JP2015204769A - Production method of pyruvic acid using halomonas bacteria - Google Patents
Production method of pyruvic acid using halomonas bacteria Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015204769A JP2015204769A JP2014086578A JP2014086578A JP2015204769A JP 2015204769 A JP2015204769 A JP 2015204769A JP 2014086578 A JP2014086578 A JP 2014086578A JP 2014086578 A JP2014086578 A JP 2014086578A JP 2015204769 A JP2015204769 A JP 2015204769A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- salt
- culture
- pyruvic acid
- halomonas
- culture solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、ハロモナス菌を用いたピルビン酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing pyruvic acid using Halomonas bacteria.
近年、エネルギーのみならずケミカル・リファイナリーのバイオベース化、工業用原料の石油からバイオマスへの転換等が課題となっている。 In recent years, not only energy but also biorefinery of chemical refineries and conversion of industrial raw materials from petroleum to biomass have become issues.
ピルビン酸は多くの生物の代謝において重要な化合物であり、解糖系として知られるグルコースの嫌気性代謝による生産物である。嫌気的代謝過程において、グルコース1分子はピルビン酸2分子へと分解され、これに続く好気的代謝の過程において、ピルビン酸はクレブス回路(TCA回路、クエン酸回路)として知られる一連の反応の主要な材料であるアセチル補酵素Aへと変換される。また、ピルビン酸は補充反応によってオキサロ酢酸にも変換される。そしてオキサロ酢酸はクレブス回路の中間体を補充し、糖新生にも使用される。 Pyruvate is an important compound in the metabolism of many organisms, and is a product of anaerobic metabolism of glucose known as a glycolytic system. During anaerobic metabolism, one glucose molecule is broken down into two pyruvate molecules, and in the subsequent aerobic metabolism process, pyruvate is a series of reactions known as the Krebs cycle (TCA cycle, citrate cycle). It is converted into acetyl coenzyme A, which is the main material. Pyruvate is also converted to oxaloacetate by a supplementary reaction. And oxaloacetate supplements the intermediate of the Krebs cycle and is also used for gluconeogenesis.
十分な酸素が供給されない環境下では、ピルビン酸は嫌気的に分解されて乳酸、エタノール等が生成する。解糖系から産生したピルビン酸は、乳酸発酵において乳酸脱水素酵素と補酵素NADHを用いて、又はアルコール発酵においてアセトアルデヒド、更にエタノールへと変換される。また、ピルビン酸は糖新生によって炭水化物、アセチルCoA等を介して脂肪酸;エネルギー;アラニン;エタノール等へと変換することができる。すなわち、ピルビン酸は代謝経路ネットワークの鍵となる化合物である。 In an environment where sufficient oxygen is not supplied, pyruvic acid is decomposed anaerobically to produce lactic acid, ethanol, and the like. Pyruvate produced from the glycolytic system is converted into acetaldehyde and further ethanol in lactate fermentation using lactate dehydrogenase and coenzyme NADH or in alcohol fermentation. In addition, pyruvic acid can be converted to fatty acid; energy; alanine; ethanol and the like via carbohydrate, acetyl-CoA and the like by gluconeogenesis. That is, pyruvic acid is a key compound in the metabolic pathway network.
ピルビン酸の用途はその反応性が高いことから、医薬、農薬等の合成の基質といったファインケミカルにおける重要な中間体として用いられ、また、細胞にエネルギーを供給する際に解糖系を経由しないことから、輸液、サプリメント等への応用も期待されている。 The use of pyruvic acid is highly reactive, so it is used as an important intermediate in fine chemicals such as synthetic substrates for pharmaceuticals and agricultural chemicals, and because it does not go through glycolysis when supplying energy to cells. Application to infusions and supplements is also expected.
ピルビン酸の製造方法として、カンジダ属(Candida)に属するカンジダ・エスピー・MC−P0101株(Candida sp. MC−P0101)FERM BP−7539によるピルビン酸の発酵生産が示されている(特許文献6)。 As a method for producing pyruvic acid, fermentative production of pyruvic acid by Candida sp. MC-P0101 strain (Candida sp. MC-P0101) FERM BP-7539 belonging to Candida is shown (Patent Document 6). .
本発明者らは、微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討する中で、ある条件下では、ハロモナス属に属する好塩菌が唯一の混入する菌として生育することを認めた。当該好塩菌そのものは、通常はpH5〜12程度の条件下の、高濃度のナトリウムを含む培地中でも良好に生育するため、好気発酵下であっても他のバクテリア等の混入が極めて起こりにくいことが知られている。そこで、当該好塩菌の各種の炭素源の資化性を検討していたところ、当該好塩菌の菌体内に著量のPHBを蓄積していること明らかにした(特許文献1)。更に、検討を進める中で、当該ハロモナス属菌が好気条件で菌体内にPHBを蓄積し、その後微好気条件に移行するとことで、PHBのモノマーである3−ヒドロキシ酪酸を培養液中に分泌産生することを見いだした(特許文献2、3)。また、別途検討を進めるなかで、生育初期の段階において培地に乳酸、酢酸等を分泌すること(特許文献4)、バイオディーゼル廃グリセロール等を含む培地を用いることでアルファケトグルタル酸、グルタミン酸が培養液中に分泌生産されることを見いだした(特許文献5)。
While examining the efficient culture method of the microalga Spirulina, the present inventors have recognized that, under certain conditions, halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas grow as the only contaminating bacteria. The halophilic bacterium itself grows well in a medium containing a high concentration of sodium, usually under a pH of about 5 to 12, so that contamination with other bacteria is extremely difficult even under aerobic fermentation. It is known. Then, assimilation of various carbon sources of the halophilic bacteria was examined, it was clarified that a significant amount of PHB was accumulated in the cells of the halophilic bacteria (Patent Document 1). Furthermore, as the investigation proceeds, the Halomonas sp. Accumulates PHB in the cells under aerobic conditions and then shifts to microaerobic conditions, so that 3-hydroxybutyric acid, a monomer of PHB, is added to the culture solution. It has been found that it is secreted (
そしてハロモナス属菌による発酵技術の鋭意検討を進めるなかで、菌体濃度が高くなった段階でグルコースが消費されているものの、菌体内のPHBの蓄積量の増加が頭打ちになる現象を見いだした。 In the course of diligent examination of fermentation techniques using genus Halomonas, we found a phenomenon in which the increase in the amount of PHB accumulated in the cells reached a peak, although glucose was consumed when the cell concentration increased.
上述のような特許文献6に記載されるカンジダ属菌を培養するには滅菌環境が必須であり、更にポリペプトン、酵母エキス等といった高価な培地成分を必要とするところ、工業的に優れたピルビン酸の製造方法とは言い難い。 A sterilizing environment is essential for culturing the Candida spp described in Patent Document 6 as described above, and it requires expensive medium components such as polypeptone and yeast extract. It is hard to say that the manufacturing method.
本発明は、ピルビン酸の発酵産生方法を提供することを目的とする。特に、安価で且つ簡便なピルビン酸の発酵生産方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the fermentative production method of pyruvic acid. In particular, an object is to provide an inexpensive and simple method for fermentative production of pyruvic acid.
本発明者らは、好塩菌を用いた発酵生産過程においてPHBを著量蓄積する培地条件で培養の検討をしていたところ、過剰の炭素源存在下で、菌体濃度が高くなった段階で、培養液のpHの低下が見られることを認めた。そこで、この培養液を分析したところ、培養液中に著量のピルビン酸などが蓄積していることを見出した。 The inventors of the present invention have been studying the culture under a medium condition that accumulates a significant amount of PHB in the fermentation production process using a halophilic bacterium. In the presence of an excess carbon source, the cell concentration increased. It was confirmed that a decrease in the pH of the culture solution was observed. Thus, when this culture solution was analyzed, it was found that a significant amount of pyruvic acid and the like was accumulated in the culture solution.
