JP2015526521A - Lpa2受容体特異的安息香酸誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年8月27日に出願された米国仮特許出願第61/693,731号の優先権の恩典を主張し、この内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、新規の安息香酸誘導体を含む組成物に関する。より具体的には、本発明は、新規のスルファモイル安息香酸誘導体を含む化合物に関し、これらの化合物はLPA2受容体アゴニストとして作用する。
増殖因子様リゾリン脂質であるリゾホスファチジン酸(LPA)およびスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、細胞生存、細胞増殖、細胞運動性および移動を含む、多くの基本的な細胞応答を調節する。LPAは、アポトーシスの防止およびアポトーシスカスケードの進行からの細胞の救済において大きな活性を有することが示された。LPA模倣物であるオクタデセニルチオホスフェート(OTP)(Durgam et al., Synthesis and pharmacological evaluation of second-generation phosphatidic acid derivatives as lysophosphatidic acid receptor ligands. Bioorg Med Chem Lett (2006) 16(3): 633-640(非特許文献1))は、放射線誘発アポトーシスからの細胞および動物の救済において、LPAと比較して、インビトロおよびインビボで優れた効能を示した(Deng et al., The lysophosphatidic acid type 2 receptor is required for protection against radiation-induced intestinal injury. Gastroenterology (2007) 132(5): 1834-1851(非特許文献2))。
式中、Aは、
であり;
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり;
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり;
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり;かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
である。
式中、Aは、
であり;
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり;
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり;
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり;かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
である。
本発明者らは、LPA2受容体特異的アゴニストとして有用である安息香酸誘導体を含む化合物を開発し、これらの化合物は、損傷細胞における、例えば、照射によっておよび/または癌化学療法のために使用されるもののような化学療法剤への曝露によって損傷された細胞におけるアポトーシスを、阻害することについて有効である。化合物は、細胞増殖を促進することについても有効であり、標的細胞の増殖を促進するために、治療的にまたは例えば組成培養物中においてのいずれかで使用され得る。LPAは、マクロファージ、シュワン細胞、Tリンパ球、線維芽細胞、内皮細胞、および骨芽細胞における細胞生存の増大と関連付けられた。現在の証拠は、これがLPA2媒介効果であることを示唆している。したがって、本発明の化合物を含む組成物はまた、免疫障害、損傷後の骨再形成、内皮機能不全、およびうっ血性心不全などの様々な状態において治療効果を有し得る。
式中、Aは、
であり;
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり;
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、H、NO2、Br、Cl、またはOCH3であり;
Bは、C2〜C8アルキルまたはアルケニルであり;かつ
Cは、F、Cl、Br、NO2、NH2、OCH3、CH3、CO2H、またはフェニルで置換されていてもよい
である。
乾燥アセトン中のベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン1(1当量)の溶液へ、無水K2CO3(3当量)および対応のジブロモアルカン(2a〜c)(3当量)を添加した。反応混合物を22時間還流し、室温まで冷却し、濾過した。溶媒を減圧下で蒸発させ、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題化合物を得た。
DMF中の2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4(1当量)および無水K2CO3(5当量)の撹拌混合物へ、2-(ブロモアルキル)ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(3a〜c)(3当量)を添加した。反応混合物を一晩穏やかに還流し、室温まで冷却し、砕氷中へ注いだ。得られた溶液を濃HClで酸性化し、クロロホルムで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、所望の生成物を得た。
