JP2015509000A - Ｈｃｖポリメラーゼ複合体の結晶構造および使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結晶形態および結晶構造を含む。他の実施形態では、本開示は、相同タンパク質を同定するため、ならびにＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの機能をモジュレートし得る薬剤をデザインまたは同定するために、結晶構造および構造座標を使用する方法を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本願は、２０１２年１月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／５８６，５８４号の優先権の利益を主張し、この出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

発明の背景
発明の分野
世界で推定１億８，０００万人の人々が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。これらのおよそ８０％が慢性肝疾患を発症し、かなりのサブセットが肝臓の硬変症に進行し、最終的に死亡する（Ｌａｖａｎｃｈｙ（２００９年）Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ． ２９巻（補遺１）：７４〜８１頁）。ＨＣＶは、小型の一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルスであり、デングウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルスおよびウエストナイルウイルスと同様、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの一員である。上記ウイルスがコードするＨＣＶポリタンパク質のＣ末端において見出される約５９０アミノ酸の６６ｋＤａタンパク質である非構造５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）タンパク質は、必要なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の機能性を提供する（Ｐｅｎｉｎら（２００４年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３９巻：５〜１９頁）。このポリメラーゼは、上記ウイルスによって提供される初期プラス鎖ＲＮＡ鋳型からこのポリメラーゼが合成する中間のマイナス鎖ＲＮＡを使用することによって、ウイルス粒子へのキャプシド形成のためのプラス鎖ＲＮＡを生成する。ＧＴＰ依存性のｄｅ ｎｏｖｏ開始は、ｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレオチド重合の好ましい様式である^７。
遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂをカバーする、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂのほぼ１００の結晶構造が報告されているが、全ての構造がＣ末端の膜アンカー尾部を欠いている^４。ＨＣＶ ＮＳ５Ｂは、容易に認識される「フィンガー」、「パーム」および「サム」ドメインと共に、多数のポリメラーゼに共通する「右手」形状を示す^８〜１０。成長するＲＮＡプライマー−鋳型対との複合体の野生型ＨＣＶポリメラーゼの高分解能結晶構造を取得するための大規模な努力は不首尾であると証明されたが、非生産的コンフォメーションのポリウリジン鋳型を有する構造が報告されている^１１。ＮＳ５ＢおよびＨＩＶ−１逆転写酵素^１２の結晶構造の重ね合わせは、ＨＣＶ伸長に関する最初期のモデルを提供した^８〜１０。しかし、サムドメインの残基４４２〜４５４に及ぶβ−ヘアピンループおよびＣ末端リンカーは、伸長に必要な出口（ｅｇｒｅｓｓ）を遮断し、ＨＩＶ−１ ＲＴで観察されたのと同様に、サムドメインは、ＲＮＡの存在下で移動すると予測された^８、９。ＧＴＰおよび鋳型とのバクテリオファージΦ−６ポリメラーゼの開始複合体^１３に対する類似から、このβ−ヘアピンループのＴｙｒ４４８は、ｄｅ ｎｏｖｏ開始の間の開始ＧＴＰに対してスタックし得る。結晶構造は、分子の作用機構に関する構造情報を提供する。

Ｌａｖａｎｃｈｙ（２００９年）Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ． ２９巻（補遺１）：７４〜８１頁 Ｐｅｎｉｎら（２００４年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３９巻：５〜１９頁

従って、ＨＣＶ感染症およびＨＣＶポリメラーゼ活性に関連する他の疾患に有用な新規治療剤を同定する必要性がなお存在する。成長するＲＮＡプライマー−鋳型との複合体の野生型ＨＣＶポリメラーゼの高分解能結晶構造は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＨＣＶ感染の阻害剤のデザインにおいて有用である。

発明の要旨
従って、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結晶形態および結晶構造を包含する。他の態様では、本開示は、相同タンパク質を同定するため、ならびにＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの機能をモジュレートし得る薬剤をデザインまたは同定するために、結晶構造および構造座標を使用する方法を提供する。本開示は、本明細書に記載されるように、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも一部分の構造座標から導出される点の３次元立体配置ならびに構造的に等価な立体配置もまた包含する。この３次元立体配置は、基質に結合していない場合または基質に結合した場合のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位を定義する複数のアミノ酸の位置を表す構造座標から導出される点を含む。

同様に、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに対して構造的に相同な分子または分子複合体の構造座標から導出される点の拡張可能な３次元立体配置ならびに構造的に等価な立体配置もまた包含する。構造的に相同な分子または分子複合体は、本明細書で定義される。有利なことに、構造的に相同な分子は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造座標を使用して、本開示の方法に従って同定することができる。

本開示に従う構造座標から導出される空間中の点の立体配置は、例えば、ホログラフィー画像、ステレオ図、モデルまたはコンピュータ表示画像として可視化され得、従って本開示は、かかる画像、図またはモデルを含む。

結晶構造および構造座標は、例えば、関連分子の構造情報を取得するため、ならびにＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性をモジュレートする薬剤を同定およびデザインするための方法において使用され得る。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの座標は、表１に提供される。ＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの座標は、表２および３に提供される。

図１Ａ／１Ｂは、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼ１ｂ ＷＴ、１ｂ Ｓ２８２Ｔおよび１ｂ Δ８構築物のｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成活性を示す図である。図１Ａでは、放射性ＲＮＡ産物を、以前に記載されたように、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して未反応の基質から分離した。これらの産物を、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して可視化および定量化した。図１Ｂでは、反応速度を、ＧｒａｐｈＦｉｔ（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｈｏｒｌｅｙ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を使用して計算した。試料１ｂ Δ８＿１および１ｂ Δ８＿２は、１ｂ Δ８タンパク質の２つの別々の調製物由来の試料を示す。

図２は、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼ１ｂ Δ８構築物についてのＲＮＡ合成およびＰＳＩ−３５２６６６による鎖終結を示す図である。ＰＳＩ−３５２６６６終結産物（^＊ＧＧＣＸ）は、次の正確な後継ヌクレオチド（ＡＴＰ）の存在下で、さらに伸長しなかった。レーンは、プレインキュベーション後０分、２分、５分、１０分、２０分、４０分、６０分の時間過程を示す。

図３は、ＰＳＩ−３５２６６６または２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰによる、ＨＣＶポリメラーゼ１ｂ ＷＴ、１ｂ Ｓ２８２Ｔ、１ｂ Δ８および１ｂ Δ８ Ｓ２８２Ｔの鎖終結を示す図である。

図４は、対称プライマー−鋳型ＲＮＡ（上）または融合プライマー−鋳型ヘアピンＲＮＡ（下）の非存在下および存在下でのＮＳ５Ｂポリメラーゼ１ｂ ＷＴのｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析を示す図である。

図５は、対称プライマー−鋳型ＲＮＡ（上）または融合プライマー−鋳型ヘアピンＲＮＡ（下）の非存在下および存在下でのＮＳ５Ｂポリメラーゼ１ｂ Δ８のｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析を示す図である。

図６Ａ／６Ｂは、対称プライマー−鋳型ＲＮＡ（上）または融合プライマー−鋳型ヘアピンＲＮＡ（下）の存在下でのＮＳ５Ｂポリメラーゼ２ａ ＷＴのｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析を示す図である。

図７は、２．５Å分解能のａｐｏ構造を生成した、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｉｎｄｅｘスクリーン条件Ｅ９（３０％ペンタエリスリトールエトキシレート、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、５０ｍＭ硫酸アンモニウム）中で成長したａｐｏ ２ａ Δ８の結晶を示す図である。

図８は、浸漬実験に使用し、５’−ＵＡＣＣＧ（３’−ｄＧ）で２．９Å分解能の構造を生成し５’−ＣＡＵＧＧＣ（２’，３’−ｄｄＣ）で３．０Å分解能の構造を生成した、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｉｎｄｅｘスクリーン条件Ｇ６（０．２Ｍ酢酸アンモニウム、０．１Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ５．５、２５％ ＰＥＧ ３３５０）から取得されたａｐｏ ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ２ａ Δ８の結晶を示す図である。

図９は、２．９Å分解能において５’−ＵＡＣＣＧ（３’−ｄＧ）で解明されたＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼ２ａ Δ８（上）および３．０Å分解能において５’−ＣＡＵＧＧＣ（２’，３’ｄｄＣ）で解明された２ａ Δ８（下）の結晶構造のＲＮＡ成分についての電子密度マップを示す図である。左側に、対称プライマー−鋳型ＲＮＡモデルが構築されたオミット電子密度マップ｜Ｆ_ｏ｜−｜Ｆ_ｃ｜が、３．０σでの輪郭の緑のメッシュで示される。右側に、最終精密化電子密度マップ２｜Ｆ_ｏ｜−｜Ｆ_ｃ｜。マップは、最終精密化ＲＮＡモデルとオーバーレイされる。各構造について、鋳型鎖は、サーモン色の炭素骨格で示され、プライマー鎖は、シアン色の炭素骨格で示される。

図１０ａ／１０ｂは、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの構造および内部欠失バリアントの活性を示す図である。１０ａ、慣習^１０に従って番号付けおよび着色した、フィンガー、パーム、サムおよびＣ末端リンカードメインを有する遺伝子型２ａ ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲｄＲｐ^２３の結晶構造。本研究において欠失させたβ−ヘアピンループは黄色で着色される。２つのループエレメントは、ＨＣＶ ＲｄＲｐの「右手」が「ＯＫ」のジェスチャーを形成し、従って、触媒部位へのＮＴＰ入口を完全に取り囲むかのように、フィンガードメインからサムドメインに向けて延びる^１０。β−鎖フィンガー領域は、後継鋳型ＲＮＡ鎖へのアクセスを潜在的に提供し、一方でα−フィンガー領域は、二本鎖ＲＮＡ産物について提唱された出口通路の一部を提供する。パームドメインは、公知のポリメラーゼの全てにわたる最も良好に保存された構造形体（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅ）であり、触媒残基を含む。サムドメインは、種々のポリメラーゼのうちで最も高い可変性を有するようである。ＨＣＶ ＮＳ５Ｂでは、サムドメインは、約１６０アミノ酸を含み、他のポリメラーゼにおける、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ ＲｄＲｐの１形質よりも有意に大きい^３０。この領域は、７つのα−ヘリックスと、疑いなしにＲＮＡ産物鎖にとっての出口経路であるものを部分的に遮断するパームドメインへと傾斜していく比較的独自のβ−鎖とを含む。１０ｂ、遺伝子型２ａ ＪＦＨ１分離株、野生型ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ（２ａ ＷＴ）およびβ−ヘアピンループが欠失していてＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーで置き換えられた構築物（２ａ Δ８）の、ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成活性であり、２ａ ＷＴと比較して２ａ Δ８について＞１００倍高い総活性を実証する。放射性標識産物の時間依存的形成がブロットで示される。右側に、２ａ ＷＴおよび２ａ Δ８の両方についての活性を、ヌクレオチド三リン酸アナログ阻害剤ＰＳＩ−３５２６６６の存在下で測定したところ、２ａ ＷＴについて６．０５±０．８２μＭおよび２ａ Δ８について６．４１±０．７５μＭのＩＣ_５０値が得られた。

図１１（ａ〜ｃ）は、ａｐｏ遺伝子型２ａ ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ野生型およびΔ８の結晶構造の比較を示す図である。１１ａ、図１中と同様に着色された、本明細書で決定された遺伝子型２ａ ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの２．５Å分解能結晶構造との、金色のリボンで示された遺伝子型２ａ ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ（ＰＤＢ ＩＤ ２ＸＸＤ）の以前に決定された閉鎖結晶構造^２３のオーバーレイ。フィンガードメインおよびパームドメインの残基６２〜３５０をアラインして、サムドメインにおける大きい移動を実証した。１１ｂ、閉鎖２ａ ＷＴ構造^２３中のサムドメインの相互作用。１１ｃ、プライマー突出部ヘリックス（ｐｒｉｍｅｒ ｂｕｔｔｒｅｓｓ ｈｅｌｉｘ）をプライマーグリップヘリックス（ｐｒｉｍｅｒ ｇｒｉｐ ｈｅｌｉｘ）に接続するループ残基３９７〜４０５の劇的な再配列ならびにサムドメイン中のいくつかのヘリックスの移動を示す、開放２ａ Δ８構造中のサムドメインの相互作用。パネルｂおよびｃは、パネルａについて記載したようにオーバーレイした。

図１２（ａ〜ｄ）は、プライマー−鋳型ＲＮＡを有する２ａ Δ８ ＨＣＶ ＮＳ５Ｂの結晶構造を示す図である。１２ａ、図１中と同様の着色を有する鋳型ＲＮＡ入口トンネルから見た構造の漫画による描写。鋳型鎖はサーモン色で着色し、プライマー鎖はシアン色で着色される。１２ｂ、膜表面を上にした、ポリメラーゼのＲＮＡ出口トンネルからの図。１２ｃ、対称プライマー−鋳型ＲＮＡ ５’−ＵＡＣＣＧ（３’−ｄＧ）および５’−ＣＡＵＧＧＣ（２’，３’−ｄｄＣ）との、２ａ Δ８の結晶構造のオーバーレイ。異なる配列および異なる鎖ターミネーターであるにもかかわらず、両方のプライマー−鋳型対は、同じ全体的コンフォメーションにおいて中心窪み内に存在する。１２ｄ、左側に、対称プライマー−鋳型ＲＮＡ ５’−ＵＡＣＣＧ（３’−ｄＧ）が構築されたオミット電子密度マップ｜Ｆ_ｏ｜−｜Ｆ_ｃ｜が、３．０σでの輪郭の緑のメッシュで示され、右側に、２｜Ｆ_ｏ｜−｜Ｆ_ｃ｜電子密度マップが、１．０σでの輪郭の青色のメッシュで示される。プライマー鎖はシアン色に着色された炭素骨格であり、鋳型鎖はサーモン色に着色された炭素骨格である。