好塩菌を発酵培養することによりハロモナス属菌体内にポリヒドロキシアルカノエート(PHAs)が蓄積されると、炭素源の一部が乳酸、酢酸等として培養液中に分泌され、培養の過程において上記菌体により再度取り込まれて栄養源として利用されてしまい、培養時間が長くなると、結果として乳酸、酢酸等は培地中から無くなってしまう。 When polyhydroxyalkanoates (PHAs) are accumulated in the genus Halomonas by fermentation of halophilic bacteria, a part of the carbon source is secreted into the culture solution as lactic acid, acetic acid, etc. If it is taken up again by the cells and used as a nutrient source and the culture time is prolonged, lactic acid, acetic acid and the like are lost from the medium as a result.
これに対して、ピルビン酸はハロモナス属菌の培養液中にて菌体濃度が上昇しても、PHBへの合成等が進行することなく、培養液中に分泌され続け、その結果として培養液のpHを低下することを確認した。 On the other hand, pyruvic acid continues to be secreted into the culture solution without progressing synthesis to PHB even if the cell concentration increases in the culture solution of Halomonas spp. It was confirmed that the pH of the solution was lowered.
更に、本発明者らは好塩菌が高価なペプトンや酵母エキスを用いることなく高アルカリ条件下でピルビン酸を産生させることができるため、低コストでの培養及び他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境での培養することでピルビン酸を産生できることを見出した。 Furthermore, since the present inventors can produce pyruvic acid under high alkaline conditions without using expensive peptone or yeast extract, halophilic bacteria are less prone to culturing at low cost and contamination of other bacteria. It was found that pyruvic acid can be produced by culturing in an environment.
本発明は、これら知見に基づいて鋭意検討を重ねて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を含むものである。 The present invention has been completed by earnest studies based on these findings, and includes the inventions of the following broad aspects.
項1 下記の工程(1)〜(3)を含む、ピルビン酸又はその塩の製造方法:
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程1、
(2)培養液中に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも1つを添加する工程2、
(3)工程2で得られる培養液から、ピルビン酸又はその塩を回収する工程3。
Item 1 A method for producing pyruvic acid or a salt thereof, comprising the following steps (1) to (3):
(1) Step 1 of aerobically cultivating a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas in a medium containing an organic carbon source and an inorganic salt,
(2)
(3) Step 3 for recovering pyruvic acid or a salt thereof from the culture solution obtained in
項2 工程2における窒素源が、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、及び尿素からなる群より選択される少なくとも1つである、上記項1に記載の製造方法。
項3 工程2における金属塩が、亜鉛塩、モリブデン塩、マンガン塩、銅塩、及びコバルト塩からなる群より選択される少なくとも1つの金属である、請求項1又は2に記載の製造方法。
Item 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the metal salt in
項4 工程2における窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも1つを添加する時期が、培養液のOD600が30以上となる時期である、上記項1〜項3の何れか1項に記載の製造方法。
Item 4 The above item 1 to item 3, wherein the time when at least one selected from the group consisting of a nitrogen source, a metal salt, and a borate in
項5 工程1における、培養条件が20〜45℃である、上記項1〜項4の何れか1項に記載の製造方法。
項6 工程2にて得られる培養液1L当たり、10g以上のピルビン酸又はその塩が含まれることを特徴とする上記項1〜項5の何れか1項に記載の方法。
Item 6 The method according to any one of Items 1 to 5, wherein 10 g or more of pyruvic acid or a salt thereof is contained per liter of the culture solution obtained in
項7 前記好塩菌がハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM−1株(FERM BP−10995)である、上記項1〜項6のいずれか1項に記載の方法。 Item 7. The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the halophilic bacterium is Halomonas sp. KM-1 strain (FERM BP-10995).
本発明に係る製造方法は、ピルビン酸又はその塩を培養液中に産生させることができる。 The production method according to the present invention can produce pyruvic acid or a salt thereof in a culture solution.
本発明に係る製造方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を培養する工程が含まれるが、斯かる好塩菌の培養は、他の細菌の混入が起こりにくい環境で培養することが可能であり、非滅菌培地及び/又は非滅菌環境下での培養が可能である。更に、供気条件の変更も容易であることから優れた製造方法である。 The production method according to the present invention includes a step of culturing a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas, and the culturing of the halophilic bacterium can be cultivated in an environment where contamination with other bacteria hardly occurs. In addition, culture in a non-sterile medium and / or a non-sterile environment is possible. Furthermore, it is an excellent manufacturing method because the air supply conditions can be easily changed.
本発明に係る製造方法にて用いる好塩菌は、例えば、安価な無機塩に加え、バイオディーゼル生産に副生する廃グリセロール、エタノール発酵等の過程で生産される木材糖化液;生ごみ等の発酵で得られる有機酸等を有機炭素源として単独で、又は他の有機炭素源と組み合わせて用いることが可能である。さらに、酵母細胞を用いたエタノール発酵において得られ、利用が難しいとされる五炭糖のキシロース、アラビノース等を有機炭素源として有効に利用することも可能である。 The halophilic bacteria used in the production method according to the present invention include, for example, waste glycerol by-produced in biodiesel production, wood saccharified liquid produced in the process of ethanol fermentation, etc .; An organic acid or the like obtained by fermentation can be used alone as an organic carbon source or in combination with other organic carbon sources. Furthermore, pentoses such as xylose and arabinose, which are obtained in ethanol fermentation using yeast cells and are difficult to use, can be effectively used as an organic carbon source.
本発明に係る製造方法では、ピルビン酸又はその塩を培養液中にて生産させることが可能である。ピルビン酸の産生は一連のハロモナス属菌体の増殖中にて行われるため、一段階の培養でのピルビン酸の産生が可能である。 In the production method according to the present invention, pyruvic acid or a salt thereof can be produced in a culture solution. Since pyruvic acid is produced during the growth of a series of genus Halomonas, pyruvic acid can be produced in one stage of culture.
また、菌体培養液からピルビン酸又はその塩を含む画分を簡便に回収することが可能であり、精製工程を行ったとしても、簡易な精製方法が適用できるため、優れた製造方法である。 In addition, it is possible to easily recover a fraction containing pyruvic acid or a salt thereof from a bacterial cell culture solution, and even if a purification step is performed, a simple purification method can be applied, and thus it is an excellent production method. .
この点に関して、本発明に係る製造方法ではハロモナス属に属する好塩菌体の溶菌を伴わない条件にてピルビン酸又はその塩をその培養液中から回収することができるので、ピルビン酸又はその塩を精製する際に、溶菌に伴う核酸、タンパク質、糖質、脂質等といった夾雑分子を除去するための精製工程が非常に簡便になるといった効果を有する。 In this regard, in the production method according to the present invention, pyruvic acid or a salt thereof can be recovered from the culture solution under conditions that do not involve lysis of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas. When purifying the protein, there is an effect that the purification process for removing contaminant molecules such as nucleic acids, proteins, carbohydrates, lipids and the like accompanying lysis becomes very simple.
特に、本発明に係る方法によると、ピルビン酸を回収する際の培養液がアルカリ性になっており、ピルビン酸が塩を形成しにくい環境であるため、ピルビン酸の回収に有効である。 In particular, according to the method of the present invention, the culture solution for recovering pyruvic acid is alkaline, and it is an environment in which pyruvic acid is difficult to form a salt, so that it is effective for recovering pyruvic acid.