DMF中の6-置換ベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン1,1-ジオキシド6a〜c(1当量)および無水K2CO3(5当量)の撹拌混合物へ、2-(4-ブロモブチル)-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-1,3(2H)-ジオン(3b)(3当量)を添加した。反応混合物を一晩穏やかに還流し、室温まで冷却し、砕氷中へ注いだ。得られた溶液を濃HClで酸性化し、クロロホルムで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題生成物を得た。
ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(1)および1,2ジブロモプロパン(2a)を使用してGP-1に従って、この化合物を調製した。EtOAc-ヘキサンを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、3aを得た。
ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(1)および1,2ジブロモブタン(1,2 dibromobuane)(2b)を使用してGP-1に従って、この化合物を調製した。EtOAc-ヘキサンを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、3bを得た。
ベンゾ[de]イソキノリン-1,3-ジオン(1)および1,2ジブロモペンタン(2c)を使用してGP-1に従って、この化合物を調製した。EtOAc-ヘキサンを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、3cを得た。
2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4および化合物3aを使用してGP-2に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、5aを得た。
2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4および化合物3bを使用してGP-2に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、5bを得た。
2-スルファモイル安息香酸エチルエステル4および化合物3cを使用してGP-2に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、5cを得た。
6-ニトロベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン1,1-ジオキシド6aを使用してGP-3に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、7aを得た。
6-ブロモベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン1,1-ジオキシド6bを使用してGP-3に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、7bを得た。
6-メトキシベンゾ[d]イソチアゾール-3(2H)-オン1,1-ジオキシド6cを使用してGP-3に従って、化合物を調製した。MeOH-CHCl3を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、7cを得た。
DMF中の3-オキソ-2,3-ジヒドロベンゾ[d]イソチアゾール-6-カルボン酸1,1-ジオキシド(8)(1 mmol)および無水K2CO3(5 mmol)の撹拌混合物へ、2-(4-ブロモブチル)-1H-ベンゾ[de]イソキノリン-1,3(2H)-ジオン(3b)(3 mmol)を添加した。反応混合物を一晩穏やかに還流し、室温まで冷却し、砕氷中へ注いだ。得られた溶液を濃HClで酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。MeOH-CHCl3(2:8)を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって粗残渣を精製し、所望の生成物を得た。
9 (50 mg)および水性1 N NaOH(3 mL)の懸濁液を室温で10分間撹拌した。この懸濁液へ、溶液が透明になるまでエタノール(2 mL)を添加した。出発物質が消滅するまで、撹拌を2時間継続した。溶液を氷水中へ注ぎ、37% HClでpH 1へ酸性化した。得られた塊を酢酸エチルで抽出し、有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮し、粗生成物を得た。EtOAc-ヘキサン-DCMを使用して粗残渣を再結晶させ、表題化合物を得た。
