘導される、請求項１１に記載のＡＰＣ。
  13. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを標的とする、単離されたＣＴＬ。
  14. 請求項１０に記載の方法によって誘導される、請求項１３に記載のＣＴＬ。
  15. がんに対する免疫応答を対象において誘導する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
  16. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的活性断片。
  17. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
  18. 請求項１７に記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
  19. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５に記載のポリヌクレオチド、または請求項１６に記載の抗体もしくは免疫学的活性断片を含む、診断キット。
  20. ＵＢＥ２Ｔ由来の断片を提示する細胞に対する特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導する能力を有するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む、方法：
    （ｉ）配列番号：１、２、４、６、１１、１２、１３、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３２、３６、３８、４１、４８、４９、５１、５２、５３、５５、５６および５８からなる群より選択される元のアミノ酸配列に対して１個、２個、または数個のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入および／または付加することによって改変されたアミノ酸配列からなる候補配列を提供する段階；
    （ｉｉ）ＵＢＥ２Ｔ以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドとも実質的に有意な相同性を有さない候補配列を選択する段階；
    （ｉｉｉ）段階（ｉｉ）において選択される候補配列からなるペプチドを抗原提示細胞と接触させる段階；
    （ｉｖ）段階（ｉｉｉ）の抗原提示細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞と接触させる段階；ならびに
    （ｖ）ＣＴＬ誘導能が、前記元のアミノ酸配列からなるペプチドと同じであるかまたはそれよりも高い前記ペプチドを特定する段階。
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