本発明に係る製造方法によって得られるピルビン酸又はその塩は、医療用の輸液等に添加したり、健康食品などとして利用するだけでなく、化粧品、医薬品などの素材、化成品原料等として有用である。 The pyruvic acid or salt thereof obtained by the production method according to the present invention is not only added to medical infusions, etc., but also used as health foods, etc., and is useful as a raw material for cosmetics, pharmaceuticals, etc. is there.
グラフ中の●(黒丸)は、培養開始から18時間目、24時間目、36時間目、48時間目、60時間目それぞれに、2.5g/Lの硝酸ナトリウム加えたものの結果を示す。グラフ中の▲(黒三角)は、培養開始後、硝酸ナトリウム加えなかったものの結果を示す。
グラフ中の●(黒丸)は、培養開始から18時間目、24時間目、36時間目、48時間目、60時間目それぞれに、2.5g/Lの硝酸ナトリウム加えたものの結果を示す。グラフ中の▲(黒三角)は、培養開始後、硝酸ナトリウム加えなかったものの結果を示す。
グラフ中の●(黒丸)は、培養開始から33℃で培養したものの結果を示す。グラフ中の▲(黒三角)は、培養開始から37℃で培養したものの結果を示す。グラフ中の■(黒四角)は、培養開始から40℃で培養したものの結果を示す。
グラフ中の●(黒丸)は、培養開始から33℃で培養したものの結果を示す。グラフ中の▲(黒三角)は、培養開始から37℃で培養したものの結果を示す。グラフ中の■(黒四角)は、培養開始から40℃で培養したものの結果を示す。
グラフ中の●(黒丸)は、Halomonos sp. KM−1の結果を示す。グラフ中の▲(黒三角)は、Halomons meridian:NBRC15608の結果を示す。グラフ中の■(黒四角)は、Halomons pantelleriensis: ATCC700273の結果を示す。グラフ中の◆(黒ダイヤモンド)は、Halomonas campisalis:ATCC700597の結果を示す。
グラフ中の●(黒丸)は、Halomonos sp. KM−1の結果を示す。グラフ中の▲(黒三角)は、Halomons meridian:NBRC15608の結果を示す。グラフ中の■(黒四角)は、Halomons pantelleriensis: ATCC700273の結果を示す。グラフ中の◆(黒ダイヤモンド)は、Halomonas campisalis:ATCC700597の結果を示す。 ● (black circle) in the graph indicates Halomonos sp. The result of KM-1 is shown. The black triangles in the graph indicate the results of Halomons meridian: NBRC15608. The black squares in the graph indicate the results of Halomons pantererensis: ATCC 7000027. The diamonds (black diamonds) in the graph indicate the results of Halomonas campisalis: ATCC 7000059.
本発明に係るピルビン酸又はその塩の製造方法は下記の工程(1)〜(3)を含む製造方法である。 The manufacturing method of pyruvic acid or its salt which concerns on this invention is a manufacturing method including the following process (1)-(3).
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程1、
(2)培養液中に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも1つを添加する工程2、
(3)工程2で得られる培養液から、ピルビン酸又はその塩を回収する工程3。
(1) Step 1 of aerobically cultivating a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas in a medium containing an organic carbon source and an inorganic salt,
(2)
(3) Step 3 for recovering pyruvic acid or a salt thereof from the culture solution obtained in
本発明に係る製造方法によって製造されるピルビン酸の塩とは、製造時に使用するハロモナス属に属する好塩菌の培地中に含まれる成分に由来する陽イオン及び/又は菌体内に存在する陽イオンによって形成される塩であり、特に限定はされないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、アンモニウム塩、リチウム塩、銀塩、水銀塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、カドミウム塩、ニッケル塩、スズ塩、鉛塩、マンガン塩、アルミニウム塩等が挙げられる。 The salt of pyruvic acid produced by the production method according to the present invention is a cation derived from a component contained in a medium of a halobacterium belonging to the genus Halomonas used at the time of production and / or a cation present in the microbial cell. Although not particularly limited, for example, sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, cobalt salt, zinc salt, iron salt, copper salt, molybdenum salt, ammonium salt, lithium salt, silver Examples include salts, mercury salts, strontium salts, barium salts, cadmium salts, nickel salts, tin salts, lead salts, manganese salts, aluminum salts, and the like.
工程1について
本発明に係るピルビン酸又はその塩の製造方法における工程1は、ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程である。
Step 1 Step 1 in the method for producing pyruvic acid or a salt thereof according to the present invention is a step of aerobic culture of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas in a medium containing an organic carbon source and an inorganic salt.
<A:好塩菌>
本発明の製造方法工程1にて用いる好塩菌は、下記の(i)又は(ii)のいずれかによって示されるハロモナス属に属する好塩菌を用いればよい。
(i)無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、ピルビン酸又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とする好塩菌。
(ii)無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖した後、ピルビン酸又はその塩を菌体外の培養液に分泌産生することを特徴とする好塩菌。
<A: halophilic bacteria>
The halophilic bacterium used in the production method step 1 of the present invention may be a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas represented by either (i) or (ii) below.
(I) A halophilic bacterium characterized by growing aerobically in a medium containing an inorganic salt and a single or a plurality of organic carbon sources to produce pyruvic acid or a salt thereof in a medium outside the cell.
(Ii) A halophilic salt characterized by secreting and producing pyruvic acid or a salt thereof in a culture solution outside the cell after aerobically growing in a medium containing an inorganic salt and a single or a plurality of organic carbon sources. Fungus.
なお、「無機塩」及び「有機炭素源」については、<培地>の欄にて後述する。このようなハロモナス属に属する好塩菌は、酸化的代謝も嫌気的代謝も使い分けることができ、遊離酸素の存在の有無にかかわらず生存が可能で、且つ、遊離酸素の存在下のほうが生育し易い傾向となる、所謂、通性嫌気性菌の性質を有する菌体である。 The “inorganic salt” and “organic carbon source” will be described later in the section <Medium>. Such halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas can use both oxidative metabolism and anaerobic metabolism, can survive regardless of the presence of free oxygen, and grow in the presence of free oxygen. It is a microbial cell having the property of a so-called facultative anaerobic bacterium that tends to be easy.
上述のハロモナス属に属する好塩菌は、0.1〜1.0Mの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。そして、上述のハロモナス属に属する好塩菌は、通常はpH5〜12程度の培地にて生育する。 The above-mentioned halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas are bacteria that have a halophilic property with a suitable salt concentration of 0.1 to 1.0 M and sometimes grow even in a medium containing no salt. And the halophilic bacteria which belong to the above-mentioned genus Halomonas usually grow on a medium of about pH 5-12.
上述のハロモナス属に属する好塩菌として、例えば、ハロモナス・エスピー(Halomonas sp.)KM−1株が挙げられる。ハロモナス・エスピーKM−1株は、平成19年7月10日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305−8566茨城県つくば市東1−1−1中央第6)に受託番号FERM P−21316として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はFERM BP−10995である。当該ハロモナス・エスピーKM−1株の16S rRNA遺伝子は、DDBJにAccession Number AB477015として登録されている。 Examples of the halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas include the Halomonas sp. KM-1 strain. Halomonas SP KM-1 was commissioned on July 10, 2007 to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (Central 1-1, Higashi 1-1-1 Tsukuba City, 305-8586 Ibaraki Prefecture). Deposited under the number FERM P-21316. This strain has now been transferred to an international deposit and its deposit number is FERM BP-10995. The 16S rRNA gene of the Halomonas sp. KM-1 strain is registered as Accession Number AB477015 in DDBJ.