Autodock Vina(Trott and Olson, AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J. Comput. Chem. (2010) 31(2): 455-461)を使用して、Sardarら(Sardar et al., Molecular basis for lysophosphatidic acid receptor antagonist selectivity. Biochim Biophys Acta (2002) 1582(1-3): 309-317)によって報告された活性化LPA2受容体相同性モデル中へ化合物をフレキシブルにドッキングさせた。ドッキング前に、Molecular Operating Environmentソフトウェア(MOE、2010.10バージョン)中のMerck Molecular Force Field 94(MMFF94)を用いて、化合物および受容体相同性モデルを両方ともエネルギー最適化した。ドッキングシミュレーションを、65×63×50Åの寸法を有するドッキングボックスおよび20の結合モードの探索スペースを使用して行い、網羅的探索パラメータ(exhaustive search parameter)を5に設定した。ベストドッキングポーズを、最小エネルギー・コンフォーメーションに基づいて選択した。最後に、ベストポーズをMOE中のMMFF94を使用してさらにリファインした。
NSC12404の類似性探索を、UC-DDCライブラリーデータベース(drugdiscovery.uc.edu)を使用して行った。参照化合物についてのTanimoto類似性インデックスを、Pipeline Pilotソフトウェア(Accelerys, Inc.; San Diego, CA)中のECFC6、FCFP4、およびFCFP6フィンガープリントを使用して計算した。Pipeline Pilotフィンガープリントを使用してUC-DCCライブラリーをスクリーニングし、追加のLPA2リガンドを同定した。類似性閾値を80%に設定した。225個のリターンされたヒットの中から、類似性>80%を有する化合物を、類似性および構造がどれくらい緊密に参照化合物を反映したかを注意深く考慮して、目視検査によって選択した。LPA受容体活性化Ca2+動員アッセイを使用しての評価のために、合計27個の化合物を選択した。
BallesterosおよびWeinstein(Ballesteros and Weinstein, Integrated methods for the construction of three dimensional models and computational probing of structure-function relations in G-protein coupled receptors. Methods Neurosci (1995) 25: 366-425)によって記載されたように、膜貫通(TM)ドメイン中のアミノ酸にインデックス位置を割り当て、異なる数のアミノ酸を有するGPCR間の比較を容易にした。インデックス位置はX.YY.の形式であり、ここで、Xは、残基が現れるTMドメインを意味し、YYは、TMドメイン中の最も高度に保存された残基に対するその残基の位置を示し、これに自由裁量によって50位を割り当てる。
個々のLPA1、LPA2、LPA3、LPA4、およびLPA5の確立された受容体サブタイプ、ならびに推定のLPA受容体GPR87およびP2Y10を発現する安定細胞株、または適切な空ベクターがトランスフェクトされた対照は、以前に作製および記載された(Murakami et al., Identification of the orphan GPCR, P2Y(10) receptor as the sphingosine-1-phosphate and lysophosphatidic acid receptor. Biochem Biophys Res Commun (2008) 371(4): 707-712; Tabata et al., The orphan GPCR GPR87 was deorphanized and shown to be a lysophosphatidic acid receptor. Biochem Biophys Res Commun (2007) 363(3): 861-866; Williams et al., Unique ligand selectivity of the GPR92/LPA5 lysophosphatidate receptor indicates role in human platelet activation. J Biol Chem (2009) 284(25): 17304-17319)。細胞内Ca2+のリガンド活性化動員についてのアッセイを、以前に記載されたように(Durgam et al., Synthesis and pharmacological evaluation of second-generation phosphatidic acid derivatives as lysophosphatidic acid receptor ligands. Bioorg Med Chem Lett (2006) 16(3): 633-640)、Flex Station 2自動蛍光プレートリーダー(Molecular Devices; Sunnyvale, CA)を使用して行った。適切な濃度のテスト化合物を、単独で使用する(アゴニスト試験のため)か、または、試験されるLPA受容体についてそれぞれ約EC75濃度のLPA18:1と混合した(アンタゴニストスクリーニング)。細胞に、30分間、0.01%プルロニック酸を含有するKrebs緩衝液中のFura-2-アセトキシメチルエステル(Fura-2/AM)を負荷し、Ca2+動員を測定する前にKrebs緩衝液でリンスした。リガンド添加の2分後の510 nmでのピーク発光の比率を、340 nm/380 nmの励起波長について測定した。全てのサンプルを四つ組で実行した。所定の受容体についてのEC75濃度のLPA18:1に対する10μMのテスト化合物によって誘発された阻害(Ι10μM)を、用量反応曲線から内挿した。半最大有効濃度(EC50)、および阻害定数(Ki)値を、KaleidaGraphソフトウェア(バージョン4.1, Synergy Software; Dubai, United Arab Emirates)を使用して用量反応データポイントへシグモイド関数を適合させることによって計算した。