図１３（ａ〜ｄ）は、ＨＣＶポリメラーゼによるプライマー−鋳型認識を示す図である。１３ａ、対合するヌクレオチド（＋１）の核酸塩基は、産物のプレ転位状態のプライマー鎖と塩基対合しつつ、高度に保存されたＩｌｅ１６０の上部にスタックする。プライマー鎖の３’残基は、強制的鎖ターミネーター３’−ｄＧを含み、転位後に後継ＮＴＰが結合すると予測されるプレ転位状態にある。この残基の２’−ヒドロキシルは、高度に保存されたＡｓｐ２２５と水素結合する。プライマー鎖の末端ヌクレオチドのホスフェートは、フィンガードメインのＡｒｇ１５８と相互作用する。１３ｂ、鋳型鎖のホスフェートおよび２’−ヒドロキシルの全てが、ＨＣＶポリメラーゼによって認識される。鋳型鎖の＋２残基の糖およびホスフェートは、鋳型入口トンネルの下方に延びる。鋳型鎖ホスフェートは、Ａｒｇ９８（＋２）およびＡｌａ９７（＋１）の骨格アミド窒素原子ならびにＡｒｇ１６８（＋０）、Ｌｙｓ１７２（−１）およびＧｌｎ１８０（−２）の側鎖と相互作用する。対合するヌクレオチド（＋１）の２’−ヒドロキシルは、厳密に保存されたＧｌｙ２８３の骨格酸素によって認識されるが、鋳型鎖の他の２’−ヒドロキシルは、Ｖａｌ２８４（＋０）の骨格酸素、Ｓｅｒ２８８（−１）の側鎖およびおそらくはＰｈｅ１９３（−２）の骨格酸素によって認識される。ある特定のヌクレオチドアナログ阻害剤に対する抵抗性の主な源は、プライマー鎖の末端ヌクレオチドの直下のＳｅｒ２８２に存在する。１３ｃ、プライマー鎖ホスフェートは、フィンガードメインのＡｒｇ１５８（＋１）ならびにサムドメインのＡｒｇ３８６、Ａｒｇ３９４（＋０）、Ａｒｇ３９４（−１）およびＨｉｓ４０２（−２）と、塩橋を形成する。１３ｄ、図３中と同様に着色されたＨＣＶポリメラーゼのプライマー−鋳型ＲＮＡ結合結晶構造と、実質的に異なるサムドメインであるにもかかわらず類似の全体的なプライマー−鋳型−ポリメラーゼ認識を示す、黄色で着色したポリオウイルスポリメラーゼ（ＰＤＢ ＩＤ ３ＯＬ６）^１８のプライマー−鋳型ＲＮＡ結合結晶構造とのオーバーレイ。

図１４は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位のモデルを示す図である。このポリメラーゼの活性部位が、平滑化ｖｄＷ表面と共に淡黄色で示される（１Ｃ２Ｐ^１０／１ＧＸ５^２データを使用する）。触媒性２価金属カチオンは、Ａｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９（ＧＤＤモチーフの一部）およびＡｓｐ２２０の側鎖と相互作用する紫の球として示される。Ａｒｇ１５８は、フィンガーループ領域から垂れ下がり、成長中のＲＮＡ鎖と後継ＮＴＰとの間のホスホジエステル結合の形成を促進する（Ａｒｇ１５８は、明確にするために、表面を伴わずに示される）。種々の２’ＭｅＮＴＰベースの阻害剤に対する抵抗性の発生に重要であることが見出されているＳｅｒ２８２は、ＲＮＡ鎖に取り込まれるときに後継ＮＴＰがフィットするべき表面の一部を形成する。サムループ中で見出されるＴｙｒ４４８は、ｄｅ ｎｏｖｏ開始の間のプライマーＧＴＰとの相互作用によって、開始複合体の形成を安定化する助けになり得る。Ｃ末端ループ（灰色）は、開始の際に必然的に置き換えられ、Ｃ末端ループおよびサムループの両方が、伸長の間に置き換えられる。

発明の詳細な説明
定義
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬などに限定されず、それ自体変動し得ると理解すべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、本特許請求の範囲のみによって定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。

本明細書および本特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の言及を包含する。操作例（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｅｘａｍｐｌｅ）における場合以外、または特段示した場合以外、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されると理解すべきである。用語「約」は、百分率と併せて使用する場合、±１％を意味し得る。

同定された全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明と関連して使用され得るかかる刊行物に記載された方法論を記述および開示する目的のために、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日前のその開示のためにのみ提供される。これに関して、何物も、先行の発明を理由としてまたは任意の他の理由のために、本発明者らがかかる開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈すべきではない。日付に関する主張またはこれらの文献の内容に関する提示の全ては、出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さに関していずれの承認も構成しない。

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。

アミノ酸は、「１文字」記号または「３文字」記号のいずれかによって表される。

特に記載されない限り、以下の定義が本明細書で使用される：

用語「ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ」または「ＲｄＲｐ」は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡ分子に結合することが可能でＲＮＡを合成する任意のネイティブの（ｎａｔｉｖｅ）（天然に存在するものであれ合成であれ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドを指す。上記ウイルスがコードするＨＣＶポリタンパク質のＣ末端において見出される約５９０アミノ酸の６６ｋＤａタンパク質である非構造５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）タンパク質は、必要なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）機能性を提供する^６。このポリメラーゼは、上記ウイルスによって提供される初期プラス鎖ＲＮＡ鋳型からこのポリメラーゼが合成する中間のマイナス鎖ＲＮＡを使用することによって、ウイルス粒子へのキャプシド形成のためのプラス鎖ＲＮＡを生成する。ＧＴＰ依存性のｄｅ ｎｏｖｏ開始は、ｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレオチド重合の好ましい様式である。用語「野生型ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ」は一般に、天然に存在するＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに見出されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、天然に存在する短縮形態または分泌形態、およびバリアント形態が含まれる。

遺伝子型２ａ分離株ＪＦＨ１（２ａ ＪＦＨ１）の完全プロテオーム配列は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースＱ９９ＩＢ８に見出される。遺伝子型２ａの完全タンパク質配列は、約３０３３アミノ酸である。野生型ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの参照配列は、Ｃ末端における約５９０アミノ酸に関係する。アラインメント中に示されるような、本明細書で同定されるアミノ酸位置の番号付けの目的のための配列番号付けは、以下の表８に示されるように、開始配列ＳＭＳＹとのアラインメントに基づく。遺伝子型２ａ ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼについて、開始アミノ酸１は、アミノ酸位置２４４３において見出され、終末アミノ酸は、Ｑ９９ＩＢ８に示される配列の３０３３位において見出され、本明細書で使用される場合アミノ酸位置５９０に対応する。当業者は、表８に提供されるアラインメントを参照して、対応するアミノ酸残基を容易に決定することができる。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ２ａ遺伝子型の配列番号付けは、配列番号１の番号付けに従う。異なる遺伝子型のＨＣＶ由来のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼが公知である。これらの配列のアラインメントは表８に示される。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子型２ａ分離株ＪＦＨ１の参照配列は、配列番号１の配列である。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ１ｂ ＢＫの参照配列は、配列番号２の配列である。
表８に提示される残りの配列は以下である：

「ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼバリアント」とは、本明細書で使用する場合、参照ポリペプチドとは異なる配列を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、この参照ポリペプチドは、配列番号１または２を含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼである。バリアントには、「天然に存在しない」バリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号１または２のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。これらのバリアントには、置換、付加または欠失を有するポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、このＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子型２ａのアミノ酸４４４〜４５３に対応するβヘアピン残基の欠失を有する。他の実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも２０〜３０アミノ酸の欠失のように、Ｃ末端ペプチド膜結合領域を欠く。いくつかの実施形態では、バリアントは、その分子の溶解度を増強するアミノ酸置換などの、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を有するＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの４７位、８６位、８７位、１１４位に対応するアミノ酸位置およびそれらの混合からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ活性の阻害剤に対する抵抗性と関連するアミノ酸位置においてアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、アミノ酸位置２８２においてアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、１５位、２２３位、３２１位およびそれらの混合からなる群から選択されるアミノ酸位置においてアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、活性部位残基の１つまたは複数においてアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔｙｒ４４８、Ａｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９、Ａｓｐ２２０、Ｔｈｒ２２１、Ａｒｇ１５８、Ａｓｐ２２５、Ｉｌｅ１６０およびＳｅｒ２８２ならびにそれらの混合からなる群から選択されるアミノ酸位置においてアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、これらのバリアントは、野生型ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの生物学的活性と比較して、増加したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する。

通常、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼバリアントポリペプチドは、配列番号１または２を含むアミノ酸配列を含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドに対し、少なくとも８０％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８１％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８２％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８３％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８４％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８６％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８７％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８８％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８９％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９１％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９２％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９３％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９４％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。

用語「活性部位」は、本明細書で使用する場合、その形状、静電的電荷の分布、水素結合アクセプターもしくは水素結合ドナーの提示、および／または非極性領域の分布の結果としてＲＮＡ鋳型プライマー分子と有利に会合する、分子または分子複合体の領域を指す。従って、活性部位は、ドメイン間の窪み、表面もしくは界面などの特徴を含み得るまたはそれらからなり得る。構造活性部位は、３次元構造の試験から決定されるような「接触した」アミノ酸残基を含み得る。「接触」は、原子のファンデルワールス半径を使用して、あるいはリガンドと分子または分子複合体との間の空間から、溶媒、典型的には水を排除するのに十分な接近によって、決定することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ鋳型分子と接触したＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ残基は、ＲＮＡ鋳型分子の核酸残基の約５Å以内に１つの原子を有する残基である。あるいは、「接触した」残基は、少なくとも約１０Å、より好ましくは少なくとも約５０Å〜約３００Åの、溶媒露出表面積（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ）の喪失を有する残基であり得る。溶媒露出表面の喪失は、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９７１年、２月１４日；５５巻（３号）：３７９〜４００頁）の方法および当業者に公知の類似のアルゴリズムによって決定することができる。

「接触した」アミノ酸残基のいくつかは、別のアミノ酸型で置換された場合、機能的結合部位を定義するために使用される生化学アッセイ、細胞ベースのアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいていずれの変化も引き起こさない可能性があるが、３次元構造の形成に寄与し得る。機能的結合部位には、ＲＮＡポリメラーゼ活性の増加またはＲＮＡポリメラーゼ阻害剤に対する抵抗性の減少などの機能喪失または機能獲得に基づいて活性部位残基として同定されたアミノ酸残基が含まれる。いくつかの実施形態では、機能的結合部位のアミノ酸残基は、構造的結合部位のアミノ酸残基のサブセットである。

用語「ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位」は、ＲＮＡ鋳型プライマー分子と有利に会合し得るＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの領域を指す。用語活性部位は、本明細書で使用する場合、取り込むヌクレオチドに産物を連結するリン酸結合ならびに後継ＲＮＡ鋳型鎖および流出（ｏｕｔｇｏｉｎｇ）ＲＮＡダイマー鎖を安定化する残基の触媒および形成を実施する領域を含む。ＨＣＶ ＮＳ５Ｂの活性部位は、タンパク質の中心に存在し、この酵素の３つ全てのサブドメイン「フィンガー」、「サム」および「パーム」によって提供されるエレメントによって形成される。活性部位の残基のいくつかは本明細書に記載される。活性部位は、「サム」サブドメインβ−ヘアピンループによって提供されるｄｅ ｎｏｖｏ開始に重要なエレメント（Ｔｙｒ４４８）が、活性部位から離れて移動するように必然的に変形し、それにより、伸長（ＲＮＡ産物鎖の成長）が開始させる。２つの金属イオンＭｇ^＋２またはＭｎ^＋２は、ホスフェート骨格の形成を触媒し、Ａｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９、Ａｓｐ２２０およびＴｈｒ２２１によりそれらの活性部位が安定化される。Ａｒｇ１５８は、出だしのジホスフェート脱離基を安定化することによって、触媒において役割を果たす。Ａｓｐ２２５は、リボースの２’ＯＨおよび３’ＯＨと相互作用して、おそらくＲＮＡ娘鎖への付加のための適切な結合ポケットへと上記ヌクレオチドを方向付けるようである。さらに、Ｉｌｅ１６０は、上記ポリメラーゼによって後継ヌクレオチドが対合されている鋳型鎖ヌクレオチドの塩基（プリンまたはピリミジン）部分と共に、後継ヌクレオチドの塩基（プリンまたはピリミジン）部分と直接相互作用する唯一の残基であるようである。最後に、２’Ｍｅヌクレオチドクラスに対する抵抗性の発生の際にスレオニンに変異し得るＳｅｒ２８２は、Ａｒｇ１５８およびＩｌｅ１６０の両方を活性部位に提示するフィンガーループの安定化において構造的役割を果たすようである。

「構造的に等価な活性部位」は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位を形成するアミノ酸の骨格原子の構造座標から、最大でも約０．７０Å、好ましくは約０．５Åの根平均二乗偏差によって定義される。

「結晶」は、本明細書で使用する場合、３次元で周期的に反復するパターンで原子が配置され、典型的には格子を形成する、物質の固体状態の１形態を指す。「相補的または相補体」は、本明細書で使用する場合、例えば空間、電荷、３次元立体配置などを包含する、相互作用を可能にする２つの分子間のフィットまたは関係を意味する。

用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」とは、アミノ酸の位置または配列が参照配列とアラインされる場合に、配列中の同じ位置（単数または複数）において見出されるアミノ酸残基またはアミノ酸配列を指す。いくつかの実施形態では、この参照配列は、配列番号１または２の配列を有するＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの断片である。アミノ酸の位置または配列が参照配列とアラインされる場合、アミノ酸の番号付けは、参照配列のものとは異なり得ることが理解される。

「重原子誘導体」は、本明細書で使用する場合、Ｈｇ、Ａｕ、Ｓｅ、Ｓｅメチオニンまたはハロゲンなどの重原子を用いて結晶を化学的に改変することによって生成する誘導体を意味する。

本明細書で使用されるＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの「構造ホモログ」は、そのネイティブのコンフォメーションに折り畳まれた場合に、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの３次（３次元）構造の少なくとも一部分を示すまたは示すと合理的に予測される、アミノ酸配列に関する１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加または再配列を含むタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、３次元構造の一部分は、容易に認識される「フィンガー」、「パーム」および「サム」ドメインと共に、多くのポリメラーゼに共通する「右手」形状を含む、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造ドメインを指す^８〜１０（図１０ａ）。例えば、構造的に相同な分子は、ループまたはドメインなどの、１つまたは複数の連続または非連続アミノ酸の置換、欠失または付加を有し得る。構造的に相同な分子には、側鎖改変、骨格改変、ならびにアセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化を含むＮ末端およびＣ末端改変、ならびに炭水化物部分または脂質部分、補因子の結合などの改変を含む、１つまたは複数の構成アミノ酸において化学的または酵素的に誘導体化された「改変された」ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ分子もまた含まれる。

「ＲＮＡ鋳型プライマー分子」は、本明細書で使用する場合、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位と会合する単一のリボヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ鋳型プライマー分子は、鋳型鎖およびプライマー鎖の両方を含む。対称ＲＮＡ鋳型分子には、表５に示されるものなどの、４、６および８塩基対のリボ核酸が挙げられる。例えば、ＲＮＡ５４では、ＲＮＡ鋳型プライマー分子は、プライマー鎖（ｓｔａｎｄ）および鋳型鎖；５’−ＵＡＣＣＧｄ−３’鋳型鎖および３’−ｄＧＣＣＡＵ−５’プライマー鎖の両方を含む、部分的に二本鎖である。融合鋳型ヘアピンＲＮＡ構築物は、約１０〜２５リボヌクレオチドを有する。融合プライマー鋳型ヘアピンは、ヘアピン構造の形成を可能にする少なくとも４つのリボヌクレオチドによって分離された、３、５、６、７または９個連続するシトシンおよびグアノシンを含む。融合プライマー鋳型ヘアピンの特定の実施形態は、表５に示される。対称および非対称の両方のＲＮＡ鋳型プライマー分子が、本明細書に記載される。

「分子複合体」は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの組合せを指す。いくつかの実施形態では、分子複合体は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ鋳型およびＲＮＡ産物鎖を包含する。

「機械可読データ記憶媒体」は、本明細書で使用する場合、機械可読データがコード化されたデータ記憶材料を意味し、ここで、機械は、かかるデータを使用するための命令がプログラムされ、所望の形式で、例えば分子または分子複合体のグラフィカル３次元描写で、データを表示することが可能である。