また、上述したようなハロモナス属に属する好塩菌の生育特性等に鑑みて、本発明に係る製造方法において用いる好塩菌として、ハロモナス・エスピーKM−1株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス(Halomonas pantelleriensis:ATCC 700273)、ハロモナス・カンピサリス(Halomonas campisalis:ATCC 700597)、ハロモナス・メリディアナ(Halomonas meridiana:NBRC15608)等も挙げることができる。 Further, in view of the growth characteristics of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas as described above, as halophilic bacteria used in the production method according to the present invention, in addition to Halomonas sp. KM-1 strain, Halomonas pantheraliensis ( Halomonas pantelliensis (ATCC 700033), Halomonas campisalis (ATCC 7000059), Halomonas meridiana (NBRC15608), etc. can also be mentioned.
さらに、16SリボゾームRNA配列による分析から、上述のハロモナス属に属する好塩菌に限らず、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア、ハロモナス・メリディアナ等も、本発明に係る製造方法にて用いるハロモナス属に属する好塩菌として使用してもよい。 Furthermore, from analysis by 16S ribosomal RNA sequence, not only the halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas but also Halomonas nitritofilus, Halomonas amentitalia, Halomonas meridiana and the like are used in the production method according to the present invention. It may be used as a halophilic bacterium belonging to.
なお、上述したハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明に係る製造方法において、ピルビン酸又はその塩の生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、ピルビン酸の発現量を増大させる遺伝子、ピルビン酸の該菌体外への分泌を上昇させる機能を発現させる遺伝子;ピルビン酸又はその塩を培養液にて生産する機能を増大させる遺伝子;ピルビン酸又はその塩の産生量を増大させる遺伝子等が挙げられる。組換えDNAの当該菌体への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。 A gene may be introduced into the halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas described above. The gene to be introduced is not particularly limited as long as it can express the function of improving the production efficiency of pyruvic acid or a salt thereof in the production method according to the present invention. For example, a gene that increases the expression level of pyruvic acid, a gene that expresses the function of increasing the secretion of pyruvic acid outside the cells, a gene that increases the function of producing pyruvic acid or a salt thereof in a culture solution; Examples include genes that increase the amount of acid or its salt produced. Various general methods can be adopted as a method for introducing recombinant DNA into the cells and a transformation method using the method.
<B:培地>
工程1にて用いる培地は、無機塩と及び有機炭素源を含有する。培地のpHは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすpHであることが好ましく、具体的にはpH5〜12程度にすればよい。より好ましくはpH8.8〜12の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができ、また分泌されたピルビン酸によって生じるpHの大幅な低下を抑制するので好ましい。
<B: Medium>
The medium used in step 1 contains an inorganic salt and an organic carbon source. The pH of the medium is not particularly limited, but is preferably a pH that satisfies the above-mentioned growth conditions for halophilic bacteria. Specifically, the pH may be about 5 to 12. A medium having a pH of 8.8 to 12 is more preferable. Use of an alkaline medium is preferable because contamination of other bacteria can be more effectively prevented, and a significant decrease in pH caused by secreted pyruvic acid is suppressed.
工程1にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、及びナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。 The inorganic salt to be blended in the medium used in Step 1 is not particularly limited. For example, phosphate, nitrate, carbonate, sulfate, sodium, magnesium, potassium, manganese, iron, zinc, copper, cobalt And metal salts such as
例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、NaCl、NaNO3、NaHCO3、Na2CO3等を用いればよい。 For example, when sodium is used as the inorganic salt, NaCl, NaNO 3 , NaHCO 3, Na 2 CO 3 or the like may be used.
これらの無機塩は、上述の好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。 As these inorganic salts, it is preferable to use a compound that becomes a nitrogen source or a phosphorus source for the halophilic bacteria described above.
窒素源は、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、尿素等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばNaNO3、NaNO2、NH4Cl、尿素等の化合物を用いればよい。 The nitrogen source may be nitrate, nitrite, ammonium salt, urea or the like, and is not particularly limited. For example, a compound such as NaNO 3 , NaNO 2 , NH 4 Cl and urea may be used.
窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明のピルビン酸又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよい。具体的には、培養初期の培地100ml当たり通常であれば硝酸塩として500mg程度以上とすればよく、より好ましくは1000mg程度以上、更に好ましくは1250mg程度以上である。 What is necessary is just to set the usage-amount of a nitrogen source suitably in the range in which the production objective of the pyruvic acid of this invention or its salt is achieved, without affecting the growth of a microbial cell. Specifically, it is usually about 500 mg or more as nitrate, more preferably about 1000 mg or more, still more preferably about 1250 mg or more per 100 ml of culture medium at the initial stage of culture.
リン源は、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばK2HPO4、KH2PO4等の化合物を用いればよい。 The phosphorus source may be phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate or the like, and is not particularly limited. For example, a compound such as K 2 HPO 4 or KH 2 PO 4 may be used.
リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地100ml当たり通常は50〜400mg程度とすればよく、より好ましくは100〜200mg程度である。 The usage amount of the phosphorus source may be appropriately set from the same viewpoint as the usage amount of the nitrogen source, and specifically, it may be usually about 50 to 400 mg per 100 ml of the medium as dihydrogen phosphate, More preferably, it is about 100 to 200 mg.
これらの無機塩は単一で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。 These inorganic salts may be used alone or in combination of two or more.
その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は0.1〜2.5M程度となる濃度で用いればよく、好ましくは0.2〜1.0M程度、より好ましくは0.2〜0.5M程度である。 The inorganic salt including other compounds may be used at a concentration that is generally about 0.1 to 2.5 M, preferably about 0.2 to 1.0 M, more preferably 0.2 to 0. About 5M.
工程1にて用いる培地に配合する有機炭素源は、特に限定はされないが、例えばトリプトン、イーストエキストラクト、可溶性デンプン、エタノール、n−プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖;リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖;スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖;エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。 The organic carbon source to be blended in the medium used in step 1 is not particularly limited. For example, tryptone, yeast extract, soluble starch, ethanol, n-propanol, acetic acid, sodium acetate, propionic acid, waste glycerol, and waste beet sugar. , Saccharified wood, psicose, fructose, sorbose, tagatose, allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, etc .; ribulose, xylulose, ribose, arabinose, xylose, lyxose, deoxyribose, etc. Pentose sugars; disaccharides such as sucrose, lactose, maltose, trehalose, tulanose, cellobiose; sugar alcohols such as erythritol, glycerin, mannitol, sorbitol, xylitol, and the like.
本発明に係る製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、ハロモナス属に属する好塩菌を培養するので、他の菌体の混入、増殖の恐れ等がほとんどない。従って、上述の培地に対して滅菌処理等を行っても行わなくともよく、且つ、簡便な設備で培養することも可能である。 In the production method according to the present invention, since halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas are cultured in a medium having a relatively high salt concentration, there is almost no risk of contamination or growth of other bacterial cells. Therefore, the above-described medium may or may not be sterilized, and can be cultured with simple equipment.
<C:培養方法>
工程1における上述のハロモナス属に属する好塩菌の培養は、好気培養を採用する。工程1における好気培養は、当該菌体が増殖する限り、特に限定はされない。
<C: culture method>
The culture of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas in step 1 employs aerobic culture. The aerobic culture in step 1 is not particularly limited as long as the cells grow.
