JP2015230199A - Method and marker for determining onset risk of fabry disease - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ファブリー病の発症危険度を判定する方法に関する。 The present invention relates to a method for determining the onset risk of Fabry disease.
ファブリー病は、α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧＡＬ）の酵素活性が欠損又は低下することによって生じる、先天性の糖脂質代謝異常症である。α−ＧＡＬは、糖脂質又は糖タンパク質の非還元末端のα−ガラクトシド結合を切断する反応を触媒する酵素であり、生体内では糖脂質の分解を担っている。α−ＧＡＬはライソゾームの中にあり、主にスフィンゴ糖脂質を基質として分解する。 Fabry disease is a congenital dyslipidemia caused by loss or decrease in the enzyme activity of α-galactosidase A (α-GAL). α-GAL is an enzyme that catalyzes a reaction that cleaves the α-galactoside bond at the non-reducing end of a glycolipid or glycoprotein, and is responsible for degradation of the glycolipid in vivo. α-GAL is present in lysosomes and degrades mainly using glycosphingolipid as a substrate.
したがって、α−ＧＡＬの活性が欠損又は低下すれば、スフィンゴ糖脂質の一種であるグロボトリアオシルセラミド（「Ｇｂ３」、「ＧＬ−３」、「セラミドトリヘキソアミド（ＣＴＨ）」ともいう。）が分解されずに、血管内皮細胞（血管内壁を構成している細胞）、全身の細胞、全身の組織に蓄積し、ファブリー病を発症する。その結果、四肢の痛み、低汗症、アンジオケラトーマ、角膜混濁、消化器障害、目眩、聴覚障害、脳血管障害、腎障害及び心障害等の様々な症状が出現し、時間の経過とともに重症化することが知られている。 Therefore, if the α-GAL activity is deficient or decreased, globotriaosylceramide (also referred to as “Gb3”, “GL-3”, “ceramide trihexamide (CTH)”), which is a kind of glycosphingolipid. Without being decomposed, it accumulates in vascular endothelial cells (cells constituting the inner wall of blood vessels), whole body cells, and whole body tissues, and develops Fabry disease. As a result, various symptoms such as limb pain, hypohidrosis, angiokeratoma, corneal opacity, digestive disorder, dizziness, hearing impairment, cerebrovascular disorder, renal disorder and heart disorder appear and become severe over time. It is known that
ファブリー病は、その症状、及び、被験者の白血球中のα−ＧＡＬの酵素活性、被験者のα−ＧＡＬをコードする遺伝子（ＧＬＡ）を調べることによって診断することができる。例えば、男性患者では、ＧＬＡ遺伝子の変異の種類によって、酵素活性がほぼ消失している古典型（Ｃｌａｓｓｉｃ）と、酵素活性がわずかに残っている遅発型（Ｌａｔｅｒ−Ｏｎｓｅｔ）に分類できることが知られている。しかしながら、近年、通常行われている蛋白質コード領域の遺伝子解析ではＧＬＡ遺伝子の配列に変異が認められないにも拘わらず、ファブリー病様の症状を呈する患者が存在することがわかってきている。また、Ｘ染色体上に存在するＧＬＡ遺伝子に変異がある男性患者の場合には、酵素活性の有無によってα−ＧＡＬの欠損を判別することができるが、Ｘ染色体のランダムな不活性化が生じているヘテロ接合型の遺伝子型を有する女性患者においては、α−ＧＡＬ酵素活性では、ファブリー病の発症危険度を判定することは難しい。以上のことから、遺伝子解析、α−ＧＡＬ酵素活性の測定によらない、ファブリー病の発症危険度を判定する方法が求められている。 Fabry disease can be diagnosed by examining its symptoms, the enzyme activity of α-GAL in the white blood cells of the subject, and the gene (GLA) encoding α-GAL of the subject. For example, it is known that male patients can be classified into a classical type (Classic) in which enzyme activity has almost disappeared and a delayed type (Later-Onset) in which enzyme activity remains slightly, depending on the type of GLA gene mutation. It has been. However, in recent years, it has been found that there are patients who exhibit Fabry disease-like symptoms even though no mutation is observed in the sequence of the GLA gene in the usual gene analysis of the protein coding region. In addition, in the case of male patients with a mutation in the GLA gene present on the X chromosome, α-GAL deficiency can be determined by the presence or absence of enzyme activity, but random inactivation of the X chromosome occurs. In a female patient having a heterozygous genotype, it is difficult to determine the risk of developing Fabry disease using the α-GAL enzyme activity. From the above, there is a need for a method for determining the onset risk of Fabry disease that is not based on genetic analysis or measurement of α-GAL enzyme activity.
