JP2015511610A - エンテロコッカス・フェカリスの細胞壁高分子及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
R2はH又はα−D−Glcpから選択される)、
並びにその誘導体及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される腸球菌細胞壁成分によって解決される。ここでRhapは6−デオキシ−マンノピラノース(ラムノース)であり、GalpNAcは2−アセトアミド−2−デオキシ−ガラクトピラノース(N−アセチル−ガラクトサミン)であり、Glcpはグルコピラノースである。
細菌株、生育条件及び培地
エンテロコッカス・フェカリスを、指定のそれぞれの抗生物質を添加したトリプチックソイブロス(TSB)(Carl Roth,Karlsruhe)中で撹拌せずに37℃で培養した。短期培養物をトリプチックソイ寒天(TSA)で生育させ、4℃で貯蔵した。腸球菌細胞壁多糖の単離のための培養物を静止期まで18時間生育させ、遠心分離によって採取した。大腸菌(E. coli)培養物を、指定の抗生物質を添加したルリア−ベルターニ(LB)培地(Carl Roth,Karlsruhe)中で好気的に培養した。
エンテロコッカス・フェカリスV583の遺伝子EF_1172の標的化挿入突然変異体を、Rigottier-Gois et al.(Rigottier-Gois L, Alberti A, Houel A, Taly J-F, Palcy P, Manson J, et al. Large-Scale Screening of a Targeted Enterococcus faecalis Mutant Library Identifies Envelope Fitness Factors. PLoS ONE. 2011 Dec 15;6(12):e29023)により記載されるように作製し(done)、標的化挿入の局在化を以前に記載されているようなPCR及びサザンブロット法によって検証した。
正常なヒトプール血清を、インフォームドコンセントを受けた健常ボランティアから得た。ウサギ乳児血清はCederlane Laboratoriesから入手した。C1q枯渇血清はQuidelから購入した。血清の熱不活性化を、56℃で20分間のインキュベーションにより行った。血清から、4℃で60分間の細菌細胞による吸収によってエンテロコッカス・フェカリスV583に対する特異的Abを枯渇させた。吸収後に、細菌を遠心分離によってペレット化し、上清を0.2μmフィルターに通した。
ヒト白血球(WBC)による細菌オプソニン食作用を、以前に記載されているように測定した(Theilacker C, et al. Serodiversity of Opsonic Antibodies against Enterococcus faecalis-Glycans of the Cell Wall Revisited. PLoS ONE. 2011;6(3):e17839)。簡潔に述べると、細菌株をTSB中で対数中期(OD600=0.4)まで生育させ、15%ウシ胎仔血清を添加したRPMIで希釈した。WBCを健常ボランティアの血液からヘパリン−デキストランバッファーを用いた沈降により精製し、残存する赤血球を1%NH4Cl溶液中での低張溶解(hypotonic lysis)により除去した。15倍に希釈したウサギ乳児血清を補体源とした。標的株に対する天然Abを除去するために、補体を上記のようにエンテロコッカス・フェカリスV583で吸収した。熱死滅エンテロコッカス・フェカリスV583に対して産生されるウサギ血清を2500倍の希釈率でAb源とした。対照チューブでは、Ab、補体又はPMNはアッセイから除外した。オプソニン食作用の測定については、等量の2.5×106個のPMN、2.5×106CFUの細菌、補体及び熱不活性化免疫ウサギ血清を合わせた。90分間のインキュベーションの後、反応を4℃で停止し、PMNを低張溶解によって溶解し(lysed)、段階希釈物のプレーティングによって生存細胞数を決定した。
食作用アッセイを変更した記載のように行った(Rooijakkers SH, et al. Immune evasion by a staphylococcal complement inhibitor that acts on C3 convertases. Nat Immunol. 2005 Sep;6(9):920-7)。ヒトプール血清を上記のようにエンテロコッカス・フェカリスで吸収させ、0.05%ヒト血清アルブミン(HSA)を添加したRPMIでそれぞれの濃度まで希釈した。次に、7.5×104個の新たに単離されたヒト好中球及び7.5×105個のFITC標識熱死滅エンテロコッカス・フェカリスV583野生型又はエンテロコッカス・フェカリスV583Δ1172を添加し、750rpmで振盪しながら37℃で15分間インキュベートした。RPMI(0.1%HSA)中の1.5%氷冷パラホルムアルデヒドを添加することによって反応を停止した。10000個のゲーティングした好中球の蛍光を測定するフローサイトメトリー(FACSCalibur;Becton Dickinson)によって食作用を分析した。熱不活性化血清を補体非依存性食作用の対照として使用した。
エンテロコッカス・フェカリス株をOD600が0.5となるまでTSB中で生育させ、0.1%BSAを含むHEPES++バッファー(20mM HEPES、140mM NaCl、5mM CaCl2、2.5mM MgCl2)で洗浄した。12.5×105個の細菌を血清とともに900rpmで振盪しながら30分間インキュベートした。細菌を、0.1%BSAを添加したPBSで洗浄した。C3b沈着を、マウス抗ヒトC3d Ab(Quidel)及びFITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Protos)を用いて検出した。10000個の細菌の蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。古典的経路及びレクチン経路を、細菌を補体とともにHEPES++バッファー+5mM MgCl2及び10mM EGTA(pH7.5)の存在下でインキュベートすることによって破壊した。古典的経路の特異的な不活性化のために、C1q枯渇血清(Quidel)を使用した。C3転換酵素複合体(C4bC2a)を、ヒトC4/C4dに対するモノクローナル抗体(Quidel)、及び二次抗体としてヤギポリクローナル抗マウスFITCコンジュゲート(Dako)を用いて測定した。ヤギポリクローナル抗MASP−2 Ab(Santa Cruz Biotechnology)を用いてMASP−2沈着を検出した。
腸球菌細胞壁多糖の単離のために、細菌を上記のように培養した。細菌を洗浄し、消化バッファー(PBS+20mM CaCl2、20mM MgCl2、0.05%NaN3)に再懸濁し、ムタノリシン(0.01mg/mL)及びリゾチーム(0.5mg/mL)を用いて37℃で18時間酵素的に切断した。その後、不溶性物質を遠心分離によって除去し、上清をヌクレアーゼ(DNase I及びRNase、最終濃度0.1mg/mL)を用いて37℃で18時間処理した。タンパク質を、プロテイナーゼK(0.1mg/mL)を用いて56℃で8時間の消化によって分解した。上清をH2Oに対して十分に透析し(10ku MMCO)、凍結乾燥した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)のために、サンプルを50mM炭酸アンモニウムバッファー(pH8.8;0.02%NaN3)に溶解し、Sephacryl S 200カラム(1.6×100cm、GE Healthcare)にアプライした。ヘキソース及びリンの含量を以前に記載されているように測定し(Theilacker C, et al. Opsonic antibodies to Enterococcus faecalis strain 12030 are directed against lipoteichoic acid. Infect Immun. 2006 Oct;74(10):5703-12)、それぞれ0.29及び0.31のKavで溶出する陽性画分を合わせ、透析し、凍結乾燥した。得られた物質を20mM NaHCO3(pH8.0、0.02%NaN3)に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー(QセファロースFF、GE Healthcare)に供した。
粗腸球菌細胞壁炭水化物のSDS−PAGEのために、40mLの培養物を遠沈し、ペレットを上記のようにムタノリシン、リゾチーム、ヌクレアーゼ及びプロテイナーゼKで消化した。H2Oに対する十分な透析の後、100μgの凍結乾燥物質をNupage SDS−MES泳動バッファー(Invitrogen)中のプレキャスト10%Nupage Novex BisTrisゲル(Invitrogen)で分離した。炭水化物をStains All又は過ヨウ素酸シッフ(PAS)試薬で以前に記載されているように染色した(Theilacker C, Kaczynski Z, Kropec A, Sava I, Ye L, Bychowska A, et al. Serodiversity of Opsonic Antibodies against Enterococcus faecalis-Glycans of the Cell Wall Revisited. PLoS ONE. 2011;6(3):e17839、Hancock LE, Gilmore MS. The capsular polysaccharide of Enterococcus faecalis and its relationship to other polysaccharides in the cell wall. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Feb 5;99(3):1574-9)。
中性糖の定性分析及び定量分析を、以前に記載されているように加水分解及び過アセチル化アルジトールアセテートのガスクロマトグラフィー(GC)により行った(Haseley SR, Holst O, Brade H. Structural and serological characterisation of the O-antigenic polysaccharide of the lipopolysaccharide from Acinetobacter haemolyticus strain ATCC 17906. Eur J Biochem. 1997 Mar 15;244(3):761-6)。ポリ−(5%−ジフェニル−95%−ジメチル)−シロキサンSPB−5−キャピラリーカラム(30m、内径0.32mm)を備えるAgilent GC System(6890N)を用いてGC分離を行った。シグナルをフレームイオン化によって検出し、Agilent ChemStation Version B 01.01ソフトウェアで分析した。糖の絶対配置を過アセチル化(S)−2−ブタノールグリコシドのGCによって決定した。
核磁気共鳴(NMR)分光法はAvance III Bruker 700MHz Ultrashield Plus分光計で標準ソフトウェア(Bruker)を適用して行った。1H−NMR実験の動作周波数は700.75MHz、13C−NMR実験の動作周波数は176.20MHz、31P−NMR実験の動作周波数は283.67MHzであった。H−D交換のためにサンプルを繰り返しD2O(99.9%)に溶解し(solved)、窒素下で蒸発させ、最終測定のためにサンプルをD2O(99.99%)に溶解した。全スペクトルを27℃で記録した。化学シフトをppmで帰属し、内部標準として使用したアセトンの値(δH:2.225;δC:31.45)に従って較正した。
WTA生合成が損なわれたエンテロコッカス・フェカリス突然変異体は、特異的Abの非存在下でのオプソニン食作用に対してより感受性である
テイコ酸グリセロール(tag)遺伝子tagO(EF2198)、tagA(EF1173)及びtagB(EF1172)に対して高い相同性を有する遺伝子の挿入突然変異体は以前に構築されている(表1)(Rigottier-Gois L, Alberti A, Houel A, Taly J-F, Palcy P, Manson J, et al. Large-Scale Screening of a Targeted Enterococcus faecalis Mutant Library Identifies Envelope Fitness Factors. PLoS ONE. 2011 Dec 15;6(12):e29023)。
エンテロコッカス・フェカリスV583Δ1172の貪食取込みの増大が補体沈着の増大によるものであるか否かを試験するために、本発明者らはフローサイトメトリーによって細菌細胞に結合したC3bの量を測定した。標的株を用いた吸収により特異的Abを枯渇させたヒト血清を補体源として使用した。野生型細菌と比較して、エンテロコッカス・フェカリスV583Δ2198(tagOホモログ)及びエンテロコッカス・フェカリスV583Δ1172(図1C)に結合したC3bの濃度の増大が検出された。C3bは補体活性化の古典的経路、レクチン経路及び代替的経路の最終産物である。古典的経路及びレクチン経路の両方がC3転換酵素複合体C4bC2bの形成をもたらし、これによりC3がC3a及びC3bへと切断される。Ca2+は古典的経路及びレクチン経路の活性化の必須補因子である。
この仮説を調査するために、本発明者らはエンテロコッカス・フェカリス野生型及びV583Δ1172の細胞壁関連多糖の構造を特性化した。この目的で、ムタノリシン及びリゾチームによるペプチドグリカンの解重合後の細胞壁断片をSDS−PAGEによって分離し、PAS及びStains Allによって染色した(図2)。野生型株の細胞壁断片のSDS−PAGEから約60kuの広いバンドが明らかとなった。対照的に、エンテロコッカス・フェカリスV583Δ1172においては、このバンドは明らかにより遅く移動し、カチオン染料Stains Allによっては染色されず、負電荷モチーフの喪失が示唆された(図2)。
エンテロコッカス・フェカリスV583野生型及びその挿入突然変異体V583Δ1172の細胞壁抽出物をクロマトグラフィーによって更に精製した。最初に、物質をSECによって分離した。SDS PAGEでの異なる移動パターンにも関わらず、野生型及び突然変異体の細胞壁抽出物はSECにおいて同様の容量で溶出し、同様の分子量が示された。しかしながら、エンテロコッカス・フェカリスV583Δ1172に由来する物質が含有するリンはより少なかった。更なる分析のために、主要な炭水化物含有ピークの画分を合わせ(KAv 0.30)、陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。エンテロコッカス・フェカリス野生型に由来する物質は、175mM NaClでQセファロースから主要なリン含有ピークとして溶出した。対照的に、エンテロコッカス・フェカリスV583Δ1172における主要ピークは陰イオン交換カラムに結合せず、この場合も負電荷の喪失が示唆された。精製抽出物の組成分析から、両方の株の多糖がRha、Glc、GalN、GlcN、リビトール及びリン酸塩を含有することが明らかとなった。糖、リビトール及びリン酸塩のモル比の比較から、V583Δ1172多糖が野生型と比較しておよそ4倍少ないガラクトサミン及びリビトール、並びにおよそ2.5倍少ないリン酸塩を含有することが明らかとなった。1H NMR分光法では、エンテロコッカス・フェカリス野生型及びV583Δ1172の細胞壁多糖のアノマープロトンシグナルは異なっていたが、アノマー領域の不均一性により分子を更に分解することなく詳細な分析が排除された。
両方の細胞壁多糖の構造を更に調査するために、リン酸ジエステル結合をHF水溶液によって加水分解し、加水分解物をSECによって分画した(補足図1及び図3A)。野生型株の細胞壁断片と比較して、突然変異体多糖の溶出プロファイルは総カラム容量近くで溶出する低分子量ピークを欠いていた。野生型株に由来するこの低分子量物質をサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製し、組成分析を行った。リビトール含有TAの典型的な成分としてD−GalN、L−Rha、D−Glc及びリビトールの存在が確認された(表2)。HPAECによるこの物質の更なる分離から、OS I及びOS IIと表される2つの異なるオリゴ糖の存在が明らかとなり、これを続いて分取HPAECによって単離した。
Claims (14)
- 下記β−D−GalpNAc−リビトール構造:
R2はH又はα−D−Glcpから選択される)、
並びにその誘導体及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される腸球菌細胞壁成分。 - 請求項1に記載の腸球菌細胞壁成分を特異的に認識する抗体、又はモノクローナル抗体又はその抗原断片。
- 少なくとも1つの請求項1に記載の腸球菌細胞壁成分及び/又は少なくとも1つの請求項2に記載の抗体を、薬学的に許容可能な担体及び/又は賦形剤とともに含む医薬組成物。
- 式Iによる細胞壁成分を含む、請求項3に記載の医薬組成物。
- ワクチンとして配合される、請求項3又は4に記載の医薬組成物。
- 前記式Iによる細胞壁成分が複合糖質ワクチン中に存在する、請求項3〜5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 疾患の治療に使用される、請求項1に記載の腸球菌細胞壁成分、請求項2に記載の抗体又は請求項3〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載の腸球菌細胞壁成分を作製する方法であって、該腸球菌細胞壁成分を細菌画分から単離することを含むか、又は該腸球菌細胞壁成分からなる抗原を少なくとも部分的に化学合成によって合成することを含む、方法。
- 請求項2に記載の抗体を作製する方法であって、哺乳動物、又はウサギを請求項1に記載の腸球菌細胞壁成分、又は請求項3〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項5又は6に記載のワクチンで免疫化することを含む、方法。
- 請求項2に記載の抗体を作製する方法であって、該抗体をモノクローナル抗体として産生するハイブリドーマ細胞を生成することを含むか、又は前記抗体を宿主細胞において組換え産生することを含む、方法。
- 院内感染菌血症、心内膜炎、尿路感染、手術創感染及び異物感染で代表される細菌感染、又は腸球菌感染の治療への請求項1に記載の腸球菌細胞壁成分、請求項2に記載の抗体、又は請求項3〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
- 脊椎動物における少なくとも1つの腸球菌株に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記脊椎動物に免疫学的に有効な量の請求項1に記載の腸球菌細胞壁成分、請求項2に記載の抗体又は請求項3〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 脊椎動物における細菌感染を治療又は予防する方法であって、該脊椎動物に治療的に有効な量の請求項1に記載の腸球菌細胞壁成分、請求項2に記載の抗体又は請求項3〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 前記細菌感染が院内感染菌血症感染、心内膜炎、尿路感染、手術創感染及び異物感染等の腸球菌感染であり、VRE株、又はエンテロコッカス・フェカリスで代表される抗生物質耐性腸球菌に起因する、請求項13に記載の方法。
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- 2014-03-26 HK HK14102960.6A patent/HK1189893A1/xx not_active IP Right Cessation
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Non-Patent Citations (1)
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EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 207, no. 3, JPN6017003708, 1992, pages 1063 - 1075 * |
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