具体的には、5ml程度の培地に当該好塩菌を植菌し、通常30〜37℃程度、攪拌速度は120〜180rpm程度で1晩振盪しながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に100倍程度に希釈し本培養する。 Specifically, the halophilic bacteria are inoculated in a medium of about 5 ml, and preculture is usually performed at about 30 to 37 ° C. and a stirring speed of about 120 to 180 rpm while shaking overnight. Subsequently, the microbial cells obtained by pre-culture are diluted about 100 times in a medium in an Erlenmeyer flask, a fermenter, a jar fermenter, etc., and are subjected to main culture.
本培養は通常20〜45℃程度で可能であるが、33℃程度以上とすることが好ましく、33℃〜40℃程度が更に好ましい。この際の攪拌速度は通常は150〜250rpm程度とすればよい。なお、培養環境は培地が空気に触れる環境とすればよく、培養液表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や培地中に係る気体を吹き込む方法を採用してもよい。 The main culture is usually possible at about 20 to 45 ° C, but is preferably about 33 ° C or more, more preferably about 33 ° C to 40 ° C. The stirring speed at this time is usually about 150 to 250 rpm. The culture environment may be an environment in which the culture medium comes into contact with air, and a method of positively spraying a gas containing oxygen on the surface of the culture solution or a method of blowing the gas in the culture medium may be employed.
工程1では、このような培養条件でハロモナス属に属する好塩菌を好気培養すればよい。具体的に好気培養時の培養液中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は0.5mg/L以上とすればよく、2mg/L以上が好ましい。 In step 1, halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas may be aerobically cultured under such culture conditions. Specifically, the dissolved oxygen concentration in the culture solution at the time of aerobic culture is not particularly limited, but is usually 0.5 mg / L or more, and preferably 2 mg / L or more.
工程1での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、ピルビン酸又はその塩を効率よく製造するには、本発明に係る方法によって用いる好塩菌が他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮して長期の連続培養も可能である。そして、培養環境も特に限定はされず、非滅菌環境下であっても滅菌環境下であってもよい。 Examples of the culture method in Step 1 include culture methods such as batch culture, semi-batch culture, and continuous culture, and are not particularly limited, but in order to efficiently produce pyruvic acid or a salt thereof, the method according to the present invention is used. Considering that the possibility of halophilic bacteria to be mixed with other bacteria is extremely low, long-term continuous culture is also possible. The culture environment is not particularly limited, and may be a non-sterile environment or a sterilized environment.
工程2について
本発明に係るピルビン酸又はその塩の製造方法における工程2は、培養液中に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも1つを添加する工程である。
工程2では、上記窒素源のみを添加してもよいし、更に金属塩及び/又はホウ酸塩を添加してもよい。窒素源並びに金属塩及び/又はホウ酸塩の添加時期は、同一であっても異なっていてもよく、特に限定はされないが、異なる場合は窒素源の添加の後に金属塩及び/又はホウ酸塩を添加することが好ましい。
In
なお、金属塩及びホウ酸塩を添加する際の添加時期は、同一であっても、異なっていてもよく、特に限定はされない。 In addition, the addition time at the time of adding a metal salt and a borate may be the same, may differ, and is not specifically limited.
窒素源は、上記工程1において詳述した通りとすればよい
金属塩は、特に限定はされないが、例えば亜鉛塩、モリブデン塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩等が挙げられる。これらの金属塩は適宜組み合わせて添加してもよく、特に限定はされないが、少なくともモリブデン塩を含む組み合わせとすることが好ましい。
The nitrogen source may be as described in detail in Step 1 above. The metal salt is not particularly limited, and examples thereof include zinc salts, molybdenum salts, manganese salts, copper salts, and cobalt salts. These metal salts may be added in combination as appropriate, and are not particularly limited, but a combination containing at least a molybdenum salt is preferable.
具体的にはモリブデン塩、亜鉛塩、マンガン塩、銅塩、及びコバルト塩を含む金属塩;モリブデン塩、銅塩を含む金属塩;モリブデン塩、亜鉛塩を含む金属塩;モリブデン塩、マンガン塩を含む金属塩;モリブデン塩、コバルト塩を含む金属塩等の組み合わせが挙げられる。 Specifically, metal salts including molybdenum salt, zinc salt, manganese salt, copper salt, and cobalt salt; metal salt including molybdenum salt and copper salt; metal salt including molybdenum salt and zinc salt; molybdenum salt and manganese salt Metal salt containing; Combinations, such as a metal salt containing a molybdenum salt and a cobalt salt, are mentioned.
ホウ酸塩は、特に限定はされないが例えばホウ酸(H3BO3)、メタホウ酸(HBO2)n、過ホウ酸(HBO3)、次ホウ酸(H4B2O4)、ボロン酸(H3BO2)、ボリン酸(H3BO)等が挙げられる。 The borate is not particularly limited. For example, boric acid (H 3 BO 3 ), metaboric acid (HBO 2 ) n , perboric acid (HBO 3 ), hypoboric acid (H 4 B 2 O 4 ), boronic acid (H 3 BO 2 ), borinic acid (H 3 BO) and the like.
工程2における、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも1つを添加する時期は、特に限定はされないが、例えば培養液のOD600の値が30以上となる時期にすればよい。好ましくは50以上である。
OD600の測定方法は、市販の分光光度計を用いて測定する。
The timing of adding at least one selected from the group consisting of a nitrogen source, a metal salt, and a borate in the
The measuring method of OD600 is measured using a commercially available spectrophotometer.
工程1における窒素源の添加量は、特に限定はされないが、通常は100重量部の培地に対して、硝酸ナトリウムとして0.1〜0.5重量部程度とすればよい。また、工程1における金属塩の添加量は、特に限定はされないが、通常は100重量部の培地に対して0.02〜0.250重量部程度とすればよい。そして、工程1におけるホウ酸塩の添加量も、特に限定はされないが、通常は100重量部の培地に対して0.143〜0.286重量部程度とすればよい。なお、金属塩及びホウ酸塩の添加量の合計は、100重量部の培地に対して通常は0.02〜0.286重量部程度とすればよい。 The amount of the nitrogen source added in step 1 is not particularly limited, but is usually about 0.1 to 0.5 parts by weight as sodium nitrate with respect to 100 parts by weight of the medium. The amount of the metal salt added in step 1 is not particularly limited, but is usually about 0.02 to 0.250 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the medium. The amount of borate added in step 1 is not particularly limited, but is usually about 0.143 to 0.286 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the medium. In addition, what is necessary is just to make the sum total of the addition amount of a metal salt and a borate normally about 0.02-0.286 weight part with respect to a 100 weight part culture medium.
窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される、少なくとも1つを添加する回数は、特に限定はされないが、通常は1〜5回程度とすればよい。複数回添加する場合、上述の培養条件下であれば、3〜24時間の間隔を空ければよい。 The number of times of adding at least one selected from the group consisting of a nitrogen source, a metal salt, and a borate is not particularly limited, but is usually about 1 to 5 times. In the case of adding a plurality of times, an interval of 3 to 24 hours may be left under the above-described culture conditions.