一方、ファブリー病患者の血管内皮及び内臓組織に蓄積され、患者から採取される体液において検出可能な糖脂質としては、尿及び血漿中で検出可能なグロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質［Ｌｙｓｏ−ｅｎｅ−Ｇｂ３（−Ｈ２（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）））、＋Ｏ（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋１６））、＋Ｈ２Ｏ２（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））］、尿中で検出可能なＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質［−Ｃ２Ｈ４（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２８））、−Ｃ２Ｈ４＋Ｏ（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−１２））、−Ｈ２＋Ｏ（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋１４））、＋Ｈ２Ｏ３（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋５０））］、又は血漿中で検出可能なＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質［＋Ｈ２Ｏ（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋１８））］、又は血漿中で検出可能なグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）関連物質が報告されている（非特許文献１〜７）。個々のＬｙｓｏ−Ｇｂ３及びＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質の測定によって健常人とファブリー病患者を判定する方法については報告されているが、特定の物質の組み合わせを用いて判定する方法は報告されていない。 On the other hand, as glycolipids accumulated in the vascular endothelium and visceral tissues of Fabry disease patients and detectable in body fluids collected from patients, globotriaosylsphingosine (Lyso-Gb3), Lyso detectable in urine and plasma -Gb3-related substances [Lyso-ene-Gb3 (-H2 (Lyso-Gb3 (-2))), + O (Lyso-Gb3 (+16)), + H2O2 (Lyso-Gb3 (+34))], detectable in urine Lyso-Gb3 related substances [-C2H4 (Lyso-Gb3 (-28)), -C2H4 + O (Lyso-Gb3 (-12)), -H2 + O (Lyso-Gb3 (+14)), + H2O3 (Lyso-Gb3 (+50)) )], Or a Lyso-Gb3-related substance [+ H 2 O (Lyso-Gb3 (+18))] detectable in plasma, Detectable in the plasma globotriaosylceramide (Gb3) related substances have been reported (Non-Patent Document 1 to 7). Although a method for determining a healthy person and a Fabry disease patient by measuring individual Lyso-Gb3 and Lyso-Gb3 related substances has been reported, a method for determining using a combination of specific substances has not been reported.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ファブリー病の発症危険度を判定する方法を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of the said situation, and it aims at providing the method of determining the onset risk of Fabry disease.
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、血漿等の体液に存在する複数のＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質の量から算出される指標値、好ましくは量比、具体的には、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（+３４））の量に基づいて算出される指標値を用いることで、従来の方法に比べて、より正確にファブリー病の発症危険度を判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have conducted an index value calculated from the amount of a plurality of Lyso-Gb3-related substances present in body fluid such as plasma, preferably a quantitative ratio, specifically, globotriaosyl. By using an index value calculated based on the amount of sphingosine (-2) body (Lyso-Gb3 (-2)) and the amount of globotriaosyl sphingosine (+34) body (Lyso-Gb3 (+34)) The inventors have found that the risk of developing Fabry disease can be determined more accurately than the conventional method, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］ファブリー病の発症危険度を判定する方法であって、
被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、
上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、上記被験者がファブリー病を発症している可能性があると判定する工程と、
を含む方法。
［２］被験者の組織へのグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の蓄積の可能性を判定する方法であって、
被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、
上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、上記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性があると判定する工程と、
を含む方法。
［３］上記指標値が上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量に対する上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量の比率である、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］上記基準値Ａが、健常人における上記比率である、上記［３］に記載の方法。
［５］上記体液が血漿又は血清であって、上記基準値Ａが、１〜２の間で設定される値である、上記［３］に記載の方法。
［６］上記体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の量を測定する工程を更に含み、
上記指標値が上記基準値Ａよりも小さく、かつ上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、上記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は上記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定する、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］上記体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の量を測定する工程を更に含み、
上記指標値が、［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値である、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［８］上記基準値Ａが、健常人における上記［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値である、上記［７］に記載の方法。
［９］上記体液が血漿又は血清であって、上記基準値Ａが、１０〜８０の間で設定される値である、上記［７］に記載の方法。
［１０］上記指標値が上記基準値Ａよりも小さく、かつ上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、上記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は上記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定する、上記［７］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］上記基準値Ｂが、健常人における上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量である、上記［６］又は［１０］に記載の方法。
［１２］上記体液が血漿又は血清であって、上記基準値Ｂが０．２ｎＭ〜０．７ｎＭの間で設定される体液中濃度である、上記［６］又は［１０］に記載の方法。
［１３］上記体液が血漿又は血清である、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
That is, the present invention relates to the following.
[1] A method for determining the risk of developing Fabry disease,
The amount of globotriaosyl sphingosine (-2) (Lyso-Gb3 (-2)) and globotriaosyl sphingosine (+34) (Lyso-Gb3 (+34)) contained in the body fluid collected from the subject Measuring the amount of
When the index value calculated based on the amount of Lyso-Gb3 (-2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34) is smaller than the reference value A, the subject may have Fabry disease Determining that there is
Including methods.
[2] A method for determining the possibility of accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) in the tissue of a subject,
The amount of globotriaosyl sphingosine (-2) (Lyso-Gb3 (-2)) and globotriaosyl sphingosine (+34) (Lyso-Gb3 (+34)) contained in the body fluid collected from the subject Measuring the amount of
When the index value calculated based on the amount of Lyso-Gb3 (-2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34) is smaller than the reference value A, Gb3 is accumulated in the tissue of the subject. Determining that there is a possibility,
Including methods.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the index value is a ratio of the amount of Lyso-Gb3 (+34) to the amount of Lyso-Gb3 (-2).
[4] The method according to [3] above, wherein the reference value A is the ratio in healthy persons.
[5] The method according to [3] above, wherein the body fluid is plasma or serum, and the reference value A is a value set between 1 and 2.
[6] The method further includes the step of measuring the amount of globotriaosylsphingosine (Lyso-Gb3) contained in the body fluid,
If the index value is smaller than the reference value A and the amount of Lyso-Gb3 is greater than the reference value B, the subject is more likely to develop Fabry disease, or the subject's tissue The method according to any one of [1] to [5] above, wherein it is determined that the possibility that Gb3 is accumulated is higher.
[7] The method further includes the step of measuring the amount of globotriaosylsphingosine (Lyso-Gb3) contained in the body fluid,
In the above [1] or [2], the index value is a value represented by [{amount of Lyso-Gb3 (+34) / amount of Lyso-Gb3 (-2)} / amount of Lyso-Gb3]. The method described.
[8] The reference value A is a value represented by the above [{Amount of Lyso-Gb3 (+34) / Amount of Lyso-Gb3 (-2)} / Amount of Lyso-Gb3] in a healthy person, The method according to [7].
[9] The method according to [7] above, wherein the body fluid is plasma or serum, and the reference value A is a value set between 10 and 80.
[10] When the index value is smaller than the reference value A and the amount of Lyso-Gb3 is larger than the reference value B, the subject is more likely to develop Fabry disease, or the subject The method according to any one of the above [7] to [9], wherein it is determined that Gb3 is more likely to be accumulated in the tissue.
[11] The method according to [6] or [10] above, wherein the reference value B is the amount of Lyso-Gb3 in a healthy person.
[12] The method according to [6] or [10], wherein the body fluid is plasma or serum, and the reference value B is a concentration in the body fluid set between 0.2 nM and 0.7 nM.
[13] The method according to any one of [1] to [12] above, wherein the body fluid is plasma or serum.
本発明によれば、ファブリー病の発症危険度を判定する方法を提供することが可能になる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to provide the method of determining the onset risk of Fabry disease.
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本実施形態に係るファブリー病の発症危険度を判定する方法（以下、単に「判定方法」という場合がある。）は、
（１）被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、
（２）上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、上記被験者がファブリー病を発症している可能性があると判定する工程と、
を含む。
The method for determining the onset risk of Fabry disease according to the present embodiment (hereinafter sometimes simply referred to as “determination method”) is as follows.
(1) The amount of globotriaosyl sphingosine (-2) (Lyso-Gb3 (-2)) and globotriaosyl sphingosine (+34) (Lyso-Gb3 ( Measuring the amount of +34));
(2) When the index value calculated based on the amount of Lyso-Gb3 (-2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34) is smaller than the reference value A, the subject develops Fabry disease. Determining that there is a possibility that
including.
ファブリー病とは、α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧＡＬ）の酵素活性が欠損又は低下することによって生じる、先天性の糖脂質代謝異常症を意味する。α−ＧＡＬの活性が欠損又は低下すると、スフィンゴ糖脂質の一種であるグロボトリアオシルセラミド（「Ｇｂ３」、「ＧＬ−３」、「セラミドトリヘキソアミド（ＣＴＨ）」ともいう。）が分解されずに、血管内皮細胞、全身の細胞、全身の組織に蓄積する。その結果、四肢の痛み、低汗症、アンジオケラトーマ、角膜混濁、消化器障害、目眩、聴覚障害、脳血管障害、腎障害及び心障害等の様々な症状が出現し、時間の経過とともに重症化することが知られている。したがって、上記判定方法は、被験者の組織へのグロボトリアオシルセラミドの蓄積の可能性を判定する方法として把握することもできる。 Fabry disease means a congenital glycolipid metabolic disorder caused by deletion or reduction of the enzyme activity of α-galactosidase A (α-GAL). When the α-GAL activity is deficient or decreased, globotriaosylceramide (also referred to as “Gb3”, “GL-3”, “ceramide trihexamide (CTH)”), which is a kind of glycosphingolipid, is degraded. Rather, it accumulates in vascular endothelial cells, whole body cells, and whole body tissues. As a result, various symptoms such as limb pain, hypohidrosis, angiokeratoma, corneal opacity, digestive disorder, dizziness, hearing impairment, cerebrovascular disorder, renal disorder and heart disorder appear and become severe over time. It is known that Therefore, the determination method can also be grasped as a method for determining the possibility of accumulation of globotriaosylceramide in the tissue of the subject.
被験者から採取された体液としては、特に制限はなく、例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液等が挙げられ、血漿又は血清が好ましく用いられる。 There is no restriction | limiting in particular as a bodily fluid extract | collected from the test subject, For example, blood, plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid etc. are mentioned, Plasma or serum is used preferably.
グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（以下、「Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）」という場合がある。）及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（以下、「Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）」という場合がある。）は、グロボトリアオシルスフィンゴシン（以下、「Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３」という場合がある。）の類似体（アナログ体）である。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３から２個の水素原子が脱離した構造を有する類似体である。一方、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３に２個の水素原子と２個の酸素原子とが付加した構造を有する類似体である。以下、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の類似体を、「Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質」という場合がある。 Globotriaosylsphingosine (−2) form (hereinafter sometimes referred to as “Lyso-Gb3 (−2)”) and Globotriaosylsphingosine (+34) form (hereinafter referred to as “Liso-Gb3 (+34)”) ) Is an analog (analogue) of globotriaosylsphingosine (hereinafter sometimes referred to as “Lyso-Gb3”). Lyso-Gb3 (-2) is an analog having a structure in which two hydrogen atoms are eliminated from Lyso-Gb3. On the other hand, Lyso-Gb3 (+34) is an analog having a structure in which two hydrogen atoms and two oxygen atoms are added to Lyso-Gb3. Hereinafter, the analogue of Lyso-Gb3 may be referred to as “Lyso-Gb3 related substance”.
Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量、及びＬｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量を測定する方法としては、特に制限はなく公知の方法によって測定することが可能であるが、液体クロマトグラフィー法と質量分析法とを組み合わせた方法（ＬＣ−ＭＳ法）が好ましく用いられる。 The method for measuring the amount of Lyso-Gb3 (-2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34) is not particularly limited and can be measured by a known method. However, liquid chromatography and mass spectrometry can be used. A method (LC-MS method) combined with a method is preferably used.
液体クロマトグラフィー用のカラムとしては、例えば、逆相カラム、ＨＩＬＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）カラム等が挙げられる。内径が２０〜１００μｍの逆相カラム（ナノカラム）は、微量の試料でも測定できることから好ましく用いられる。市販されているナノカラムとしては、例えば、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ ｎａｎｏ ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍｘ０．１ｍｍ、３ｍｍ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が挙げられる。 Examples of the column for liquid chromatography include a reverse phase column, a HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) column, and the like. A reverse phase column (nanocolumn) having an inner diameter of 20 to 100 μm is preferably used because it can measure even a small amount of sample. Examples of commercially available nanocolumns include Zorbax 300SB-C18 nano column (150 mm × 0.1 mm, 3 mm particles; Agilent Technology).
液体クロマトグラフィーの移動相は、用いるカラムによって適宜設定できるが、例えば逆相カラムを用いる場合、メタノール、アセトニトリル等が好ましく用いられる。 The mobile phase of liquid chromatography can be appropriately set depending on the column to be used. For example, when a reverse phase column is used, methanol, acetonitrile and the like are preferably used.
質量分析法としては、例えば、大気圧化学イオン化法(ＡＰＣＩ)、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、ナノエレクトロスプレー法等が挙げられ、好ましくは、ナノエレクトロスプレー法が挙げられる。質量分析法に用いられる機器としては、市販されているものであれば特に制限はないが、例えば、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。 Examples of the mass spectrometry include atmospheric pressure chemical ionization (APCI), electrospray ionization (ESI), nanoelectrospray, and the like, and preferably nanoelectrospray. An instrument used for mass spectrometry is not particularly limited as long as it is commercially available, and examples thereof include Q-Exclusive mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific).
上記の測定を行うにあたり、当業者に周知の方法で適宜工程（１）における測定前に、被験者から採取された体液に対して前処理を行ってもよい。例えば、体液が血液である場合、まず被験者の末梢血を採血管に採取し、凝固させた後、遠心分離を行うことによって上清を得る。得られた上清画分を、固相抽出等の前処理を行うことで、測定試料とすることができる。ここでナノエレクトロスプレー法を用いた測定を行う場合、１μｌ〜５μｌ程度の血漿量又は血清量で測定が可能である。 In performing the above measurement, a pretreatment may be performed on the body fluid collected from the subject before the measurement in step (1) as appropriate by a method well known to those skilled in the art. For example, when the body fluid is blood, first, peripheral blood of the subject is collected in a blood collection tube, coagulated, and then centrifuged to obtain a supernatant. The obtained supernatant fraction can be used as a measurement sample by performing pretreatment such as solid phase extraction. Here, when the measurement using the nanoelectrospray method is performed, the measurement can be performed with a plasma volume or serum volume of about 1 μl to 5 μl.
上記の測定は、適宜内部標準物質の存在下で行ってもよい。当該内部標準物質としては、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３又はＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質の任意の炭素原子又は水素原子が、それぞれ１３Ｃ、重水素原子等の安定同位体に置換された物質を用いることができる。内部標準物質として、具体的には後述の実施例に示す、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の末端メチル基の水素原子が重水素原子に置換され、かつスフィンゴシン骨格３位の炭素原子が１３Ｃに置換された化合物（グロボトリアオシル−［３−１３Ｃ１，１８−２Ｈ３］−スフィンゴシン）が挙げられる。 The above measurement may be appropriately performed in the presence of an internal standard substance. As the internal standard substance, a substance in which any carbon atom or hydrogen atom of the Lyso-Gb3 or Lyso-Gb3 related substance is substituted with a stable isotope such as 13 C and deuterium atom can be used. As an internal standard substance, specifically, a compound in which the hydrogen atom of the terminal methyl group of Lyso-Gb3 is substituted with a deuterium atom and the carbon atom at the 3-position of the sphingosine skeleton is substituted with 13 C, as shown in the Examples below. (globotriaosyl - [3- 13 C 1, 18- 2 H 3] - sphingosine) may be mentioned.
本実施形態に係る判定方法に用いられる測定用キットであって、当該内部標準物質があらかじめ充填された容器を含む測定用キットもまた、本実施形態の範疇である。測定用キットとしては、例えば、上記内部標準物質があらかじめ充填された体液注入用容器等が挙げられる。上記体液注入用容器に上記体液を注入することで、ＬＣ−ＭＳ等の分析機器で測定するための試料を作製できる。 A measurement kit used in the determination method according to the present embodiment, which includes a container prefilled with the internal standard substance, is also included in the category of the present embodiment. Examples of the measurement kit include a body fluid injection container filled with the internal standard substance in advance. By injecting the body fluid into the body fluid injection container, a sample for measurement with an analytical instrument such as LC-MS can be produced.
被験者におけるＬｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、被験者がファブリー病を発症している可能性がある、又は、被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性があると判定する。 If the index value calculated based on the amount of Lyso-Gb3 (-2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34) in the subject is smaller than the reference value A, the subject may have Fabry disease It is determined that there is a possibility that Gb3 is accumulated in the tissue of the subject.
上記指標値は、上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量に対する上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量の比率であることが好ましい。この場合、上記基準値Ａとしては、健常人における上記比率であってもよいし、あらかじめ設定された値であってもよい。あらかじめ設定された値としては、保有する健常人及び患者の測定値のうち、患者群が含まれない指標値を適宜設定することができ、好ましくは、健常人群にも患者群にも含まれず、健常人群と患者群との間の値を設定する。あらかじめ設定された値を用いる場合、体液が血漿又は血清であるときには、基準値Ａは、１〜２の間で設定される値であることが好ましく、１．４〜２の間で設定される値であることがより好ましく、１．４〜１．５の間で設定される値であることが更により好ましい。 The index value is preferably a ratio of the amount of Lyso-Gb3 (+34) to the amount of Lyso-Gb3 (-2). In this case, the reference value A may be the above-mentioned ratio for healthy persons, or may be a preset value. As a preset value, among the measured values of healthy individuals and patients, it is possible to appropriately set an index value that does not include the patient group, preferably not included in the healthy person group or the patient group, A value between the healthy group and the patient group is set. When using a preset value, when the body fluid is plasma or serum, the reference value A is preferably a value set between 1 and 2, and is set between 1.4 and 2. More preferably, it is a value, and even more preferably a value set between 1.4 and 1.5.
本実施形態に係る判定方法は、上記体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の量を測定する工程を更に含んでもよい。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量を測定する方法としては、特に制限はなく公知の方法によって測定することが可能であるが、例えば、内部標準物質を用いたＬＣ−ＭＳ法が好ましく用いられる。内部標準物質としては、例えば、安定同位体標識したＬｙｓｏ−Ｇｂ３が挙げられる。 The determination method according to the present embodiment may further include a step of measuring the amount of globotriaosylsphingosine (Lyso-Gb3) contained in the body fluid. The method for measuring the amount of Lyso-Gb3 is not particularly limited and can be measured by a known method. For example, an LC-MS method using an internal standard substance is preferably used. Examples of the internal standard substance include Lyso-Gb3 labeled with a stable isotope.
Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量を測定することによって、判定方法の精度が更に向上する傾向がある。すなわち、上記指標値が上記基準値Ａよりも小さく、かつ上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、上記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は、上記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定できる。 By measuring the amount of Lyso-Gb3, the accuracy of the determination method tends to be further improved. That is, when the index value is smaller than the reference value A and the amount of Lyso-Gb3 is larger than the reference value B, the subject is more likely to develop Fabry disease, or the subject It can be determined that there is a higher possibility that Gb3 is accumulated in the tissue.
基準値Ｂは、健常人におけるＬｙｓｏ−Ｇｂ３の量であってもよいし、あらかじめ設定された値であってもよい。あらかじめ設定された値としては、保有する健常人及び患者の測定値のうち、患者群が含まれない測定値を適宜設定することができ、好ましくは、健常人群にも患者群にも含まれず、健常人群と患者群との間の値を設定する。健常人におけるＬｙｓｏ−Ｇｂ３の量は男性、女性で分けてもよく、平均値±標準偏差等で設定してもよい。あらかじめ設定された値を用いる場合、体液が血漿又は血清であるときには、基準値Ｂは体液中濃度０．２ｎＭ〜０．７ｎＭの間で設定される値であることが好ましく、０．５ｎＭ〜０．７ｎＭの間で設定される値であることがより好ましい。 The reference value B may be the amount of Lyso-Gb3 in a healthy person, or may be a preset value. As a preset value, among the measurement values of healthy people and patients that can be held, it is possible to appropriately set a measurement value that does not include the patient group, preferably, not included in the healthy person group or the patient group, A value between the healthy group and the patient group is set. The amount of Lyso-Gb3 in healthy people may be divided between men and women, and may be set as an average value ± standard deviation. When using a preset value, when the body fluid is plasma or serum, the reference value B is preferably a value set between a body fluid concentration of 0.2 nM and 0.7 nM, and 0.5 nM to 0 More preferably, the value is set between 7 nM.
Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量を測定する工程を含む場合、指標値は、［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値であることが好ましい。判定方法の精度が更に向上する傾向がある。このときの基準値Ａは、健常人における上記［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値であってもよいし、あらかじめ設定された値であってもよい。あらかじめ設定された値としては、保有する健常人及び患者の測定値のうち、患者群が含まれない指標値を適宜設定することができ、好ましくは、健常人群にも患者群にも含まれず、健常人群と患者群との間の値を設定する。あらかじめ設定された値を用いる場合、体液が血漿又は血清であるときには、基準値Ａは、１０〜８０の間で設定される値であることが好ましく、３０〜８０の間で設定される値であることがより好ましく、３０〜４０の間で設定される値であることが更に好ましい。 When the step of measuring the amount of Lyso-Gb3 is included, the index value is represented by [{amount of Lyso-Gb3 (+34) / amount of Lyso-Gb3 (-2)} / amount of Lyso-Gb3]. It is preferable that There is a tendency that the accuracy of the determination method is further improved. The reference value A at this time may be a value represented by the above [{Lyso-Gb3 (+34) amount / Lyso-Gb3 (-2) amount} / Lyso-Gb3 amount] in a healthy person. However, it may be a preset value. As a preset value, among the measured values of healthy individuals and patients, it is possible to appropriately set an index value that does not include the patient group, preferably not included in the healthy person group or the patient group, A value between the healthy group and the patient group is set. When using a preset value, when the body fluid is plasma or serum, the reference value A is preferably a value set between 10 and 80, and a value set between 30 and 80. More preferably, it is more preferably a value set between 30 and 40.
以上説明したように、本実施形態に係る判定方法は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及びＬｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値を用いて行われるため、ヘテロ接合型の遺伝子型を有する女性患者等の被験者においても、精度よく判定することが可能になる。また、本実施形態に係る判定方法は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及びＬｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量の比率に基づく指標値を用いる場合、内部標準物質を用いることなく、精度高く算出できる点で、特に有用である。 As described above, since the determination method according to the present embodiment is performed using the index value calculated based on the amount of Lyso-Gb3 (-2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34), the heterojunction is performed. Even in a subject such as a female patient having a type of genotype, the determination can be made with high accuracy. In addition, the determination method according to the present embodiment calculates with high accuracy without using an internal standard substance when using an index value based on the ratio of the amount of Lyso-Gb3 (-2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34). It is particularly useful in that it can.
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
試薬
Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３は、Ｍａｔｒｅｙａ社（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ，ＰＡ）から購入した。内部標準物質として使用した安定同位体標識したＬｙｓｏ−Ｇｂ３（ａｂｂｒ． Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳ）は、Ｌ−セリン−１−１３Ｃとパルミチン酸−ＣＤ３を原料の一部とし、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１１：１６５２−１６６３に記載の方法で、合成した。すなわち、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳはひとつの１３Ｃと３つの重水素とを含む以下の式：
で表される化合物（グロボトリアオシル−［３−１３Ｃ１，１８−２Ｈ３］−スフィンゴシン）である。
サンプル調製及びｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳに用いたメタノール（ＭｅＯＨ、ＬＣ−ＭＳグレード）、並びに、アセトニトリル（ＡｃＮ、ＬＣ−ＭＳグレード）は、関東化学株式会社から購入した。ギ酸（ＦＡ、ＬＣ−ＭＳグレード）は和光純薬工業株式会社から購入した。
Reagent Lyso-Gb3 was purchased from Matreya (Pleasant Gap, PA). Stable isotope-labeled Lyso-Gb3 (abbr. Lyso-Gb3-IS) used as an internal standard substance has L-serine-1- 13 C and palmitic acid-CD 3 as a part of the raw materials, Eur. J. et al. Org. Chem. It was synthesized by the method described in 2011: 1652-1663. That is, Lyso-Gb3-IS has the following formula containing one 13 C and three deuterium:
Compound represented by (globotriaosyl - [3- 13 C 1, 18- 2 H 3] - sphingosine) is.
Methanol (MeOH, LC-MS grade) and acetonitrile (AcN, LC-MS grade) used for sample preparation and nano-LC / MS were purchased from Kanto Chemical Co., Inc. Formic acid (FA, LC-MS grade) was purchased from Wako Pure Chemical Industries.
サンプル調製
血漿は、健常人（男性２０名、女性２０名）、並びに、ファブリー病男性患者（Ｃｌａｓｓｉｃ９名、Ｌａｔｅｒ−ｏｎｓｅｔ８名）及び女性患者（１０名）から採取した。採取された血漿からのＬｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体の抽出は、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． ４１４：２７３−２８０に記載の方法を最適化して実施した。まず、標準血漿を作製した。具体的には、チャコール処理した血漿に０、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０、５０及び２５０ｎＭの濃度でＬｙｓｏ−Ｇｂ３を添加して標準血漿を作製した。次にＬｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳを１％Ｈ３ＰＯ４／ＭｅＯＨに終濃度が２．５ｎＭになるように希釈し、ＩＳ溶液（内部標準溶液）を作製した。２０μＬの標準血漿にＩＳ溶液を８０μＬ添加し、混合後に遠心し、タンパク質を除去した。一方、ファブリー病患者又は健常人から採取した上記血漿試料も同様に血漿２０μＬにＩＳ溶液を８０μＬ添加して、混合後に遠心した。遠心後、得られた混合液の上清８０μＬに１％Ｈ３ＰＯ４／４０％ＭｅＯＨを９２０μＬ添加混合し、１２００μＬのＭｅＯＨ及び１２００μＬの２％Ｈ３ＰＯ４で予めコンディショニングしたＯＡＳＩＳ ＭＣＸカートリッジ（ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、３０ｍｇ、６０ｍｍ）に添加した。その後、カートリッジを１２００μＬの２％ＦＡ、１２００μＬの０．２％ＦＡ／ＭｅＯＨ、１２００μＬの２％ＮＨ４（２８％（ｖ／ｖ））／５０％ＭｅＯＨの順に洗浄した。アナログ体の抽出の場合は１２００μＬの２％ＮＨ４（２８％（ｖ／ｖ））／５０％ＭｅＯＨによる洗浄は実施しなかった。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体は１２００μＬの２％ＮＨ４（２８％（ｖ／ｖ））／ＭｅＯＨでガラスチューブに溶出し、エバポレーターで乾固した。得られた乾固物は適切な容量の０．１％ＦＡ／５０％ＡｃＮで溶解し、得られたサンプルをｎａｎｏ−ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。
Sample Preparation Plasma was collected from healthy individuals (20 men, 20 women), and Fabry disease male patients (Classic 9 people, Ratter-onset 8 people) and female patients (10 people). Extraction of Lyso-Gb3 and its analogs from the collected plasma was performed in Clin. Chim. Acta. 414: 273-280 was performed in an optimized manner. First, standard plasma was prepared. Specifically, Lyso-Gb3 was added to charcoal-treated plasma at concentrations of 0, 0.016, 0.08, 0.4, 2, 10, 50 and 250 nM to prepare standard plasma. Next, Lyso-Gb3-IS was diluted with 1% H 3 PO 4 / MeOH to a final concentration of 2.5 nM to prepare an IS solution (internal standard solution). 80 μL of IS solution was added to 20 μL of standard plasma and centrifuged after mixing to remove proteins. On the other hand, the plasma sample collected from a Fabry disease patient or a healthy person was similarly added with 80 μL of IS solution to 20 μL of plasma, and centrifuged after mixing. After centrifugation, OASIS MCX cartridge (waters pre-conditioned with 1200 μL of MeOH and 1200 μL of 2% H 3 PO 4 after adding 920 μL of 1% H 3 PO 4 /40% MeOH to 80 μL of the supernatant of the resulting mixture. Corp., 30 mg, 60 mm). The cartridge was then washed in order of 1200 μL 2% FA, 1200 μL 0.2% FA / MeOH, 1200 μL 2% NH 4 (28% (v / v)) / 50% MeOH. In the case of analog extraction, washing with 1200 μL of 2% NH 4 (28% (v / v)) / 50% MeOH was not performed. Lyso-Gb3 and its analog were eluted in a glass tube with 1200 μL of 2% NH 4 (28% (v / v)) / MeOH and dried to dryness with an evaporator. The obtained dried product was dissolved in an appropriate volume of 0.1% FA / 50% AcN, and the obtained sample was injected into a nano-LC MS / MS system.
機器及び定量方法
ｎａｎｏ−ＬＣシステムとして、ＬＣ（液体クロマトグラフィー）はＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＲＳＬＣｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、オートサンプラーはＰＡＬ ＨＴＳ ＸＴ−ＣＴＣ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＡＧ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。サンプルは１μＬ ｎａｎｏ Ｖｉｐｅｒ Ｌｏｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて注入した。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体の分離にはＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ ｎａｎｏ ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍｘ０．１ｍｍ、３ｍｍ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。溶媒Ａは０．２％ＦＡ／５％ＡｃＮ、溶媒Ｂは０．２％ＦＡ／ＡｃＮを用い、２５分間のグラジエントを使用した（０分、１％溶媒Ｂ；１０分、９９％溶媒Ｂ；１６分、９９％溶媒Ｂ；１６．１分、１％溶媒Ｂ；２５分、１％溶媒Ｂ）。流速は０．５μＬ／分とした。Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＬｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体の検出に用いた。装置のキャリブレーションは全ての測定前に実施した。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体の定量はＴａｒｇｅｔｅｄ ＭＳ／ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＨＲＰＳ）ｍｏｄｅで実施した。一段目の四重極は１．０ ＦＷＨＮ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器は１７５００ ＦＷＨＮに設定した。ＡＧＣターゲット値は１ｅ５、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅは１００ｍｓに設定した。すべての測定対象化合物のコリジョンエネルギーは２５％に設定した。ターゲットとした質量はＬｙｓｏ−Ｇｂ３に対してｍ／ｚ ７８６．４４８２、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳに対してｍ／ｚ ７９０．４７０、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）に対してｍ／ｚ ７８４．４３３、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）に対してｍ／ｚ ８２０．４５４とした。Ｑｕａｎ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてデータ処理を行った。スフィンゴシン由来の最も強度が強いピークを定量のために選択した。選択した質量はＬｙｓｏ−Ｇｂ３に対してｍ／ｚ ２８２．２７８、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳに対してｍ／ｚ ２８６．３０１、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）に対してｍ／ｚ ２８０．２６３、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）に対してｍ／ｚ ３３４．２９５とした。
Equipment and Quantification Method As nano-LC system, LC (liquid chromatography) is Ultimate 3000RSLC nano (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), Autosampler is PAL HTS XT-CTC autoZamp, CTC AnalSw, CTC AnalZ used. Samples were injected using a 1 μL nano Viper Loop (Thermo Fisher Scientific). Zorbax 300SB-C18 nano column (150 mm × 0.1 mm, 3 mm particles; Agilent Technology) was used for separation of Lyso-Gb3 and its analog form. Solvent A was 0.2% FA / 5% AcN, Solvent B was 0.2% FA / AcN and a 25 minute gradient was used (0 min, 1% solvent B; 10 min, 99% solvent B; 16 minutes, 99% solvent B; 16.1 minutes, 1% solvent B; 25 minutes, 1% solvent B). The flow rate was 0.5 μL / min. Q-Exact mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) was used to detect Lyso-Gb3 and its analogs. The instrument was calibrated before every measurement. Quantification of Lyso-Gb3 and its analogs was performed with Targeted MS / MS analysis (HRPS) mode. The first quadrupole was set to 1.0 FWHN, and the Orbitrap detector was set to 17500 FWHN. The AGC target value was set to 1e5, and the maximum injection time was set to 100 ms. The collision energy of all measurement target compounds was set to 25%. Target masses are m / z 786.4482 for Lyso-Gb3, m / z 780.470 for lyso-Gb3-IS, m / z 784.433 for lyso-Gb3 (-2), It was set to m / z 820.454 with respect to lyso-Gb3 (+34). Data processing was performed using Quan Browser software (Thermo Fisher Scientific). The strongest peak from sphingosine was selected for quantification. Selected masses are m / z 282.278 for Lyso-Gb3, m / z 286.301 for lyso-Gb3-IS, m / z 280.263 for lyso-Gb3 (-2), lyso It was set to m / z 334.295 with respect to -Gb3 (+34).
上述したｎａｎｏ−ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステムによる分析の結果に基づいて、健常人及びファブリー病患者における、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）及びｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の内部標準に対する相対量（ピーク面積比）、並びに、（−２）／（＋３４）、（＋３４）／（−２）及び｛（＋３４）／（−２）｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の各比率（以下、「アナログ比」という場合がある。）を算出した（表１〜表５）。ここで、「（−２）」及び「（＋３４）」は、それぞれ、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）及びｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）を示す。 Based on the results of the above-described analysis by the nano-LC MS / MS system, the concentrations of lyso-Gb3, lyso-Gb3, lyso-Gb3 (-2) and lyso-Gb3 (+34) in healthy subjects and Fabry disease patients. Relative amount with respect to internal standard (peak area ratio), and ratios of (−2) / (+ 34), (+34) / (− 2) and {(+34) / (− 2)} / Lyso-Gb3 (below) , Sometimes referred to as “analog ratio”) (Tables 1 to 5). Here, “(−2)” and “(+34)” indicate lyso-Gb3 (−2) and lyso-Gb3 (+34), respectively.
横軸にアナログ比（＋３４）／（−２）、縦軸にｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度をとったプロット、及び、横軸にアナログ比｛（＋３４）／（−２）｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３、縦軸にｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度をとったプロットを、それぞれ図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。これらのプロットから、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度よりも、上記アナログ比の方が、健常人とファブリー病患者とを区別しやすいことが分かった。すなわち、上記アナログ比の方が、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度よりもファブリー病の発症危険度を判定するための指標として適していることが分かった。さらに、アナログ比｛（＋３４）／（−２）｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３は、アナログ比（＋３４）／（−２）よりも、健常人とファブリー病患者との差が更に明確となり、指標としてより適していることが分かった。
また、上記アナログ比及びｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度の２つのパラメータを用いることでも、健常人とファブリー病患者との区別が行いやすくなることがわかった。
The horizontal axis represents the analog ratio (+34) / (-2), the vertical axis represents the concentration of lyso-Gb3, and the horizontal axis represents the analog ratio {(+34) / (-2)} / Lyso-Gb3, vertical Plots with the concentration of lyso-Gb3 on the axis are shown in FIGS. 1 (A) and 1 (B), respectively. From these plots, it was found that the analog ratio was easier to distinguish between a healthy person and a Fabry disease patient than the concentration of lyso-Gb3. That is, it was found that the analog ratio is more suitable as an index for determining the risk of developing Fabry disease than the concentration of lyso-Gb3. Furthermore, the analog ratio {(+34) / (-2)} / Lyso-Gb3 makes the difference between healthy people and Fabry patients clearer than the analog ratio (+34) / (-2). I found it suitable.
It was also found that the use of two parameters, the analog ratio and the lyso-Gb3 concentration, makes it easy to distinguish between a healthy person and a Fabry disease patient.
Claims (13)
被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、
前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、前記被験者がファブリー病を発症している可能性があると判定する工程と、
を含む方法。 A method for determining the risk of developing Fabry disease,
The amount of globotriaosyl sphingosine (-2) (Lyso-Gb3 (-2)) and globotriaosyl sphingosine (+34) (Lyso-Gb3 (+34)) contained in the body fluid collected from the subject Measuring the amount of
When the index value calculated based on the amount of Lyso-Gb3 (-2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34) is smaller than the reference value A, the subject may have Fabry disease Determining that there is
Including methods.
被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、
前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、前記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性があると判定する工程と、
を含む方法。 A method for determining the possibility of accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) in a subject's tissue,
The amount of globotriaosyl sphingosine (-2) (Lyso-Gb3 (-2)) and globotriaosyl sphingosine (+34) (Lyso-Gb3 (+34)) contained in the body fluid collected from the subject Measuring the amount of
When the index value calculated based on the amount of Lyso-Gb3 (−2) and the amount of Lyso-Gb3 (+34) is smaller than the reference value A, Gb3 is accumulated in the tissue of the subject. Determining that there is a possibility,
Including methods.
前記指標値が前記基準値Ａよりも小さく、かつ前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、前記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は前記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 Further comprising measuring the amount of globotriaosylsphingosine (Lyso-Gb3) contained in the body fluid,
When the index value is smaller than the reference value A and the amount of Lyso-Gb3 is larger than the reference value B, the subject is more likely to develop Fabry disease, or the subject's tissue The method according to claim 1, wherein it is determined that Gb3 is more likely to be accumulated.
前記指標値が、［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値である、請求項１又は２に記載の方法。 Further comprising measuring the amount of globotriaosylsphingosine (Lyso-Gb3) contained in the body fluid,
The method according to claim 1 or 2, wherein the index value is a value represented by [{amount of Lyso-Gb3 (+34) / amount of Lyso-Gb3 (-2)} / amount of Lyso-Gb3]. .
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| US11335461B1 (en) | 2017-03-06 | 2022-05-17 | Cerner Innovation, Inc. | Predicting glycogen storage diseases (Pompe disease) and decision support |
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