JP2015526503A - 口腔ケア - Google Patents
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Abstract
Description
前記植物材料を空気乾燥する工程;
前記植物材料を粉末状に粉砕する工程;
前記粉末をアルコールと混合することによって抽出する工程;
抽出物を少なくとも1回濾過する工程;及び
溶媒を蒸発して抽出物を保持する工程
を含む方法によって調製されてもよい。
調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程;
調製したエナメル質ブロックに微生物を添加する工程;及び
走査型電子顕微鏡(SEM)によってエナメル質上の微生物のコロニー形成を測定する工程
を包含する、歯のエナメル質表面への微生物の付着及びそのような付着に対する組成物の効果を評価する方法にまで広がる。
H.ナタレンシスの葉及び小枝を含む着生植物部分を収集した。植物は、プレトリア大学の植物園から1月に収集した。証拠標本を作製し、プレトリア大学のH.G.W.J.Schwelcherdt Herbarium(PRU)(PRU 096405)で同定した。
植物材料は、室温(25℃)で空気乾燥し、Janke&Kunkel(IKA Labortechnik(ドイツ))粉砕機を用いて微粉末に粉砕した。この粉末材料を、400mlのエタノール(Merck Chemicals(Pty)Ltd Wadeville(南アフリカ))と共に振盪することによって抽出した(Labcom shaker)。試料を、真空濾過器(Merck Chemicals(Pty)Ltd Wadeville(南アフリカ))を用いてWhattman No.1(直径110mm)(Merck Chemicals(Pty)Ltd Wadeville(南アフリカ))濾紙で濾過した。この過程を、数回繰り返した。溶媒をBUCHI Rotavapor(Labotec(PTY)Ltd.Halfway House(南アフリカ))を用いて、減圧下、40℃で蒸発させた。抽出物を室温でさらに乾燥し、その後抗菌試験を実施した。
本研究に使用した微生物には、アクチノマイセス・イスラエリイ(ATCC10049)、プレボテラ・インターメディア(ATCC25611)、ストレプトコッカス・ミュータンス(ATCC25175)、カンジダ・アルビカンス(Candia albicans)(ATCC10231)並びにポリエン及びアゾール耐性のカンジダ・アルビカンス菌株(1051604)が挙げられる。細菌は、カゼインペプトン・ソイミールペプトン寒天培地(CASO)(Merck Chemicals(Pty)Ltd Wadeville(南アフリカ))上で、Anaerocult(登録商標)A(Merck KGaA Darmstadt(ドイツ))を用いた嫌気ジャー内の嫌気性条件下で、37℃で72時間培養した。アクチノマイセス・イスラエリイ及びS.ミュータンスには、1%ショ糖添加CASO寒天(Merck Chemicals(Pty)Ltd Wadeville(南アフリカ))を用いた。C.アルビカンスの薬剤脆弱性及び薬剤耐性菌株は、サブローブドウ糖4%寒天培地(SDA)(Merck Chemicals(Pty)Ltd Wadeville(南アフリカ))上で、37℃で72時間培養した。継代培養は、2週間毎に実施した。細菌試験用微生物を、それぞれのブロス中に、濁度がマクファーランド濁度標準液1(Merck Chemicals(Pty)Ltd Wadeville(南アフリカ))に相当するまで懸濁することによって、接種材料を調製した。酵母試験用微生物は、滅菌蒸留水に、濁度がマクファーランド濁度標準液1(McFarland,1907)に相当するまで懸濁した。
Eloff(1998)が記載した96ウェルマイクロプレートを用いた微量希釈法を使用して、研究中の微生物に対する粗抽出物のMIC及びMBC値を得た。10%ジメチルスルホキシド(DMSO)(Merck Chemicals(Pty)Ltd)に溶解した抽出物を、細菌についてはブロス(A.イスラエリイ及びS.ミュータンスは強化培地)、カンジダ種については滅菌水に、段階希釈した;96ウェルプレートに37℃で48時間培養した微生物を添加した。抽出物の最終濃度は12.5〜0.10mg/mlの範囲で、陽性対照の5%クロルヘキシジングルコン酸塩(CHX)(Dental Warehouse、Sandton(南アフリカ))の最終濃度は12.5〜3.8×10−4mg/mlの範囲であった。実績のある抗真菌薬であるアムホテリシンB(Davis Diagnostics、Gauteng)を、0.2mg/ml〜1.5×10−3mg/mlの範囲で、カンジダアッセイに含めた。溶媒DMSOの最高濃度(2.5%)は、被験微生物に無毒であることが確認された。アクチノマイセス・イスラエリイ及びS.ミュータンスは、37℃、嫌気性条件下で、24時間インキュベートした;P.インターメディアは、37℃、嫌気性条件下で、48時間インキュベートした;C.アルビカンスは、37℃で、既に添加したp−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット(INT)(Sigma−Aldrich(南アフリカ))と共に、湿潤好気性条件下で24時間インキュベートした。
