JP2015502748A - オーロラキナーゼ阻害剤に対する癌細胞薬剤感受性の決定方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌病に冒された患者のオーロラキナーゼ阻害剤治療に対する感受性および／または耐性を決定する方法であって、特定のグループから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を患者から得た癌細胞または体液においてインビトロにて決定する工程および／または特定のグループから選択される少なくとも１つの遺伝子のレベルを患者から得た癌細胞または体液においてインビトロにて決定する工程を有する方法に関する。

Description

発明の詳細な説明

（技術分野）
本発明は、オーロラキナーゼ阻害剤に対する癌細胞薬剤感受性（すなわち癌細胞が感受性または耐性であるか）の決定方法、および、耐性を克服するために用いることができる化合物に関する。

（背景技術）
化学療法は悪性癌患者の主要な治療形態の一つである。癌患者が特定の薬剤に対して最初は応答するにも関わらず、長期に渡る治療中に再発がよくある。癌細胞に対する淘汰圧によって、癌細胞は試薬誘発性細胞死を逃れるより良い遺伝子型に自身を進化させる。癌化学療法では薬剤耐性が主要な障害の一つである（Gottesman M.M. et al., Annual Review of Medicine 2002; 53, 615-27）。薬剤耐性の問題に対処するため、特定の試薬に対する癌細胞耐性機構を同定しかつ理解することが必要である。いくつかのよくある薬剤耐性機構は、薬剤輸送体の上方制御（Parekh M. et al., Biomedical Pharmacology 1997; 56, 461-70）、薬剤標的の変異（Gorre M.E. Science 2001; 293, 876-70）、ＣＹＰ４５０の上方制御（McFayden M.C.E. et al., British Journal of Cancer 2004; 91, 966-71）、および薬剤標的の増幅（Gorre M.E. et al., Science 2001; 293, 876-70）および他にも多くのものを含む。癌薬剤耐性機構は非常に複雑であり、かつ複数の耐性機構が特定の薬剤に関わりうる。薬剤耐性は１つの遺伝子によってもたらされるものではない；むしろそれは多くの遺伝子の影響の結果である。前臨床研究に並行した薬剤耐性機構の研究によって、応答を予測する初期臨床治験研究に適用可能な多くの情報が得られる。

最近、オーロラキナーゼ（Ａ、Ｂ、Ｃ／セリンチロシンキナーゼ）が、いくつかのタイプの癌に関連することから多くの注目を集めている。オーロラキナーゼは有糸分裂における複数の機能に関わる。オーロラＡは、有糸分裂開始、中心子対の分離、正確な双極紡錘体構築、中期染色体の整列、細胞質分裂の完了に関わる（Marumoto T. et al., The Journal of Biological Chemistry 2004; 278, 51786-95）。オーロラＢは、染色体双配向の制御および動原体と微小管との連合の制御に関わる染色体パッセンジャタンパク質である（Adams R.R. et al., The Journal of Biological Chemistry 2001; 15, 865-80）。オーロラＣは、オーロラＢに割り当てられた機能と同様の機能を発揮し、かつ細胞質分裂に必要である。上述した機能はゲノム安定性の維持に直接関わる。オーロラキナーゼの過剰発現と形質転換との間の関連は多くの癌において報告されている。オーロラＡは、結腸直腸癌、腎臓癌、メラノーマ、および乳がんにおいて過剰発現することが示された（Bischoff J.R. et al., EMBO Journal 1998; 17, 3052-65）。主に、オーロラＢは結腸直腸癌において過剰発現することが示された（Katayama H. et al., Journal of National Cancer Institute 1999; 91, 1160-62）。オーロラＢはまた甲状腺未分化癌（Sorrentino R. et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2004; 90, 928-35）およびグリオブラストーマ（Zeng W.F. et al., Journal of Clinical Pathology 2007; 60, 218-21）に関連することが示された。これとは別に、オーロラキナーゼは多くの他の進行性固形癌において過剰発現することが示された。多くの固形癌におけるオーロラキナーゼの過剰発現は、いくつかのオーロラキナーゼ阻害剤を探索しかつ開発するための強力な理由の基礎である。いくつかのオーロラキナーゼ阻害剤はすでに臨床治験されており、進行性固形癌において有望な抗癌活性を示している。ＡＺＤ１１５２（アストラゼネカ）は現在フェーズＩＩ研究にあり、結腸癌およびメラノーマに効果的であることが証明されている。それは進行性癌において安定病態を達成する（chellens J.H. et al., Journal of Clinical Oncology 2006; 24, 3008 (Suppl)）。同様に、ＡＴ−９２８３（Ａｓｔｅｘ）（Kristeleit R. et al., ASCO Annual Meeting 2009）,ＰＨＡ−７３９３５８（ファイザー）（Paquette R. et al., Haemotology Meeting Reports 2008; 2, 92-93）、およびＭＬＮ８２３７（Ｍｉｌｌｉｅｎｎｉｕｍ）（Infante J. et al., European Journal of Cancer Supplements 2008; 6, 90-91）, ＭＬＮ８０５４（Ｍｉｌｌｉｅｎｎｉｕｍ）（Dees E.C. et al., Cancer Chemotherapy and Phramacology 2011; 67, 945-54）、ＶＸ−６８０（Ｖｅｒｔｅｘ）（Bebbington D. et al., Bioorganic & medicical chemistry letters 2009; 19, 3586-92）は、臨床治験において非常に有望であると証明された。

Ｃｙｃｌａｃｅｌ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）によって発見された開発されたＣＹＣ１１６（４−メチル−５−（２−（４−モルフォリノフェニルアミノ）ピリミジン４−イル）チアゾール−２−アミン）は、新しいｐａｎ−オーロラキナーゼ阻害剤である。それは、前臨床研究（Wang S. et al., Journal of Medicinal Chemistry 2010; 53, 4367-78）および初期臨床研究において有望な抗がん活性を示した。オーロラキナーゼとは別に、（オーロラＡ−４４ｎＭ、オーロラＢ−１９ｎＭ、オーロラＣ−６５ｎＭ）ＣＹＣ１１６もまた、ＶＥＧＦＲ２およびＦｌｔ−３を含む他の発癌性キナーゼを阻害する。ＺＭ４４７４３９（Ｎ−［４−［［６−メトキシ−７−３−（４−モルフォリニル）プロポキシ］４キアゾリニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド）は、第一世代オーロラキナーゼ阻害剤である。

本発明は、遺伝子発現または当該遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルがオーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性と共に変化する一群の遺伝子を提供する。したがって本発明は、癌病に冒された患者のオーロラキナーゼ阻害剤治療に対する感受性を決定する方法およびその薬剤耐性機構を克服する治療的アプローチを提供する。

（発明の開示）
発明の目的は、癌病に冒された患者のオーロラキナーゼ阻害剤治療に対する感受性を決定する方法であって、患者から得た癌細胞において、ＣＹＰ２４Ａ１、ＥＨＦ、ＫＲＴ７、ＰＲＫＡＣＢ、およびＡＮＸＡ１０を有するグループから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現変化またはコピー数変化をインビトロにて決定する工程を有する方法である。

より好ましくは、これらの遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの組み合わせの発現を決定する。最も好ましくは、ＣＹＰ２４Ａ１、ＥＨＦ、ＫＲＴ７、ＰＲＫＡＣＢ、およびＡＮＸＡ１０の全遺伝子の組み合わせの発現を決定する。

好ましい実施形態では、ＭＩＤ１、ＡＲＨＧＡＰ２９、Ａ４ＧＡＬＴ、ＣＹＰ１Ａ１、ＧＪＣ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＦＡＭ１２２Ｂ、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＢＤＮＦ、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＥＲＩ１、ＳＥＲＩＮＣ２、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＨＴＲ７、ＴＢＸ３、およびＴＳＰＡＮ１を含むグループから選択される他の少なくとも１つの遺伝子の発現をさらに決定する。

より好ましくは、他の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の遺伝子の発現を決定する。最も好ましくは、ＣＹＰ２４Ａ１、ＥＨＦ、ＫＲＴ７、ＰＲＫＡＣＢ、ＡＮＸＡ１０、ＭＩＤ１、ＡＲＨＧＡＰ２９、Ａ４ＧＡＬＴ、ＣＹＰ１Ａ１、ＧＪＣ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＦＡＭ１２２Ｂ、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＢＤＮＦ、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＥＲＩ１、ＳＥＲＩＮＣ２、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＨＴＲ７、ＴＢＸ３、およびＴＳＰＡＮ１の全遺伝子の組み合わせの発現を決定する。

他の好ましい実施形態では、次の表に示す遺伝子の一覧から選択される他の少なくとも１つの遺伝子の発現をさらに決定する。

より好ましくは、他の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の遺伝子の発現を決定する。

試験癌細胞と比較されるコントロールは、通常、これと遺伝的に同一な薬剤感受性対応物である。腫瘍患者原発腫瘍における評価研究のために、未処理の患者腫瘍から直接単離した細胞をインビトロ試薬応答に用いた。最も感受性のある患者腫瘍対最も耐性のある患者腫瘍から単離した核酸を、株細胞実験において事前に同定した遺伝子発現兆候の検証に用いた。

この表に一覧にした遺伝子発現における増加または減少は、それぞれ、オーロラキナーゼ阻害剤に対して耐性のあるいくつかの試験癌株細胞において観察された。したがって遺伝子発現の変化は、オーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性を示す。

発現はＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで決定することができる。

さらに本発明は、癌病に冒された患者のオーロラキナーゼ阻害剤治療に対する感受性を決定する方法であって、上記患者から得た癌細胞における以下の表に含まれるグループから選択される少なくとも１つのタンパク質のレベルをインビトロにて決定する工程を有する方法を提供する。

薬剤耐性癌細胞と比較されるコントロールは、通常、これと遺伝的に同一な薬剤感受性対応物である。

制御されるタンパク質は、４〜７および６〜１１のｐＨにおける比較２−Ｄゲル電気泳動と、それに続くＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦタンパク質同定によって同定された。全部で、親薬剤感受性細胞に比べて耐性細胞における発現が約２倍またはそれ以上、約−２倍またはそれ以下の４３個のタンパク質がある。

好ましくは、他の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のタンパク質の発現を決定する。

オーロラキナーゼ阻害剤は、好ましくは、ＣＹＣ１１６（４−メチル−５−（２−（４−モルフォリノフェニルアミノ）ピリミジン４−イル）チアゾール−２−アミン）、ＺＭ４４７４３９（Ｎ−［４−［［６−メトキシ−７−３−（４−モルフォリニル）プロポキシ］４キアゾリニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド）、ＡＺＤ１１５２（２−［エチル−［３−［４−［［５−［２−（３−フルオロアニリノ）−２−オキソエチル］−１Ｈピラゾル３イル］アミノ］キナゾリン７−イル］オキシプロピル］アミノ］エチル二水素リン酸塩）、ＶＸ−６８０（Ｎ−［４−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−６−［（５−メチル−１Ｈピラゾル−３−イル）アミノ］ピリミジン２−イル］スルファニルフェニル］シクロプロパンカルボキサミド）、ＭＬＮ８０５４（４−［［９−クロロ−７−（２，６−ジフルオロフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンザゼピン−２−イル］アミノ］安息香酸）、ＭＬＮ８２３７（４−［［９−クロロ−７−（２−フルオロ−６−メトキシフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンザゼピン−２−イル］アミノ］−２−メトキシ安息香酸）、ＰＨＡ−７３９３５８（Ｎ−［５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルアセチル］−４，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピラゾル−３−イル］−４−（４−メチルピペラジン−１−）ベンズアミド）、ＡＴ−９２８３（１−シクロプロピル−３−［（３Ｚ）−３−［５−（モルフォリン−４−イルメチル）ベンズイミダゾール−２−イリデン］−１，２−ジヒドロピラゾル−４−イル］尿素）からから選択される。

発現決定に適した方法は、免疫化学法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、免疫蛍光法、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、電気泳動、質量分析、およびＥＬＩＳＡを含む。

本発明の方法が有用な癌病は、肉腫癌、結腸直腸癌、メラノーマ、皮膚がん、乳がん、甲状腺癌、グリオブラストーマ、肺がん、前立腺癌、卵巣癌、頸椎癌、子宮癌、頭頸部癌、血液癌、胃がん、食道癌、神経癌、すい臓癌、および腎臓癌を含む。

さらに本発明は、オーロラキナーゼ阻害剤耐性腫瘍の治療時に用いられるオーロラキナーゼ阻害剤に組み合わせた、Ｂｃｌ−２阻害剤、特にはＡＢＴ−２６３［（Ｒ）−４−（４−（（４’−クロロ−４，４−ジメチル３，４，５，６−テトラヒドロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）−Ｎ−（（４−（（４−モルフォリノ−１−（フェニルチオ）ブタン−２−イル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルフォニル）フェニル）スルフォニル）ベンズアミド］、ＡＴ−１０１（７−（８−フォルミル−１，６，７−トリヒドロキシ−３−メチル−５−プロパン−２−イルナフタレン−２−イル）−２，３，８−トリヒドロキシ−６−メチル−４−プロパン−２−イルナフタレン−１−カルバルデヒド）、ＧＸ１５−０７０（２Ｅ）−２−［（５Ｅ）−５−［（３，）５−ジメチル１Ｈ−ピロル−２−イル）メチリデン］−４−メトキシピロル−２−イリデン］インドール；メタンスルホン酸）、ＴＷ−３７（Ｎ−［４−（２−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）スルフォニルフェニル］−２，３，）４−トリヒドロキシ−５−［（２−プロパン−２−イルフェニル）メチル］ベンズアミド）、およびｓＨＡ１４−１（２−アミノ−６−ブロモ−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈ−クロメン−３−カルボン酸塩）を構成するグループから選択されるものを含む。

我々はＢｃｌ阻害剤たとえばＡＢＴ−６３がオーロラキナーゼ阻害剤に対する腫瘍の耐性を驚くほど克服することを発見している。

より特にはＢｃｌ−２阻害剤がＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルにおいてＢｃｌ−ｘＬ過剰発現ｐ５３野生型ＣＹＣ１１６における耐性を克服することが示された。

オーロラキナーゼ（たとえばＣＹＣ１１６）誘導耐性におけるＲｃｌ−ｘＬ過剰発現の役割を評価するために、我々はまた、Ｂｃｌ−ｘＬ発現を遺伝的にノックダウンするためのＲＮＡ干渉法を用い、その後、オーロラキナーゼ阻害剤で処理した。耐性を逆転させるＢｃｌ−２阻害剤能力（薬理学的に）に対応して、抗Ｂｃｌ−２ ｓｉＲＮＡとオーロラキナーゼ阻害剤との組み合わせによって、オーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性腫瘍の感受性（親株細胞に近い）が回復する。

ＡＢＴ−２６３［（Ｒ）−４−（４−（（４’−クロロ−４，４−ジメチル３，４，５，６−テトラヒドロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）−Ｎ−（（４−（（４−モルフォリノ−１−（フェニルチオ）ブタン−２−イル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルフォニル）フェニル）スルフォニル）ベンズアミド］は、新たなｐａｎ−Ｂｃｌ−２阻害剤である。ＡＢＴ−２６３は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＢｃｌ−ｗに対して１ｎＭ／Ｌよりも小さいＫｉを有する、経口利用可能なＢａｄ様ＢＨ３擬態物である。Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー特にＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＢｃｌ−ｗの過剰発現は、腫瘍細胞耐性および進行に関わることが示されている。ＡＢＴ−２６３は、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘＬのアポトーシス促進タンパク質（Ｂｉｍ）への結合を妨害し、この結果、急速なアポトーシス細胞死が起こる（Tse C. et al., Cancer Research 2008; 68, 3421-3428）。それは異種移植モデルにおいて化学療法薬の活性を増強することも示されている。

現在、いくつかの他のＢｃｌ−２阻害剤が臨床治験および前臨床治験の段階にある。Ａｓｃｅｎｔａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発されたＡＴ−１０１（７−（８−フォルミル−１，６，７−トリヒドロキシ−３−メチル−５−プロパン−２−イルナフタレン−２−イル）−２，３，８−トリヒドロキシ−６−メチル−４−プロパン−２−イルナフタレン−１−カルバルデヒド）は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＭｃｌ−１の経口利用可能な潜在的阻害剤である。現在、固形癌および血液癌において試験中の臨床治験フェーズＩＩにある（Liu G. et al., Clinical Cancer Research 2009; 15, 3172-3176）。それは、乳房、結腸、前立腺、頭頸部、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫を含むいくつかの腫瘍モデルにおいて、顕著な抗腫瘍活性を示す。この化合物は、下痢、疲労、悪心、および食欲不振を含む毒性がより緩和した厳しさで許容された。この化合物は、良好な薬物動態学的および薬理学的特性を有する。Ｇｅｍｉｎｉ Ｘによって開発されたＯｂａｔｏｃｌａｘメシル酸素（ＧＸ１５−０７０）（２Ｅ）−２−［（５Ｅ）−５−［（３，）５−ジメチル１Ｈ−ピロル−２−イル）メチリデン］−４−メトキシピロル−２−イリデン］インドール；メタンスルホン酸）は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ａ１、およびＢｃｌ−ｂの潜在的阻害剤である。それは現在、固形癌および血液学的癌において試験中の臨床治験フェーズＩＩにある（Schimmer A.D. et al., Clinical Cancer Research 2008; 14, 8295-8301）。それは患者に対する点滴の形態で利用可能である。Ｏｂａｔｏｃｌａｘの副作用は、傾眠、疲労、めまい、多幸感、歩行障害を含む。血漿濃度は点滴終了前に定常状態に到達する。いくつかのＢｃｌ−２阻害剤が、現在、前診療評価の段階にある。ＴＷ−３７（Ｎ−［４−（２−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）スルフォニルフェニル］−２，３，）４−トリヒドロキシ−５−［（２−プロパン−２−イルフェニル）メチル］ベンズアミド）はミシガン大学の研究者によって最初に合成された。それはＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＭｃｌ−１に対して高親和性を有する。それはアポトーシス促進性活性（Mohammad R.M. et al., Clinical Cancer Research 2007; 13, 2226-2235）および血管新生抑制活性（Zeitlin B.D. et al., Cancer Research 2006; 66, 8698-8706）の双方を有する。ＴＷ−３７はマウス静注入された。最大耐用量でのマウスにおける副作用は体重減少および薄汚い毛皮を含む。前診療的ｓＨＡ１４−１（２−アミノ−６−ブロモ−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈ−クロメン−３−カルボン酸塩）は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＭｃｌ−１に対して高い親和性を有する。それはジャーカット細胞においてアポトーシスを効果的に引き起こす（Tian D. et al., Cancer Letters 2008; 8, 198-208）。それは、薬剤耐性を克服することもまた示されている。いくつかの自然に見出されるＢｃｌ−２阻害剤は、テトロカルシンＡ、チェレスリン塩化物、およびアンチマイシンを含む。これらとは別にいくつかの製薬会社が自身の主導的Ｂｃｌ−２阻害剤を開発している。潜在的には上述した全てのＢｃｌ−２阻害剤は試薬耐性を克服するためにオーロラキナーゼ阻害剤に組み合わせて利用することができる。

Ｂｃｌ−ｘＬ発現もまた複数の多発性骨髄腫における化学療法耐性の指標候補であることが示された（Tu Y. et al., Cancer Research 1998; 58, 256-62）。それゆえ抗アポトーシスＢｃｌ−２メンバーの過剰発現は、小分子阻害剤による標的の強力な理論的根拠を構成する。現在、ＡＢＴ−２６３は多くの固形癌および難治性白血病において評価されているフェーズＩＩ臨床治験にある。

本発明の一例において示され、オーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性を克服し、特に、Ｂｃｌファミリーの発現変化に明白に関連するＡＢＴ−２６３の作用は、Ｂｃｌ−２阻害剤が一般にオーロラキナーゼ阻害剤に対する腫瘍の耐性を克服することに適していることを示す。特にＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６クローンにおけるＢｃｌ−ｘＬ（Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー）の上方制御はまた、ウェスタンブロットを用いてタンパク質レベルにおいて決定された。それゆえ我々は薬剤耐性を過剰克服するために、ＣＹＣ１１６耐性クローンにおけるＢｃｌ−２ファミリー阻害剤であるＡＢＴ−２６３を試した。

遺伝子の名称および略称はＥＮＳＥＭＢＬデータベースおよびアフィメトリクスデータベースに即して示す。

（図面の簡単な説明）
図１：原発腫瘍サンプルにおける耐性クローン遺伝子発現条件（実施例を参照）と比べて、いくつかの遺伝子に対するＣｔ値（表８を参照）を、薬剤感受性患者腫瘍対薬剤耐性患者腫瘍における相対的遺伝子発現を示すチャートを構築するために用いた。

図２：ＣＹＣ１１６耐性クローンおよびＺＭ４４７４３９耐性クローンに対するＡＢＴ−２６３の有効性。Ｙ軸は親クローンおよび耐性クローンにおけるＡＢＴ−２６３のＩＣ５０値（μＭ）を示す。ＭＴＴアッセイを独立した３回の繰り返し実験において行った（ｎ＝３）。

図３：ＨＣＴ親株細胞に対するＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６耐性クローンにおけるＢｃｌ−ｘＬの上方制御を示すウェスタンブロット。アクチンをローディングコントロールに用いた。

図４：遺伝的（ｓｉＲＮＡ）Ｂｃｌ−ｘＬノックダウンおよびそれに続くＣＹＣ１１６処理を示すＭＴＴアッセイ、ＣＹＣ１１６に対するＣＹＣ１１６耐性クローンの感受性を回復した（ｎ＝３）。

（発明を実行する実施例）
（実施例１）
（はじめに）
我々は耐性クローンを選択するために２つの株細胞（ＨＣＴ１１６ ｐ５３＋／＋およびＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−）および２つのオーロラキナーゼ阻害剤（ＣＹＣ１１６およびＺＭ４４７４３９）を用いた。各株細胞を別々に１μＭ濃度でＣＹＣ１１６またはＺＭ４４７４３９に曝し、４〜５週間後にコロニーが現れた。コロニーを単離し、さらなる研究のために拡大させた。

耐性、交差耐性、多剤耐性、細胞周期条件、薬剤輸送体の発現、およびバイオマーカー調整に関して、耐性クローンの初期性質決定を行った。全てのＣＹＣ１１６耐性クローンおよびＺＭ４４７４３９耐性クローンは、構造的に別々であった、他のオーロラキナーゼ阻害剤に対する交差耐性を示した（表１）。これらの阻害剤は、ＡＺＤ１１５２（アストラゼネカのオーロラＢ特異的）、ＶＸ−６８０（Ｖｅｒｔｅｘのｐａｎ−オーロラ阻害剤）、およびＭＮＬ８０５４（ＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍｓオーロラＡ特異的）を含む。この交差耐性は、その同様の機構的作用のため本質的であり、耐性の分子基盤は共通し得る。それゆえ我々の発明はすでに臨床治験にあるオーロラキナーゼ阻害剤（ＡＺＤ１１５２、ＶＸ−６８０、およびＭＬＮ８０５４）および開発中の阻害剤に適用できる。

表１．他の合成オーロラキナーゼ阻害剤に対するＣＹＣ１１６耐性クローンおよびＺＭ４４７４３９耐性クローンの交差耐性条件

上記の表１内の全ての値はそれぞれ技術的に２回繰り返した３つの独立した実験から算出したμＭでの平均ＩＣ５０を表す。上記のデータに対するＳＤ値は±０．０００４〜±１１の範囲にある。括弧内の値は耐性クローンの平均ＩＣ５０値を親ｐ５３＋／＋細胞のＩＣ５０値または親ｐ５３−／−細胞のＩＣ５０値で割ることによって算出される増加倍率である。ＡＺＤ１１５２は、試した最も高い濃度においてさえもｐ５３−／−バックグラウンド細胞におけるＩＣ５０値まで到達できなかった。

潜在的な耐性機構を同定するために用いた方法は、薬剤輸送体、オーロラキナーゼ発現、標的変異、およびマイクロアレイベースの差動的遺伝子発現の解析を含む。ＣＹＣ１１６耐性クローンにおいて決定した遺伝子発現兆候を、様々なＣＹＣ１１６感受性原発腫瘍生検およびＣＹＣ１１６耐性原発腫瘍生検と比較した。遺伝子の構造的変化および数的変化を決定するために、全ての耐性クローンに対して比較ゲノムハイブリダイゼーションを行った。最後に差動的タンパク質発現研究を２ＤＥ質量分析を用いて行った。

高度に上方制御（＞２倍変化）または下方制御（＜２倍変化）される特定の遺伝子の例およびその生物学的役割を以下に示す：
チトクロムＰ４５０、ファミリー１、サブファミリー、ポリペプチド１（ＣＹＰ１Ａ１）が、全てのＣＹＣ１１６耐性クローンにおいて高度に過剰発現することが見出された。ＣＹＰ１Ａ１は多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）の代謝に関与する。喫煙者ではＣＹＰ１Ａ１はＰＡＨを前発癌物質に変換する。ＣＹＰ１Ａ１発現は肺がんにおいて報告されており、かつ多くの肺腫瘍において発現は変化した（McLemore T.L. et al., Journal of the National Cancer Institute 1990; 82, 1333-39）。ＨＣＴ１１６およびＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−をＣＹＣ１１６で４８時間処理すると、ＣＹＣ１１６の上方制御は観察されなかった。しかし全てのＣＹＣ１１６クローンが高レベルのＣＹＰ１Ａ１を示した。ＣＹＰ１Ａ１はＣＹＣ１１６応答を予測するのに高度に適しており、その機能に基づき、ＣＹＰ１Ａ１阻害は代謝安定性を増加しかつＣＹＣ１１６に対する薬剤耐性を低減することに使えると予測できる。

Ｒｕｎｔ関連転写制御因子２（ＲＵＮＸ２）は、ＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６クローンにおいて上方制御されるもう１つの遺伝子である。ＲＵＮＸ２は骨芽細胞分化に関わる転写制御因子であり、また、多くの癌タイプにおける発癌において主要な役割を有する。それは、特に骨に対する転移乳がんおよび転移すい臓癌において過剰発現することが示された。それは生存促進および転移促進にも関与している。それは高転移性前立腺癌において過剰発現しかつコロニー形成を助けることが見出された。２２Ｒｖ１前立腺癌株細胞におけるＲＵＮＸ２の誘導発現は抗癌試薬に対する耐性を与える（Chua C.W. et al., Clinical Cancer Research 2009; 15, 4322-35）。

ｖ−Ａｋｔ、マウス胸腺腫ウイルス性癌遺伝子ホモログ３（タンパク質キナーゼＢ、ガンマ）（ＡＫＴ３）は、ＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６クローンにおいて上方制御される。脱制御されたＡＫＴイソ型はいくつかの重要なアポトーシス促進性遺伝子（ＢＡＤおよびプロカスパーゼ９）を不活性化し、かつ腫瘍細胞生存を引き起こす。それはＭＤＭ２活性およびそれに続くｐ５３下方制御を活性化することも示された。ＡＫＴをノックダウンすると多くの癌株細胞においてアポトーシスが引き起こされた（Koseoglu S. et al., Cancer Biology & Therapy 2007; 6, 755-62）。それゆえＡＫＴはＣＹＣ１１６応答を検証する際の信頼できるバイオマーカーとして機能する。Ｂ−ＲＡＦ標的メラノーマ細胞に対する耐性におけるその役割が最近記述された（Shao Y. et al., Cancer Research 2010; 70, 6670-81）。

ケラチン７（ＫＲＴ７）もまたＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６クローンにおいて上方制御される。サイトケラチンは構造タンパク質であり、統合性、信号伝達、および分化のフレームワークを構成する。サイトケラチンは化学療法に応答して癌細胞生存に影響することが示された。サイトケラチンの発現を増加させると、試薬分布、発癌性オーロラキナーゼのような節約型核標的に影響しうる（Bauman P.A. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1994; 91, 5311-14）。

チトクロムＰ４５０、ファミリー２４、サブファミリーＡ、ポリペプチド１（ＣＹＰ２４Ａ１）は、ＨＣＴ１１６クローンおよびＨＣＴ１１６ｐ５３−／−ＣＹＣ１１６クローンの双方において高度に下方制御されている。それは活性ビタミンＤの分解に関与する。ＣＹＰ２４Ａ１は多くの癌において過剰発現することが示され、かつ予後不良に関与している。活性ビタミンＤは肺腺癌細胞において抗癌活性を有する。ＣＹＰ２４Ａ１のｍＲＮＡは低分化の癌において高度に発現している。高度なＣＹＰ２４Ａ１発現のため、Ａ５４９株細胞はビタミンＤに対してより耐性があった（Chen G. et al., Clinical Cancer Research 2011; 17, 817-26）。しかしＣＹＰ２４Ａ１の下方制御機構およびＣＹＣ１１６耐性クローンにおけるその影響は未知であり、しかし、耐性クローンのより遅いサイクルに関与し、それゆえオーロラキナーゼ阻害剤に対する増加した応答に関与しうる。

Ｅｔｓ相同性因子はＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＣＹＣ１１６耐性クローンにおいて高度に上方制御されている。ＥＨＦは保存されたＤＮＡ結合ドメインを有し、その異常発現は多くの癌において報告されている。ドキソルビシン誘導ストレスに応答して、ＥＨＦ発現によって、老化減少および前立腺癌株細胞におけるドキソルビシン耐性が得られる。
ＥＨＦのノックダウンは、細胞増殖を阻害しかつ老化を増加させた（Park C. et al., Molecular Cancer Therapeutics 2006; 5, 3191-96）。同じ研究ではテロメアーゼはＥＨＦの存在下で上方制御することが示された。

ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＣＹＣ１１６クローンにおいて上方制御されるプレＢ細胞白血病ホメオボックス（ＰＢＸ１）。それは細胞生存および分化の制御に関与する転写因子である。ＰＢＸ１は、癌細胞成長に関与するバロシン含有タンパク質を正に制御する。ＰＢＸ１遺伝子をノックダウンするとＶＣＰ発現が減少する。ＰＢＸ１の発現が減少するとＴＮＦα処理後の生存度が顕著に減少する（Qiu Y. et al., Epithelial and Mesenchymal Cell Biology 2007; 170, 152-9）。それゆえＰＸ１およびＶＣＰ発現はサイトカインストレス下の細胞生存に重要である。

Ｍｉｄｌｉｎｅ１（Ｑｐｉｔｚ／ＢＢＢ症候群）（ＭＩＤ１）は、ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＣＹＣ１１６耐性クローンにおいて高度に下方制御されている。ａＣＧＨ研究によってＭＩＤ１の強い下方制御であるＭＩＤ１の欠損が明らかになった。正中線異常によって特徴づけられるＱｐｉｔｚ／ＢＢＢ症候群はＭＩＤ１の変異によって引き起こされる（Perry J. et al., Genomics 1999; 62, 385-94）。それは細胞周期全体に渡る微小管に関与し、細胞質分裂中に中心体に関与することが示されている。オーロラキナーゼもまた有糸分裂中に同様に局在化される。ＣＹＣ１１６耐性クローンにおける下方制御機構は未知であるが、しかしより遅い耐性細胞周期に関与し、それゆえオーロラキナーゼ阻害に対する応答の減少に関しうる。それにも関わらずＭＩＤ１は、ＣＹＣ１１６応答を予測する頑強なマーカーとして用いることができる。

ＡＢＣＦ１、ＡＴＰ結合カセット輸送体ファミリーは、ＨＣＴ１１６：ＺＭ４４７４３９耐性クローンにおいて上方制御される。これらのタンパク質は、多くの抗癌剤のよく特徴づけられた輸送体である。薬物の輸送体のいくつかは、耐性腫瘍において過剰発現することが示された。たとえばＡＣＢＢ１（ＰｇＰ）は、タコール（Parekh H. et al., Biochemical Pharmacology 1997; 4, 461-70）、イマチニブ（Illmer T. et al., Leukemia 2004; 18, 401-8）、およびアントラサイクリン（Hu X.F. et al., British Journal of Cancer 1995; 71, 931-36）を含む多くの抗がん剤を輸送することが示された。

アネキシン１０（ＡＮＸＡ１０）はＨＣＴ１１６：ＺＭ４４７４３９耐性クローンにおいて顕著に下方制御される。アネキシンは信号伝達および細胞増殖の制御に関与する膜たんぱく質である。正常細胞に比べて胃がん組織では発現が減少することが報告された。これらの株細胞にＡＮＸＡ１０遺伝子を形質移入するとアポトーシスが増強されて細胞増殖が阻害された（Kim J.K. et al., Oncology Reports 2010; 24, 607-12）。

脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）はＨＣＴ１１６ＺＭ４４７４３９耐性クローンにおいて下方制御される。ＴｒｋＢチロシンキナーゼと協働するＢＤＮＦは脳ニューロンの生存に主に関与する。ＢＤＮＦの発現増加は特に神経芽腫における予後不良に関係する。ＢＤＮＦは下方制御アポトーシス促進性Ｂｉｍによって神経芽腫においてパクリタキセル耐性を媒介する（Li Z. et al., Cell Death and Differentiation 2006; 14, 318-26）。

カベオリン１（ＣＡＶ１）はＨＣＴ１１６耐性クローンおよびＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−ＺＭ４４７４３９耐性クローンの双方において顕著に下方制御される。カベオラは膜タンパク質であり、いくつかの信号伝達経路に関与することが示されている。腫瘍抑制因子としてのＣＡＶ１の役割は以前に記述されている。その発現は、いくつかの脂肪肉腫、繊維肉腫、および血管肉腫において下方制御されることが示された。ＨＴ−１０９０繊維肉腫株細胞においてＣＡＶ１を強制発現するとコロニー形成が阻害された（Wiechen K. et al., The American Journal of Pathology 2001; 158, 833-39）。この業績はＣＡＶ１が腫瘍抑制因子でありその下方制御が薬剤耐性に貢献することの証拠を明白に提供する。

Ｂｃｌ−ｘＬ（ＢＣＬ２Ｌ１）の上方制御はＨＣＴ１１６耐性クローンおよびＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−ＣＹＣ１１６耐性クローンの双方において見出された。Ｂｃｌ−ｘＬはアポトーシス細胞死の潜在的な阻害剤である。Ｂｃｌ−ｘＬは、アポトーシス促進性Ｂａｘのミトコンドリアへの移行、チトクロムＣの放出、およびカスパーゼ３開裂を阻害する（Ackler S. et al., Cancer Chemotherapy and Pharmacology 2010; 66, 869-80）。Ｂｃｌ−ｘＬの上方制御は、多発性骨髄腫患者におけるメルファランおよびプレドンゾンまたはビンクリスチン、アドリアマイシン、およびデキサメタゾンの放出を減少させることに関連した。特にＢｃｌ−ｘＬの発現は再発患者から得た生検において顕著である（Tse C. et al., Cancer Research 2008; 68, 3421-3428）。

（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙ（アフィメトリクス）による全般的遺伝子発現の決定）
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙによる特定遺伝子の倍率変化は、十分な量および質のＲＮＡがあれば任意の癌株細胞から便利に行うことができる。ＲＡＮを全ての健康な分裂中の耐性クローンおよびコントロールから３回の生物学的な繰り返し実験において単離した。ＲＮＡ単離のために１０×１０^６個の細胞を用いた。細胞を１ｍｌのＴＲＩ試薬を用いてリンスした。２００μｌのクロロホルムをＴＲＩ試薬に加え、室温で１０分間インキュベートし、その後４０℃かつ１２０００ｇで１５分間遠心分離した。溶液は３つの相に分かれる。上部のＲＮＡ部分を注意深く集めて５００μｌのイソプロパノールを用いてＲＮＡ沈殿させた。続いて遠心分離し７５％のエタノールで洗浄するとＲＮＡペレットが得られた。ＲＮＡペレットの大きさに応じてＤＥＰＣ水を加えた。

標識感知標的の調製のために開始材料として３００ｎｇのＲＮＡを用いた。サンプルを製造者の指示に従い処理してアフィメトリクスチップにハイブリダイズした。ＴＲＩ試薬を用いて株細胞からＲＮＡを単離した。ビオチン化センス鎖ＤＮＡ標的の調製のため、アフィメトリクスプロトコルに基づき３００ｎｇのＲＮＡを用いた。断片化されかつ標識されたサンプルを、アフィメトリクスＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙにハイブリダイズした。発現プロファイルを３つの独立した生物学的反復実験から試験した。発現アレイの全ての統計的解析をGentlemanらによるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（バージョン２．７）（Gentleman R.C. et al., Genome Biology 2004; 5, R80）または元のＲコードを含むＲシステムソフトウェア（http://www.R-project.org、バージョン２．１１．０）パッケージ群のいずれかを用いて行った。我々は全てのチップ用のＱＣレポートを生成するために、ａｆｆｙＱＣＲｅｐｏｒｔ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｒパッケージを用いた。このフィルタを通過しなかったチップはこの研究には含めなかった。発現チップからの未加工の特性データをＲパッケージａｆｆｙに実装されるＩｒｉｚａｒｒｙらによる頑強マルチアレイ（ＲＭＡ）法（Irizarry R.A. et al., Biostatistics 2003; 4, 249-64）を用いたバッチにおいて標準化した。差動的に発現される遺伝子を同定するために、ＲＭＡ ｌｏｇ_２単一強度発現データに基づき、我々はＬｉｍｍａ ｍｏｄｅｒａｔｅ Ｔ−ｔｅｓｔ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｌｉｍｍａ）（Smyth G.K. et al., Springer 2005; 397-420）を用いた。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）法（Benjamini Y. et al., Journal of Royal Statistical Society Series B 1995; 57, 289-300）を用いたＦＤＲを見積もるためにｓｔａｔｓ Ｒパッケージのｐ．ａｄｊｕｓｔ機能を用いた。

（原発腫瘍サンプルにおける遺伝子発現プロファイルの比較）
耐性クローンの各グループから、減少したｐ値に基づき上位１００個の遺伝子を一覧にした。生物学的関連に基づき、関連するグループ間において共通する遺伝子、高度に上方制御または下方制御される遺伝子、およびいくつかを、ｑＲＴ−ＰＣＲ確認試験のために選択した（全部で４２遺伝子）。初期耐性細胞からの４２個の遺伝子のうち１２個の遺伝子を原発腫瘍サンプルにおける比較および確認のために選択した（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。以前に我々は９６時間ＭＴＴアッセイを用いて様々な原発腫瘍におけるＣＹＣ１１６の感受性を試験した。１３個のＣＹＣ１１６感受性原発腫瘍および１４個のＣＹＣ１１６耐性腫瘍をｑＲＴ−ＰＣＲを用いた選択遺伝子発現試験のために選択した。良く凍結保存された任意の原発腫瘍サンプルが高品質ＲＮＡの単離に適している。ＲＮＡを原発腫瘍サンプルから上述したように耐性株細胞のために単離した。ｃＤＮＡを調製するために、全量４５μｌの反応混合物において４．５μｇのＲＮＡを用いた。４．５μｇのＲＮＡ、０．４５μｇのヘキサマーの混合物に水を加えて最終的に１９．５μｌにし、サーモサイクラーにおいて７０℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを氷の上に１分間置いた。９μｌの５×ＲＴバッファー、４．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、および１．１２５μｌ（３０Ｕ）のＲＮＡｓｉｎのマスター混合物を各サンプルに加えた。最後に１５０Ｕの逆転写酵素を加え、混合し、室温で１０分間インキュベートした。この後サンプルを勾配サーモサイクラーにおいて４２℃で６０分間、それから７０℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション時間後にサンプルを−２０℃で保存した。

２５μｌの最終反応容量でＲＴーＰＣＲを行うために１００ｎｇのｃＤＮＡを用いた。実行したＲＴ−ＰＣＲはＰＣＲ蓄積産物（標的遺伝子ｃＤＮＡ）へのＳＹＢＲグリーン結合能力に基づいた。良好なｃＤＮＡ品質およびよく設計された高度に特異的なプライマーを有することを条件として、ＳＹＢＲグリーンは高度によく機能することができる。１２．８μｌのＤＥＰＣ水、２．５μｌの１０×ＰＣＲバッファー、３μｌのＭｇ２＋、それぞれ２μｌ（０．００５ｍＭ）の順方向プライマーおよび逆方向プライマー、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌ（１：１０００）のＳＹＢＲグリーン、および０．２μｌ（１Ｕ）のＴａｑポリメラーゼから、マスター混合物を調製した。２４μｌのマスター混合物をチューブに振り分けた。チューブを回転式コンベアに配置し、蛍光を感知することによって自動的キャリブレーションを行い、そして関連プログラムを開始した。特定のサンプルにおいて各遺伝子に対して得たＣｔ（サイクル閾値）値を、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子のＣｔ値を減算することによって標準化した。耐性サンプルの相対的遺伝子発現を算出するために、統計的手法を適用した。まず、全ての感受性サンプルおよび耐性サンプルからの遺伝子の標準化Ｃｔ値から平均を算出した（値Ａ）。それから、値Ａから、各サンプルからの各遺伝子の標準化Ｃｔ値を減算した。得た値を便宜上値Ｂとして表記する。最後に感受性サンプル群および耐性サンプル群から別々に得た値から平均を計算した。感受性サンプルと耐性サンプルとの間における相対的な遺伝子発現の相違を示すために、これらの値をチャートにプロットした（図１）。

提案した遺伝子プライマーは、Ｐｒｍｉｅｒ３と呼ばれる自由にアクセス可能なインターネットサーバを用いて設計した。選択した遺伝子に対する提案プライマーおよび温度条件を表２に示す。最適化プロセスの間、遺伝子プライマーの特異性を試験し、最適な融解温度を選択した。全ての遺伝子に対する最適化プロセスを、提案プライマーを用いて続けて行った。最後に増幅産物のサイズをＤＮＡチップを用いたアジレントバイオアナライザーによって検証した。

表２．選択した遺伝子に対する提案プライマー配列および温度条件

比較ゲノムハイブリダイゼーション
染色体遺伝子の構造的および数的変化を決定することにａＣＧＨ解析を効果的に用いることができる。この方法は高品質のＤＮＡを有する任意のタイプの細胞から便利に実行することができる。ＤＮＡは１００万個の細胞からＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（キアゲン）を用いて抽出した。任意の癌株細胞および原発腫瘍サンプルからの高品質ＤＮＡがこの試験には必要である。抽出したゲノムＤＮＡを製造者のプロトコル（アフィメトリクス、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従い正確に処理した。１００ｎｇのＤＮＡを全ゲノム増幅によって増幅した。磁気ビーズを用いた産物精製の後、ＤＮＡを定量化し、断片化し、標識し、かつＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ ２．７Ｍアレイにハイブリダイズした。アレイを洗浄し、染色し、そしてスキャンした。我々はＣＧＨアレイを解析するためにソフトウェアＰａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅを用いた（Grayson B.L. et al., BioData Mining 2011; 4, 5-11）。我々は薬剤耐性株細胞サンプルおよびコントロール薬剤感受性株細胞サンプルにおける顕著なコピー数の変化の領域を同定し遺伝子一覧を作成した。

（プロテオミクス研究）
タンパク質は他のパートナーと相互作用することによってまたは酵素活性を通じてその機能を発揮する究極の生物学的分子である。差動的タンパク質発現は高品質な結果を達成するために用いることができるもう１つの側面である。二次元電気泳動に基づくプロテオミクス法は差動的タンパク質発現を研究するために選択される技術として好ましかった。差動的に発現されるタンパク質を同定するためにゲルのスポットを質量分析同定に掛けた。タンパク質抽出物は任意の無処置の生物学的材料から継続して調製できる。

（溶解物の調製）
最初に３×１０^６個の細胞をペトリ皿に植えつけると、耐性クローンおよびコントロールは近い培養密度まで増殖する。単層を氷冷却ＰＢＳによって３回洗浄した。それから５００μｌのリシスバッファー（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、３％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ、２％ｖ／ｖのノニデット４０、５ｍＭ ＴＣＥＰ、プロテアーゼ阻害剤およびフォスファターゼ阻害剤のカクテル）を単層の上部に加えて、タンパク質抽出を最適化するために室温で３０分間放置した。溶解物を４℃、２００００ｇで１時間遠心分離し、清澄な上清を−８０℃で保存した。

（二次元電気泳動）
Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＥＦ Ｃｅｌｌ およびＰｒｏｔｅａｎ ＩＩ ｘｉ細胞を、一次元目および二次元目にそれぞれ用いた。４〜７および６〜１１のＩＰＧを有するポリアクリルアミド条片をＩＥＦ分離に用いて、ｐＨ範囲が４〜７の１００μｇのタンパク質およびｐＨ範囲が６〜１１の７０μｇのタンパク質をＩＰＧ条片にロードした。４〜７のｐＨ範囲では１１０μｌの溶解物を２３０μｌの再水和バッファー（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、２％のＣＨＡＰＳ、２００ｍＭ ＤｅＳｔｒｅａｋ試薬、２％かつｐＨ４〜７のＩＰＧバッファー、プロテアーゼ阻害剤およびフォスファターゼ阻害剤のカクテル、極微量のブロモフェノールブルー）に希釈した。５０Ｖで一晩続くゲル中再水和を用いて、タンパク質をＩＰＧ条片４〜７にロードした。ＩＥＦを次のように行った：２００Ｖを１０時間、６００Ｖを３０分、１０００Ｖを３０分、そして、５０００Ｖを全部で５００００Ｖｈに達するのに必要な時間。この後、ＩＰＧ条片を、ｐＨ６．８の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍの尿素、３０％グリセロール、４％ＳＤＳ、および１００ｍＭ ＤｅＳｔｒｅａｋ試薬に２５分間平衡化した。ｐＨ範囲６〜１１では、ＩＰＧ条片は、３４０μｌの再水和バッファー（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％のＣＨＡＰＳ、３０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６〜１１かつ０．５％のＩＰＧバッファー、プロテアーゼ阻害剤およびフォスファターゼ阻害剤のカクテル、極微量のブロモフェノールブルー）においてサンプル無しで一晩中、受動的に再水和した。１５時間後、６５ｍＭ ＤＴＴを含むリシスバッファーおよび０．５％のＩＰＧバッファーによって溶解物を１５０μｌに希釈した。１５分後、３０ｍＭヨードアセトアミドを遊離チオール基のアルカリ化に用い、その後、極微量のブロモフェノールを加え、最後にカップローディングを適用した。ＩＥＦを、１５０Ｖを１２時間、１０００Ｖを１時間、８０００Ｖを３時間、そして８０００Ｖを全部で２００００Ｖｈに達するまで、行った。ＩＰＧ条片をｐＨ６．８かつ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍの尿素、３０％グリセロール、８％ＳＤＳで２０分間平衡化した。

ＭＳ同定のため、５００μｇ（ｐＨ４〜７）および１３０μｇ（ｐＨ６〜１１）のタンパク質をＩＰＧ条片にロードした。タンパク質を３００ｍＭ ＤＴＴで還元させ、上述したようにフォーカスした。ＩＰＧ条片をｐＨ６．８かつ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍの尿素、３０％グリセロール、４％ＳＤＳ、および１％のＤＴＴで１５分間平衡化した。１％のＤＴＴを４％のヨードアセトアミドに置換しかつ極微量のブロモフェノールブルーが存在する溶液を用いて、遊離チオール基のアルカリ化を行った。

平衡化後、ＩＰＧ条片を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに乗せ４０ｍＡで電気泳動した。解析ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色によって染色した。調製用のゲルにおけるタンパク質スポットを、亜鉛塩を用いた逆染色によって可視化した（Ｈａｒｄｙ ２００４）。Ｐｈａｒｏｓ ＦＸスキャナを用いて解析ゲルをスキャンし５００ＤＰＩの解像度でデジタル化した。それから二次元ゲル画像をＲＥＤＦＩＮソフトウェアを用いて評価した。自動生成されたスポット検知およびマッチングを手作業でチェックし、制御タンパク質のスポットを特定の比較群間の平均標準化量から計算される倍率変化に基づき探索した。１．２よりも大きい倍率変化かつ０．０５よりも小さいｐ値（ＡＮＯＶＡ）を有する差動的スポットを有意と見做した。各サンプルにおいて４つの生物学的繰り返し実験を２−ＤＥで解析した。細胞を異なるペトリ皿で増殖させ、そして以下の全ての操作を独立して行った。

（酵素的ゲル中消化）
亜鉛で染色した調製用ゲルから切除したタンパク質スポットを小片に切った。亜鉛塩を除去するために、ゲル片を、２００μｌかつｐＨ８．３の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、２０ｍＭグリセリン、および３０％のアセトニトリルで数分間インキュベートした。完全な脱染色後、ゲルをｐＨ８．３の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌで２回洗浄した。それからゲルを水で洗浄し、ＭｅＣＮにおける脱水によって収縮させ、さらにこの工程を２回繰り返した。最後に、上清を除いて、ゲルをＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器を用いて部分的に乾燥させた。開裂バッファー（２５ｍＭ ４−エチルモルフォリン酢酸塩、５％のＭｅＣＮ、３．３ｎｇ／μｌのトリプシン）において再水和を３７℃で一晩中行った。ＭｅＣＮにおけるトリフルオロ酢酸を用いて消化を停止させ、結果として得たペプチド混合物を、Ｐｏｒｏｓ Ｏｌｏｇｏ Ｒ３材料が入ったＧＥＬｏａｄｅｒμカラムを用いて脱塩した。精製しかつ濃縮したペプチドを、いくつかの液滴におけるマクロカラムから、１μｌのα−シアノ−ヒドロキシケイ皮酸マトリックス溶液（５０％のＭｅＣＮにおいて５ｍｇ／ｍＬ、０．１％のトリフルオロ酢酸）を用いてＭＡＬＤＩプレートに直接溶出させた。

（ＭＡＬＤＩ ＭＳによるタンパク同定）
ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを、スマートビーム固体レーザーおよびＭＳ／ＭＳ解析用のＬＩＦＴを備えたＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ機器（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）において測定した。質量範囲７００〜４０００ＤａにおいてＰＦＭスペクトルを得て、トリプシン自己タンパク質分解断片（８４２．５Ｄａおよび２２１１．１Ｄａ）のモノアイソトピック［Ｍ＋Ｈ］^＋イオンを用いて内部的に較正した。ＰＭＦデータベースサーチのために、ＸＭＬデータフォーマットにおけるピークリストを、ＳＮＡＰピーク検出アルゴリズムを含むｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ３．０プログラムを用いて作成した。スムージングは適用せず割り当てピークの最大数を５０にセットした。ピーク標識化の後、全ての既知の汚染信号を除去した。ピーク一覧を、ヒトタンパク質のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ２０１０＿０９データベースサブセットに対する社内のＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いて、以下の検索設定で検索した：３０ｐｐｍのペプチド誤差、１に設定した未消化部位、可変のシステインのカルバミドメチル化、メチオニンの酸化、およびタンパク質Ｎ末端アセチル化。タンパク質分子量およびｐＩ値に対して制限はしなかった。Ｍａｓｃｏｔスコアが閾値５６を超えるタンパク質を固定パラメータのもとで同定したと見做した。スコアが閾値よりも小さいかわずかに大きい場合、タンパク質候補の同一性をＭＳ／ＭＳ解析によって確かめた。上述したＭＡＳＣＯＴ設定に加えて、０．６Ｄａの断片質量誤差および機器タイプＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＰＦをＭＳ／ＭＳスペクトル検索に適用した。

（結果）
（全般的遺伝子発現の決定）
全体的に我々は耐性クローンを選択するために２つの株細胞（ＨＣＴ１１６ ｐ５３＋／＋およびＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−）および２つのオーロラキナーゼ阻害剤（ＣＹＣ１１６およびＺＭ４４７４３９）を用いた。各株細胞を別々にＣＹＣ１１６またはＺＭ４４７４３９に１μＭの濃度で曝すと４〜５週間後にコロニーが現れた。コロニーを単離して、さらなる試験のために拡大した。各グループの耐性クローンを次のように表記した。［１］ＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６（Ｒ１．１、Ｒ１．２、Ｒ１．３）［２］ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＣＹＣ１１６（Ｒ２．１、Ｒ２．２、Ｒ２．３）ＨＣＴ１１６：ＺＭ４４７４３９（Ｒ３．１、Ｒ３．２、Ｒ３．３）［４］ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＺＭ４４７４３９（Ｒ４．１、Ｒ４．２、Ｒ４．３）。

アフィメトリクスベースの遺伝子発現（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙ）解析によって、コントロールに比べて各遺伝子由来のクローンでは多くの遺伝子が差動発現していることが明らかになった。いくつかの遺伝子の差動発現は統計的に顕著であった。８８５、１０８５、２２４、および２１２番の遺伝子セットは、ＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６クローン、ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＣＹＣ１１６クローン、ＨＣＴ１１６：ＺＭ４４７４３９クローン、およびＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＺＭ４４７４３９クローンにおいてそれぞれ差動発現していた。それぞれの場合の上位１００個のみを表３〜６に示す。しかし各グループにおける全ての３つのクローンからのいくつかの遺伝子は共通して上方制御されており、いくつかの遺伝子は共通して下方制御されていた。一方、いくつかの遺伝子の差動発現は全ての３つのクローンにおいて共通ではなく、このことは、各グループにおける遺伝子発現の可変性を示唆している。各グループ由来のクローンの同時クラスタ化がデンドログラムによって明らかになった。これにより、薬剤耐性遺伝子発現兆候は、特定のオーロラキナーゼ阻害剤、我々の場合はＣＹＣ１１６またはＺＭ４４７４３９に独特であり、しかし野生型細胞または変異細胞に特有のｐ５３状態または遺伝子兆候に関わらず一般にオーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性を反映する遺伝子もまた存在する。

非常に高い統計的兆候を示す上位１００個の遺伝子を一覧にした。ＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６グループでは、上記１００個の遺伝子内の最も高度に上方制御される遺伝子は、ＬＣＮ２（平均倍率：６．６）、ＴＳＰＡＮ８（６．５５倍）、ＳＥＲＩＮＣ２（５倍）、続いてＨＯＸＢ６（３．９）、ＦＸＹＤ３（３．７）、ＩＴＧＢ７（３．５）、ＫＲＴ１３（３．４）、ＫＬＫ１０（３．４倍）、ＳＧＫ１（３．３４倍）、ＲＵＮＸ２（３．３３倍）、ＴＢＸ３（３．３倍）、ＴＮＦＡＩＰ３（３．２２倍）、ＣＡＬＢ１（３．２倍）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（３．１倍）、ＡＫＴ３（３倍）、およびＰＴＰＮ２２（３倍）を含む。最も高度に下方制御される遺伝子は、ＣＹＰ２４Ａ１（−３２倍）、ＰＲＫＡＣＢ（−９倍）、ＡＲＨＧＡＰ２９（−４．７倍）、ＫＬＲＫ１（−４．１倍）、続いてＰＡＬＬＤ（−３．９倍）、ＥＮＣ１（−３．８）、ＴＳＰＡＮ５（−２．８）、およびＧＪＣ１（−２．７倍）を含む。薬剤代謝を担ういくつかの遺伝子もまた差動発現遺伝子の中に見出され、ＣＹＰ４Ｆ１２（２倍）、ＣＹＰ１Ａ１（２．６倍）、ＣＹＰ４Ｆ３（２．２倍）、ＣＹＰ２Ｃ１８（１．２倍）を含む。ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＣＹＣ１１６では、高度に上方制御される遺伝子は、ＥＨＦ（８．４倍）、およびＣＹＰ１Ａ１（８倍）、続いてＰＢＸ１（３．９）、ＳＡＭＤ１２（３倍）、ＳＬＣ１６Ａ６（３倍）、ＦＳＴＬ４（２．８倍）、ＰＩＯＮ（２．７倍）、ＳＹＴＬ２（２．６７倍）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（２．６倍）、およびＡ４ＧＡＬＴ（２．３倍）を含む。高度に下方制御される遺伝子は、ＣＹＰ２４Ａ１（−３０倍）、ＭＩＤ１（−１８倍）、ＰＲＦ１（−６．２倍）、ＺＮＦ２２（−４．７７倍）、ＧＪＣ１（−４．７倍）、ＡＲＨＧＡＰ２９（−４．３倍）、ＰＯＮ３（−４．３）、ＴＲＩＭＬ２（−３．４倍）、ＣＤＫ６（−３．１倍）、およびＰＲＫＡＣＢ（−３倍）を含む。薬物代謝を担う遺伝子は、ＣＹＰ４Ｆ１１（−２．６）、ＣＹＰ１Ｂ１（４．２倍）、ＣＹＰ４Ｆ１２（２倍）、およびＣＹＰ４Ｆ３（１．９倍）を含む。これらのグループの間のいくつかの共通遺伝子が注目されることができる。

ＨＣＴ１１６：ＺＭ４４７４３９グループでは、高度に上方制御された遺伝子は、ＴＵＳＣ３（４．６倍）、ＯＤＺ３（４倍）、ＡＢＣＦ１（３．５倍）、ＦＡＭ２７Ｃ（３．４倍）、ＣＳＭＤ３（３．４倍）、ＴＳＰＡＮ１（２．６倍）、およびＡＫＴ３（２．３倍）であった。いくつかの性質不明な遺伝子は３倍以上変化していたので、アノテーションは記載していない。高度に下方制御される遺伝子は、ＡＲＭＣ４（−６倍）、ＰＡＬＬＤ（−４．２）倍）、ＭＭＰ７（−４．５）、続いてＭＫＸ（−３．３倍）、ＡＮＸＡ１０（−３）、ＭＮＳ１（−２．８倍）、ＥＮＣ１（−２．６倍）、ＢＤＮＦ（−２．５倍）、およぼいＣＡＶ１（−２．４倍）を含む。ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＺＭ４４７４３９では、上方制御される遺伝子は、ＳＰＡＲＣ（７倍）、ＥＰＢ４１Ｌ４Ａ（５．４倍）、ＣＤ３３（３倍）、続いてＬＲＰ１Ｂ（２．９倍）、ＦＡＭ１９８Ｂ（２．９倍）、ＫＩＲＲＥＬ２（２．８倍）、およびＳＬＣ７Ａ８（２．６）であった。最も高度に下方制御される遺伝子は、ＣＹＰ２４Ａ１（−５５倍）、ＭＡＬ２（−４８倍）、ＳＬＣ２７Ａ２（−９．４倍）、ＬＭＮＡ１（−９倍）、ＳＱＬＥ（−６倍）、続いてＣＡＶ１（−４．３倍）、ＣＡＳＫ（−４倍）、ＳＹＴＬ５（−３．４倍）、およびＰＤＥ４Ｂ（−３倍）を含む。ＣＹＣ１１６クローンおよびＺＭ４４７４３９クローンに対して８つの遺伝子が共通していた。８つの共通遺伝子は、全てのグループにおいて０．０１よりも小さいｐ値で差動発現しており、ＡＲＨＧＡＰ２９、ＨＴＲ７、ＴＳＰＡＮ１、ＡＮＸＡ１０、ＦＡＭ１２２Ｂ、ＥＲＩ１、ＴＦＰＩ、およびＡＰ３Ｓ１を含む。

差動発現遺伝子では、対応する細胞遺伝学的変化もまた存在した。

表３．ＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６グループにおける上位１００個の差動発現遺伝子（累積ｐ値＜０．００１）および対応するコピー数変化。Ｃｈｒ．−染色体、ＦＣ−倍率変化、Ａｍｐ．−増幅、Ｄｅｌ．−欠落、Ｎｄ−記述無し、ｆｇ−ファミリー遺伝子。アフィメトリクスプローブが、同じ認識配列を有する遺伝子における一か所よりも多い位置に結合するので、いくつかの遺伝子では識別番号が１つよりも多く存在する。１回よりも多く表される同じ遺伝子ＩＤは、独自のＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤを有する。

表４．ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＣＹＣ１１６グループにおける上位１００個の差動発現遺伝子（累積ｐ値＜０．００１）および対応するコピー数変化。

表５．ＨＣＴ１１６：ＺＭ４４７４３９グループにおける上位１００個の差動発現遺伝子（累積ｐ値＜０．００１）および対応するコピー数変化。

表６．ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−：ＺＭ４４７４３９グループにおける上位１００個の差動発現遺伝子（累積ｐ値＜０．００１）および対応するコピー数変化。

（ＣＹＣ１１６薬剤耐性株細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによるマクロアレイベースの遺伝子発現データの検証）
各グループに対してヒットした上位１００個の遺伝子を、ｐ値が減少する順に一覧にした。高度に上方制御または下方制御された、関連グループ間の共通遺伝子、および、生物学的関連性に基づくいくつかを、ｑＲＴ−ＰＣＲ検証研究のために選択した（全部で４２遺伝子）。発現パターンにおけるほぼ１００％の合致が、マクイロアレイ遺伝子発現データとｑＲＴ−ＰＣＲ検証との間に見られた。たとえば表７は、ＣＹＣ１１６感受性原発腫瘍対ＣＹＣ１１６耐性原発腫瘍の検証研究のためにさらに選択された全般的遺伝子発現対１２個の遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲからの比較的データを示す。

表７．遺伝子発現研究とｑＲＴ−ＰＣＲ検証研究との間の相対的発現傾向（倍率）

特定の遺伝子の倍率を遺伝子発現解析およびｑＲＴ−ＰＣＲの双方から示した。正の値および負の値は、所望の遺伝子の上方制御および下方制御をそれぞれ指す。各遺伝子の倍率は、各グループからの３つのクローンの平均値である。ＮＥ−発現無し。

表８〜１０は、選択した遺伝子の平均倍率およびコピー数変化を示す。テーブルに示す、コントロールにおける発現に対する癌細胞における遺伝子発現の増加および減少は、オーロラキナーゼ阻害剤に対する癌の耐性を指す。ｐ値は１．１４×１０^−１１〜０．０００９である。対応する細胞学的変化もまた、遺伝子コピー数改変として示した。

表８：

表９：

表１０：

（ＣＹＣ１１６薬剤耐性原発腫瘍細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによる株細胞からのマイクロアレイベースの遺伝子発現データの検証）
我々の研究所は様々なタイプの原発腫瘍生検を収集し、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いてＣＹＣ１１６のために試験した（Sargent J.M. et al., British Journal of Cancer 1989; 60, 206-10）。いくつかのサンプルはＣＹＣ１１６に感受性であり、いくつかは耐性であった。１３個の感受性サンプル（平均ＩＣ５０≦４．４２μＭ）および１４個の耐性サンプル（平均ＩＣ５０≧９５μＭ）を、耐性原発細胞におけるＣＹＣ１１６に対する遺伝子発現を比較するために選択した。我々は、組織形成の起源が異なる任意抽出の癌、たとえば血液腫瘍（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、不特定リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫）および固形腫瘍（卵巣、肺、乳房、およびメラノーマ）を用いた。

表１１．ＣＹＣ１１６感受性原発腫瘍サンプルおよびＣＹＣ１１６耐性原発腫瘍サンプルにおける選択した１２個の遺伝子の平均相対的Ｃｔ値を比較するｑＲＴ−ＰＣＲデータ（Ｃｔ値が低いほど遺伝子発現が高い）。原発腫瘍ｑＲＴ−ＰＣＴデータはまた、ＣＹＣ１１６耐性株細胞における発現傾向（

）ｑＲＴ−ＰＣＲデータとも比較した。サブグループ遺伝子のみが原発ヒト腫瘍の制限されたコホートにおいて異なる発現を顕著に示したにも関わらず、データは、株細胞における遺伝子発現対ＣＹＣ１１６に耐性を有する原発腫瘍における遺伝子発現の完璧な合致を示す。

（比較ゲノムハイブリダイゼーション研究）
この研究は、ＣＹＣ１１６耐性クローンおよびＺＭ４４７４３９耐性クローンにおける染色体の任意の構造的および数的変化を検証するために行った。アフィメトリクスＷｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ２．７Ｍ Ａｒｒａｙをこの研究に用いた。特定の染色体領域の開示された遺伝子リスト中の１４０個の遺伝子に対する増幅または欠損を見出した。増幅および欠損は遺伝子発現変化を反映しており、それゆえオーロラキナーゼ阻害剤に耐性のある患者の診断に用いることができる。

（プロテオミクス研究）
コントロールと比べた差動的タンパク質レベルを決定するために、各グループ由来の２つのクローンを選択した。溶解物を、４つの独立した２ＤＥ電気泳動およびそれに続く質量分析によるタンパク質特定のための繰り返し実験に調製した。一次元目においてタンパク質を分離するために、４〜７および６〜１１を含む２つのｐＨ勾配を等電点電気泳動中に用いた。差動的に発現したタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって同定した。ＺＭ４４７４３９クローン（Ｒ３．１：ｐ５３＋／＋、Ｒ３．２：ｐ５３＋／＋、Ｒ４．２：ｐ５３−／−、Ｒ４．３：ｐ５３−／−）では、７７種類のタンパク質候補が差動発現を示した。ＣＹＣ１１６クローン（Ｒ１．２：ｐ５３＋／＋、Ｒ１．３：ｐ５３＋／＋、Ｒ２．１：ｐ５３−／−、Ｒ２．２：ｐ５３−／−）では、７３種類のタンパク質候補が差動発現を示した。１．２よりも大きい倍率変化および０．０５よりも小さいｐ値（ＡＮＯＶＡ）を有する差動スポットは、プロテオミクス解析において顕著であると見做した。

（実施例２）
マクロアレイベースの遺伝子発現解析によって、ＨＣＴ１１６ ｐ５３＋／＋耐性クローンおよびＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−耐性クローンにおけるＣＹＣ１１６に対するＢｃｌ−ｘＬ（ＢＣＬ２Ｌ１）の上方制御が明らかになった。ＣＹＣ１１６耐性クローンにおけるＢｃｌ−ｘＬの上方制御は統計的に顕著であり（ｐ＜０．００１）かつ２倍近くあった。ＣＹＣ１１６耐性クローンにおけるＢｃｌ−ｘＬの顕著な上方制御は細胞増殖アッセイにおいてＡＢＴ−２６３ ｓｉＲＮＡおよび抗Ｂｃｌ−ｘＬ ｓｉＲＮＡを試験することの強力な根拠になった。ＲＮＡレベルに加えて、Ｂｃｌ−ｘＬ上方制御はまた、ウェスタンブロットによってタンパク質レベルでも確かめられた（図３）。

（ＭＴＴベースの細胞増殖アッセイ）
この方法は、生存細胞が黄色のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５ジフェニルテトラゾリウム臭化物）塩を紫色のホルマザンに還元できるという原理に基づいて行われる。紫色の産物の強度は、生存細胞の数に直接比例しており、このことは熱量測定法によって測定できる。任意の医学的試薬の半阻害濃度（ＩＣ５０）を決定するために、ＭＴＴアッセイは非常に信頼できかつ良く受け入れられる。ＡＢＴ−２６３のＩＣ５０値を決定するために、８０μｌの培養培地内の３０００個の細胞を９６ウェルプレートに撒いた。５倍濃度ストックから調整した２０μｌの各濃度のＡＢＴ−２６３（１：３、１０μＭの最高濃度から０．０１μＭの最低濃度の連続希釈によって調整）の化合物を、細胞に加えた。このアッセイを、各濃度に対する２つの技術的繰り返し実験と、３つの生物学的繰り返し実験とにおいて行った。ブランクおよびコントロールを並べて含めかつ９６時間インキュベートした。アッセイの終了時点において、１０μｌのＭＴＴ／ウェル（Ｓｉｇｍａ）（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、すみれ色のホルマザン結晶が現れるまでインキュベートした。プレートを３７℃で一晩中インキュベートすることによって、ホルマザンを１０ｍｌ／ウェルの１０％水溶性ＳＤＳに溶解した。Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ ＩＭＳリーダを用いて光学濃度を５４０ｎｍで測定し、ＩＣ５０値をＣｈｅｍｏｒｅｚｉｓｔソフトウェアを用いて決定した。

我々は、耐性クローンの各グループ由来の２つのクローンに対するＡＢＴ−２６３の活性を試験した。特に野生型ｐ５３有りの倍数体ＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６耐性クローンは、ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−親株細胞よりもＡＢＴ−２６３に対して高度に感受性を示した（平均：１１倍）（図２）。この感受性は、タンパク質レベルで決定された、ＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６耐性クローンにおけるＢｃｌ−ｘＬの過剰発現に対応している（図３）。

ＣＹＣ１１６誘発耐性におけるＢｃｌ−ｘＬ過剰発現の役割を検証するために、我々はまたＲＮＡ干渉法を用いてＢｃｌ−ｘＬを遺伝的に下方制御した。Ｂｃｌ−ｘＬをノックダウンし、それに続いてＣＹＣ１１６で処理すると、ＣＹＣ１１６に対する耐性腫瘍を顕著に感作した（図４）。１つのＨＣＴ１１６ ｐ５３＋／＋：ＣＹＣ１１６耐性クローン（ｓｉＲＮＡ研究に用いた）におけるＣＹＣ１１６のＩＣ５０値は６μＭであり、これはＨＣＴ１１６親株細胞（０．３４μＭ）よりも１８倍高い。Ｂｃｌ−ｘＬをノックダウンし、それに続いてＣＹＣ１１６で処理すると、この耐性クローンを親株細胞近くに感作した（０．９μＭ）。ＨＣＴ１１６親株細胞（低Ｂｃｌ−ｘＬ発現）においてＢｃｌ−ｘＬをノックダウンしても、ＣＹＣ１１６に対する感作効果は無い（図４）。これは、ＣＹＣ１１６誘発耐性における抗アポトーシス性Ｂｃｌ−ｘＬの関与を確証する。薬理学的にまたは遺伝的にＢｃｌ−ｘＬを阻害することは、Ｂｃｌ−ｘＬを過剰発現する耐性クローンにおけるＣＹＣ１１６感受性を選択的に回復することに有利である。一方、倍数体ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−ＣＹＣ１１６耐性クローンは、親ＨＣＴ１１６ ｐ５３−／−細胞に比べてＡＢＴ−２６３に対する交差耐性を顕著に示した。ｐ５３＋／＋二倍体ＺＭ４４７４３９クローンおよびｐ５３−／−二倍体ＺＭ４４７４３９耐性クローンの双方は、ＡＢＴ−２６３に対して耐性であった。これらの発見は、ＣＹＣ１１６によって誘発される倍数体遺伝型が野生型ｐ５３の存在下ではＡＢＴ−２６３に対して高度に脆弱であることを確証する。それゆえ耐性を克服するためにまたは耐性の発生を防ぐためにさえ、ＣＹＣ１１６誘発表現形を診療所において用いることができる。

（ウェスタンブロット解析）
細胞溶解物を、ＲＩＰＡバッファー（ｐＨ８．０、１５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１％のＮＰ−４０、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸）を用いて調製した。８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質を分離しニトロセルロース膜に移した。５％の非脂肪乾燥ミルクパウダーおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＣにおいて膜をブロックした。一次抗体をブロッキング溶液において調整し、膜を一晩中インキュベートした。洗浄後、膜を二次抗体において１時間インキュベートした。ＥＣＬプラス試薬を用いて化学発光シグナルを検知した。

（ｓｉＲＡＮ形質移入によるＢｃｌ−ｘＬノックアウト）
０．１×１０^６個の細胞を６ウェルプレート内の２ｍｌの培地に植えた。Ｂｃｌ−ｘＬ ｓｉＲＮＡを加える前に、細胞を２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、抗生物質を含まない２ｍｌの新鮮な培地を加えた。Ｏｒｉｇｅｎｅから購入したＢｃｌ−ｘＬ ｓｉＲＮＡおよびクローンｓｉＲＮＡを、１０μＭの濃度にするために、ＲＮａｓｅを含まない二重鎖バッファーに希釈した。二重鎖を形成するために、希釈したｓｉＲＮＡを９４℃で２分間熱した。２．２μｌの希釈ｓｉＲＮＡを２００μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥバッファー（ＰｏｌｙＰｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）に加え、その後、４μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥ形質移入試薬を加え、混合し、室温で１５分間インキュベートした。混合物を一滴ごとに２ｍｌの培地に加え、最終ｓｉＲＮＡ濃度は１０ｎＭであった。プレートを２４時間インキュベートし、培地を除いて、ｓｉＲＮＡを含まない新鮮な培地を加えた。Ｂｃｌ−ｘＬ下方制御をウェスタンブロットによって決定するために、細胞溶解物を７２時間および９６時間調製した。特に、２つのタイプのＢｃｌ−ｘＬのｓｉＲＮＡ下方制御が９６時間まで存在した。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡおよび形質移入試薬は、Ｂｃｌ−ｘＬ発現に影響しない。オーロラキナーゼ阻害剤に対する薬剤耐性の遺伝的な誘発におけるＢｃｌ−ｘＬの重要性を証明するために、Ｂｃｌ−ｘＬを高度に過剰発現している１つのｐ５３野生型ＣＹＣ１１６耐性クローンを最適化のために利用した。抗Ｂｃｌ−ｘＬ ｓｉＲＮＡが２４時間形質移入された細胞を、Ｂｃｌ−ｘＬノックダウンおよびＣＹＣ１１６組み合わせの、ＣＹＣ１１６単独またはコントロールｓｉＲＮＡと比べて有効性を決定するために、ＭＴＴアッセイに用いた。データは、阻害剤に対するＣＹＣ１１６耐性細胞の感受性がＢｃｌ−ｘＬ発現の遺伝的抑制によって回復することを明白に示している。

他のタンパク質に対する耐性決定レベルの変化を手作業で決定した：

クローン耐性とクローンとの倍率変化は、ＲＥＤＦＩＮソフトウェアによって平均標準化スポット量（ｐ値＜０．０５）から算出した。

（産業上の利用可能性）
本発明において同定した遺伝子およびタンパク質は、臨床上設定においてオーロラキナーゼ阻害剤に対する応答をモニターすること、オーロラキナーゼ阻害剤治療の有効性をモニターすること、これらの遺伝子の発現に基づき患者を階層化すること、などに用いることができる。アストラゼネカのＡＺＤ１１５２（オーロラＢ特異的）は、現在、フェーズＩＩ臨床治験にある。ＺＭ４４７４３９およびＡＺＤ１１５２の双方は、癌細胞に対してほぼ同一の作用様式を有する。ＺＭ４４７４３９耐性クローンおよびＣＹＣ１１６耐性クローンは、ＺＭ４４７４３９（アストラゼネカのオーロラＢ特異的阻害剤）、ＭＬＮ８０５４（ＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍのオーロラＡ特異的阻害剤）、およびＶＸ−６８０（Ｖｅｒｔｅｘのｐａｎ−オーロラ阻害剤）に対して高度に交差耐性である（表１）。これは、これらの化合物に対する腫瘍細胞耐性の類似した機構を強力に示す。それゆえ、ＺＭ４４７４３９遺伝子発現データおよびプロテオミクスデータは、ＡＺＤ１１５２長期間応答を予測することに用いることに適している。ＣＹＣ１１６クローンがＡＺＤ１１５２、ＶＸ−６８０、およびＭＬＮ８０５４に高度に交差耐性である事実に基づき、ＣＹＣ１１６データもまた、ＡＺＤ１１５２および他のオーロラキナーゼ阻害剤応答を予測することに用いることができる。

オーロラキナーゼ阻害剤に対する患者の感受性の予測を用いることによって、治療に利点がある患者に対してのみ治療を行うことができ、これによって癌治療の全般コストおよび副作用を低減する。オーロラキナーゼ阻害剤治療に如何なる利点もない患者は、当該患者により適した他の薬物治療を素早く選択でき、不必要かつ効果のない治療を受けずに済む。さらに、オーロラキナーゼ薬剤耐性の証明としての本発明において同定された遺伝子およびその経路は、薬剤耐性を克服するための新たな戦略を開発するための将来の薬理学的標的として用いることができる。

また本発明は、耐性を克服するためのオーロラキナーゼ阻害剤耐性腫瘍の治療におけるオーロラキナーゼ阻害剤の使用に組み合わせた阻害剤のＢｃｌ−２ファミリーの使用を提供する。

原発腫瘍サンプルにおける耐性クローン遺伝子発現条件（実施例を参照）と比べて、いくつかの遺伝子に対するＣｔ値（表８を参照）を、薬剤感受性患者腫瘍対薬剤耐性患者腫瘍における相対的遺伝子発現を示すチャートを構築するために用いた。 ＣＹＣ１１６耐性クローンおよびＺＭ４４７４３９耐性クローンに対するＡＢＴ−２６３の有効性。Ｙ軸は親クローンおよび耐性クローンにおけるＡＢＴ−２６３のＩＣ５０値（μＭ）を示す。ＭＴＴアッセイを独立した３回の繰り返し実験において行った（ｎ＝３）。 ＨＣＴ親株細胞に対するＨＣＴ１１６：ＣＹＣ１１６耐性クローンにおけるＢｃｌ−ｘＬの上方制御を示すウェスタンブロット。アクチンをローディングコントロールに用いた。 遺伝的（ｓｉＲＮＡ）Ｂｃｌ−ｘＬノックダウンおよびそれに続くＣＹＣ１１６処理を示すＭＴＴアッセイ、ＣＹＣ１１６に対するＣＹＣ１１６耐性クローンの感受性を回復した（ｎ＝３）。

Claims (10)

1. 癌病に冒された患者のオーロラキナーゼ阻害剤治療に対する感受性を決定する方法であって、患者から得た癌細胞における、ＣＹＰ２４Ａ１、ＥＨＦ、ＫＲＴ７、ＰＲＫＡＣＢ、およびＡＮＸＡ１０を有するグループから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現変化またはコピー数変化をインビトロにて決定する工程を有することを特徴とする方法。
   

   
2. 上記遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの組み合わせの発現を決定する請求項１に記載の方法。
3. ＣＹＰ２４Ａ１、ＥＨＦ、ＫＲＴ７、ＰＲＫＡＣＢ、およびＡＮＸＡ１０の全遺伝子の組み合わせの発現を決定する請求項１に記載の方法。
4. さらに、ＭＩＤ１、ＡＲＨＧＡＰ２９、Ａ４ＧＡＬＴ、ＣＹＰ１Ａ１、ＧＪＣ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＦＡＭ１２２Ｂ、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＢＤＮＦ、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＥＲＩ１、ＳＥＲＩＮＣ２、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＨＴＲ７、ＴＢＸ３、およびＴＳＰＡＮ１を含むグループから選択される他の少なくとも１つの遺伝子の発現を決定する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
   

   
5. ＣＹＰ２４Ａ１、ＥＨＦ、ＫＲＴ７、ＰＲＫＡＣＢ、ＡＮＸＡ１０、ＭＩＤ１、ＡＲＨＧＡＰ２９、Ａ４ＧＡＬＴ、ＣＹＰ１Ａ１、ＧＪＣ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＦＡＭ１２２Ｂ、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＢＤＮＦ、ＰＰＡＰ２Ｂ、ＥＲＩ１、ＳＥＲＩＮＣ２、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＨＴＲ７、ＴＢＸ３、およびＴＳＰＡＮ１の全遺伝子の組み合わせの発現を決定する請求項４に記載の方法。
6. さらに、次の表に示す遺伝子の一覧から選択される他の少なくとも１つの遺伝子の発現を決定する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
   

   

   

   

   

   

   
7. 癌病に冒された患者のオーロラキナーゼ阻害剤治療に対する感受性を決定する方法であって、上記患者から得た癌細胞または体液における、以下の表に含まれるグループから選択される少なくとも１つのタンパク質のレベルをインビトロにて決定する工程を有することを特徴とする方法。
   

   

   
8. 上記オーロラキナーゼ阻害剤は、好ましくは、ＣＹＣ１１６（４−メチル−５−（２−（４−モルフォリノフェニルアミノ）ピリミジン４−イル）チアゾール−２−アミン）、ＺＭ４４７４３９（Ｎ−［４−［［６−メトキシ−７−３−（４−モルフォリニル）プロポキシ］４キアゾリニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド）、ＡＺＤ１１５２（２−［エチル−［３−［４−［［５−［２−（３−フルオロアニリノ）−２−オキソエチル］−１Ｈピラゾル３イル］アミノ］キナゾリン７−イル］オキシプロピル］アミノ］エチル二水素リン酸塩）、ＶＸ−６８０（Ｎ−［４−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−６−［（５−メチル−１Ｈピラゾル−３−イル）アミノ］ピリミジン２−イル］スルファニルフェニル］シクロプロパンカルボキサミド）、ＭＬＮ８０５４（４−［［９−クロロ−７−（２，６−ジフルオロフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンザゼピン−２−イル］アミノ］安息香酸）、ＰＨＡ−７３９３５８（Ｎ−［５−［（２Ｒ）−２−メトキシ−２−フェニルアセチル］−４，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピラゾル−３−イル］−４−（４−メチルピペラジン−１−）ベンズアミド）、ＭＬＮ８２３７（４−［［９−クロロ−７−（２−フルオロ−６−メトキシフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンザゼピン−２−イル］アミノ］−２−メトキシ安息香酸）、ＡＴ−９２８３（１−シクロプロピル−３−［（３Ｚ）−３−［５−（モルフォリン−４−イルメチル）ベンズイミダゾール−２−イリデン］−１，２−ジヒドロピラゾル−４−イル］尿素）から選択される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 上記癌病は、肉腫癌、結腸直腸癌、メラノーマ、皮膚がん、乳がん、甲状腺癌、グリオブラストーマ、肺がん、前立腺癌、卵巣癌、頸椎癌、子宮癌、頭頸部癌、血液癌、胃がん、食道癌、神経癌、すい臓癌、および腎臓癌を含むグループから選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. オーロラキナーゼ阻害剤耐性腫瘍の治療に用いられる、オーロラキナーゼ阻害剤と組み合わせたＢｃｌ−２ファミリー阻害剤。

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