工程3について
本発明に係るピルビン酸又はその塩の製造方法における工程3は、上記工程1〜2によって得られた培養液から、ピルビン酸又はその塩を回収する工程である。ここで、回収とは工程1〜2によって得られる培養液中にピルビン酸又はその塩が存在している時に上述の工程2の培養を停止し、ピルビン酸又はその塩を含む培養液と、上記好塩菌体を分離すすればよい。
Step 3 Step 3 in the method for producing pyruvic acid or a salt thereof according to the present invention is a step of recovering pyruvic acid or a salt thereof from the culture solution obtained by the
なお、分離した菌体内からは、特許文献1〜3に記載の手法に従い、バイオポリマーPHB、3−ヒドロキシ酪酸等を回収することも可能である。 In addition, it is also possible to collect | recover biopolymer PHB, 3-hydroxybutyric acid, etc. from the isolate | separated microbial cell according to the method of patent documents 1-3.
具体的な分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記工程1〜2によって得られるハロモナス属に属する好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離手段を用いて培養液と前記好塩菌体を分離する方法等が挙げられる。
As a specific separation method, a known solid-liquid separation operation such as centrifugation or filtration may be employed. Further, the method for stopping the culture is not particularly limited. For example, a method for sterilizing halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas obtained by the
培養液中にピルビン酸又はその塩が含まれたまま培養をし続けて、特に培養条件が好気的になればなるほど、ハロモナス属に属する好塩菌体から培養液中に分泌されたピルビン酸又はその塩が、当該好塩菌体内に再度取り込まれて利用される傾向となり、培養液中のピルビン酸又はその塩が減少し、最終的には培養液からこれらが消失してしまうこともある。 Pyruvate secreted into the culture solution from the halobacteria belonging to the genus Halomonas, the more aerobic culture conditions are continued, while the culture solution contains pyruvic acid or its salt. Or the salt tends to be taken up again and used in the halophilic bacterium, and pyruvic acid or a salt thereof in the culture solution decreases and may eventually disappear from the culture solution. .
従って、培養液中にピルビン酸又はその塩が、培養液1L当たり10g以上存在しているときに、上記培養を停止することが好ましい。すなわち本発明の方法によると、上記培養液中に、培養液1L当たり10g以上のピルビン酸又はその塩を産生させることができる。 Therefore, it is preferable to stop the culture when 10 g or more of pyruvic acid or a salt thereof is present in 1 L of the culture solution. That is, according to the method of the present invention, 10 g or more of pyruvic acid or a salt thereof can be produced per 1 L of the culture solution in the culture solution.
培養液中のピルビン酸又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであり、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、継時的に培養液を採取し、これをHPLC、分析キット等による分析方法を供して、培養を停止する時間を決定することもできる。 The method for confirming the presence of pyruvic acid or its salt in the culture solution can vary depending on the bacterial species, medium components, culture conditions, etc., and is appropriately determined in consideration of these factors. For example, the culture solution can be collected over time and subjected to an analysis method using HPLC, an analysis kit, or the like to determine the time for stopping the culture.
また、ピルビン酸は酸性を示す化合物であることから、培養液のpHを継時的にモニタリングしながら、培養の際の培地のpHの低下を基準にして、ピルビン酸の存在を確認してもよい。 In addition, since pyruvic acid is an acidic compound, the presence of pyruvic acid can be confirmed on the basis of a decrease in the pH of the medium during culture while monitoring the pH of the culture solution over time. Good.
なお、回収されるピルビン酸の塩は、培養液中に含まれる無機塩に基づくナトリウム、カルシウム等のアルカリ金属;アルカリ土類金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。従って、ピルビン酸を製造するには、回収した培養液を塩析等の常法に供すればよい。 The recovered salt of pyruvic acid is recovered as an alkali metal salt reacted with an alkali metal such as sodium or calcium; an alkaline earth metal cation or the like based on an inorganic salt contained in the culture solution. Therefore, in order to produce pyruvic acid, the collected culture solution may be subjected to a conventional method such as salting out.
また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。これら以外の他の方法として、回収した培養液のpHを適宜変更して、所望のピルビン酸又はその塩のいずれかを精製工程に供してもよい。 Moreover, you may use the collect | recovered culture solution for a refinement | purification process by the column chromatography using a suitable column. As another method other than these, the pH of the collected culture solution may be changed as appropriate, and any desired pyruvic acid or a salt thereof may be subjected to the purification step.
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. Needless to say, the present invention is not limited to the examples.
本実施例では、ハロモナス属に属する好塩菌を用いたピルビン酸又はその塩を製造する方法について具体的に詳述する。 In this example, a method for producing pyruvic acid or a salt thereof using a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas will be specifically described in detail.
表1に示すSOT改5(Spirulina platensis Medium改5)を基本にした培地を用いた。この培地は、Spirulina platensis Medium(国立環境研究所のHP)であり、NaHCO3及びNa2CO3の量を調整し、窒素源のNaNO3を5倍に、リン源のK2HPO4を4倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のpHは9.4±0.1であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。 A medium based on SOT modified 5 (Spirulina platendium Medium modified 5) shown in Table 1 was used. This medium is Spirulina platendium Medium (HP of National Institute for Environmental Studies). The amount of NaHCO 3 and Na 2 CO 3 is adjusted, the nitrogen source NaNO 3 is increased 5 times, and the phosphorus source K 2 HPO 4 is 4 times. Adjusted to increase by a factor of two. The pH after adjusting the above medium was 9.4 ± 0.1, and it was used as it was without sterilization operation such as autoclave.
培養の際には、上述の培地に対してグルコースを適宜追加して用いた。 During the culture, glucose was appropriately added to the above medium.
<ピルビン酸又はその塩の測定>
本実施例における培養液にて生産されるピルビン酸又はその塩の測定は、BIO−RAD社Aminex HPX−87Hに添付に記載された分析条件に準拠し、検出には島津製作所RID−10A示差屈折率検出器を用いた方法にて行った。
<Measurement of pyruvic acid or its salt>
The measurement of pyruvic acid or its salt produced in the culture solution in this example is based on the analysis conditions described in the attached to BIO-RAD Aminex HPX-87H, and Shimadzu RID-10A differential refraction is used for detection. This was performed by a method using a rate detector.
簡略には、培養液を遠心分離して上清のみ採取し、50μL分取し、450μLの水を加えて10倍に希釈した。これを上記HPLCにて分析した、ピルビン酸の標品と比較した。また、「F−キット ピルビン酸」(株式会社J.K.インターナショナル)のキットでの測定値と、ガスクロマトグラフ装置での測定値が一致したことから、分析されたピークはピルビン酸であることが確認された。 Briefly, the culture broth was centrifuged to collect only the supernatant, 50 μL was collected, and 450 μL of water was added to dilute it 10 times. This was compared with the sample of pyruvic acid analyzed by the above HPLC. Moreover, since the measured value with the kit of "F-kit pyruvic acid" (JK International Co., Ltd.) and the measured value with a gas chromatograph apparatus corresponded, the analyzed peak may be pyruvic acid. confirmed.
<ハロモナス属に属する好塩菌のプレ培養>
ハロモナス属に属する好塩菌(ハロモナス・エスピーKM−1株を、プレート培養より、16.5mm径の試験管に5mlの上記SOT5改培地に炭素源として上述のグルコースではなく、1w/v%グルコースを加えて、37℃で1晩振盪培養した。
<Pre-culture of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas>
From the plate culture, halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas (Halomonas sp. KM-1 strain) were added to 5 ml of the above-mentioned SOT5 modified medium in a 16.5 mm diameter test tube as a carbon source instead of the above-mentioned glucose. Was added and cultured overnight at 37 ° C. with shaking.