マウス胚線維芽細胞(MEF)を、E13.5 LPA1&2ダブルノックアウト(DKO)胚から単離した。MEFに空ベクターまたはLPA2含有レンチウイルスを形質導入し、1.5μg/mlピューロマイシンで選択した。10%(V/V)ウシ胎仔血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補われたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中に細胞を維持した。無血清培地はDMEM中に0.1%(W/V)BSAを含有した。ラット腸上皮細胞株6(IEC-6)を、第13継代でAmerican Type Culture Collection (Rockville, MD)から得;第16〜21継代物を全ての実験において使用した。IEC-6細胞を90%空気および10%CO2の雰囲気中において加湿した37℃インキュベーター中に維持した。増殖培地は、5%熱不活性化FBS、10μg/mLインスリン、および50μg/mLゲンタマイシンが補われたDMEMからなった。血清飢餓培地の組成は、それがFBSを含有しなかった点を除いて、完全増殖培地の組成と同一であった。LPA2受容体を安定発現するMcArdleラットヘパトーマ細胞株(RH7777)は、Fumikazu Okajima博士(Gunma University, Maebashi, Japan)から提供された。LPA1またはLPA3受容体を安定発現するRH7777細胞は、インハウスで作製し、以前に特徴付けしていた。野生型およびLPA受容体(LPAR)が安定してトランスフェクトされたRH7777細胞を、250μg/ml G418の存在下で、10% FBSおよび2 mM L-グルタミンが補われたDMEM中において増殖させた。ベクターまたはLPA4受容体のいずれかを安定発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、Takao Shimizu博士(Tokyo University; Tokyo, Japan)から提供された。10% FBS、2 mM L-グルタミン、および350μg/ml G418を含有するHam F12培地中において細胞を培養した。ラット神経芽細胞腫細胞(B103)に、FLAG-LPA5の野生型を有するレンチウイルスを形質導入し、ピューロマイシンで選択し、安定細胞株を樹立した。10% FBSおよび0.4μg/mlピューロマイシンが補われたDMEM中において安定細胞を維持した。GPR87発現およびP2Y10発現CHO細胞ならびにベクタートランスフェクト対照細胞は、Norihisha Fujita博士(Ritsumeikan University; Shiga, Japan)から提供された。高浸潤性MM1ラットヘパトーマ細胞(Michiko Mukai博士, Osaka University, Japanから提供された)を、10%(V/V)FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補われたDMEM中の懸濁液中において増殖させた。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、VEC Technologies Inc. (Rensselaer, NY, USA)から購入し、10%(V/V)FBS、90μg/mLヘパリン、10 ng/mL EGF、1μg/mLヒドロコルチゾン、0.2 mg/mL EndoGrowth (VEC Technologies Inc.)サプリメント、100 U/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、および25μg/mLアンホテリシンBが補われたMCDB-131完全培地中において培養した。
細胞増殖に対するLPA受容体リガンドの効果を測定するために、ベクター-およびLPA2-形質導入MEF細胞(2×104)を、完全増殖培地中の24ウェルプレートの各ウェル中に平板培養した。細胞を翌日カウントし、培地を、1μM LPA、1μM OTP、または10μM GRI977143が補われたまたは補われていない1.5%(V/V)FBSを含有する培地と交換した。LPA、OTP、およびGRI977143を含有する培地を24時間ごとに新しくした。時間の関数としてZ1 Coulter Particle Counter (Beckman Coulter; Hileah, FL)を使用して三つ組で細胞数をカウントすることによって、増殖速度を測定した。
実験をベクター-およびLPA2-形質導入MEF細胞に対して行った。カスパーゼ3、7、8、または9活性およびDNA断片化を測定するために、細胞を48ウェルプレート中に平板培養した(2×104細胞/ウェル)。PARP-1切断およびBaxトランスロケーションを検出するために、1.5×106細胞を10cm皿中に平板培養し、完全増殖培地中において一晩培養した。翌朝、増殖培地を血清飢餓培地と置き換え、細胞をLPA(1〜10μM)、OTP(1〜10μM)、GRI977143(1〜10μM)、またはビヒクルで1時間前処理した。カスパーゼ活性、DNA断片化、PARP-1切断、およびBaxトランスロケーションを、1.7μMアドリアマイシンとのインキュベーションの5時間後または血清除去の24時間後に測定した。
コンフルエントな血清飢餓IEC-6細胞を、3時間、OTP(10μM)、GRI977143(10μM)、またはLPA(1μM)の存在下で、TNF-α(10 ng/ml)/シクロヘキシミド(CHX)(20μg/ml)で処理したかまたは処理しなかった。細胞をPBSで2回洗浄し、定量的DNA断片化アッセイを以前に記載されたように行った(Valentine et al., (S)-FTY720-vinylphosphonate, an analogue of the immunosuppressive agent FTY720, is a pan-antagonist of sphingosine 1-phosphate GPCR signaling and inhibits autotaxin activity. Cell Signal (2010) 22(10): 1543-1553)。
Caspase-Glow(登録商標)3/7、Caspase-Glow(登録商標)8およびCaspase-Glow(登録商標)9試薬を、Promega (Madison, WI)から購入し、製造業者の説明書に従って使用した。簡潔に記載すると、1ウェル当たり50μlの溶解試薬を添加し、続いて室温で30分間振盪することによって、細胞を溶解させた。可溶化物200μlを96ウェルホワイトウォールプレートへ移し、BioTek(登録商標)(Winooski, VT)プレートリーダーを使用してルミネセンスを測定した。
以前に記載されたように(Valentine et al., 2010)、アポトーシスさせた(apoptotically-challenged)細胞をPBSで2回洗浄し、定量的DNA断片化アッセイを、Cell Death Detection ELISA PLUSキット(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)を使用して行い、BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Inc.; Rockford, IL)を使用してタンパク質濃度に対して正規化した。核を含まない細胞可溶化物のアリコートを、ストレプトアビジンコーティングウェル中に置き、2時間室温で抗ヒストン-ビオチン抗体および抗DNAペルオキシダーゼ結合抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを除去し、ウェルを洗浄し、室温で2,2'-アジノ-ジ[3-エチルベンゾチアゾリン-スルホネート基質100μlと共にインキュベートし、その後、吸光度を405 nmで読み取った。本発明者らの以前の報告において詳述したように(Ray et al., Mdm2 inhibition induces apoptosis in p53 deficient human colon cancer cells by activating p73- and E2F1-mediated expression of PUMA and Siva-1. Apoptosis(2011) 16(1): 35-44)、結果を405 nmでの吸光度/分/mgタンパク質として表した。
HUVEC(第5〜7継代の1.3×105細胞)を、0.2%ゼラチンがプレコーティングされた12ウェルプレート(Sigma-Aldrich)の各ウェル中へ播種した。コンフルエントな単層が形成されるまで、細胞を2日間増殖させた。MM1細胞を、2時間、2μg/mLカルセインAM(Life Technologies; Grand Island, NY)でプレ標識し、2回リンスし、1ウェル当たり5×104細胞をHUVEC単層上に播種した。腫瘍-単層細胞浸潤を、1μM LPAまたは1〜10μM GRI977143を添加してまたは添加せずに、1% FBSを含有するMCDB-131完全培地中において20時間行った。単層をPBS(Ca2+およびMg2+を含有する)で繰り返しリンスすることによって非浸潤腫瘍細胞を除去し、続いて10%緩衝ホルマリンでの固定を行った。単層に浸透した腫瘍細胞を、位相差および蛍光照明でNIKON TiU倒立顕微鏡を使用して撮影した。蛍光および位相差画像を、Elements BRソフトウェア(Nikon、バージョン3.1x)を使用して重ね合わせた。1ウェル当たり合計5つの重複していない領域を画像化し、浸潤したMM1細胞(単層の真下で扁平形状を示す)の数をカウントした。
リガンド誘発ERK1/2活性化を検出するために、ベクター-およびLPA2-トランスフェクトMEF細胞を、1μM LPA、1μM OTP、10μM GRI977143、またはビヒクルへの10分間の曝露の3時間前に、血清飢餓処理した。ERK1/2活性化およびPARP-1切断測定のために、細胞を1×Laemmliサンプルバッファー中に採取し、12% Laemmli SDS-ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した。Baxトランスロケーションを評価するために、Cell Fractionation Kit-Standard (MitoSciences; Eugene, OR)を使用して、細胞可溶化物を細胞質、ミトコンドリア、および核フラクションに分離した。次いで、細胞質フラクションを75%トリクロロ酢酸での沈降によって濃縮し、ペレットを50 mM非中和Tris pH 10バッファーおよび6×Laemmliバッファー中に溶解した。サンプルを5分間沸騰させ、12% SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードした。ウェスタンブロット法を以前に記載されたように(Valentine et al., 2010)行った。pERK1/2、PARP-1、Bax(Cell Signaling Technology; Beverly, MA)、アクチン(Sigma-Aldrich)に対する一次抗体、および抗ウサギ-ホースラディシュペルオキシダーゼ二次抗体(Promega)を、製造業者の説明書に従って使用した。
LPA2は、TRIP6およびNHERF2と共に三元複合体を形成する。この複合体は、LPA2のC末端PSD95/Dlg/ZO-1ドメイン(PDZ)結合モチーフへのNHERF2の結合、LPA2のジンクフィンガー様CxxCモチーフへのTRIP6の結合、およびTRIP6のPDZ結合モチーフへのNHERF2の結合を含む、複数のタンパク質間相互作用によってアセンブルされている。リガンド誘発高分子複合体形成を調べるために、本発明者らの以前の刊行物(E et al., The LPA2 receptor-mediated supramolecular complex formation regulates its antiapoptotic effect. J Biol Chem (2009) 284: 14558-14571)に詳細に記載されるように、HEK293T細胞にFLAG-LPA2および高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)-NHERF2をトランスフェクトし、細胞を10分間10μM GRI977143へ曝露した。抗FLAG M2モノクローナル抗体結合アガロースビーズ(Sigma-Aldrich)を使用して複合体をプルダウンし、抗EGFP抗体(A.P. Naren博士;UTHSC, TNから提供された)、抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich)、および抗TRIP6抗体(Bethyl Laboratories; Montgomery, TX)を使用するウェスタンブロット法のために処理した。
三つ組で実行したサンプルについての平均値± SDまたはSEMとしてデータを表す。各実験を少なくとも2回繰り返した。対照および処理群間の比較のためにスチューデントt検定を使用した。p値≦0.05を有意と考えた。
LPAは、細胞タイプおよびそれが発現する受容体に応じて、マイトジェンまたはアンチマイトジェンとして機能し得る。本発明者らは、ベクター-(図4A)およびLPA2-形質導入MEF細胞(図4B)の細胞増殖に対するGRI977143の効果を試験した。LPAは、空ベクター-形質導入MEF細胞の増殖に対して有意な効果を有さなかった。同様に、GRI 977143は、72時間時点(p<0.05)以外は、ベクター細胞増殖の有意な増加を引き起こさなかった。対照的に、OTPは、24時間以降、空ベクター形質導入MEF細胞の増殖を有意に(p<0.001)増加させた。LPA2-形質導入MEFの増殖に対するLPA、OTPおよびGRI 977143の効果は全て、24時間以降、有意であった。
高浸潤性ラットヘパトーマMM1細胞は、LPA依存様式で中皮細胞単層に浸潤する。LPA2受容体は、MM1細胞において豊富に発現される。本発明者らは、LPA2のGRI977143媒介活性化がMM1細胞によるHUVEC単層の浸潤を刺激し得るかどうかを問題にし、結果は、1μM LPAがMM1細胞浸潤の有意な増加を引き起こした一方、浸潤の同一の有意な増加を誘発するためには、より高い(10μM)濃度のGI977143が必要であったことを示した(図5)。
本発明者らは、アポトーシスを誘発するためにアドリアマイシンを使用して、GRI977143の抗アポトーシス特性を調べた。GRI977143(10μM)は、LPA2形質導入MEF細胞におけるカスパーゼ9活性化を46±4%減少させ、この減少は、1μM LPAのそれと大きさの点で同様であり、一方、1μM OTPは、僅かにより小さな38±1%の減少をもたらした(図6A)。GRI977143は、ベクター形質導入細胞におけるカスパーゼ9活性化に影響を与えなかった一方、LPAおよびOTPは、1μM濃度であっても、カスパーゼ9活性化を20〜24%減少させた(図6A)。本発明者らは、次に、ベクター-およびLPA2形質導入MEF細胞におけるアドリアマイシン誘発カスパーゼ3および7活性化に対するテスト化合物の効果を試験した。GRI977143は、3μMを超えると有意な保護を誘発した(p<0.01)。10μM濃度で、GRI977143は、10μM LPAと同程度にカスパーゼ3および7活性化を減少させたが、10μM OTPの効果を上回った。LPAおよびOTPはLPA2形質導入MEF細胞を保護した。しかし、10μMで、LPAはまた、ベクター形質導入細胞において26±1%の阻害効果を有した。対照的に、10μMで適用した場合、GRI977143およびOTPは、ベクター形質導入細胞においてカスパーゼ3/7を弱めなかった(図6B)。
本発明者らはまた、GRI977143が、LPA2受容体を発現するまたはLPA2受容体を欠いている血清飢餓MEF細胞へ必要な栄養支援を提供することができるかどうかを調べた。このパラダイムでの実験によって、10μM GRI977143は、カスパーゼ3、7、8、および9活性化を減少させることにおいて非常に有効であり、さらにDNA断片化を減じたことが示された(図7)。GRI977143は、ベクター形質導入MEF細胞においてこれらのアポトーシスインジケータのいかなる減少も引き起こさなかった。対照的に、LPAおよびOTPは、ベクター形質導入MEF細胞も保護した。これらの結果は、アドリアマイシン誘発アポトーシスパラダイムにおける本発明者らの知見を反映し、LPA2活性化の役割を血清除去誘発アポトーシスの防止へと拡張させる。
本発明者らは、LPAおよびOTPは、TNFα誘発アポトーシスから非形質転換IEC-6陰窩様腸上皮細胞を保護および救済することを以前に実証した。IEC-6細胞は、LPA1/2/3/4 GPCR、GPR87およびP2Y5を内因的に発現する。したがって、本発明者らは、この外因性アポトーシスモデルにおいてGRI977143の効果を試験した。TNF-α/CHXでの処理はDNA断片化を20倍以上増加させる;断片化は、10μM OTPによって完全に遮断され、1μM LPAまたは10μM GRI977143処理によって有意に減少した(図8)。いずれのLPARアゴニストも、TNF-α/CHXの非存在下で培養物へ添加された場合、DNA断片化の検出可能ないかなる変化も引き起こさなかった。
GRI977143はカスパーゼ3、7、8、および9の活性化を減少させたので、本発明者らは、アドリアマイシンまたは血清除去によって誘発されるミトコンドリアへのBaxトランスロケーションに対する10μM GRI977143の効果を試験した。図9Aに示されるように、10μM GRI977143処理は、アドリアマイシン処理後、LPA2形質導入MEF細胞の細胞質中に高レベルのBaxを維持し、結果的にミトコンドリアへのそのトランスロケーションを減少させた。GRI977143は、ベクター形質導入MEFにおいてBaxトランスロケーションを減少させなかった。アポトーシスの血清除去モデルにおいて、本発明者らは、細胞質ゾルBaxレベルのいかなる変化も検出しなかった(図9B)。
GRI977143の抗アポトーシス効果を担う分子メカニズムの一部を解明するために、本発明者らは、LPA2受容体媒介抗アポトーシスシグナル伝達において必要なステップである、ERK1/2キナーゼの活性化に対するその効果を調べた。10分間の10μM GRI977143での処理は、LPA2形質導入MEF細胞においてERK1/2活性化を9.6倍増加させたが、ベクター形質導入細胞においてはこれらのキナーゼの基底活性を変化させなかった(図10A〜B)。
LPA2受容体媒介超分子複合体形成は、アドリアマイシン誘発アポトーシスに対する保護のために必要である。GRI977143によって活性化される分子メカニズムをさらに解明するために、本発明者らは、TRIP6、NHERF2、およびLPA2のC末端間のアゴニスト誘発シグナロソーム集合に対するその効果を調べた。この高分子(macomolecular)複合体は、ERK1/2およびプロテインキナーゼB-核因子κB(Akt-NFκB)生存経路の刺激による抗アポトーシス効果において重要な役割を果たす。GRI97143は、LPA2受容体へのTRIP6およびEGFP-NHERF2のリクルートメントによって示される高分子複合体の集合を誘発した(図10C)。ビヒクル処理細胞可溶化物中ではごく微量の三元複合体しか検出されず、GRI977143によるLPA2の活性化がシグナル伝達複合体の集合を誘発したことを示している。
この研究に使用したマウス胚線維芽細胞(MEF)を、LPA1/2ダブルノックアウト(LPA2-DKO)マウス{Lin, 2007 #132}から単離した。これらのMEFは、より低いレベルで内因的にLPA4/5/6受容体を発現するが、LPA1/2/3受容体サブタイプを完全に欠く。ヒトLPA2受容体をレンチウイルス形質導入によってこれらのMEF細胞中へ再導入した。これらをLPA2 DKO MEF{Lin, 2007 #132}と呼ぶ。EV DKO MEFと呼ぶ、空ベクター形質導入MEF細胞を対照として使用した。細胞を、10% v/vウシ胎仔血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補われたDMEM中において培養した。血清飢餓処理の間、増殖培地を、0.1%(w/v)BSAを含有するDMEMで置き換えた。
細胞を48ウェルプレート中に平板培養し(2×104細胞/ウェル)、完全増殖培地中において一晩培養した。翌朝、増殖培地を無血清飢餓培地と置き換え、細胞をLPA(1または3μM)、化合物5bまたは7b(1、3または10μM)で、1時間、前処理した。ベクターおよびLPA2形質導入MEF細胞において、アポトーシスを1.7μMアドリアマイシンによって誘発した。カスパーゼ3、7、8、9活性およびDNA断片化を、アドリアマイシン曝露の5時間後にアポトーシスを評価するために測定した。
MEF細胞を2×104細胞/ウェルの密度で48ウェルプレート中において照射の前日に平板培養した。照射の1時間前に、増殖培地を無血清飢餓培地へ変更し、細胞培養物を、3.2 Gy/分の線量率で、15 Gy y照射の線量へ曝露した。照射の1時間後、細胞をビヒクル(BSAもしくはDMSO)、LPA(1〜3μM)、化合物5bまたは化合物7b(両方とも1、3もしくは10μMで)のいずれかで処理した。カスパーゼ活性化、DNA断片化を照射の4時間後に測定した。
カスパーゼ活性化を測定するために、細胞を50μl Caspase-Glow(登録商標)試薬(Caspase 3/7、8、9 Promega, Madison, WI)中において溶解させた。細胞を室温(RT)で30分間カスパーゼ試薬と共に振盪した。30分後、BioTek (Winooski, VT)プレートリーダーを使用して、ルミネセンスを測定した。三つ組での平均カスパーゼ活性/実験群±SDを計算した。LPAを陽性対照として全ての実験において使用した。
Cell Death Detection ELISAアッセイキット(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)を使用することによって、DNA断片化を定量化した。細胞可溶化物20μlを、RTで2時間振盪しながら96ウェルストレプトアビジンコーティングプレート中において抗ヒストン-ビオチン 抗DNA-ペルオキシダーゼ結合抗体と共にインキュベートした。ウェルをインキュベーションバッファーで3回洗浄した後、2,2'-アジノ-ジ(3-エチルベンゾチアゾリン-スルホネート)基質100μl/ウェルを添加し、吸光度を405 nmで測定した。BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL)を使用して、タンパク質濃度を測定した。DNA断片化を吸光度単位/mgタンパク質として表した。LPAを陽性対照として全ての実験において使用した。
10週齢雌性C57BL/6マウスを、137Cs源からの15.68 Gy(約LD60/8〜10)線量のγ照射へ曝露した。照射の24時間後、PBS緩衝液中の0.8%DMSO、1%エタノール、2%プロパンジオール中に溶解された1 mg/kgのテスト化合物5b、7a、および7bの200μL単回皮下注射でマウスを処置した。動物を毎日観察し、餌および水を自由摂取させた。第4日以降、マウスにゲル餌も与えた。研究エンドポイントは第20日までの死亡率であった。結果を図20に示す。特に、化合物5aおよび7aは死亡率を有意に減少させ(p<0.001)、一方、この投薬および処方での化合物7bは効果がなかった。
LPA18:1と比較してのRP-10-71およびRP-10-73のCa2+動員のEC50値を測定するために、Fura-2AMが負荷されたLPA2 DKO MEF細胞の三つ組のウェルを、Krebs緩衝液中の等モル濃度のBSAの存在下で、0.0003---0.1μM LPA18:1または0.003〜3μM RP化合物で処理した。340/510 nmおよび380/510 nmのEx/Emλで、合計70秒間、蛍光を3.42秒ごとに読み取った。次いで、データ(相対的蛍光)を、各濃度についての三つ組の平均蛍光比率値として記録した。次いで、GraphPad Prismバージョン5.0aを使用し、可変傾斜モデルにおける非線形回帰曲線に適合させ(A)、EC50、Emax、およびカーブフィット(R2)を決定した(B)。結果を表3に示す。
[本発明1001]
下記式Iの化合物:
式中、Aは、
であり;
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり;
R 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 、およびR 6 は、独立して、H、NO 2 、Br、Cl、またはOCH 3 であり;
Bは、C 2 〜C 8 アルキルまたはアルケニルであり;かつ
Cは、F、Cl、Br、NO 2 、NH 2 、OCH 3 、CH 3 、CO 2 H、またはフェニルで置換されていてもよい
である。
[本発明1002]
Aが
である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
Cが
である、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
ヒトまたは動物対象の細胞および組織におけるアポトーシスを阻害するための方法であって、下記式Iの化合物を含む組成物の治療有効量を対象に投与する段階を含む、方法:
式中、Aは、
であり;
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり;
R 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 、およびR 6 は、独立して、H、NO 2 、Br、Cl、またはOCH 3 であり;
Bは、C 2 〜C 8 アルキルまたはアルケニルであり;かつ
Cは、F、Cl、Br、NO 2 、NH 2 、OCH 3 、CH 3 、CO 2 H、またはフェニルで置換されていてもよい
である。
[本発明1005]
Aが
である、本発明1004の化合物。
[本発明1006]
Cが
である、本発明1004の化合物。
[本発明1007]
1種もしくは複数種の化学療法剤、電離放射線、または両方の組み合わせの抗アポトーシス効果を防止または改善するためにヒトまたは動物対象を治療するための方法であって、治療有効量の下記式Iの化合物を対象に投与する段階を含む、方法:
式中、Aは、
であり;
Rは、Hまたは置換もしくは非置換フェニルであり;
R 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 、およびR 6 は、独立して、H、NO 2 、Br、Cl、またはOCH 3 であり;
Bは、C 2 〜C 8 アルキルまたはアルケニルであり;かつ
Cは、F、Cl、Br、NO 2 、NH 2 、OCH 3 、CH 3 、CO 2 H、またはフェニルで置換されていてもよい
である。
[本発明1008]
Aが
である、本発明1007の化合物。
[本発明1009]
Cが
である、本発明1007の化合物。
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