Vero細胞及びHEp−2細胞(Highveld Biological、Gauteng)を入れたマイクロタイタープレートを用いて、結果が優れた上位4種類のエタノール抽出物の細胞毒性を、Basson(2005)の方法に従って試験した。細胞毒性は、XTT(3’−[1−(フェニルアミノ−カルボニル)−3,4−テトラゾリウム]−ビス−[4メトキシ−6−ニトロ]ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物)法により、細胞増殖キットII(Roche Diagnostics GmbH)を用いて測定した。100μlのVero及びHEp−2細胞(1×105ml)をマイクロプレートに播き、24時間インキュベートして、細胞をプレートの底に付着させた。抽出物で希釈系列を作製し、様々な濃度(400〜3.1μg/ml)をマイクロプレートに添加して、72時間インキュベートした。XTT試薬を最終濃度0.3mg/mlに添加し、細胞を1〜2時間インキュベートした。陽性薬剤対照の塩酸ドキソルビシン(Sigma−Aldrich(南アフリカ))及びアクチノマイシンD(Sigma−Aldrich(南アフリカ))を、濃度範囲0.78〜0.01μg/mlでアッセイに含めた。インキュベーション後、色の吸光度を、固相酵素免疫測定法(ELISA)プレートリーダー(BIO−TEK Power−Wave XS,Weltevreden Park(南アフリカ))を用いて分光光度定量(690nmを基準波長として、490nmにおける光学密度を測定)した。アッセイは、トリプリケートで実施した。
H.ナタレンシスの葉及び小枝を含む着生植物部分を収集した。植物は、プレトリア大学の農園から1月に収集した。証拠標本を作製し、プレトリア大学のH.G.W.J.Schwelcherdt Herbarium(PRU)(PRU 096405)で同定した。メラレウカ・アルテニフォリア精油(Holistic Emporium cc,Gauteng(南アフリカ))、メンタ・ピペリタ精油(Holistic Emporium cc,Gauteng(南アフリカ))、及びTEAVIGO(登録商標)(Chempure(Pty)Ltd,Silverton(南アフリカ))も、本発明の研究用に購入した。
上清中のIL−8の濃度を、BD Bioscienceから得た固相酵素免疫測定(ELISA)キット(Pharmigen,OptEIA Human IL−8セット、カタログ番号555244)を用いて測定した。細胞をプレコートT−75フラスコ内の10%ウシ胎児血清(FBS)含有イーグル最小必須培地(MEM)中で培養し、コンフルエントになるまで2〜3日毎にリフィードした。続いて、コンフルエントな接着性単層を、ポリビニルピロリドン(PVP)−トリプシン−EDTAで処理した後にプラスチック表面から外し、24ウェルプレートに播種し、24時間後に処理を行った。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液で3回洗い、1mlの抗生物質不含培地を細胞に添加した後、この細胞を、過去に細胞培養研究で確認された非細胞毒性濃度のH.ナタレンシスで処理した。
植物抽出物がヒトの歯のエナメル質へのS.ミュータンスの付着に影響するか否かを明らかにするため、時間依存研究を実施した。最初に、H.ナタレンシス抽出物を、MIC濃度の1.82mg/ml及びMIC値以下の0.91mg/mlで、調製したエナメル質断片に添加し、1時間後にS.ミュータンスを添加した。2番目に、植物抽出物及びS.ミュータンスを一緒にエナメル質断片に添加した。最後にS.ミュータンスをエナメル質断片に添加し、1時間後に植物抽出物を添加した。植物抽出物は、各ウェルにデュプリケートで添加した。 陽性対照は、細菌の付着を防止する化学物質でコーティングしたエナメル質断片からなった。S.ミュータンス及びエナメル質断片のみの陰性対照を含めた。プレートを一晩インキュベートした。
24時間及び48時間の時点で、異なる濃度の植物抽出物を含有する組織培養ウェルの各々から1点のSEM用試料を採取し、エナメル質上での微生物のコロニー形成を明らかにした。試料は、Glauert(1975)及びHayat(1981)による生物学的SEM評価の標準方法に従って調製した。
乾燥したエタノール抽出物(60g)を、極性を高くするヘキサン:酢酸エチルのグラジエント(酢酸エチル0%〜100%)で溶出液として使用して、シリカカラム(10×70cm)で分画した。29の画分を採取し、薄層クロマトグラフィー(TLC)特性が類似した画分は合わせた(TLCプレートは、ヘキサン:酢酸エチル(7:3);ヘキサン:酢酸エチル(8:2);ジクロロメタン:メタン(99.5:0.5)及びジクロロメタン:メタン(99:1)を溶出液として展開した。酸性バニリン;3.5%硫酸メタノール溶液中バニリン0.34%;を検出に使用した)。13の主要画分(1B〜13B)が得られ、そのA.イスラエリイに対する抗菌活性を試験した(表1)。