<ハロモナス属に属する好塩菌の培養、サンプルの回収等>
製造例1
プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体0.2mlを、100ml容の三角フラスコに入れた上記SOT改5培地20mlに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、33℃で撹拌速度を200rpmとなる条件にて振盪培養し、12時間後から、およそ12時間おきに培養液を0.25mlずつ回収して、上清中のピルビン酸又はその塩の量を測定した。
<Cultivation of halophilic bacteria belonging to the genus Halomonas, sample recovery, etc.>
Production Example 1
The pre-cultured 0.2 ml of halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas was mixed with 20 ml of the above-mentioned SOT modified 5 medium placed in a 100 ml Erlenmeyer flask and inoculated to produce silicosene. This was cultured with shaking at 33 ° C. under a stirring speed of 200 rpm. After 12 hours, 0.25 ml of the culture solution was collected approximately every 12 hours, and pyruvate or its salt in the supernatant was recovered. The amount was measured.
培養当初は、撹拌速度を200rpmと好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、37℃で振盪培養を継続し、半回分培養した。 At the beginning of the culture, the culture was performed under an aerobic condition with a stirring speed of 200 rpm, and the culture solution was subjected to silicocene again after sampling, followed by shaking culture at 37 ° C. and culturing in half batch.
有機炭素源は、培養当初に10重量%のグルコースを培地し、18時間目、24時間目、36時間目それぞれに、5重量%のグルコースを添加した。 As the organic carbon source, 10% by weight of glucose was cultured at the beginning of the culture, and 5% by weight of glucose was added to each of the 18th, 24th and 36th hours.
さらに、窒素源として、培養当初に12.5g/Lの硝酸ナトリウムを添加し、培養開始から18時間目、24時間目、36時間目、48時間目、60時間目それぞれに、2.5g/Lの硝酸ナトリウム加えたものと、加えなかったものとを比較した。結果を図1及び2に示す。 Furthermore, as a nitrogen source, 12.5 g / L sodium nitrate was added at the beginning of the culture, and 2.5 g / L was added at the 18th, 24th, 36th, 48th and 60th hours from the start of the culture. A comparison was made between the L sodium nitrate added and the one not added. The results are shown in FIGS.
図1に示す菌体重量の結果から、硝酸ナトリウムの添加を行った場合も行わなかった場合も菌体重量には変化はなかった。 From the results of the cell weight shown in FIG. 1, there was no change in the cell weight whether or not sodium nitrate was added.
一方で、図2のピルビン酸分泌量の結果から、硝酸ナトリウムを加えなかった場合には、36時間目に分泌量の極大値18g/Lを示すのに対して、硝酸ナトリウムを逐次加えた場合には、60時間に分泌量の極大値40g/Lを超えた。 On the other hand, from the result of the amount of pyruvate secreted in FIG. 2, when sodium nitrate was not added, the maximum amount of secretion was 18 g / L at 36 hours, whereas sodium nitrate was added sequentially. The maximum value of secretion amount exceeded 40 g / L in 60 hours.
以上の結果から、好気培養中の適当な時期に硝酸ナトリウム等の適当な窒素源を添加することで、ピルビン酸の培養液中での産生量を増大させることができることが明らかとなった。 From the above results, it was revealed that the amount of pyruvic acid produced in the culture solution can be increased by adding an appropriate nitrogen source such as sodium nitrate at an appropriate time during the aerobic culture.
製造例2
培養当初は、撹拌速度を200rpmと好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、振盪培養を継続し、半回分培養した。
Production Example 2
At the beginning of the culture, the culture was performed under an aerobic condition with a stirring speed of 200 rpm, and the culture solution was sampled and then silicosene again, and the shaking culture was continued, followed by half-batch culture.
有機炭素源は、培養当初に15重量%のグルコースを培地し、24時間目、36時間目、48時間目それぞれに、5重量%のグルコースを添加した。 As an organic carbon source, 15% by weight of glucose was cultured at the beginning of the culture, and 5% by weight of glucose was added at 24, 36, and 48 hours, respectively.
窒素源として、培養当初に12.5g/Lの硝酸ナトリウムを添加し、培養開始から24時間目、36時間目、48時間目、60時間目、72時間目それぞれに、2.5g/Lの硝酸ナトリウム加えた。
さらに、培養温度を、33℃、37℃、40℃それぞれで行い、比較した。結果を図3及び4に示す。
As a nitrogen source, 12.5 g / L sodium nitrate was added at the beginning of the culture, and 2.5 g / L was added at 24 hours, 36 hours, 48 hours, 60 hours and 72 hours from the start of the culture. Sodium nitrate was added.
Furthermore, the culture temperatures were 33 ° C., 37 ° C., and 40 ° C., respectively. The results are shown in FIGS.
図3に示す菌体重量の結果から、36時間目以降、乾燥菌体重量は、33℃、37℃、40℃の順であり、特に40℃で培養したものは菌体重量の増加はほとんど見られなかった。 From the results of the cell weight shown in FIG. 3, after 36 hours, the dry cell weight is in the order of 33 ° C., 37 ° C., and 40 ° C. Especially, those cultured at 40 ° C. have almost no increase in cell weight. I couldn't see it.
一方で、図4のピルビン酸分泌量の結果から、36時間目以降に、40℃、37℃、33℃の順で、ピルビン酸の分泌が見られた。 On the other hand, from the result of the amount of pyruvate secreted in FIG. 4, the secretion of pyruvate was observed in the order of 40 ° C., 37 ° C., and 33 ° C. after the 36th hour.
以上の結果から、培養温度により、ピルビン酸の分泌量に変化が生じ、特に40℃では、生育が抑制された一方で、ピルビン酸が著しく速やかに分泌されることが確認され、温度によるピルビン酸の分泌量の影響があることが明らかとなった。 From the above results, it was confirmed that the amount of pyruvic acid secreted was changed by the culture temperature, and especially at 40 ° C., growth was suppressed while pyruvic acid was secreted extremely rapidly. It became clear that there was an influence on the amount of secretion.
製造例3 ハロモナス菌株による比較
培養当初は、撹拌速度を200rpm、培養温度37℃の好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、振盪培養を継続し、半回分培養した。用いた菌株は、Halomonos sp. KM−1、Halomons meridian:NBRC15608、Halomons pantelleriensis: ATCC700273、Halomonas campisalis:ATCC700597であった。
Production Example 3 At the beginning of comparative culture with Halomonas strains, culture was performed under aerobic conditions with a stirring speed of 200 rpm and a culture temperature of 37 ° C. Cultured. The strain used was Halomonos sp. KM-1, Halomons meridian: NBRC15608, Halomons pantererensis: ATCC7000027, Halomonas campisalis: ATCC7000059.
有機炭素源は、培養当初に15重量%のグルコースを培地し、Halomonos sp. KM−1、Halomons meridian:NBRC15608は24時間目、36時間目それぞれに、5重量%のグルコースを添加し、Halomons pantelleriensis : ATCC700273、Halomonas campisalis : ATCC700597は、24時間目に、5重量%のグルコースを添加した。 The organic carbon source is a medium containing 15% by weight of glucose at the beginning of culturing. KM-1, Halomons meridian: NBRC15608 added 5% by weight glucose at 24 and 36 hours respectively, Halomons panthelerensis: ATCC70000273, Halomonas campalisis: ATCC7000059 at 5% by weight of glucose at 24 hours. Added.
窒素源として、培養当初に12.5g/Lの硝酸ナトリウムを添加し、培養開始から24時間目、36時間目、48時間目それぞれに、2.5g/Lの硝酸ナトリウム加え比較した。結果を図5及び6に示す。 As a nitrogen source, 12.5 g / L sodium nitrate was added at the beginning of the culture, and 2.5 g / L sodium nitrate was added and compared at 24 hours, 36 hours, and 48 hours from the start of the culture. The results are shown in FIGS.