「拡張可能な」は、本明細書で使用する場合、本質的に同じ角度を維持しながらの、スカラー因子による座標（点の立体配置）間の距離の増加または減少を意味する。

「空間群対称性」は、本明細書で使用する場合、結晶格子の並進対称性を点群対称性と組み合わせる結晶の全体的対称性を意味する。空間群は、点群記号が後に続く格子型を同定する大文字（Ｐ、Ａ、Ｆなど）によって指定され、ここで、回転要素および反射要素は、らせん軸および映進面を含むように拡張される。所与の空間群についての点群対称性は、空間群の格子センタリング記号を除去し、類似の回転軸によって全てのらせん軸を置き換え、鏡映面によって全ての映進面を置き換えることによって決定することができることに留意されたい。空間群についての点群対称性は、その逆格子の真の対称性を記述する。

「単位格子」は、本明細書で使用する場合、規則的な反復パターンで配置された結晶中の原子を意味し、ここで、最小の反復単位は単位格子と呼ばれる。構造全体は、３つの長さ（ａ、ｂおよびｃ）および３つの角度（α、βおよびγ）によって特徴付けられる単位格子の知見から再構築することができる。量ａおよびｂは、格子の底面の辺の長さであり、γは、これら２つの辺間の角度である。量ｃは、単位格子の高さである。角度αおよびβは、単位格子の底面と垂直方向の面との間の角度を記述する。

「Ｘ線回折パターン」は、結晶中の分子または原子の周期的アセンブリのＸ線散乱から取得されるパターンを意味する。Ｘ線結晶学は、Ｘ線が結晶によって回折されるという事実を利用する技術である。Ｘ線は、匹敵するサイズの原子の電子雲によって散乱される適切な波長（オングストローム（Å）範囲、およそ１０^−８ｃｍ）を有する。結晶中の分子または原子の周期的アセンブリのＸ線散乱から取得された回折パターンに基づき、電子密度を再構築することができる。さらなる位相情報は、回折データから、または再構築（結晶学における位相問題）を完了するための、補足的回折実験のいずれかから抽出することができる。次いで、モデルが実験的電子密度へと漸進的に構築され、データに対して精密化されて、正確な分子構造が生成される。

Ｘ線構造座標は、空間中の点の独自の立体配置を定義する。当業者は、タンパク質もしくはタンパク質／リガンド複合体またはそれらの一部分に関する構造座標のセットが、次に３次元の立体配置を定義する、点の相対的セットを定義することを理解している。類似または同一の立体配置は、座標間の距離および角度が本質的に同じままであることを条件として、完全に異なるセットの座標によって定義することができる。さらに、点の立体配置は、本質的に同じ角度を維持しながら、スカラー因子により座標間の距離を増加または減少させることによって定義することができる。

「結晶構造」は一般に、結晶材料中の反復する原子単位または分子単位の３次元または格子空間配置を指す。結晶材料の結晶構造は、Ｘ線結晶学的方法によって決定され得、例えば、Ｊａｎ Ｄｒｅｎｔｈによる「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ−Ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｘｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；第２版、１９９９年２月、ＩＳＢＮ：０３８７９８５８７５、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎによる「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、２００２年１０月１８日、ＩＳＢＮ：０４７１２５１２２４を参照のこと。
発明を実施するための様式：

従って、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結晶形態および結晶構造を包含する。いくつかの実施形態では、分子複合体は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ鋳型およびＲＮＡ産物鎖を包含する。他の態様では、本開示は、相同タンパク質を同定するため、ならびにＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの機能をモジュレートし得る薬剤をデザインまたは同定するために、結晶構造および構造座標を使用する方法を提供する。

本開示は、本明細書に記載されるように、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも一部分の構造座標から導出される点の３次元立体配置ならびに構造的に等価な立体配置もまた包含する。この３次元立体配置は、基質に結合していない場合または基質に結合した場合のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位を定義する複数のアミノ酸の位置を表す構造座標から導出される点を包含する。同様に、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに対して構造的に相同な分子または分子複合体の構造座標から導出される点の拡張可能な３次元立体配置ならびに構造的に等価な立体配置もまた包含する。構造的に相同な分子または分子複合体は、以下に定義される。

有利なことに、構造的に相同な分子は、本開示の方法に従って、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造座標を使用して同定することができる。本開示に従う構造座標から導出される空間中の点の立体配置は、例えば、ホログラフィー画像、ステレオ図、モデルまたはコンピュータ表示画像として可視化され得、従って本開示は、かかる画像、図またはモデルを含む。

結晶構造および構造座標は、例えば、関連分子の構造情報を取得するため、ならびにＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性をモジュレートする薬剤を同定およびデザインするための方法において使用することができる。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの座標は、表１に提供される。ＲＮＡ鋳型プライマー鎖との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの座標は、表２および表３に提供される。
１．ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチド、バリアントおよびこのポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸
ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチド

本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの記載を提供する。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡ分子に結合することが可能でＲＮＡを合成する任意のネイティブの（天然に存在するものであれ合成であれ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドを指す。ウイルスがコードするＨＣＶポリタンパク質のＣ末端において見出される約５９０アミノ酸の６６ｋＤａタンパク質である非構造５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）タンパク質は、必要なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）機能性を提供する^６。このポリメラーゼは、ウイルスによって提供される初期プラス鎖ＲＮＡ鋳型からこのポリメラーゼが合成する中間のマイナス鎖ＲＮＡを使用することによって、ウイルス粒子へのキャプシド形成のためのプラス鎖ＲＮＡを生成する。ＧＴＰ依存性のｄｅ ｎｏｖｏ開始は、ｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレオチド重合の好ましい様式である。野生型ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは一般に、天然に存在するＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに見出されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、天然に存在する短縮形態または分泌形態、およびバリアント形態が挙げられる。野生型ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの１例は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

ＨＣＶ遺伝子型の異なる遺伝子型由来のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼが公知である。表８中のアラインメントは、保存されたアミノ酸位置および変動するアミノ酸位置を示す。変動するアミノ酸位置は、機能的活性が変化するという予測なしに、変化し得る。他のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ配列は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの全てに結合し得るまたはそれを阻害し得るＲＮＡ鋳型分子を同定するために、本明細書に記載される相同性モデリングにおいて使用することができる。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性は、当業者によって決定することができ、阻害剤の存在下または非存在下においてＲＮＡ合成活性を決定するための方法をが挙げられる。
ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼバリアント

本開示の１態様では、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼバリアントを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単離されたバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを提供し、このポリメラーゼバリアントは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する。他の実施形態では、このＨＣＶ遺伝子型２ａ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号８の配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単離されたバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを提供し、このポリメラーゼバリアントは、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型１ｂと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する。他の実施形態では、このＨＣＶ遺伝子型１ｂ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号５、６または７の配列を有する。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼバリアントとは、参照ポリペプチドとは異なる配列を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、この参照ポリペプチドは、配列番号１または２を含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼである。バリアントには、「天然に存在しない」バリアントが含まれる。これらのバリアントには、置換、付加または欠失を有するポリペプチドが含まれる。

いくつかの実施形態では、このＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子型２ａまたは配列番号４のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子型１ｂのアミノ酸４４２〜４５４に対応するβヘアピン残基の欠失を有する。

他の実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも２０〜３０アミノ酸のＣ末端ペプチドの欠失のように、膜結合領域を欠く。

いくつかの実施形態では、バリアントは、分子の溶解度を増強するアミノ酸置換などの、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を有するＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの４７位、８６位、８７位、１１４位に対応するアミノ酸位置およびそれらの混合からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ活性の阻害剤に対する抵抗性と関連するアミノ酸位置においてアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、アミノ酸位置２８２においてアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、１５位、２２３位、３２１位およびそれらの混合からなる群から選択されるアミノ酸位置においてアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、活性部位残基の１つまたは複数においてアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔｙｒ４４８、Ａｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９、Ａｓｐ２２０、Ｔｈｒ２２１、Ａｒｇ１５８、Ａｓｐ２２５、Ｉｌｅ１６０およびＳｅｒ２８２ならびにそれらの混合からなる群から選択されるアミノ酸位置においてアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、これらのバリアントは、野生型ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの生物学的活性と比較して、増加したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する。いくつかのバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼが表４に示される。

通常、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼバリアントポリペプチドは、配列番号１または２を含むアミノ酸配列を含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドに対し、少なくとも８０％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８１％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８２％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８３％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８４％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８６％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８７％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８８％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも８９％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９１％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９２％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９３％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９４％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９６％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。

バリアントは、合成手段または組換え手段によって調製することができる。アミノ酸の置換、欠失および挿入などの変化を導入するための方法は、当業者に公知である。
ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ核酸

１態様では、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびバリアントをコードする核酸を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＨＣＶ遺伝子型２ａ ＲＮＡポリメラーゼバリアントをコードする単離された核酸を提供し、このポリメラーゼバリアントは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する。他の実施形態では、この単離されたＨＣＶ遺伝子型２ａ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号８の配列を有する。

別の態様では、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびバリアントをコードする核酸を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＨＣＶ遺伝子型１ｂ ＲＮＡポリメラーゼバリアントをコードする単離された核酸を提供し、このポリメラーゼバリアントは、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型１ｂと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する。他の実施形態では、この単離されたＨＣＶ遺伝子型２ａ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号５、６または７の配列を有する。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列は、種々のＨＣＶ遺伝子型を形成し、公知であり、かつＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースにおいて容易に入手可能である。かかるポリペプチドを調製するためのベクターおよび方法が、本明細書に記載される。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼのバリアントを調製する方法は、例えば、部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、ＰＣＲベースの変異誘発などの標準的方法を使用して実施することができる。
融合タンパク質

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチド、バリアントまたはその構造ホモログもしくは一部分は、異種ポリペプチドまたは化合物に融合することができる。この異種ポリペプチドは、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの機能とは異なる機能を有するポリペプチドである。異種ポリペプチドの例には、キャリアとして作用し得る、半減期を延長し得る、エピトープタグとして作用し得る、および融合タンパク質を検出または精製する方法を提供し得る、ポリペプチドが挙げられる。異種ポリペプチドには、ＫＬＨ、アルブミン、サルベージ受容体結合エピトープ、免疫グロブリン定常領域およびペプチドタグが挙げられる。検出または精製に有用なペプチドタグには、ＦＬＡＧ、ｇＤタンパク質、ポリヒスチジンタグ、インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニン、Ｔ７タグ、Ｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ビオチン、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質およびマルトース結合性タンパク質が挙げられる。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ、バリアントまたはその構造ホモログもしくは一部分と組み合わせることができる化合物には、放射性標識、保護基および炭水化物部分または脂質部分が挙げられる。
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼバリアントまたはその断片は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡへと適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のポリペプチドバリアントの合成によって、調製することができる。

本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して取得することができる。所望のポリヌクレオチド配列は、適切な供給源細胞から単離および配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。一旦取得されると、上記ポリペプチドまたはバリアントポリペプチドをコードする配列は、宿主細胞において異種ポリヌクレオチドを複製および発現することが可能な組換えベクターへと挿入される。当該分野で入手可能な公知の多くのベクターが、本発明の目的のために使用され得る。適切なベクターの選択は、ベクターへと挿入される核酸のサイズおよびそのベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現またはそれら両方）およびそのベクターが存在する特定の宿主細胞との適合性に依存して、種々の成分を含む。ベクターの構成要素には一般に、以下が挙げられるがこれらに限定されない：複製起点（特に、ベクターが原核生物細胞へと挿入される場合）、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入物および転写終結配列。

一般に、宿主細胞と適合性の種から誘導されるレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関して使用される。このベクターは、複製部位、ならびに形質転換された細胞における表現型選択を提供することが可能なマーキング配列を通常保有する。例えば、有用なベクターは、ｐＥＴ−２８ａベースのベクターである。さらに、宿主微生物と適合性のレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターが、これらの宿主に関して形質転換ベクターとして使用され得る。

特定の状況の必要性に従って、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかが本発明において使用され得、そのことは、当業者によって確認され得る。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。

真核生物宿主細胞系もまた、当該分野において十分確立されている。無脊椎動物細胞の例には、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９などの昆虫細胞、ならびに植物および植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。より具体的な例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）：チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；およびマウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が挙げられる。
ポリペプチド産生

宿主細胞は、上記発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された、従来の栄養培地中で培養される。

トランスフェクションとは、任意のコード配列が実際に発現されるにしろ発現されないにしろ、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。ＣａＰＯ_４沈殿およびエレクトロポレーションなどのトランスフェクションの多数の方法が、当業者に公知である。このベクターの作動の任意の指標が宿主細胞内で存在する場合に、首尾よいトランスフェクションが一般に認識される。

本発明のポリペプチドを産生するために使用される真核生物細胞は、当該分野で公知の、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖される。必要に応じて、この培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトールおよびジチオスレイトールからなる群から選択される１つまたは複数の還元剤を含み得る。誘導性プロモーターが発現ベクターにおいて使用される場合、タンパク質発現は、このプロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。当該分野で公知のように、使用されるベクター構築物に従って、種々の誘導因子を使用することができる。

真核生物宿主細胞は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドの発現に適した条件下で培養される。上記ポリペプチドを産生するために使用される宿主細胞は、種々の培地において培養することができる。市販の培地、例えば、Ｈａｍの Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）が、上記宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら、１９７９年、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８巻：４４頁、Ｂａｒｎｅｓら、１９８０年、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２巻：２５５頁、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号または米国特許第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５および米国再発行特許第３０，９８５号のうち１つまたは複数に記載される培地のいずれかを、上記宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかには、必要な場合、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム塩、マグネシウム塩およびリン酸塩）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ（商標））、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標））、微量元素（マイクロモル濃度範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補充することができる。他の補充物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された上記宿主細胞と共に以前に使用された条件であり、当業者に明らかである。

宿主細胞において発現される本明細書に記載されるポリペプチドは、該宿主細胞のペリプラズムに分泌され得るおよび／またはペリプラズムから回収され得る。タンパク質回収は典型的に、一般には浸透圧ショック、超音波処理または溶解などの手段によって、微生物を破壊することを必要とする。一旦細胞が破壊されると、細胞細片または細胞全体が、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えばアフィニティ樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。あるいは、タンパク質は、培養培地へと移送され得、そこから単離することができる。細胞は、培養物から除去され得、培養物上清が、産生されたタンパク質のさらなる精製のために濾過および濃縮され得る。発現したポリペプチドは、免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでのまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用するゲル濾過；疎水性アフィニティ樹脂、マトリックスに固定化した適切な抗原を使用するリガンド親和性およびウエスタンブロットアッセイなどの一般に公知の方法を使用して、さらに単離および同定することができる。

産生されるポリペプチドは、さらなるアッセイおよび使用のために実質的に均質な調製物を取得するために精製することができる。当該分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を使用することができる。以下の手順が、適切な精製手段の例示である：免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用するゲル濾過。

いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。細胞は、氷上で撹拌しながら２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２、プロテアーゼ阻害剤を含む２０％グリセロール、リゾチームおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ中で溶解し、その後超音波処理する。清澄化後、可溶性タンパク質画分は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、２０％グリセロールで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ ＦＦカラムにロードする。タンパク質は、勾配プロトコールおよび０．５Ｍイミダゾールを補充した溶出緩衝液を使用して溶出する。プールした画分を収集し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．４Ｍ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＴＣＥＰで透析する。タンパク質は、より低分子の夾雑物を除去するために、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルタで濃縮する。
２．結晶および結晶構造

別の態様では、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結晶形態および結晶構造を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含む結晶を提供し、このポリメラーゼバリアントは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する。他の実施形態では、本開示は、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼとＲＮＡ鋳型プライマー分子とを含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型プライマー複合体を含む結晶を提供し、このポリメラーゼバリアントは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する。いくつかの実施形態では、このＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。結晶は、組成物を形成するために、キャリアと組み合わせることができる。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結晶は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを保存または濃縮するための有用な手段でもあり得る。

本開示の別の態様は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを結晶化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを結晶化する方法は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ、そのバリアントまたは断片を単離するステップ、およびこのＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを、結晶が形成するまで、約３０％のペンタエリスリトールエトキシレート、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、５０ｍＭ硫酸アンモニウムと接触させるステップ、を含む。特定の実施形態では、このＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含み、このポリメラーゼバリアントは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する。

他の実施形態では、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを結晶化する方法は、ａ）ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはその断片もしくはバリアントを単離するステップ；ｂ）このＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを、結晶が形成するまで、約０．２Ｍの酢酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ｐＨ５．５、２５％ ＰＥＧ ３３５０と接触させるステップ；およびｃ）この結晶をＲＮＡ鋳型プライマー分子と接触させるステップ、を含む。特定の実施形態では、このＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含み、このポリメラーゼバリアントは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する。

いくつかの実施形態では、このＲＮＡ鋳型分子は、４、６、８のＲＮＡプライマー鋳型分子またはＲＮＡプライマーヘアピン鋳型を含む。対称ＲＮＡプライマー鋳型分子には、表５に示されるものなどの、４、６および８塩基対のリボ核酸が挙げられる。融合プライマー鋳型ヘアピンＲＮＡ構築物は、約１０〜２５リボヌクレオチドを有する。融合プライマー鋳型ヘアピンは、ヘアピン構造の形成を可能にする少なくとも４つのリボヌクレオチドによって分離された、３、５、６、７または９個連続するシトシンおよびグアノシンを含む。融合プライマー鋳型ヘアピンの特定の実施形態は、表５に示される。

他の実施形態では、本開示は、配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含む結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼであって、Ｐ６_５の空間群対称性を有し、単位格子であって、ａはｂに等しく約１４０．６９Åであり、ｃは約９２．６３Åであり、αはβに等しく約９０°であり、γは約１２０°である寸法を有する単位格子を含む、結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含む結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型プライマー複合体であって、Ｐ６_５の空間群対称性を有し、単位格子であって、ａはｂに等しく約１４３．２７．６９Åであり、ｃは約９２．１９Åまたは９１．５Åであり、αはβに等しく約９０°であり、γは約１２０°である寸法を有する単位格子を含む、結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型プライマー複合体を提供する。

配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結晶の３次元座標は、表１に提供される。配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼとＲＮＡ鋳型プライマー分子とを含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型の結晶の３次元座標は、表２および表３に提供される。用語「構造座標」とは、結晶形態にあるＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの原子（散乱中心）による、Ｘ線の単色ビームの回折で得られるパターンに関連する数学的方程式から導出されるデカルト座標を指す。回折データは、結晶の反復単位の電子密度マップを計算するために使用される。次いで、この電子密度マップは、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの個々の原子の位置を確立するために使用される。

構造座標における僅かな変動は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造座標を数学的に操作することによって生成し得る。例えば、表１〜３に示される構造座標は、構造座標の結晶学的置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）、構造座標の分数化（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、構造座標のセットへの整数の加算または減算、構造座標の反転、または上記の任意の組合せによって操作することができる。あるいは、アミノ酸の変異、付加、置換、欠失およびそれらの組合せに起因する結晶構造の改変、または結晶を形成する成分のいずれかにおける他の変化もまた、構造座標における変動を生じ得る。個々の座標におけるかかる僅かな変動は、全体的形状に対してほとんど影響を有さない。かかる変動が、元の座標と比較して許容可能な標準誤差内にある場合、得られた３次元形状は、構造的に等価とみなされる。構造等価性は、本明細書でより詳細に記載される。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの個々の構造座標における僅かな変動が、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結合部位または他の構造形体と会合し得るリガンドなどの化学的実体の性質を有意に変更させないと予測されることに、留意すべきである。この文脈では、語句「〜と会合する」とは、リガンドまたはその一部分とＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはその一部分との間の近接の状態を指す。上記会合は、非共有結合であり得、その場合には水素結合、ファンデルワールス力および／または静電相互作用によって近位（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）がエネルギー的に好まれ、または該会合は共有結合であり得る。
ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造および活性部位

遺伝子型２ａのＪＦＨ１分離株は、細胞培養においてならびにｉｎ ｖｉｖｏでの効率的な複製が可能な唯一のクローニングされたＨＣＶ株である^２３。β−ヘアピンループがＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーで置き換えられた２ａ ＪＦＨ１ ＮＳ５Ｂの構築物（「２ａ Δ８」）は、ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成アッセイにおいて野生型２ａよりも＞１００倍活性が高く、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析においてＲＮＡを結合することが可能であり、野生型２ａと比較してＰＳＩ−３５２６６６（６μＭ）による鎖終結について類似のＩＣ_５０値を生じたことが観察された。１．８Åの全体的ｒ．ｍ．ｓ．ｄ値を有する以前に決定された２ａ ＮＳ５Ｂ構造^{２３〜２５}と比較して実質的な構造変化を明らかにする、２ａ Δ８の２．５Å分解能ａｐｏ結晶構造が取得された。

２ａ Δ８ Ｇｌｙ４４４−Ｇｌｙ４４５リンカーが秩序付けられ（ｏｒｄｅｒｅｄ）、Ｐｈｅ５５１は、最後に秩序付けられた残基であった。閉鎖ａｐｏ ２ａ構造^２３のパームドメインおよびフィンガードメインとａｐｏ ２ａ Δ８構造とのアラインメントは、サムドメインの全体的な約２０°の移動を示す。β−ヘアピンループの欠如、Ｃ末端リンカー領域の無秩序（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、およびサムドメインの移動が組み合わさって、ポリメラーゼの中心における大きい窪みを生成する。サムドメインの移動には、プライマーグリップヘリックスをプライマー突出部ヘリックスに接続する残基３９７〜４１２の有意な再秩序付けが伴う（図１１）。特に、全ての遺伝子型にわたりｄｅ ｎｏｖｏ開始に重要であることが以前に詳述されたＩｌｅ４０５^２３は、閉鎖野生型構造中のβ−ヘアピンループから１２Åよりも多く移動して、プライマーバットレスヘリックスを延ばし、高度に保存されたＴｒｐ４０８の上部にまとまる（ｐａｃｋ）（図１１）。Ｔｒｐ４０８は、閉鎖野生型構造中のほぼ不変のＰｈｅ４２９の上部にスタックし、両方の残基は、２ａ Δ８構造内の異なる回転異性体コンフォメーションをとる。さらに、閉鎖ａｐｏ構造（図１１ｂ）においてフィンガードメインのＨｉｓ９５と接触する高度に保存されたＰｒｏ４０４は、ａｐｏ ２ａ Δ８構造中のＴｒｐ３９７の主鎖の上部にまとまりつつ、ループ中の重要なターンを形成する（図１１ｃ）。このループの再秩序付けは、ＧＴＰを用いたｄｅ ｎｏｖｏ開始から、成長するプライマー−鋳型ＲＮＡの伸長までの移行にとって重要であり得る。ａｐｏ ２ａ Δ８構造と他のＲｄＲｐ三元複合体^{１７〜１９}との比較は、この開放コンフォメーションでは、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂがプライマー−鋳型ＲＮＡを結合することが可能であり得ることを示唆した。

ａｐｏ ２ａ Δ８の結晶を、対称プライマー−鋳型ＲＮＡ対に浸漬し、構造を２．９Åおよび３．０Åの分解能において決定した（図１２）。Ａ形態のＲＮＡは、得られた電子密度マップ（図１２ｄ）において容易に見分けられ、２つのＲＮＡ配列のプリン／ピリミジン対合における差を明らかに示した。両方の対称プライマー−鋳型ＲＮＡ対を、３’−ｄＧまたは２’，３’−ｄｄＣのいずれかにより強制的鎖ターミネーターとしてデザインしたので、当然、産物状態、プレ転位レジストリ（ｐｒｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｓｔｒｙ）が、両方の複合体において観察された（図３ｃ）。核酸塩基水素結合のアクセプターもドナーもこのポリメラーゼによって認識されず、これは、ポリメラーゼによる配列非依存性認識を示す。鋳型鎖の対合するヌクレオチド（慣習により残基＋１）の核酸塩基は、予測されるように^９、厳密に保存されたＩｌｅ１６０の上部にスタックするが、糖は、ＴｙｒまたはＰｈｅとして保存されるＴｙｒ１６２の上部にスタックする（図１３ａ）。対合するヌクレオチドがピリミジンである場合、プライマー鎖の残基＋１（後継ＮＴＰと等価）もまたＩｌｅ１６０と共にまとまり（図１３ａ）、プリン／ピリミジンアナログ三リン酸阻害剤活性における差のいくつかをおそらくは説明する。鋳型鎖の全てのホスフェートおよび２’−ヒドロキシルは、ＮＳ５Ｂによって認識され（図１３ｂ）、ＨＣＶにとってのＲＮＡ鋳型の重要性を実証している。同様に、プライマー鎖のホスフェートは、フィンガードメインのＡｒｇ１５８およびサムドメインのプライマーグリップヘリックスによって認識されるが、プライマーバットレスヘリックスは、いくつかのプライマー鎖糖とのファンデルワールス相互作用を形成する。基質レジストリ中の後継ＮＴＰと同じ位置に存在する産物、プレ転位状態のプライマー残基＋１の２’−ヒドロキシルは、Ａｓｐ２２５の側鎖によって認識される（図１３ｃ）。両方の構造が３’デオキシ末端残基を含む場合、Ａｓｐ２２５の他のカルボキシレート酸素は、自由にＡｓｎ２９１と水素結合する。ポリオウイルスＲｄＲｐの等価な残基（Ａｓｐ２３８）は、後継ＮＴＰ、転位状態および２価金属イオンの存在に依存して、異なるコンフォメーションをとることが示された^１８。ＤＮＡプライマーとの低減された活性^２６と一致して、プライマー鎖の他方の２’−ヒドロキシルはいずれも、ＮＳ５Ｂによって認識されない。

ＨＣＶ ＮＳ５Ｂの活性部位は、タンパク質の中心に存在し、この酵素の３つ全てのサブドメイン「フィンガー」、「サム」および「パーム」によって提供されるエレメントによって形成される。上記活性部位は、「サム」サブドメインβ−ヘアピンループによって提供されるｄｅ ｎｏｖｏ開始に重要なエレメント（Ｔｙｒ４４８）が、伸長（ＲＮＡ産物鎖の成長）を開始させる該活性部位から離れて移動するように、必然的に変形する（Ｎａｔｕｒｅ論文に記載された構造は、Ｔｙｒ４４８を含むβ−ヘアピンループを切り出した）。２つの金属イオンＭｇ^＋２またはＭｎ^＋２は、ホスフェート骨格の形成を触媒し、それらはＡｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９、Ａｓｐ２２０およびＴｈｒ２２１により上記活性部位において安定化される。Ａｒｇ１５８は、出だしのジホスフェート脱離基を安定化することによって、触媒において役割を果たす。上記構造に基づくと、Ａｓｐ２２５は、リボース２’ＯＨおよび３’ＯＨと相互作用して、おそらくＲＮＡ娘鎖への付加のための適切な結合ポケットへとヌクレオチドを導くようである。さらに、Ｉｌｅ１６０は、上記ポリメラーゼによって後継ヌクレオチドが対合されている鋳型鎖ヌクレオチドの塩基（プリンまたはピリミジン）部分と共に、後継である該ヌクレオチドの塩基（プリンまたはピリミジン）部分と直接相互作用する唯一の残基であるようである。最後に、２’Ｍｅヌクレオチドクラスに対する抵抗性の発生の際にスレオニンに変異し得るＳｅｒ２８２は、Ａｒｇ１５８およびＩｌｅ１６０の両方を活性部位に提示するフィンガーループの安定化において構造的役割を果たすようである（例えば、図１４を参照のこと）。

本開示の別の態様は、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドの未結合のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも一部分を含む分子または分子複合体を提供し、この活性部位は、Ｔｙｒ４４８、Ａｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９、Ａｓｐ２２０、Ｔｈｒ２２１、Ａｒｇ１５８、Ａｓｐ２２５、Ｉｌｅ１６０、Ｓｅｒ２８２およびそれらの混合からなる群から選択される、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼのある位置のアミノ酸残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、この少なくとも１つのアミノ酸残基は、表１、２および／または３に列挙した構造座標によって表されるアミノ酸の骨格原子を表す点から約０．７０Å未満の根平均二乗偏差を有する点のセットによって定義される。

本開示の別の態様は、点の３次元立体配置を提供し、これらの点の少なくとも一部分は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位を定義するアミノ酸の骨格原子の位置を表す表１、２および／または３の構造座標から導出される。いくつかの実施形態では、本開示は、ホログラフィー画像、ステレオ図、モデルまたはコンピュータ表示画像として表示された点の３次元立体配置を提供し、これらの点の少なくとも一部分は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位を含む表１、２および／または３に列挙した構造座標から導出され、このＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼは、空間群対称性Ｐ６_５を有する結晶を形成する。
３．構造的に等価な結晶構造

構造形体を定義する分子または該分子の一部分が、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型分子に結合したＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの全てまたは一部に対して、その３次元構造に関して定義された「構造的に等価」であるかどうかを決定するために、種々のコンピュータ分析が使用することができる。かかる分析は、現在のソフトウェアアプリケーション、例えば、ＱＵＡＮＴＡのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、バージョン４．１において、付属のユーザーガイドに記載されるように、実施することができる。

このＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーションは、異なる構造間、同じ構造の異なるコンフォメーション間、および同じ構造の異なる部分間の比較を可能にする。構造を比較するためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙにおいて使用される手順は、以下を包含する：１）比較される構造をロードするステップ；２）これらの構造中の原子等価性を定義するステップ；３）フィッティング操作を実施するステップ；および４）結果を分析するステップ。

１つの構造は、標的（即ち、固定された構造）として同定される；全ての残りの構造は、動作する構造（即ち、移動する構造）である。ＱＵＡＮＴＡ内の原子等価性は、ユーザーの入力によって定義されるが、本開示の目的のために、等価な原子は、比較されている２つの構造間の全ての保存された残基について、タンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）として定義される。保存された残基は、構造的または機能的に等価である残基として定義される。厳正なフィッティング操作のみが考慮される。

厳正なフィッティング方法が使用される場合、動作する構造は、標的構造との最適なフィットを得るために、並進され回転される。このフィッティング操作は、等価な原子の特定の対にわたりフィットの根平均二乗差が絶対最小値であるように、移動構造に適用される最適な並進および回転を計算するアルゴリズムを使用する。オングストロームで与えられるこの数は、ＱＵＡＮＴＡによって報告される。

構造的に等価な結晶構造は、許容可能な誤差範囲内で実質的に同一な２つの分子の一部分を有する。上記誤差範囲は、当業者に公知の方法によって計算することができる；いくつかの実施形態では、任意の分子もしくは分子複合体またはそれらの任意の一部分は、約０．７０Å未満、好ましくは０．５Åの保存された残基骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）の根平均二乗偏差を有する。例えば、構造的に等価な分子または分子複合体は、表１、２および／または３に列挙される構造座標のセット全体±０．７０Å以下、好ましくは０．５Åのそのアミノ酸の保存された骨格原子からの根平均二乗偏差によって定義される、分子または分子複合体である。用語「根平均二乗偏差」は、上記偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。これは、傾向またはオブジェクトからの逸脱または変動を表現するための方法である。本開示の目的のために、上記「根平均二乗偏差」は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの骨格またはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの骨格（本明細書に記載される複合体の構造座標によって定義される）からの、タンパク質の骨格またはその明確な構造形体における変動を定義する。
４．構造的に相同な分子、分子複合体および結晶構造

構造座標は、別の結晶化した分子または分子複合体に関する構造情報を取得することにおいて補助するために使用することができる。本開示の方法は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも一部分の構造形体に類似した１つまたは複数の構造形体を含む分子または分子複合体の３次元構造の少なくとも一部分の決定を可能にする。これらの分子は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに対して「構造的に相同な」と本明細書で称される。類似の構造形体には、例えば、アミノ酸同一性の領域、保存された活性部位または結合部位モチーフ、および同様に配置された二次構造エレメントが挙げられ得る。

必要に応じて、構造相同性は、その配列の長さに沿って同一アミノ酸の数を最適化するように２つのアミノ酸配列の残基をアラインさせることによって決定される；いずれかの配列または両方の配列におけるギャップは、アラインメントを作成する際に同一アミノ酸の数を最適化するために許容されるが、各配列中のアミノ酸は、それにもかかわらず、その適切な秩序のままでなければならない。２つのアミノ酸配列は、Ｔａｔｕｓｏｖａら（５６）によって記載され、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において入手可能な、ＢＬＡＳＴ ２検索アルゴリズムのＢＬＡＳＴプログラム、バージョン２．０．９を使用して比較される。好ましくは、行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップペナルティ＝１１、伸長ギャップペナルティ＝１、ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝３およびフィルター オンを含む全てのＢＬＡＳＴ ２検索パラメータについて、デフォルト値が使用される。ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用した２つのアミノ酸配列の比較では、構造類似性は「同一性」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、構造的に相同な分子は、配列番号１または２の配列を有するＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの野生型または組換えアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。より好ましくは、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに対して構造的に相同なタンパク質は、野生型または組換えＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの類似の一部分に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、少なくとも５０アミノ酸の少なくとも１つの連続ストレッチを含む。構造的に相同な分子または分子複合体に関する構造情報を生成するための方法は、周知であり、例えば分子置換技術が挙げられる。他のウイルス遺伝子型由来のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼのアラインメントは、表８に提供される。

従って、別の実施形態では、本開示は、その構造が未知の分子または分子複合体に関する構造情報を取得するために分子置換を利用する方法を提供し、この方法は以下を含む：（ａ）未知であるまたは不完全にしか知られていない構造の結晶化した分子または分子複合体からＸ線回折パターンを生成するステップ；および（ｂ）ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造座標の少なくとも一部分を、このＸ線回折パターンに適用して、その構造が未知であるまたは不完全にしか知られていない分子または分子複合体の３次元電子密度マップを生成するステップ。

分子置換を使用することによって、本開示によって提供されるＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造座標の全てまたは一部は、結晶化した分子または分子複合体の未解明の構造を、かかる情報を最初から決定するための試みよりも、より迅速かつ効率的に決定するために、使用することができる。

分子置換は、未知であるまたは不完全にしか知られていない構造についての位相の正確な推定を提供し得る。位相は、結晶構造を解明するために使用される方程式中の１つの因数であり、この因数は、直接決定することはできない。分子置換以外の方法によって位相についての正確な値を取得することは、近似および精密化の反復性のサイクルを含み、結晶構造の解明を大いに妨害する、時間のかかるプロセスであり得る。しかし、構造的に相同な一部分を少なくとも含むタンパク質の結晶構造が解明された場合、既知の構造を使用した分子置換は、未知であるまたは不完全にしか知られていない構造についての位相の有用な推定を提供する。

従って、この方法は、未知の分子または分子複合体の結晶の単位格子内のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの関連の部分を配向させ位置付けることによって、その構造座標が未知である分子または分子複合体の予備的モデルを生成することを包含する。この配向または位置付けは、その構造が未知である分子または分子複合体の結晶の観察されたＸ線回折パターンを最も良く説明するように、実施される。次いで、この構造の電子密度マップを生成するために、位相がこのモデルから計算され得、観察されたＸ線回折パターンの振幅と組み合わせることができる。このマップは、次いで、未知の結晶化した分子または分子複合体の最終的な正確な構造を提供するために、確立されかつ周知のモデル構築技術および構造精密化技術に供することができる（例えば、Ｌａｔｔｍａｎ、１９８５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１５巻：５５〜７７頁を参照のこと）。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの一部分に対して十分に構造的に相同な任意の結晶化した分子または分子複合体の一部分に関する構造情報が、この方法によって解明することができる。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの重原子誘導体もまた、ホモログとして含まれる。用語「重原子誘導体」とは、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結晶を化学的に改変することによって生成する、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの誘導体を指す。実際には、結晶は、結晶を通って拡散できタンパク質の表面に結合できる、塩化鉛、金チオリンゴ酸塩、セレンメチオニン、チオメルサールまたは酢酸ウラニルなどの重金属原子塩または有機金属化合物を含む溶液に浸漬される。結合した重金属原子（複数可）の位置（複数可）は、浸漬された結晶のＸ線回折分析によって決定することができる。この情報は、次いで、タンパク質の３次元構造を構築するために使用される位相情報を生成するために使用される（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、１９７６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造座標はまた、種々のＲＮＡ鋳型プライマー分子と共複合体化されるＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼバリアントまたはホモログの結晶の構造を解明またはモデル化するために特に有用である。このアプローチは、抵抗性ＨＣＶ ＲＮＳポリメラーゼの阻害剤を含む候補ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤間の相互作用のための最適な部位の決定を可能にする。この情報は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ間またはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ間のより効率的な結合相互作用、例えば、増加した疎水性相互作用もしくは極性相互作用を決定するためのさらなるツールを提供する。例えば、異なる型の溶媒に曝露された結晶から収集された高分解能Ｘ線回折データは、各型の溶媒分子が存在する場所の決定を可能にする。次いで、これらの部位に密接に結合する低分子がデザインおよび合成され得、それらのＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ親和性および／または阻害活性について試験することができる。

上で言及された全ての複合体は、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、コンピュータソフトウェア、例えば、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．により配布される）（例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、１９７６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１４巻および１１５巻、Ｈ． Ｗ． Ｗｙｃｋｏｆｆら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８５年）を参照のこと）を使用して、１．５〜３．５Å分解能のＸ線データに対して、約０．３０以下のＲファクターまで精密化され得る。従って、この情報は、公知のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を最適化するために使用され得、より重要なことには、新たなモジュレーターをデザインするために使用することができる。

本開示は、本開示の方法を使用して決定されるように、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに対して構造的に相同な分子または分子複合体の構造座標によって定義される点のセットによって定義される独自の３次元立体配置、構造的に等価な立体配置、および構造座標のかかるセットを含む磁気記憶媒体もまた包含する。
５．ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼのモジュレーターの同定のための方法

別の態様では、候補モジュレーターは、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに対する結合などの生物学的アッセイを使用して同定することができる。次いで、候補モジュレーターは、例えば、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに対する結合などの特性を改善するために、類似の薬剤をデザインするためおよび／または候補モジュレーターを改変するためのモデルとして機能し得る。候補モジュレーターのデザインまたは改変は、結晶構造座標および入手可能なソフトウェアを使用して達成することができる。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位のアンタゴニストまたはアゴニストである薬剤を評価する方法を提供し、この方法は、表１、２または３の結晶学座標の少なくとも一部分を、アンタゴニストである分子をデザインするのに適したＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の３次元モデルを作成するコンピュータアルゴリズムに適用するステップ、および分子構造データベースを検索して、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の潜在的アンタゴニストを同定するステップ、を含む。他の実施形態では、方法は、アンタゴニストを合成または取得するステップ、このアンタゴニストをＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼと接触させるステップ、およびＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性をモジュレートするアンタゴニストを選択するステップ、をさらに含む。

いくつかの実施形態では、コンピュータ実行される方法もまた提供される。かかる方法の１実施形態は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活動性活性（ａｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）をモジュレートする薬剤を同定するためのコンピュータ支援された方法を包含し、この方法は、ＲＮＡ鋳型プライマー分子中の少なくとも１つの核酸残基を改変するステップ、およびこの改変されたＲＮＡ鋳型分子と表１、２または３に示されるＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも１つのアミノ酸残基の構造座標との間のフィッティング操作を実施するステップ、を含む。他の実施形態は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性をモジュレートする薬剤を同定するためのコンピュータ支援された方法を包含し、この方法は、（ａ）ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも一部分を定義する表１、２または３の構造座標のセットを、コンピュータモデル化アプリケーションに提供するステップ；（ｂ）試験薬剤に関する構造座標のセットを、このコンピュータモデル化アプリケーションに提供するステップ；および（ｃ）（ｂ）と複合体化した（ａ）の構造をモデル化して、この試験薬剤がＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位と会合するかどうかを決定するステップ、を含む。

なお他の実施形態は、上記ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを結合する薬剤をデザインするためのコンピュータ支援された方法を包含し、この方法は以下を含む：（ａ）該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも一部分を定義する表１、２または３の構造座標のセットを、コンピュータモデル化アプリケーションに提供するステップ；および（ｂ）（ａ）の構造座標をモデル化して、該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位中の少なくとも１つのアミノ酸残基と接触する薬剤を同定するステップ。
結合部位および他の構造形体

本開示は、基質の存在下または非存在下におけるＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位の形状および構造に関する情報をとりわけ提供する。それらの対応する受容体または酵素の活性部位と天然のリガンドまたは基質との会合は、多くの生物学的作用機構の基礎である。同様に、多くの薬物は、受容体および酵素の結合部位との会合を介して、その生物学的効果を発揮する。かかる会合は、結合部位の全てまたは任意の一部に対して生じ得る。かかる会合の理解は、その標的とのより望ましい会合を有し、従って改善された生物学的効果を有する薬物のデザインを導く助けとなる。従って、この情報は、以下でより詳細に考察するように、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の潜在的モジュレーターをデザインする際に有用である。

いくつかの実施形態では、鋳型分子に対するＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位は、アミノ酸Ｔｙｒ４４８、Ａｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９、Ａｓｐ２２０、Ｔｈｒ２２１、Ａｒｇ１５８、Ａｓｐ２２５、Ｉｌｅ１６０、Ｓｅｒ２８２およびそれらの混合におけるＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの位置のアミノ酸残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位は、その骨格原子が、結合した基質もしくはリガンドの１つまたは複数の構成原子の約５Å以内に置かれたアミノ酸または結合した基質もしくはリガンドに起因して溶媒露出表面積を喪失するアミノ酸によって、定義することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１０Å〜約３００Å、より好ましくは約５０Å〜３００Åの溶媒露出表面積を喪失するＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の一部または全てを形成するアミノ酸残基である。好ましくは、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの未結合コンフォメーションにおける活性部位は、これらのアミノ酸残基の全てを含む。
合理的薬物デザイン

コンピュータによる技術は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたは構造的に相同な分子と会合することが可能な、リガンドおよびその組合せをスクリーニング、同定、選択、デザインするために使用することができる。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの候補モジュレーターは、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに対する結合などの機能的アッセイを使用して同定され得、新規モジュレーターが、そうして同定された候補分子の構造に基づいてデザインすることができる。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの構造座標の知見は、例えば、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位のコンフォメーションに対して相補的な形状を有する合成化合物のデザイン、同定などのプロセスおよび他の分子のデザイン、同定などのプロセスを可能にする。特に、コンピュータによる技術は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位と会合するアゴニストおよび／またはアンタゴニストなどのリガンドを同定またはデザインするために使用することができる。アンタゴニストは、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位の全てまたは一部分に結合し得るまたはそれらを妨害し得、競合的、非競合的または不競合的阻害剤であり得る。一旦同定され生物学的活性についてスクリーニングされると、これらのアゴニスト、アンタゴニストおよびそれらの組合せは、治療的および／または予防的に使用され、例えば、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性を遮断し、そして従って、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性と関連する疾患の発症および／またはさらなる進行を予防することができる。ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼと結合またはＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを妨害するリガンドのアナログに関する構造−活性データもまた、コンピュータにより取得することができる。

他の実施形態では、モジュレーターのデザインにおいて有用であり得る基準は、そのモジュレーターが、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位の窪みにフィットし得るかどうかである。上記窪みの体積は、表面に近接したポケットの入り口に原子を置き、これらの原子の体積を計算するためにＧＲＡＳＰなどのプログラムを使用することによって、決定することができる。別の基準は、上記アンタゴニストが、Ｔｙｒ４４８、Ａｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９、Ａｓｐ２２０、Ｔｈｒ２２１、Ａｒｇ１５８、Ａｓｐ２２５、Ｉｌｅ１６０およびＳｅｒ２８２などの活性部位中のアミノ酸残基との相互作用を強化するかどうかである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、上記活性部位中の少なくとも１つまたは全ての残基のアミノ酸と相互作用するようにデザインされる。

従って、本明細書で同定されるようなＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたは構造的に相同な分子もしくは分子複合体あるいはそれらの一部分の構造のグラフィカル３次元描写を表示することが可能な機械可読記憶媒体に記憶されたデータは、薬物発見のために有利に使用することができる。上記リガンドの構造座標は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼもしくはＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼとＲＮＡ鋳型分子との複合体、または構造的に相同な分子の３次元画像に対してコンピュータによりフィッティングされ得る３次元画像を生成するために使用される。次いで、上記データ記憶媒体中のデータによってコード化された３次元分子構造は、リガンドと会合するその能力についてコンピュータにより評価することができる。このデータによってコード化された分子構造がコンピュータスクリーンにグラフィカル３次元描写で表示される場合、そのタンパク質構造は、リガンドとの潜在的な会合について視覚的にも調査できる。

薬物デザインの方法の１実施形態は、候補リガンドの、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼもしくは構造的に相同な分子または相同な複合体との、特に、活性部位、または結合部位の一部分における少なくとも１つのアミノ酸残基との潜在的な会合を評価するステップを包含する。従って、薬物デザインの方法は、選択されたリガンドの、上に示された分子または分子複合体のいずれかとの会合の潜在性を、コンピュータにより評価するステップを包含する。この方法は、（ａ）コンピュータによる手段、例えば、当該分野で公知のまたは本明細書に開示される適切なソフトウェアを含むプログラム可能なコンピュータなどを使用して、選択されたリガンドと分子または分子複合体のリガンド結合部位またはリガンド結合部位のサブサイドとの間のフィッティング操作を実施するステップ、および（ｂ）該フィッティング操作の結果を分析して、該リガンドと該リガンド結合部位との間の会合を定量化するステップ、を包含する。必要に応じて、この方法はさらに、上記選択されたリガンドが、上記ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位および／またはサブサイドのアミノ酸と相互作用する能力を分析するステップを包含する。この方法はまた、他のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子型２ａの結合部位に対するリガンドのフィットを最適化するステップをさらに含み得る。必要に応じて、上記選択されたリガンドは、合成され得、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼと共に結晶化され得、選択されたリガンドに対するさらなる改変が、阻害活性を増強するためまたは上記活性部位にフィットするためになされ得る。

別の実施形態では、薬物デザインの方法は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ、そのホモログまたはそれらの一部分と会合するリガンドの、コンピュータ支援されたデザインを包含する。リガンドは、段階的な様式で、一度に１つの断片でデザインすることができるか、または全体としてもしくはｄｅ ｎｏｖｏでデザインすることができる。リガンドは、ＰＳＩ ３５２６６６６または２’Ｃ−ＭｅＧＴＰなどの、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つの生物学的機能をモジュレートし得る分子の構造に基づいてデザインすることができる。さらに、これらの阻害剤は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの他の公知の阻害剤をモデルとし得る。

必要に応じて、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位に対するリガンドの潜在的な結合は、このリガンドの実際の合成および試験の前に、コンピュータモデル化技術を使用して分析される。これらのコンピュータによる実験が、リガンドとＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位との間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合、このリガンドの試験は未然に除去される。しかし、コンピュータモデル化が強い相互作用を示す場合、この分子は、合成され得、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位と結合するその能力またはＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位を妨害するその能力について試験することができる。化合物が実際にＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性をモジュレートするかどうかを決定するための結合アッセイもまた実施され得、これは当該分野で周知である。

ドッキングは、ＱＵＡＮＴＡおよびＳＹＢＹＬなどのソフトウェアを使用し、その後標準的な分子力学力場を用いたエネルギー最小化および分子動力学、例えばＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲを使用して、達成することができる。特殊コンピュータプログラムもまた、リガンドを選択するプロセスを補助し得る。例には、ＧＲＩＤ（Ｈｕｂｂａｒｄ， Ｓ． １９９９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｉｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６巻：７１１〜１４頁）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能なＭＣＳＳ（ＭｉｒａｎｋｅｒおよびＫａｒｐｌｕｓ（１９９１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１巻：２９〜３４頁）；Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡから入手可能なＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、１９９０年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８巻：１９５〜２０２頁）；ならびにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡから入手可能なＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚら、１９８２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６１巻：２６９〜８８頁）が挙げられる。

上記方法によって一旦化合物がデザインまたは選択されると、そのリガンドがＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位と結合し得るまたはＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位を妨害し得る効率が、コンピュータによる評価によって、試験および最適化することができる。結合部位と結合または結合部位を妨害するようにデザインまたは選択されたリガンドは、その結合した状態で、標的酵素および周囲の水分子との反発的な静電相互作用をこのリガンドが好ましくは欠くように、コンピュータによりさらに最適化することができる。かかる非相補的静電相互作用には、反発的な電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用が挙げられる。特定のコンピュータソフトウェアが、化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するために利用可能である。かかる使用のためにデザインされたプログラムの例には、以下が挙げられる：Ｇａｕｓｓｉａｎ ９４、改訂Ｃ（Ｍ． Ｊ． Ｆｒｉｓｃｈ、Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）；ＡＭＢＥＲ、バージョン４．１（Ｐ． Ａ． Ｋｏｌｌｍａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；およびＡＭＳＯＬ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅｘｃｈａｎｇｅ、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション、例えばＩＭＰＡＣＴグラフィックを有するＩｎｄｉｇｏ２を使用して、実行することができる。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージが、当業者に公知である。

本開示によって包含される別のアプローチは、結合したコンフォメーションであれ未結合のコンフォメーションであれ、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位に対して全体がまたは一部が結合し得るリガンドまたは化合物についての、低分子データベースのコンピュータによるスクリーニングである。このスクリーニングでは、かかるリガンドの結合部位へのフィットの質は、形状相補性または推定された相互作用エネルギーのいずれかによって判断することができる（Ｍｅｎｇら、１９９２年、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｃｈｅｍ． １３巻：５０５〜２４頁）。

別の方法は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼのアンタゴニストまたはアゴニストである薬剤を評価するステップを包含する。方法は、表１、２または３の結晶学座標の少なくとも一部分を、アンタゴニストまたはアゴニストである分子をデザインするのに適した、ＲＮＡ鋳型プライマー分子と複合体化したＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの３次元モデルを作成するコンピュータアルゴリズムに適用するステップ、および、分子構造データベースを検索して、潜在的なアンタゴニストまたはアゴニストを同定するステップ、を含む。この方法はさらに、上記アンタゴニストもしくはアゴニストを合成もしくは取得するステップ、およびこのアンタゴニストもしくはアゴニストを上記ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼと接触させるステップ、および該アンタゴニストもしくはアゴニストなしの対照と比較して該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性をモジュレートする該アンタゴニストもしくはアゴニストを選択するステップ、および／または該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼに結合する該アンタゴニストもしくはアゴニストを選択するステップ、を含み得る。
６．機械可読記憶媒体

ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの全てもしくは一部分またはその活性部位のうち１つあるいは以下に定義される構造的に相同な分子に関する構造座標、あるいは上で定義されたこれらの分子または分子複合体のいずれかの構造的等価物に関する構造座標の、分子または複合体の３次元グラフィカル提示への変換は、市販のソフトウェアの使用を介して簡便に達成することができる。

従って、本開示は、機械可読データがコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体をさらに提供し、上記データを使用するための命令がプログラムされた機械は、上に記載された本開示の分子または分子複合体のいずれかのグラフィカル３次元描写を表示する。好ましい実施形態では、この機械可読データ記憶媒体は、機械可読データがコード化されたデータ記憶材料を含み、上記のデータを使用するための命令がプログラムされた機械は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ鋳型プライマー分子との複合体のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの全てまたは任意の一部を含む分子または分子複合体のグラフィカル３次元描写を表示する。別の好ましい実施形態では、この機械可読データ記憶媒体は、機械可読データがコード化されたデータ記憶材料を含み、データを使用するための命令がプログラムされた機械は、分子または分子複合体±０．０５Å以下のアミノ酸の原子からの根平均二乗偏差のグラフィカル３次元描写を表示する。

代替の実施形態では、この機械可読データ記憶媒体は、構造座標のフーリエ変換を含む第１のセットの機械可読データがコード化されたデータ記憶材料を含み、このデータを使用するための命令がプログラムされた機械は、第２のセットの機械可読データに対応する構造座標の少なくとも一部分を決定するために、分子または分子複合体のＸ線回折パターンを含む該第２のセットの機械可読データと組み合わされる。

例えば、データ記憶媒体を読み出すためのシステムは、中央演算装置（「ＣＰＵ」）、例えばＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリであり得るワーキングメモリ、マスストレージメモリ（例えば、１つまたは複数のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブ）、１つまたは複数のディスプレイデバイス（例えば、ブラウン管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、発光ダイオード（「ＬＥＤ」）ディスプレイ、液晶ディスプレイ（「ＬＣＤ」）、エレクトロルミネセントディスプレイ、真空蛍光ディスプレイ、電界放射ディスプレイ（「ＦＥＤ」）、プラズマディスプレイ、投影パネルなど）、１つまたは複数のユーザー入力デバイス（例えば、キーボード、マイクロホン、マウス、トラックボール、タッチパッドなど）、１つまたは複数の入力回線および１つまたは複数の出力回線を含むコンピュータを含み得、これらは全て、従来の双方向システムバスによって相互接続される。このシステムは、独立型コンピュータであり得るか、または他のシステム（例えば、コンピュータ、ホスト、サーバーなど）にネットワーク化（例えば、ローカルエリアネットワーク、広域エリアネットワーク、イントラネット、エクストラネットまたはインターネットを介して）することができる。このシステムは、さらなるコンピュータ制御されたデバイス、例えば、モバイルデバイス、家庭用電化製品および電気器具もまた含み得る。

入力ハードウェアは、入力回線によってコンピュータに連結され得、種々の方法で実行することができる。本開示の機械可読データは、電話回線または専用データ回線によって接続されたモデム（単数または複数）の使用を介して入力することができる。あるいはまたはさらに、この入力ハードウェアは、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはディスクドライブを含み得る。ディスプレイ端末と共同して、キーボードもまた、入力デバイスとして使用することができる。

出力ハードウェアは、出力回線によってコンピュータに連結され得、従来のデバイスによって同様に実施することができる。例として、この出力ハードウェアには、本明細書に記載されるようにＱＵＡＮＴＡなどのプログラムを使用して、本開示の結合部位のグラフィカル提示を表示するためのディスプレイデバイスが含まれ得る。出力ハードウェアには、ハードコピー出力が作成され得るようにするプリンター、または後の使用のためにシステム出力を記憶するためのディスクドライブもまた含まれ得る。

作動中、ＣＰＵは、種々の入力デバイスおよび出力デバイスの使用を調整し、マスストレージデバイスからのデータアクセスを調整し、ワーキングメモリへおよびワーキングメモリからアクセスし、データ処理ステップのシーケンスを決定する。多数のプログラムが、本開示の機械可読データを処理するために使用することができる。かかるプログラムは、本明細書に記載されるように、薬物発見のコンピュータによる方法に関して考察される。ハードウェアシステムの構成要素に対する言及は、データ記憶媒体の以下の記載全体を通して、適切に含められる。

本開示において有用な機械可読記憶デバイスには、磁気デバイス、電気デバイス、光学デバイスおよびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。かかるデータ記憶デバイスの例には、ハードディスクデバイス、ＣＤデバイス、デジタルビデオディスクデバイス、フロッピー（登録商標）ディスクデバイス、リムーバブルハードディスクデバイス、磁気光学ディスクデバイス、磁気テープデバイス、フラッシュメモリデバイス、バブルメモリデバイス、ホログラフィックストレージデバイスおよび任意の他のマスストレージ周辺デバイスが挙げられるが、これらに限定されない。これらの記憶デバイスは、データの記憶を可能にするために、必要なハードウェア（例えば、ドライブ、コントローラ、パワーサプライなど）ならびに任意の必要な媒体（例えば、ディスク、フラッシュカードなど）を含むことを理解すべきである。

（実施例１）
タンパク質の発現および精製
本発明者らの研究のために、野生型ＨＣＶポリメラーゼ遺伝子型１ｂ ＢＫ分離株およびＨＣＶポリメラーゼ遺伝子型２ａ ＪＦＨ−１分離株の構築物を、表４に示すようにデザインした。

ＨＣＶ遺伝子型１ｂ ＢＫ分離株の野生型ＨＣＶポリメラーゼをコードする核酸構築物を、Ｎ末端の２１アミノ酸が除去されそして切断不能なヘキサヒスチジンタグで置き換えられたポリメラーゼをコードするように改変した。これらの核酸構築物を、ｐＥＴ−２８ａ由来ベクターへとクローニングした。構築物「１ｂ ＷＴ」は、アミノ酸置換Ｌ４７Ｑ、Ｅ８６Ｑ、Ｅ８７ＱおよびＫ１１４Ｒを生じる４つの表面可溶化変異を含んだ。構築物「１ｂ Ｓ２８２Ｔ」は、Ｓ２８２Ｔ抵抗性変異を有するポリペプチドをコードすること以外、１ｂ ＷＴと同じであった。構築物「１ｂ Δ８」は、鋳型として１ｂ ＷＴを使用したが、β−ヘアピン残基４４４〜４５３を除去し、Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーによって置き換えた。表４中で、Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーによって置き換えた残基は、１ｂ Ｗｔにおいて影を付している。構築物「１ｂ Δ８ Ｓ２８２Ｔ」は、鋳型として１ｂ Δ８を使用し、Ｓ２８２Ｔ抵抗性変異をさらにコードした。

ＨＣＶ遺伝子型２ａ ＪＦＨ−１分離株の野生型ＨＣＶポリメラーゼの核酸構築物を、Ｃ末端の２１アミノ酸が除去されそして切断不能なヘキサヒスチジンタグで置き換えられたポリメラーゼをコードするように改変した。これらの核酸構築物を、ｐＥＴ−２８ａ由来ベクターへとクローニングした。構築物「２ａ ＷＴ」では、２つの表面可溶化変異Ｅ８６ＱおよびＥ８７Ｑを、部位特異的変異誘発を介して導入した。構築物「２ａ Δ８」では、２ａ ＷＴの構築物を、β−ヘアピンを除去してＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーによって置き換えた土台の鋳型として使用した。表４中で、Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーによって置き換えた残基は、２ａ ＷＴにおいて影を付している。β−ヘアピンが除去されそしてＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーによって置き換えられた構築物を、ＧｅｎｅＣｏｍｐｏｓｅｒにおいてデザインし、部位特異的変異誘発によってクローニングした。

これらのクローンを、Ｒｏｓｅｔｔａ ＤＥ３ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）へと形質転換した。組換えタンパク質を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＶＷＲ）において２２℃で一晩発現させた。細胞を、５０００×ｇで２０分間の遠心分離によって収集し、その細胞ペレットを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２ｍＭ ＴＣＥＰおよび１０ｍＭイミダゾールに再懸濁した。この溶解物を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅおよび卵白リゾチームの存在下で、４℃で１時間撹拌し、その後、１８，０００ｒｐｍで４０分間の遠心分離によって清澄化した。このタンパク質を、ニッケル固定化アフィニティクロマトグラフィーによって精製したところ、Ｂｉｏｒａｄ ＥｘｐｅｒｉｏｎおよびＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によって決定したとき、約９０％純粋なタンパク質が得られた。このタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２ｍＭ ＴＣＥＰおよび約２００ｍＭイミダゾール中で３．９〜４．４ｍｇ／ｍＬ（約６０μＭ）に濃縮した。
（実施例２）
ＲＮＡ構築物

一連の対称プライマー−鋳型ＲＮＡ構築物および融合プライマー−鋳型ヘアピンＲＮＡ構築物を、実施例１からのＨＣＶポリメラーゼ構築物のＨＣＶ活性アッセイ（実施例３）、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析（実施例４）および結晶学（実施例５）における使用のためにデザインした。これらの構築物は、以前に報告されたように生成した（２０、２１）。表５は、生成したＲＮＡ構築物を示す。影付きの領域は、塩基対合する領域を同定している。
（実施例３）
ＨＣＶ活性アッセイ

ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成活性および鎖終結についてのアッセイを、実施例１からのＨＣＶポリメラーゼ構築物に対して実施した。
方法

ＨＣＶ活性アッセイを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に１μＭの４種の天然リボヌクレオチド、［α−^３２Ｐ］ＵＴＰ、２０ｎｇ／μＬの遺伝子型１ｂ（−）ＩＲＥＳ ＲＮＡ鋳型、１単位／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、４０ｎｇ／μＬのＮＳ５Ｂ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および２ｍＭ ＤＴＴを含む２００μＬ混合物において実施した。この反応物を２７℃でインキュベートし、２０μＬアリコートを所望の時点で採取し、８０μＬの停止溶液（１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．２５Ｍ ＮａＣｌおよび２２５ｍＭクエン酸ナトリウム）中で混合することによってクエンチした。

構築物２ａ ＷＴおよび２ａ Δ８について、阻害アッセイを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に種々の濃度のＰＳＩ−３５２６６６または２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰ、５μＭの４種の天然リボヌクレオチド、［α−^３２Ｐ］ＵＴＰ、２０ｎｇ／μＬの遺伝子型１ｂ（−）ＩＲＥＳ ＲＮＡ鋳型、１単位／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、４０ｎｇ／μＬのＮＳ５Ｂ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および２ｍＭ ＤＴＴを含む２０μＬ混合物において実施した。

この反応物を２７℃でインキュベートし、２ａ ＷＴとの６０分間のインキュベーション後または２ａ Δ８との１５分間のインキュベーション後に、８０μＬの停止溶液を添加することによってクエンチした。放射性ＲＮＡ産物を、以前に記載されたように^２８、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して未反応の基質から分離した。これらの産物を、ホスホイメージャーを使用して可視化および定量化した。反応速度およびＩＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＦｉｔ（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｈｏｒｌｅｙ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を使用して計算した。

構築物１ｂ ＷＴおよび１ｂ Δ８について、阻害アッセイを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に５μＭの４種の天然リボヌクレオチド、［α−^３２Ｐ］ＵＴＰ、２０ｎｇ／μＬの遺伝子型１ｂ（−）ＩＲＥＳ ＲＮＡ鋳型、１単位／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、４０ｎｇ／μＬのＮＳ５Ｂ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および２ｍＭ ＤＴＴを含む１２０μＬ混合物において実施した。この反応物を２７℃でインキュベートし、２０μＬアリコートを、０分、３０分、６０分、９０分および１２０分の時点で採取し、８０μＬの停止溶液（１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２．２５Ｍ ＮａＣｌおよび２２５ｍＭクエン酸ナトリウム）と混合することによってクエンチした。放射性ＲＮＡ産物を、以前に記載されたように、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して未反応の基質から分離した（図２）。これらの産物を、ホスホイメージャーを使用して可視化および定量化した。反応速度およびＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＦｉｔを使用して計算した。

ＨＣＶポリメラーゼ１ｂ ＷＴ、１ｂ Δ８、２ａ ＷＴおよび２ａ Δ８のｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析を、実施例２に記載したように、対称プライマー−鋳型対または融合ヘアピンプライマー−鋳型ＲＮＡの非存在下および存在下で、以前に記載したように（３６、３７）実施した。
結果

Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーを有する１ｂ Δ８試料について、ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成における１０倍より大きい増加が、Ｈｙｂｏｎｄメンブレンで観察された（図１Ａ）。反応速度を、図１Ｂに示すようにグラフ化した。１ｂ Δ８試料は、１ｂ野生型および抵抗性ポリメラーゼと比較して、全ての時点において有意により大きい反応速度を示した。表６は、各々の酵素の相対的活性の比較を示し、１ｂ Δ８試料が、相対的ポリメラーゼ活性において１０〜１５倍の増加を示したことを示している。

この構築物もまた、鎖終結に対して感受性であることが観察され、類似のＩＣ_５０値が、１ｂ野生型（１ｂ ＷＴ）および１ｂ Δ８の両方について、ＧＴＰアナログＰＳＩ−３５２６６６６（４μＭ）および２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰ（７〜１３μＭ）で観察された。図２は、６０分間の期間にわたるＰＳＩ−３５２６６６の存在下でのＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼ１ｂ Δ８構築物の鎖終結を示す。

種々の濃度のＰＳＩ−３５２６６６６または２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰの存在下でのＰＳＩ−３５２６６６または２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰによるＨＣＶポリメラーゼ１ｂ ＷＴ、１ｂ Ｓ２８２Ｔ、１ｂ Δ８および１ｂ Δ８ Ｓ２８２Ｔの鎖終結反応のＩＣ_５０決定を、図３に示す。最も一般的に同定された抵抗性変異Ｓ２８２Ｔの導入の際に、１ｂ ＷＴまたは１ｂ Δ８構築物のいずれかについての類似の阻害パターンが、これら同じ化合物について注目された（ＰＳＩ−３５２６６６、ＩＣ_５０＝９〜１４μＭ、ＩＣ_５０における約２．５倍の増加；２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰ、ＩＣ_５０＝＞１００μＭ；＞１０倍の増加）。これらの結果は、抵抗性変異を有する構築物が、ＰＳＩ−３５２６６６６による鎖終結阻害に対してあまり感受性でないことを示す。欠失および抵抗性変異を有する構築物は、２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰによる鎖終結に対して最も高い抵抗性を示す。これらの結果は、Δ８変異を有する構築物が、試験阻害剤による鎖終結に対して同様に応答し、Ｓ２８２変異に対する同様の応答を有する点で、ＷＴの良好なモデルであることを示唆している。

β−ヘアピンループがＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーで置き換えられた構築物２ａ Δ８は、ｄｅ ｎｏｖｏ合成アッセイにおいて野生型２ａ（２ａ ＷＴ）よりも＞１００倍活性が高いことが観察された（図１０ｂ）。放射性標識された産物の時間依存的形成が、ブロットで示される（図１０ｂ）。２ａ Δ８のＰＳＩ−３５２６６６６（６μＭ）による鎖終結のＩＣ_５０値は、２ａ ＷＴと類似していることが見出された。図１０ｂの右側では、２ａ ＷＴおよび２ａ Δ８の両方についての活性を、ヌクレオチド三リン酸アナログ阻害剤ＰＳＩ−３５２６６６６の存在下で測定したところ、２ａ ＷＴについて６．０５±０．８２μＭおよび２ａ Δ８について６．４１±０．７５μＭのＩＣ_５０値が得られた。

本発明者らは、対称プライマー−鋳型対または融合ヘアピンプライマー−鋳型ＲＮＡの非存在下および存在下において、ＨＣＶポリメラーゼ１ｂ ＷＴおよび１ｂ Δ８に対するｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析^{３６、３７}を実施した。１ｂ ＷＴについて、ＲＮＡの存在下または非存在下で融点の変化はほとんどまたは全く観察されない（Ｔ_ｍ約４４℃、図４）。１ｂ Δ８について、本発明者らは、１ｂ ＷＴと比較してポリメラーゼの不安定化（Ｔ_ｍ約３５℃）を観察したが、対称プライマー−鋳型対または融合ヘアピンプライマー−鋳型ＲＮＡのいずれかの存在下では、最大＋１８℃の顕著な安定化を観察した（図５）。

遺伝子型１ｂ ＨＣＶポリメラーゼで観察されたように、本発明者らは、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析を使用して、ＲＮＡの存在下または非存在下で、２ａ ＷＴの融点の変化をほとんどまたは全く観察しなかった（図６）。２ａ Δ８について、本発明者らは、２ａ ＷＴ（Ｔ_ｍ約４１℃）と比較して、ポリメラーゼの不安定化（Ｔ_ｍ約３５℃）を再度観察した。本発明者らは、対称プライマー−鋳型対または融合ヘアピンプライマー−鋳型ＲＮＡのいずれかの存在下で顕著な安定化を観察した（図７）。安定化の程度は、構築物中の塩基対の数と十分に相関し、より大きいＲＮＡが、それら自体とのより多くの相互作用およびＮＳ５Ｂとのより多くの相互作用を形成することを実証している。

残基４４２〜４５６が切り出されたＨＣＶ ＮＳ５Ｂ １ｂ ＢＫ構築物を合成した。この１ｂ Δ１４ポリメラーゼは活性を低減させたが（データ示さず）、これは、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ遺伝子型１ｂにおける、Ｔｙｒ−Ｇｌｙリンカーによるこのβ−ヘアピンループ中の残基４４４〜４５３（Δ８）の置き換え（「１ｂ Δ８」）が、野生型を超えるプライマー延長活性における１７倍の増加およびプライマー−鋳型ＲＮＡを結合する能力を生じたという報告における、興味のための根拠を提供した^{２０、２１}。Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーを有する１ｂ Δ８についてのｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成における＞１０倍の増加（図１）ならびにｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析を介したＲＮＡ結合の証拠（図４および５）が観察された。この構築物は、鎖終結に対して感受性であり、類似のＩＣ_５０値が、１ｂ野生型（１ｂ ＷＴ）および１ｂ Δ８の両方について、ＧＴＰアナログＰＳＩ−３５２６６６（４μＭ）および２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰ（７〜１３μＭ）について取得された（図２）。さらに、最も一般的に同定された抵抗性変異Ｓ２８２Ｔの導入の際に、１ｂ ＷＴまたは１ｂ Δ８構築物のいずれかについての類似の阻害パターンが、これら同じ化合物について注目された（ＰＳＩ−３５２６６６、ＩＣ_５０＝９〜１４μＭ、ＩＣ_５０における約２．５倍の増加；２’−Ｃ−ＭｅＧＴＰ、ＩＣ_５０＝＞１００μＭ；＞１０倍の増加）^２２（図３）。

遺伝子型２ａのＪＦＨ１分離株は、細胞培養物中ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの効率的な複製が可能な唯一のクローニングされたＨＣＶ株である^２３。β−ヘアピンループがＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーで置き換えられた２ａ ＪＦＨ１ ＮＳ５Ｂの構築物（「２ａ Δ８」）は、ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成アッセイにおいて野生型２ａよりも＞１００倍活性が高く（図１０ｂ）、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析においてＲＮＡを結合することが可能であり（図６および７）、野生型２ａと比較してＰＳＩ−３５２６６６（６μＭ）による鎖終結について類似のＩＣ_５０値を生じた（図１０ｂ）ことが観察された。２ａ Δ８の結晶構造を、実施例４に記載したように取得した。
（実施例４）
結晶化および構造決定

遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂをカバーするほぼ１００個の結晶構造のＨＣＶ ＮＳ５Ｂが報告されているが、全ての構造がＣ末端の膜アンカー尾部を欠いている^４。ＨＣＶ ＮＳ５Ｂは、容易に認識される「フィンガー」、「パーム」および「サム」ドメインと共に、多数のポリメラーゼに共通する「右手」形状を示す^８〜１０（図１０ａ）。成長するＲＮＡプライマー−鋳型対との複合体の野生型ＨＣＶポリメラーゼの高分解能結晶構造を取得するための大規模な努力は不首尾であると証明されたが、非生産的コンフォメーションのポリウリジン鋳型を有する構造が報告されている^１１。

等価なβ−ヘアピンループを欠くノーウォークウイルス^１７、ポリオウイルス^１８および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）^１９由来のＲｄＲｐのより最近のＲＮＡ結合複合体からの知見は、残基４４２〜４５６が切り出されたＨＣＶ ＮＳ５Ｂ １ｂ ＢＫ構築物の合成を促進した。この１ｂ Δ１４ポリメラーゼは活性を低減させたが（データ示さず）、これは、β−ヘアピンループ中の残基を置き換えることにおける興味のための根拠を提供した（報告は、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ遺伝子型１ｂにおけるこのβ−ヘアピンループ中の残基４４４〜４５３（Δ８）のＴｙｒ−Ｇｌｙリンカーによる置き換えが、野生型を超えるプライマー延長活性における１７倍の増加およびプライマー−鋳型ＲＮＡを結合する能力を生じたことを言及している^{２０、２１}）。β−ヘアピンループ中の残基４４４〜４５３がＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーによって置換されたＨＣＶ ＮＳ５Ｂ １ｂ ＢＫ構築物１ｂ Δ８を合成した。１ｂ Δ８についてｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成における＞１０倍の増加（実施例３）ならびにｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析を介したＲＮＡ結合の証拠（実施例３）が観察された。遺伝子型２ａのＪＦＨ１分離株は、細胞培養物中ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの効率的な複製が可能な唯一のクローニングされたＨＣＶ株である^２３。ＨＣＶポリメラーゼ遺伝子型２ａ ＪＦＨ−１構築物２ａ ＷＴおよび２ａ Δ８、β−ヘアピンループがＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーによって置き換えられた２ａ ＪＦＨ１ ＮＳ５Ｂの構築物を、実施例１に記載されるようにデザインおよび合成した。ポリメラーゼ構築物２ａ Δ８は、ｄｅ ｎｏｖｏ ＲＮＡ合成アッセイにおいて野生型２ａ、２ａ ＷＴよりも＞１００倍活性が高く（実施例３）、ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析においてＲＮＡを結合することが可能であり（実施例３）、野生型２ａと比較してＰＳＩ−３５２６６６（６μＭ）による鎖終結について類似のＩＣ_５０値を生じた（実施例３）ことが観察された。１ｂ Δ８および２ａ Δ８ポリメラーゼ構築物の両方がそれぞれのＷＴ構築物と類似の活性を示したので、プライマー−鋳型の認識および伸長のための構造的基礎を実証するために、１ｂ Δ８および２ａ Δ８ポリメラーゼ構築物の結晶構造を取得するための試みを行った。
方法

タンパク質の結晶化条件を、Ｈａｍｐｔｏｎスクリーン（ｈａｍｐｔｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍから入手可能）およびＪＣＳＧ＋（Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を介してスクリーニングした。結晶を、０．４μＬのタンパク質溶液および１６℃で８０μＬの沈殿物に対して平衡化した等体積の沈殿物を使用して、Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓの９６ウェル形式のＣｏｍｐａｃｔ Ｊｕｎｉｏｒ結晶化プレートにおいてシッティングドロップ蒸気拡散法を使用して成長させた。ロッド形状の結晶（２０×２０×１２０μｍ^３）が、ＪＣＳＧ＋（Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）およびＩｎｄｅｘ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）スパースマトリックススクリーンからのいくつかの条件において、３〜５日以内に出現した。

ａｐｏ ＮＳ５Ｂ ２ａ Δ８構造が、３０％ペンタエリスリトールエトキシレート、０．１Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ６．５および５０ｍＭ硫酸アンモニウムの存在下で成長させた結晶から取得された（図８）。２５％ ＰＥＧ ３３５０、０．１Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ５．５〜６．５および０．２Ｍ酢酸アンモニウム（Ｉｎｄｅｘ Ｇ６−Ｇ７）の存在下で成長させたａｐｏ ＮＳ５Ｂ ２ａ Δ８結晶を、０．２ｍＭ ５’ＵＡＣＣＧ（３’ｄＧ）または５’−ＣＡＵＧＧＣ（ｄｄＣ）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、沈殿物、および凍結保護剤としての１５％エチレングリコールに、１６℃で一晩浸漬させた（図９）。ＭＥＳ緩衝液の存在下で成長または浸漬させたＮＳ５Ｂ ２ａ Δ８結晶は、ＲＮＡ結合と不適合であった。

結晶を回収し、凍結結晶学（ｃｒｙｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）のために液体窒素中で瞬間凍結させた。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ ５．０．３）においてａｐｏデータセットを収集し、ＲＮＡ結合データセットを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ ＬＳ−ＣＡＴ ２１−ＩＤ−Ｇ）において収集した。これらのデータを、ＸＤＳ／ＸＳＣＡＬＥ^２９において整理した。ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ２ａ三重バリアントの以前に決定されたａｐｏ構造（近刊）を使用して、これらの構造をＰＨＡＳＥＲ^３１において分子置換によって解明し、これを次に、野生型ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ２ａ構造（ＰＤＢ ＩＤ ２ＸＸＤ）を使用する分子置換によって解明した。最終モデルを、ＲＥＦＭＡＣ５^３２における多数の反復ラウンドの精密化およびＣＯＯＴ^３３におけるマニュアルモデル構築後に作成した。構造を、正確さについて評価し、Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ^３４を使用して検証した。
結果

実施例３における１ｂ Δ８の生物学的特徴付けは、１ｂ ＷＴと類似の機能性を実証したが、ａｐｏ １ｂ Δ８または三元複合体の結晶構造は、取得することができなかった。２ａ Δ８の２．５Å分解能のａｐｏ結晶構造を取得した。結晶構造に関する座標を表１に示す。

取得された結晶構造は、１．８Åの全体的ｒ．ｍ．ｓ．ｄ値を有する以前に決定された２ａ ＮＳ５Ｂ構造^{２３〜２５}と比較した実質的な構造変化を明らかにした。２ａ Δ８ Ｇｌｙ４４４〜Ｇｌｙ４４５リンカーを秩序付け、Ｐｈｅ５５１は、最後に秩序付けられた残基であった。閉鎖ａｐｏ ２ａ構造^２３のパームドメインおよびフィンガードメインとａｐｏ ２ａ Δ８構造とのアラインメントは、サムドメインの全体的な約２０°の移動を示した（図１１ａ）。β−ヘアピンループの欠如、Ｃ末端リンカー領域の無秩序、およびサムドメインの移動が組み合わさって、ポリメラーゼの中心において大きい窪みを生成した。

サムドメインの移動には、プライマーグリップヘリックスをプライマー突出部ヘリックスに接続する残基３９７〜４１２の顕著な再秩序付けが伴う（図１１）。特に、全ての遺伝子型にわたりｄｅ ｎｏｖｏ開始に重要であることが以前に詳述されたＩｌｅ４０５^２３は、閉鎖野生型構造中のβ−ヘアピンループから１２Åよりも多く移動して、プライマー突出部ヘリックスを延長し、高度に保存されたＴｒｐ４０８の上部にまとまる（図２）。Ｔｒｐ４０８は、閉鎖野生型構造中のほぼ不変のＰｈｅ４２９の上部にスタックし、両方の残基は、２ａ Δ８構造において異なる回転異性体コンフォメーションをとる。

さらに、閉鎖ａｐｏ構造（図１１ｂ）においてフィンガードメインのＨｉｓ９５と接触する高度に保存されたＰｒｏ４０４は、ａｐｏ ２ａ Δ８構造中のＴｒｐ３９７の主鎖の上部にまとまりつつ、ループ中の重要なターンを形成する（図１１ｃ）。このループの再秩序付けは、ＧＴＰを用いたｄｅ ｎｏｖｏ開始から、成長するプライマー−鋳型ＲＮＡの伸長への移行にとって重要であり得る。ａｐｏ ２ａ Δ８構造と他のＲｄＲｐ三元複合体^{１７〜１９}との比較は、この開放コンフォメーションでは、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂがプライマー−鋳型ＲＮＡを結合することが可能であり得ることを示唆した。

ａｐｏ ２ａ Δ８の結晶を、実施例２からの対称プライマー−鋳型ＲＮＡ対ＲＮＡ５４およびＲＮＡ６２に浸漬し、構造を２．９Åおよび３．０Åの分解能において決定した（図１２）。ＲＮＡ５４またはＲＮＡ６２とのＲＮＡ結合構造に関する座標を、それぞれ表２および３に示す。ａｐｏ ２ａ Δ８およびＲＮＡ５４またはＲＮＡ６２とのＲＮＡ結合構造に関する結晶学的統計を表７に示す。

Ａ形態のＲＮＡは、得られた電子密度マップ（図１２ｄおよび図９）において容易に見分けられ、２つのＲＮＡ配列のプリン／ピリミジン対合における差を明らかに示した。両方の対称プライマー−鋳型ＲＮＡ対を、３’−ｄＧまたは２’，３’−ｄｄＣのいずれかにより強制的鎖ターミネーターとしてデザインしたので、当然、産物状態、プレ転位レジストリが、両方の複合体において観察された（図１２ｃ）。核酸塩基水素結合のアクセプターもドナーもこのポリメラーゼによって認識されず、これは、ポリメラーゼによる配列非依存性認識を示す。鋳型鎖の対合するヌクレオチド（慣習により残基＋１）の核酸塩基は、予測されるように^９、厳密に保存されたＩｌｅ１６０の上部にスタックするが、糖は、ＴｙｒまたはＰｈｅとして保存されるＴｙｒ１６２の上部にスタックする（図１３ａ）。対合するヌクレオチドがピリミジンである場合、プライマー鎖の残基＋１（後継ＮＴＰと等価）もまたＩｌｅ１６０と共にまとまり（図１３ａ）、プリン／ピリミジンアナログ三リン酸阻害剤活性における差のいくつかをおそらくは説明する。

鋳型鎖の全てのホスフェートおよび２’−ヒドロキシルは、ＮＳ５Ｂによって認識され（図１３ｂ）、ＨＣＶにとってのＲＮＡ鋳型の重要性を実証している。同様に、プライマー鎖のホスフェートは、フィンガードメインのＡｒｇ１５８およびサムドメインのプライマーグリップヘリックスによって認識されるが、プライマー突出部ヘリックスは、いくつかのプライマー鎖糖とのファンデルワールス相互作用を形成する。基質レジストリ中の後継ＮＴＰと同じ位置に存在する産物、プレ転位状態のプライマー残基＋１の２’−ヒドロキシルは、Ａｓｐ２２５の側鎖によって認識される（図１３ｃ）。両方の構造が３’デオキシ末端残基を含む場合、Ａｓｐ２２５の他のカルボキシレート酸素は、自由にＡｓｎ２９１と水素結合する。ポリオウイルスＲｄＲｐの等価な残基（Ａｓｐ２３８）は、後継ＮＴＰ、転位状態および２価金属イオンの存在に依存して、異なるコンフォメーションをとることが示された^１８。ＤＮＡプライマーとの低減された活性^２６と一致して、プライマー鎖の他方の２’−ヒドロキシルはいずれも、ＮＳ５Ｂによって認識されない。触媒残基の外側の低い配列同一性にもかかわらず、ＨＣＶのプライマー鋳型ＲＮＡ認識戦略全体は、ノーウォークウイルス^１７、ポリオウイルス^１８およびＦＭＤＶ^１９について観察されたものと本質的に同一である（図１３ｄ）。
考察

これらの構造は、ＨＣＶポリメラーゼによるプライマー−鋳型の認識および伸長のための分子的基礎を実証し、阻害剤の影響を減少させつつ、抵抗性由来の変異がポリメラーゼを機能させ続ける構造的基礎に関する知見を提供する。本実施例において記載されるプライマー−鋳型結合複合体のより開放性の性質はまた、アロステリック阻害剤に関する作用様式へのより完全な瞥見を提供する。従って、これらの構造は、特に三元複合体を標的化するヌクレオチドアナログ阻害剤またはＮＮＩにとって、構造によりガイドされる薬物デザインのための有用な結晶化プラットフォームを提供する。プライマー−鋳型結合複合体を得るためにβ−ヘアピンループのエレメントを欠失させる方法論は、反復性の適用を介して、この構造形体を有する他のウイルスＲｄＲｐに対する有用な類似性を証明し得る。

（参考文献）

Claims (29)

1. 配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＨＣＶ遺伝子型２ａ ＲＮＡポリメラーゼバリアントをコードする単離された核酸であって、該ポリメラーゼバリアントは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する、単離された核酸。
2. 前記ＨＣＶ遺伝子型２ａ ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、配列番号８の配列を有する、請求項１に記載の単離された核酸。
3. 配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単離されたバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼであって、該ポリメラーゼバリアントは、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する、単離されたバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ。
4. 前記ＨＣＶ遺伝子型２ａ ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、配列番号８の配列を有する、請求項３に記載の単離されたバリアント。
5. （ａ）ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを単離するステップ；および
   （ｂ）該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを、結晶が形成するまで、約３０％のペンタエリスリトールエトキシレート、５０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、５０ｍＭ硫酸アンモニウムと接触させるステップ、
   を含む、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを結晶化する方法。
6. （ａ）ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを単離するステップ；
   （ｂ）該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを、結晶が形成するまで、約０．２Ｍの酢酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ｐＨ５．５、２５％ ＰＥＧ ３３５０と接触させるステップ；および
   （ｃ）該結晶をＲＮＡ鋳型プライマー分子と接触させるステップ、
   を含む、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを結晶化する方法。
7. 前記ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含み、該ポリメラーゼバリアントが、配列番号１または３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する、請求項５または請求項６に記載の方法。
8. 前記ＲＮＡ鋳型分子が、配列番号９〜１７からなる群から選択される核酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
9. 配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含む結晶であって、該ポリメラーゼバリアントは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する、結晶。
10. 配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼとＲＮＡ鋳型プライマー分子とを含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型プライマー複合体を含む結晶であって、該ポリメラーゼバリアントは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＶ遺伝子型２ａと比較して、増加したＲＮＡ合成活性を有する、結晶。
11. 結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型プライマー複合体。
12. 請求項６に記載の方法によって調製された、結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型プライマー複合体。
13. 配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含む結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ。
14. 請求項５に記載の方法によって調製された、配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含む結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ。
15. 配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含む結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼであって、Ｐ６_５の空間群対称性を有し、単位格子であって、ａはｂに等しく約１４０．６９Åであり、ｃは約９２．６３Åであり、αはβに等しく約９０°であり、γは約１２０°である寸法を有する単位格子を含む、結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ。
16. 配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含む結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型プライマー複合体であって、Ｐ６_５の空間群対称性を有し、単位格子であって、ａはｂに等しく約１４３．２７．６９Åであり、ｃは約９２．１９Åまたは９１．５Åであり、αはβに等しく約９０°であり、γは約１２０°である寸法を有する単位格子を含む、結晶ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型プライマー複合体。
17. 表１の３次元座標を有する、配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼを含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの結晶。
18. 表２または表３の３次元座標を有する、配列番号８のアミノ酸配列を有するバリアントＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼとＲＮＡ鋳型プライマー分子とを含むＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡ鋳型の結晶。
19. 請求項９〜１８のいずれか１項に記載の結晶およびキャリアを含む、組成物。
20. 配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドの未結合のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも一部分を含む分子または分子複合体であって、前記活性部位は、Ｔｙｒ４４８、Ａｓｐ３１８、Ａｓｐ３１９、Ａｓｐ２２０、Ｔｈｒ２２１、Ａｒｇ１５８、Ａｓｐ２２５、Ｉｌｅ１６０およびＳｅｒ２８２ならびにそれらの混合からなる群から選択される、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼのある位置のアミノ酸残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、該少なくとも１つのアミノ酸残基は、表１、２または３に列挙した構造座標によって表されるアミノ酸の骨格原子を表す点から約０．７０Å未満の根平均二乗偏差を有する点のセットによって定義される、分子または分子複合体。
21. 点の少なくとも一部分が、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位を定義するアミノ酸の骨格原子の位置を表す表１、２または３の構造座標から導出される、該点の３次元立体配置。
22. ホログラフィー画像、ステレオ図、モデルまたはコンピュータ表示画像として表示される請求項２１に記載の点の３次元立体配置であって、該点の少なくとも一部分は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位を含む表１、２または３に列挙された構造座標から導出され、該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼが、空間群対称性Ｐ６_５を有する結晶を形成する、点の３次元立体配置。
23. 機械可読データがコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、該データを使用するための命令がプログラムされた機械は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも一部分を含む少なくとも１つの分子または分子複合体のグラフィカル３次元描写を表示し、該活性部位は、表１、２または３に列挙される構造座標によって表されるアミノ酸の原子を表す点から約０．０５Å未満の根平均二乗偏差を有する点のセットによって定義される、機械可読データ記憶媒体。
24. 第１および第２のセットのデータを使用するための命令がプログラムされ、該第２のセットのデータに対応する構造座標の少なくとも一部分を決定する機械を使用して、該第２のセットの機械可読データと組み合わせた該第１のセットの機械可読データがコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体であって、該第１のセットのデータは、表１、２または３のＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ構造座標の少なくとも一部分のフーリエ変換を含み、該第２のセットのデータは、その３次元構造が未知であるまたは不完全にしか知られていない分子または分子複合体のＸ線回折パターンを含む、機械可読データ記憶媒体。
25. ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性をモジュレートする薬剤を同定するためのコンピュータ支援された方法であって、
    （ａ）ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも一部分を定義する表１、２または３の構造座標のセットを、コンピュータモデル化アプリケーションに提供するステップ；
    （ｂ）試験薬剤に関する構造座標のセットを、該コンピュータモデル化アプリケーションに提供するステップ；および
    （ｃ）（ｂ）と複合体化した（ａ）の構造をモデル化して、該試験薬剤が該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位と会合するかどうかを決定するステップ、
    を含む、方法。
26. 結合部位に結合する薬剤をデザインするためのコンピュータ支援された方法であって、
    （ａ）ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも一部分を定義する表１、２または３の構造座標のセットを、コンピュータモデル化アプリケーションに提供するステップ；および
    （ｂ）（ａ）の構造座標をモデル化して、該ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位における少なくとも１つのアミノ酸残基と接触する薬剤を同定するステップ、
    を含む、方法。
27. ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位のアンタゴニストまたはアゴニストである薬剤を評価する方法であって、
    （ａ）表１、２または３の結晶学座標の少なくとも一部分を、アンタゴニストである分子をデザインするのに適したＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位（ｓｉｔｅ ＨＣＶ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｅ）の３次元モデルを作成するコンピュータアルゴリズムに適用するステップ；および
    （ｂ）分子構造データベースを検索して、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の潜在的アンタゴニストを同定するステップ、
    を含む、方法。
28. （ａ）前記アンタゴニストを合成または取得するステップ；
    （ｂ）該アンタゴニストをＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼと接触させるステップ；および
    （ｃ）ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの活性をモジュレートするアンタゴニストを選択するステップ、
    をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活動性活性をモジュレートする薬剤を同定するためのコンピュータ支援された方法であって、
    （ａ）ＲＮＡ鋳型プライマー分子中の少なくとも１つの核酸残基を改変するステップ；
    （ｂ）該改変されたＲＮＡ鋳型分子と表１、２または３に示されるＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼ活性部位の少なくとも１つのアミノ酸残基の構造座標との間のフィッティング操作を実施するステップ、
    を含む、方法。