エビデンスは、歯周病とフリーラジカル生成の増大及び唾液の抗酸化活性低下の両方による酸化剤−抗酸化剤間の不均衡との間の関係を示唆している。反応性酸素種(ROS)は、歯周組織の破壊に関係する(Alviano et al.,2008)。
MIC値の低下については改良チェッカーボード法を使用した。この方法は、被験薬剤及びその阻害ポテンシャルに関して多数の濃度変数を与えた。
植物自体はIL−8放出を誘発しない(図には示していない)が、IL−8の読取値は、4.6pg/mlにおいて、細菌及び細胞のみの陰性対照の値よりも高いことから、H.ナタレンシスとA.イスラエリイとの間にIL−8の放出を誘発するマイナスの相互作用があると思われる。H.ナタレンシスは0.88mg/mlでA.イスラエリイの成長を阻害し、3.32(mg/ml)で静菌性である;H.ナタレンシスはA.イスラエリイの付着機構を妨害するようには見えず、したがって別の方法で微生物に作用するはずである。
化合物の同定は、1H及び13C核磁気共鳴(NMR)及び分極移動による無歪増強(DEPT)によって実施した。単離化合物のアクチノマイセス・イスラエリイに対するHEp−2細胞でのMIC、MBC及びIC50を表4に示す。
化合物2及び3は、環Bの置換形式が異なり、環Cは非置換であるカルコンと認識された。化合物3を1H及び13C NMRのスペクトルデータに基づいて同定した。化合物3は、7.72(2H 2,6)、7.45(3H,3,4,5)に非置換環Cの1H NMRシグナルを示した。さらに、8.05及び7.73(1H,それぞれd,J=15.4Hz)にトランスアルケンのシグナル、6.08,6.02(それぞれs,H3’及び5’)に2つの芳香族プロトンのシグナルを、3.97のメトキシのシグナルに加えて示した。
1H NMRは、δΗ13.51ppmにC−6’のキレート化ヒドロキシルの低磁場シグナル;7.40(s,3H)、7.67(s,2H)に一置換ベンゼン環のシグナル、6.31に芳香族プロトンの別の一重線シグナル、8.02、7.79(d,J=15.8Hz)に2本の二重線、2.09に低磁場メチル基及び3.67にメトキシ基を示す。
化合物は、分光データからC−フラボノイドであることが明らかとなった。1H NMRはH2の5.44(d,J=14.2Hz)にシグナルを示した。2つのH−3プロトンは2.64(d,J=16.6Hz)及び3.04(dd,16.6,14.2Hz)に現れた。6.35(s)のシグナルはH−8に帰属され、7.40及び7.53のシグナルは一置換環Bに帰属され、メチル(C−6に結合)は2.04に現れ、メトキシ基は3.76に現れる。13C NMR及びDEPT−135は61.0及び8.0に2本のメチルシグナル、45.9にメチレン基、並びに79.3(C2)、100.0(C8)、126.6,129.1及び129.2に環Bの5本のメチンシグナルを示す。四級炭素の他のシグナルは、C−4(188.0)、C−7(163.4)、C−5(162.9)、C−9(1 16.5)、C1’(140.4)及びC−6(1 13.7)に属する。
1H NMRは、6.80(m)に5本の芳香族シグナル、5.92、5.84(それぞれbr.s)に2本のメタカップリングプロトン、4.55(d,J=7.0Hz)、3.36(m)[C−2,C−3]にジェミナルヒドロキシ基の2つのプロトンを、2.84(dd,J=16.1,4.8Hz)及び2.49(dd,J=16.1,8.4Hz)のメチレンプロトンに加えて示す。
この化合物は、周知のフラボノイドであるケルセチンと同定された。1H NMRは、7.82(br.s,H−2’)、7.70(br.d,J=8.0Hz,H−6’)、6.99(br.d,J=8.0Hz,H−5’)、6.52(br.s,H−8)及び6.26(br.s,H−6)の典型的なケルセチンシグナルを示した。
DPPH阻害(DPPHが無色に変わる箇所)のパーセンテージを、図2〜6に示すように、グラフから決定した。
Claims (43)
- ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)の抽出物を含む、潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するための口腔ケア組成物。
- 前記病原性の口腔微生物が、アクチノマイセス・イスラエリイ(Actinomyces israelii)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)及びカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の群から選択される任意の1つ以上の微生物を包含する、請求項1に記載の口腔ケア組成物。
- 前記微生物がアクチノマイセス・イスラエリイ(Actinomyces israelii)であり、前記口腔ケア組成物中の前記抽出物の濃度が少なくとも0.88mg/mlである、請求項2に記載の口腔ケア組成物。
- 前記微生物がストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)であり、前記口腔ケア組成物中の前記抽出物の濃度が少なくとも1.82mg/mlである、請求項2に記載の口腔ケア組成物。
- 前記組成物が、S.ミュータンス(mutans)の歯のエナメル質表面への菌膜形成及びグルカン結合を阻害する、請求項4に記載の口腔ケア組成物。
- 前記微生物がプレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であり、前記口腔ケア組成物中の前記抽出物の濃度が少なくとも3.13mg/mlである、請求項2に記載の口腔ケア組成物。
- 前記微生物がカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)であり、前記口腔ケア組成物中の前記抽出物の濃度が少なくとも8.33mg/mlである、請求項2に記載の口腔ケア組成物。
- 前記ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)の抽出物がアルコール抽出物である、請求項1に記載の口腔ケア組成物。
- 前記アルコール抽出物がエタノール抽出物である、請求項8に記載の口腔ケア組成物。
- 前記ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)の抽出物が水抽出物である、請求項1に記載の口腔ケア組成物。
- 前記抽出物が、以下の構造:
- 前記抽出物が、アウレンチアシンA、カルダモミン、5−ヒドロキシ−7−メトキシ−6−メチルフラバノン、ケルセチン、3,5,7−トリヒドロキシフラバン又はこれらの化合物の誘導体から選択される化合物の任意の1つ以上を包含するか又は豊富に含む、請求項1に記載の口腔ケア組成物。
- 前記抽出物が、
H.ナタレンシス(natalensis)の葉及び小枝を含む着生植物材料を収集する工程;
前記植物材料を空気乾燥する工程;
前記植物材料を粉末状に粉砕する工程;
前記粉末をアルコールと混合することによって抽出する工程;
前記抽出物を少なくとも1回濾過する工程;及び
溶媒を蒸発して前記抽出物を保持する工程
を含む方法によって調製される、請求項1に記載の口腔ケア組成物。 - 前記方法が、前記抽出物を乾燥して乾燥アルコール抽出物を作製する更なる工程を包含する、請求項13に記載の口腔ケア組成物。
- 前記組成物が1つ以上の精油を包含する、請求項1に記載の口腔ケア組成物。
- 前記1つ以上の精油が、メラレウカ・アルテニフォリア(Melaleuca alternifolia)及びメンタ・ピペリタ(Mentha piperita)の群から選択される任意の1つ以上を包含してもよい、請求項15に記載の口腔ケア組成物。
- 前記組成物が1つ以上の他の植物抽出物を包含する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の口腔ケア組成物。
- 前記1つ以上の他の植物抽出物が緑茶抽出物の形態である、請求項17に記載の口腔ケア組成物。
- 前記組成物が、メラレウカ・アルテニフォリア(Melaleuca alternifolia)精油、メンタ・ピペリタ(Mentha piperita)精油、及び濃縮緑茶抽出物を包含する、請求項18に記載の口腔ケア組成物。
- 潜在的に病原性の口腔微生物がプレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)であり、ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)抽出物の濃度が少なくとも3.13mg/mlであり、濃縮緑茶抽出物の濃度が少なくとも2mg/mlであり、メンタ・ピペリタ(Mentha piperita)精油の濃度が少なくとも0.05体積%であり、メラレウカ・アルテニフォリア(Melaleuca alternifolia)精油の濃度が少なくとも0.05体積%である、請求項19に記載の口腔ケア組成物。
- 潜在的に病原性の口腔微生物がカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)であり、ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)抽出物の濃度が少なくとも3.13mg/mlであり、濃縮緑茶抽出物の濃度が少なくとも4mg/mlであり、メンタ・ピペリタ(Mentha piperita)精油の濃度が少なくとも0.05体積%であり、メラレウカ・アルテニフォリア(Melaleuca alternifolia)精油の濃度が少なくとも0.01体積%である、請求項19に記載の口腔ケア組成物。
- 潜在的に病原性の口腔微生物がストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)であり、ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)抽出物の濃度が少なくとも0.78mg/mlであり、濃縮緑茶抽出物の濃度が少なくとも0.78mg/mlであり、メンタ・ピペリタ(Mentha piperita)精油の濃度が少なくとも0.002体積%であり、メラレウカ・アルテニフォリア(Melaleuca alternifolia)精油の濃度が少なくとも0.0004体積%である、請求項19に記載の口腔ケア組成物。
- 潜在的に病原性の口腔微生物がストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)及びカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を包含し、ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)抽出物の濃度が少なくとも3.13mg/mlであり、濃縮緑茶抽出物の濃度が少なくとも4mg/mlであり、メンタ・ピペリタ(Mentha piperita)精油の濃度が少なくとも0.05体積%であり、メラレウカ・アルテニフォリア(Melaleuca alternifolia)精油の濃度が少なくとも0.05体積%である、請求項19に記載の口腔ケア組成物。
- 前記組成物が、カプセル、錠剤、洗口液、ゲル、ペースト、練り歯磨き、含浸デンタルフロス、チューインガムから選択される群の任意の1つを包含する口腔送達システムに配合される、請求項1に記載の口腔ケア組成物。
- 潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害する口腔ケア組成物の製造における、ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)抽出物の使用。
- 前記潜在的に病原性の口腔微生物が、アクチノマイセス・イスラエリイ(Actinomyces israelii)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)及びカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の群から選択される任意の1つ以上の微生物を包含する、請求項19に記載の使用。
- 組成物の抗酸化活性による歯周病治療のための口腔ケア組成物の製造における、ヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)抽出物、メラレウカ・アルテニフォリア(Melaleuca alternifolia)精油、メンタ・ピペリタ(Mentha piperita)精油及び濃縮緑茶抽出物を包含する組成物の使用。
- 歯周病を治療する方法に使用するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載の口腔ケア組成物を含む物質又は組成物。
- 潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するための口腔ケア組成物であって、アウレンチアシンA又はその誘導体を包含する、組成物。
- 潜在的に病原性の口腔微生物の成長を阻害するための、アウレンチアシンA又はその誘導体の使用。
- 歯周病を治療する方法に使用するための、アウレンチアシンA又はその誘導体を含む物質又は組成物。
- 前記緑茶抽出物が濃縮緑茶抽出物の形態である、請求項18に記載の口腔ケア組成物。
- 調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程;
調製したエナメル質ブロックに微生物を添加する工程;及び
走査型電子顕微鏡(SEM)によってエナメル質上の微生物のコロニー形成を測定する工程
を包含する、歯のエナメル質表面への微生物の付着及びそのような付着に対する組成物の効果を評価する方法。 - 前記調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程及び調製したエナメル質ブロックに微生物を添加する工程が同時に起こる、請求項33に記載の方法。
- 前記調製したエナメル質ブロックに微生物を添加する工程が、調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程の前に起こる、請求項33に記載の方法。
- 前記調製したエナメル質ブロックに組成物を添加する工程及び微生物の添加が、ある時間が経過した後で起こる、請求項33に記載の方法。
- 前記調製したエナメル質ブロックは、ヒトから歯を抜去し、該歯を滅菌し、該歯の歯冠を除去し、該歯冠をブロック体に切断することによって得られる、請求項33に記載の方法。
- 実質的に本明細書に記載及び例示された通りの請求項1〜29のいずれか一項に記載の口腔ケア組成物。
- 実質的に本明細書に記載及び例示された通りの請求項25に記載のヘテロピクシス・ナタレンシス(Heteropyxis natalensis)抽出物の使用。
- 実質的に本明細書に記載及び例示された通りの請求項27に記載の組成物の使用。
- 実質的に本明細書に記載及び例示された通りの請求項28又は31に記載の物質又は組成物。
- 実質的に本明細書に記載及び例示された通りの請求項30に記載のアウレンチアシンA又はその誘導体の使用。
- 実質的に本明細書に記載及び例示された通りの請求項33に記載の歯のエナメル質表面への微生物の付着を評価する方法。
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