図5に示す菌体重量の結果から、Halomonos sp.KM−1、Halomons meridian:NBRC15608は24時間目には、30g/Lを超えた。Halomons pantelleriensis : ATCC700273、Halomonas campisalis : ATCC700597は、84時間目においても20g/Lを超えなかった。図6に示すピルビン酸分泌量の結果から、Halomonos sp.KM−1のみならず、Halomons meridian:NBRC15608も30g/L以上のピルビン酸を分泌することが判明した。また、Halomons pantelleriensis:ATCC700273、Halomonas campisalis:ATCC700597は、72時間目、84時間目において微量のピルビン酸を分泌した。 From the results of the cell weight shown in FIG. KM-1, Halomons meridian: NBRC15608 exceeded 30 g / L at 24 hours. Halomons pantereriosis: ATCC 700033 and Halomonas campisalis: ATCC 7000059 did not exceed 20 g / L even at 84 hours. From the results of pyruvic acid secretion shown in FIG. It was found that not only KM-1 but also Halomons meridian: NBRC15608 secreted 30 g / L or more of pyruvic acid. Moreover, Halomons panteleriensis: ATCC70000273 and Halomonas campisalis: ATCC70000597 secreted a trace amount of pyruvic acid at 72 hours and 84 hours.
以上の結果から、窒素添加、炭素過剰条件において、37℃培養を行った場合には、複数のハロモナス属の菌がピルビン酸を分泌することが明らかとなった。 From the above results, it was clarified that when culturing at 37 ° C. in a nitrogen-added and carbon-excess condition, a plurality of bacteria of the genus Halomonas secrete pyruvic acid.
Claims (7)
(1)ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程1、
(2)培養液中に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも1つを添加する工程2、
(3)工程2で得られる培養液から、ピルビン酸又はその塩を回収する工程3。 The manufacturing method of pyruvic acid or its salt including the following process (1)-(3):
(1) Step 1 of aerobically cultivating a halophilic bacterium belonging to the genus Halomonas in a medium containing an organic carbon source and an inorganic salt,
(2) Step 2 of adding at least one selected from the group consisting of a nitrogen source, a metal salt, and a borate to the culture solution,
(3) Step 3 for recovering pyruvic acid or a salt thereof from the culture solution obtained in Step 2.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014086578A JP6418628B2 (en) | 2014-04-18 | 2014-04-18 | Method for producing pyruvic acid using halomonas bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014086578A JP6418628B2 (en) | 2014-04-18 | 2014-04-18 | Method for producing pyruvic acid using halomonas bacteria |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015204769A true JP2015204769A (en) | 2015-11-19 |
JP6418628B2 JP6418628B2 (en) | 2018-11-07 |
Family
ID=54602212
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014086578A Active JP6418628B2 (en) | 2014-04-18 | 2014-04-18 | Method for producing pyruvic acid using halomonas bacteria |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6418628B2 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019017334A (en) * | 2017-07-20 | 2019-02-07 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Method for producing oxaloacetic acid using Halomonas bacteria |
JP2020513776A (en) * | 2017-01-10 | 2020-05-21 | コベストロ、ドイチュラント、アクチエンゲゼルシャフトCovestro Deutschland Ag | Biodegradation of aniline from high salinity environment using halophilic microorganisms |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011083204A (en) * | 2009-10-14 | 2011-04-28 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | Method for highly efficiently producing polyhydroxyalkanoate (phas) or the like with halophilic bacterium |
-
2014
- 2014-04-18 JP JP2014086578A patent/JP6418628B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011083204A (en) * | 2009-10-14 | 2011-04-28 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | Method for highly efficiently producing polyhydroxyalkanoate (phas) or the like with halophilic bacterium |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BIORESOUR. TECHNOL., vol. Vol. 140, JPN6017042205, 2013, pages p. 73-79 * |
BIORESOUR. TECHNOL., vol. Vol. 156, JPN6017042204, March 2014 (2014-03-01), pages p. 400-403 * |
FEMS MICROBIOL., vol. Vol. 276, JPN6017042207, 2007, pages p. 26-33 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020513776A (en) * | 2017-01-10 | 2020-05-21 | コベストロ、ドイチュラント、アクチエンゲゼルシャフトCovestro Deutschland Ag | Biodegradation of aniline from high salinity environment using halophilic microorganisms |
JP7058274B2 (en) | 2017-01-10 | 2022-04-21 | コベストロ、ドイチュラント、アクチエンゲゼルシャフト | Biodegradation of aniline from high salt environment using halophilic microorganisms |
JP2019017334A (en) * | 2017-07-20 | 2019-02-07 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Method for producing oxaloacetic acid using Halomonas bacteria |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6418628B2 (en) | 2018-11-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6281887B2 (en) | Method for producing 3-hydroxybutyric acid using Halomonas bacteria | |
JP5892507B2 (en) | A method for producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof. | |
Kawata et al. | Poly (3-hydroxybutyrate) production by isolated Halomonas sp. KM-1 using waste glycerol | |
Arasu et al. | Isolation and characterization of the new Klebsiella pneumoniae J2B strain showing improved growth characteristics with reduced lipopolysaccharide formation | |
Suzuki et al. | Ethanol production from glycerol-containing biodiesel waste by Klebsiella variicola shows maximum productivity under alkaline conditions | |
Seyfried et al. | Caloramator viterbensis sp. nov., a novel thermophilic, glycerol-fermenting bacterium isolated from a hot spring in Italy. | |
CN106133143B (en) | Process for producing esters of 3-hydroxypropionic acid | |
JP6384861B2 (en) | Method for producing 3-hydroxybutyric acid using Halomonas bacteria | |
JP6521243B2 (en) | Method for aerobically producing 3-hydroxybutyric acid or a salt thereof | |
JP6418628B2 (en) | Method for producing pyruvic acid using halomonas bacteria | |
JP2011083204A (en) | Method for highly efficiently producing polyhydroxyalkanoate (phas) or the like with halophilic bacterium | |
JP2009148211A (en) | Method for fermentatively producing d-arabitol and microorganism used for performance thereof | |
Kawata et al. | Taxonomic characterization and metabolic analysis of the Halomonas sp. KM-1, a highly bioplastic poly (3-hydroxybutyrate)-producing bacterium | |
JP6558767B2 (en) | Method for producing pyruvic acid using halomonas bacteria | |
JP6872952B2 (en) | Production method for producing poly 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid, or 3-hydroxybutyrate | |
JP5229904B2 (en) | Method for producing lactic acid and / or acetic acid by halophilic bacteria | |
JP4647391B2 (en) | Highly efficient production method of dicarboxylic acid by coryneform bacteria | |
CN111117906B (en) | Improved microbial culture method | |
Almalki | Production of medically important lactic acid by Lactobacillus Pentosus: A biological conversion method | |
JP6827242B2 (en) | Method for producing oxaloacetate using Halomonas | |
WO2012137771A1 (en) | Process for producing adipic acid | |
JP6840419B2 (en) | A method for producing γ-aminobutyric acid using Halomonas. | |
JP6945469B2 (en) | Method for producing acetoacetic acid | |
JP2012170385A (en) | METHOD FOR PRODUCING α-KETOGLUTAMIC ACID AND/OR GLUTAMIC ACID | |
JP2022144466A (en) | Novel microorganism and method for producing 3-hydroxybutyric acid |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161220 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161219 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20171011 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171212 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180403 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180531 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180601 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180905 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181004 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6418628 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |