JP2015172512A - Detection method of disease related autoantibody in biochemical sample, kit and detection device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法、キット及び検出装置に関する。 The present invention relates to a detection method, kit, and detection apparatus for a disease-related autoantibody in a biological sample.
疾患の存在や進行度の指標として、現在、生体試料中の様々な疾患関連抗原が測定されている。例えば、腫瘍マーカーとして、様々な腫瘍関連抗原が測定されている。しかしながら、癌患者では、腫瘍関連抗原が増加する前に、様々な腫瘍関連抗原に対する自己抗体が増加することが明らかにされてきた（例えば、非特許文献１〜３を参照）。そこで、腫瘍関連抗原を検出するよりも、腫瘍関連抗原に対する自己抗体を検出した方が癌の早期発見につながる場合がある。癌に限らず、他の疾患においても、疾患関連自己抗体（疾患関連抗原に対する自己抗体）は、疾患の早期発見につながる新たな疾患マーカーである。 Various disease-related antigens in biological samples are currently measured as indicators of the presence and progression of disease. For example, various tumor-associated antigens have been measured as tumor markers. However, it has been clarified that in cancer patients, autoantibodies against various tumor-associated antigens increase before tumor-associated antigens increase (see, for example, Non-Patent Documents 1 to 3). Therefore, detecting autoantibodies against tumor-associated antigens may lead to early detection of cancer rather than detecting tumor-associated antigens. In other diseases as well as cancer, disease-related autoantibodies (autoantibodies against disease-related antigens) are new disease markers that lead to early detection of diseases.
近年、腫瘍マーカーとして、血液中のｐ５３タンパク質に対する自己抗体を検出する検査方法が保険適用の対象として認可された。現在、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）のみによって行われている。 In recent years, a test method for detecting autoantibodies against p53 protein in blood as a tumor marker has been approved as a subject of insurance application. Currently, detection of autoantibodies against p53 protein is performed only by enzyme immunoassay (ELISA method).
しかしながら、発明者らは、ＥＬＩＳＡ法による疾患関連自己抗体の検出は、検出感度が不十分な場合があることを見出した。 However, the inventors have found that detection of disease-related autoantibodies by the ELISA method may have insufficient detection sensitivity.
そこで、本発明は、生体試料中の疾患関連自己抗体を、より高感度に検出することができる検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキット及び疾患関連自己抗体検出用検出装置を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a detection method that can detect a disease-related autoantibody in a biological sample with higher sensitivity. Another object of the present invention is to provide a kit for detecting a disease-related autoantibody in a biological sample and a detection apparatus for detecting a disease-related autoantibody.
本発明は以下の通りである。
（１）生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法であって、エバネッセント波励起蛍光法を用いることを特徴とする、検出方法。
（２）前記生体試料中の前記疾患関連自己抗体を、基板上に固定された疾患関連抗原と反応させる工程と、前記基板上に前記疾患関連抗原を介して捕捉された前記疾患関連自己抗体に結合する、蛍光物質で標識された二次抗体を反応させる工程と、前記基板上の蛍光物質をエバネッセント波により励起する工程と、前記基板上の蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む、（１）に記載の検出方法。
（３）前記蛍光物質で標識された二次抗体が、グロブリンタイプ又はサブクラス特異的に反応する、（２）に記載の検出方法。
（４）前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法。
（５）前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体である、（４）に記載の検出方法。
（６）前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体である、（５）に記載の検出方法。
（７）前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、（６）に記載の検出方法。
（８）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、（７）に記載の検出方法。
（９）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、（７）又は（８）に記載の検出方法。
（１０）エバネッセント波励起蛍光法を用いて、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキットであって、疾患関連抗原が固定された基板と、疾患関連自己抗体に対する抗体とを含む、キット。
（１１）前記疾患関連自己抗体に対する抗体が、蛍光物質で標識されている、（１０）に記載のキット。
（１２）前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体であり、前記疾患関連抗原が、難治性疾患関連抗原である、（１０）又は（１１）に記載のキット。
（１３）前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体であり、前記難治性疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、（１２）に記載のキット。
（１４）前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であり、前記腫瘍関連抗原が、ｐ５３タンパク質である、（１３）に記載のキット。
（１５）前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、（１４）に記載のキット。
（１６）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、（１５）に記載のキット。
（１７）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、（１５）又は（１６）に記載のキット。
（１８）疾患関連自己抗体検出用検出装置であって、疾患関連抗原が固定された基板と、前記基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段と、前記エバネッセント波により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段と、を備える、検出装置。
（１９）前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体であり、前記疾患関連抗原が難治性疾患関連抗原である（１８）に記載の検出装置。
（２０）前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体であり、前記難治性疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、（１９）に記載の検出装置。
（２１）前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であり、前記腫瘍関連抗原がｐ５３タンパク質である、（２０）に記載の検出装置。
（２２）前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、（２１）に記載の検出装置。
（２３）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、（２２）に記載の検出装置。
（２４）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、（２２）又は（２３）に記載の検出装置。
The present invention is as follows.
(1) A method for detecting a disease-related autoantibody in a biological sample, which comprises using an evanescent wave excitation fluorescence method.
(2) reacting the disease-related autoantibody in the biological sample with a disease-related antigen immobilized on a substrate; and the disease-related autoantibody captured on the substrate via the disease-related antigen. Reacting a bound secondary antibody labeled with a fluorescent material, exciting the fluorescent material on the substrate with an evanescent wave, detecting fluorescence emitted from the fluorescent material on the substrate, The detection method according to (1), comprising:
(3) The detection method according to (2), wherein the secondary antibody labeled with the fluorescent substance reacts in a globulin type or subclass-specific manner.
(4) The detection method according to any one of (1) to (3), wherein the disease-related autoantibody is an intractable disease-related autoantibody.
(5) The detection method according to (4), wherein the refractory disease-related autoantibody is a tumor-related autoantibody.
(6) The detection method according to (5), wherein the tumor-associated autoantibody is an autoantibody against p53 protein.
(7) The detection method according to (6), wherein the autoantibody against the p53 protein is an antibody against at least a part of the wild-type full-length p53 protein.
(8) The detection method according to (7), wherein at least a part of the wild-type full-length p53 protein is an N-terminal domain, a core domain, or a C-terminal domain of the wild-type full-length p53 protein.
(9) The detection method according to (7) or (8), wherein at least a part of the wild-type full-length p53 protein is a phosphorylation site or an acetylation site of the p53 protein.
(10) A kit for detecting a disease-related autoantibody in a biological sample using an evanescent wave excitation fluorescence method, comprising a substrate on which a disease-related antigen is immobilized, and an antibody against the disease-related autoantibody. kit.
(11) The kit according to (10), wherein the antibody against the disease-related autoantibody is labeled with a fluorescent substance.
(12) The kit according to (10) or (11), wherein the disease-related autoantibody is an intractable disease-related autoantibody, and the disease-related antigen is an intractable disease-related antigen.
(13) The kit according to (12), wherein the refractory disease-related autoantibody is a tumor-related autoantibody, and the refractory disease-related antigen is a tumor-related antigen.
(14) The kit according to (13), wherein the tumor-associated autoantibody is an autoantibody against p53 protein, and the tumor-associated antigen is p53 protein.
(15) The kit according to (14), wherein the autoantibody against the p53 protein is an antibody against at least a part of the wild-type full-length p53 protein.
(16) The kit according to (15), wherein at least a part of the wild-type full-length p53 protein is an N-terminal domain, a core domain, or a C-terminal domain of the wild-type full-length p53 protein.
(17) The kit according to (15) or (16), wherein at least a part of the wild-type full-length p53 protein is a phosphorylation site or an acetylation site of the p53 protein.
(18) A detection device for detecting a disease-related autoantibody, which is emitted from a substrate on which a disease-related antigen is fixed, irradiation means for generating an evanescent wave on the surface of the substrate, and a fluorescent material excited by the evanescent wave And a detecting means for detecting the emitted fluorescence.
(19) The detection device according to (18), wherein the disease-related autoantibody is an intractable disease-related autoantibody, and the disease-related antigen is an intractable disease-related antigen.
(20) The detection apparatus according to (19), wherein the refractory disease-related autoantibody is a tumor-related autoantibody, and the refractory disease-related antigen is a tumor-related antigen.
(21) The detection device according to (20), wherein the tumor-related autoantibody is an autoantibody against p53 protein, and the tumor-related antigen is p53 protein.
(22) The detection apparatus according to (21), wherein the autoantibody against the p53 protein is an antibody against at least a part of the wild-type full-length p53 protein.
(23) The detection device according to (22), wherein at least a part of the wild-type full-length p53 protein is an N-terminal domain, a core domain, or a C-terminal domain of the wild-type full-length p53 protein.
(24) The detection apparatus according to (22) or (23), wherein at least a part of the wild-type full-length p53 protein is a phosphorylation site or an acetylation site of the p53 protein.
本発明により、生体試料中の疾患関連自己抗体を、より高感度に検出することが可能な検出方法を提供することができる。また、本発明により、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキット及び疾患関連自己抗体検出用検出装置を提供することができる。 The present invention can provide a detection method capable of detecting a disease-related autoantibody in a biological sample with higher sensitivity. In addition, according to the present invention, a kit for detecting a disease-related autoantibody in a biological sample and a detection device for detecting a disease-related autoantibody can be provided.
［生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法］
１実施形態において、本発明は、生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法であって、エバネッセント波励起蛍光法を用いることを特徴とする、検出方法を提供する。
[Method for detecting disease-related autoantibodies in biological samples]
In one embodiment, the present invention provides a method for detecting a disease-related autoantibody in a biological sample, characterized by using an evanescent wave excitation fluorescence method.
（エバネッセント波励起蛍光法）
例えばガラス基板に入射する励起光の入射角を大きくし、全反射を起こさせると、全反射面の逆側の界面からエバネッセント光と呼ばれる光が約数百ｎｍ滲みだす。エバネッセント波励起蛍光法とは、この原理を応用した蛍光検出方法であり、エバネッセント場に蛍光色素を置いて、エバネッセント光で蛍光を励起することにより、ガラス基板の表面付近に存在する蛍光色素だけが蛍光を発し、蛍光観察における背景光を劇的に減らすことができる検出方法である。
(Evanescent wave excitation fluorescence method)
For example, when the incident angle of the excitation light incident on the glass substrate is increased to cause total reflection, light called evanescent light oozes out about several hundred nm from the opposite interface of the total reflection surface. The evanescent wave excitation fluorescence method is a fluorescence detection method applying this principle. By placing the fluorescent dye in the evanescent field and exciting the fluorescence with the evanescent light, only the fluorescent dye existing near the surface of the glass substrate is obtained. This is a detection method that emits fluorescence and can dramatically reduce background light in fluorescence observation.
１実施形態において、上述の検出方法は、生体試料中の疾患関連自己抗体を、基板上に固定された疾患関連抗原と反応させる工程と、前記基板上に前記疾患関連抗原を介して捕捉された前記疾患関連自己抗体に結合する、蛍光物質で標識された二次抗体を反応させる工程と、前記基板上の蛍光物質をエバネッセント波により励起する工程と、前記基板上の蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む。疾患関連抗原は自己成分のみならず、菌体成分やウイルス抗原等、外来性分子であってもよい。 In one embodiment, the above-described detection method comprises a step of reacting a disease-related autoantibody in a biological sample with a disease-related antigen immobilized on a substrate, and captured on the substrate via the disease-related antigen. Reacting a secondary antibody labeled with a fluorescent substance that binds to the disease-related autoantibody, a step of exciting the fluorescent substance on the substrate with an evanescent wave, and a fluorescence emitted from the fluorescent substance on the substrate Detecting. The disease-related antigen may be not only a self-component but also a foreign molecule such as a bacterial cell component or a viral antigen.
生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物等が挙げられる。生体試料としては、例えば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、鼻孔液、唾液等が挙げられる。 Examples of the living body include humans and mammals other than humans. Examples of biological samples include blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, nasal fluid, saliva and the like.
疾患関連自己抗体とは、生体試料中に含まれる、疾患関連抗原に対する抗体を意味する。疾患関連自己抗体としては、グロブリンタイプ（クラス）が、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型、ＩｇＥ型の抗体が挙げられ、ＩｇＧ及びＩｇＡ型では、サブクラス特異的な抗体も挙げられる。 A disease-related autoantibody means an antibody against a disease-related antigen contained in a biological sample. Examples of the disease-related autoantibodies include antibodies whose globulin type (class) is IgG type, IgM type, IgA type, IgD type, IgE type, and IgG and IgA types also include subclass-specific antibodies.
疾患関連自己抗体を検出するための蛍光標識二次抗体には、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体が挙げられ、抗ヒトＩｇＧ及びＩｇＡ抗体では、それぞれのサブクラスに特異的に反応する抗体も挙げられる。 Fluorescently labeled secondary antibodies for detecting disease-related autoantibodies include fluorescently labeled anti-human IgG antibodies, anti-human IgM antibodies, anti-human IgA antibodies, anti-human IgD antibodies, and anti-human IgE antibodies. Human IgG and IgA antibodies also include antibodies that react specifically with each subclass.
二次抗体に標識される蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＡＭＣＡ、ＰｅｒＣＰ、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）、アロフィコエリトリン（ＡＰＣ）、テキサスレッド、プリンストンレッド、量子ドット、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等が挙げられる。 Fluorescent substances labeled with secondary antibodies include Cy3, Cy5, FITC, AMCA, PerCP, R-phycoerythrin (RPE), allophycoerythrin (APC), Texas Red, Princeton Red, quantum dots, and green fluorescent protein (GFP) Blue fluorescent protein (BFP), cyan fluorescent protein (CFP), yellow fluorescent protein (YFP), and the like.
（疾患関連抗原が固定された基板と生体試料とを接触させて、基板上に前記蛍光物質で標識された二次抗体を用いて疾患関連自己抗体を捕捉する工程）
基板は、エバネッセント波励起蛍光法用のものに、疾患関連抗原を固定したものである。基板としては、例えばガラスやプラスチック等の化成品が挙げられる。疾患関連抗原としては、悪性腫瘍の他、例えば厚生労働省が難病（難治性疾患）と指定する、消化器系疾患（潰瘍性大腸炎など）、呼吸器系疾患（特発性間質性肺炎など）、循環器系疾患（特発性拡張型心筋症など）、腎・泌尿器系疾患（ＩｇＡ腎症など）、血液系疾患（特発性血小板減少性紫斑病など）、免疫系疾患（全身性エリテマトーデスなど）、内分泌系疾患（クッシング症候群など）、代謝系疾患（アミロイドーシスなど）、神経・筋疾患（パーキンソン病関連疾患など）、皮膚・結合組織疾患（膿疱性乾癬など）、骨・関節系疾患（特発性大腿骨頭壊死症など）等で自己抗体が産生されるタンパク質が挙げられる。疾患関連抗原には、これらのタンパク質（自己成分）の他、例えば菌体成分やウイルス抗原等、外来性分子も含まれる。
(Step of contacting a biological sample with a substrate on which a disease-related antigen is immobilized, and capturing a disease-related autoantibody using a secondary antibody labeled with the fluorescent substance on the substrate)
The substrate is obtained by immobilizing a disease-related antigen on an evanescent wave excitation fluorescence method. Examples of the substrate include chemical products such as glass and plastic. Disease-related antigens include malignant tumors, gastrointestinal diseases (such as ulcerative colitis), respiratory diseases (such as idiopathic interstitial pneumonia) that the Ministry of Health, Labor and Welfare designates as intractable diseases (intractable diseases) , Cardiovascular diseases (such as idiopathic dilated cardiomyopathy), renal / urological diseases (such as IgA nephropathy), blood system diseases (such as idiopathic thrombocytopenic purpura), immune system diseases (such as systemic lupus erythematosus) , Endocrine diseases (such as Cushing's syndrome), metabolic diseases (such as amyloidosis), neurological / muscular diseases (such as Parkinson's disease-related diseases), skin / connective tissue diseases (such as pustular psoriasis), bone / joint diseases (idiopathic) And proteins that produce autoantibodies such as femoral head necrosis). In addition to these proteins (self-components), disease-related antigens include foreign molecules such as bacterial cell components and virus antigens.
自己抗体が産生される腫瘍関連抗原としては、例えばｐ５３、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１等、多くのタンパク質が挙げられる。疾患関連抗原は、生体試料から精製されたタンパク質であってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞等の宿主細胞内、又は、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等の無細胞発現系で発現された組換えタンパク質であってもよい。 Examples of tumor-associated antigens from which autoantibodies are produced include many proteins such as p53, HER2, CEA, and Cyclin B1. The disease-related antigen may be a protein purified from a biological sample, and is cell-free such as in E. coli, yeast, insect cells and other host cells, or in E. coli extract, rabbit reticulocyte extract, wheat germ extract, etc. It may be a recombinant protein expressed in an expression system.
腫瘍関連抗原を基板に固定する方法としては、物理吸着による方法、エポキシ基、スクシンイミド基やマレイミド基等の反応基を有する化学リンカーを使用する方法等が挙げられる。 Examples of the method for immobilizing a tumor-associated antigen on a substrate include a method using physical adsorption, a method using a chemical linker having a reactive group such as an epoxy group, a succinimide group, and a maleimide group.
疾患関連抗原が固定された基板と生体試料とを接触させると、生体試料中に含まれる疾患関連自己抗体が基板上に固定された疾患関連抗原に結合する。これによって、疾患関連自己抗体を基板上に捕捉することができる。次に、その抗体に結合する蛍光標識二次抗体を反応させる。 When the substrate on which the disease-related antigen is immobilized is brought into contact with the biological sample, the disease-related autoantibodies contained in the biological sample are bound to the disease-related antigen immobilized on the substrate. Thereby, disease-related autoantibodies can be captured on the substrate. Next, a fluorescently labeled secondary antibody that binds to the antibody is reacted.
（前記蛍光物質をエバネッセント波により励起する工程）
続いて、疾患関連自己抗体を介して、基板上に固定された蛍光標識二次抗体の蛍光物質をエバネッセント波により励起する。この工程には、例えば、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ １２００、グライコテクニカ社製）が使用できる。
(Step of exciting the fluorescent material with evanescent waves)
Subsequently, the fluorescent substance of the fluorescently labeled secondary antibody fixed on the substrate is excited by an evanescent wave through the disease-related autoantibody. In this step, for example, a fluorescence detection apparatus (trade name: GlycoStation (trademark) Reader 1200, manufactured by Glyco Technica) using an evanescent wave excitation fluorescence method can be used.
（蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程）
続いて、蛍光物質から放出された蛍光を検出する。エバネッセント波励起蛍光法は、測定が終始溶液状態で行なわれる均一系アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）であるため、検出工程中に洗浄等のＢ／Ｆ分離（Ｂｏｎｄ／Ｆｒｅｅ分離）操作が不要である。このため、例えば、結合力の弱い低親和性抗体の検出にも影響を与えない。Ｂ／Ｆ分離を組み入れた測定も可能であり、Ｂ／Ｆ分離で疾患関連抗原への結合に影響を受けないような中〜高親和性抗体の場合には、一層の高感度化が可能となる。血清サンプル中の疾患関連自己抗体量は、それに結合する蛍光標識二次抗体量に比例するため、蛍光強度を数値化し、疾患関連自己抗体を定量することができる。なお、ＥＬＩＳＡ法等の、固相化された抗体等を用いて反応、洗浄が行なわれる検出方法は、不均一系アッセイ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）と呼ばれる。
(Step of detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance)
Subsequently, the fluorescence emitted from the fluorescent material is detected. Since the evanescent wave excitation fluorescence method is a homogeneous assay in which the measurement is performed in a solution state throughout, a B / F separation (Bond / Free separation) operation such as washing is not required during the detection process. For this reason, for example, it does not affect the detection of a low-affinity antibody having a weak binding force. Measurement incorporating B / F separation is also possible, and in the case of medium to high affinity antibodies that are not affected by the binding to disease-related antigens by B / F separation, further enhancement of sensitivity is possible. Become. Since the amount of the disease-related autoantibody in the serum sample is proportional to the amount of the fluorescently labeled secondary antibody that binds to it, the fluorescence intensity can be quantified and the disease-related autoantibody can be quantified. A detection method in which a reaction or washing is performed using an immobilized antibody or the like, such as an ELISA method, is called a heterogeneous assay.
１実施形態において、疾患関連自己抗体は、難治性疾患関連自己抗体でもよいし、腫瘍関連自己抗体でもよい。また、腫瘍関連自己抗体は、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であってもよい。 In one embodiment, the disease-related autoantibody may be a refractory disease-related autoantibody or a tumor-related autoantibody. The tumor-related autoantibody may be an autoantibody against p53 protein.
（ｐ５３タンパク質）
ｐ５３タンパク質は、全長３９３アミノ酸からなり、Ｎ末端ドメイン、コアドメイン、Ｃ末端ドメインの３つの領域から構成されている。コアドメインはＤＮＡ結合に関与する領域であり、癌に認められるｐ５３タンパク質の変異のほとんどがこの領域に集中していることが知られている。
(P53 protein)
The p53 protein consists of a total length of 393 amino acids and is composed of three regions, an N-terminal domain, a core domain, and a C-terminal domain. The core domain is a region involved in DNA binding, and it is known that most of the mutations of the p53 protein found in cancer are concentrated in this region.
１実施形態において、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体は、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体であってもよい。多くの癌患者の血清サンプル中に検出される、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が認識する抗原エピトープ部位は、ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はＣ末端ドメインに存在することが知られている。そこで、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が認識する野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部は、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインであってもよい。ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１のアミノ酸配列のうち、１〜１０１残基がＮ末端ドメインであり、１０２〜２９２残基がコアドメインであり、２９３〜３９３残基がＣ末端ドメインである。 In one embodiment, the autoantibody against the p53 protein may be an antibody against at least a portion of the wild type full length p53 protein. It is known that the antigenic epitope site recognized by autoantibodies to p53 protein detected in serum samples of many cancer patients exists in the N-terminal domain or C-terminal domain of p53 protein. Therefore, at least a part of the wild-type full-length p53 protein recognized by the autoantibody against the p53 protein may be the N-terminal domain, core domain, or C-terminal domain of the wild-type full-length p53 protein. The amino acid sequence of the p53 protein is shown in SEQ ID NO: 1. Of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, residues 1 to 101 are the N-terminal domain, residues 102 to 292 are the core domain, and residues 293 to 393 are the C-terminal domain.
１実施形態において、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が認識する抗原エピトープ部位は、リン酸化やアセチル化などの修飾を受けた個所もあり得る。そこで、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が認識する野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部は、例えばリン酸化もしくはアセチル化等、修飾されたドメインであってもよい。 In one embodiment, the antigen epitope site recognized by the autoantibody against the p53 protein may be a site that has undergone modifications such as phosphorylation and acetylation. Therefore, at least a part of the wild-type full-length p53 protein recognized by the autoantibody against the p53 protein may be a modified domain such as phosphorylation or acetylation.
ｐ５３タンパク質は多彩な活性によって遺伝子の異常から生体を守る機能を担っている。ｐ５３タンパク質の機能としては、遺伝子に異常が発生した細胞における、遺伝子転写制御を介した細胞周期進行の制御、遺伝子修復酵素の活性化、アポトーシス誘導能等が挙げられる。ｐ５３遺伝子に突然変異が生じると、これらのｐ５３タンパク質の機能が欠損し、腫瘍の発生に至るというメカニズムが考えられている。 The p53 protein has a function of protecting a living body from gene abnormality by various activities. Examples of the function of the p53 protein include control of cell cycle progression through gene transcription control, activation of gene repair enzyme, and apoptosis-inducing ability in cells in which abnormality has occurred in the gene. It is considered that when a mutation occurs in the p53 gene, the function of these p53 proteins is lost, leading to tumor development.
大腸、胃、乳腺、肺、脳、食道等の多くのヒトの腫瘍において、ｐ５３遺伝子が突然変異を起こしていることが見出されている。また、多くの腫瘍組織においてｐ５３タンパク質の異常な蓄積が観察されている。さらに癌高発症家系において、ｐ５３遺伝子に変異が見られることが報告されている。 It has been found that the p53 gene is mutated in many human tumors such as the large intestine, stomach, mammary gland, lung, brain, and esophagus. In addition, abnormal accumulation of p53 protein has been observed in many tumor tissues. Furthermore, it has been reported that mutations are found in the p53 gene in families with high cancer incidence.
一方、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、腫瘍の徴候として、癌患者の血清中に見られることが知られている。ｐ５３タンパク質に対する自己抗体の出現とｐ５３遺伝子の変異には、非常に高い相関があることが示されている。また、正常細胞にはｐ５３タンパク質はごく微量しか存在しないが、ｐ５３遺伝子に突然変異が生じることにより、ｐ５３タンパク質の半減期が延長し、変異ｐ５３タンパク質が細胞核内に蓄積することが示唆されている。 On the other hand, it is known that autoantibodies against p53 protein are found in the serum of cancer patients as a sign of tumor. It has been shown that there is a very high correlation between the appearance of autoantibodies to the p53 protein and the mutation of the p53 gene. In addition, although there is only a very small amount of p53 protein in normal cells, it has been suggested that mutations in the p53 gene prolong the half-life of the p53 protein and accumulate the mutant p53 protein in the cell nucleus. .
［生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキット］
１実施形態において、本発明は、エバネッセント波励起蛍光法を用いて、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキットであって、疾患関連抗原が固定された基板と、疾患関連自己抗体に対する抗体とを含む、キットを提供する。
[Kit for detecting disease-related autoantibodies in biological samples]
In one embodiment, the present invention provides a kit for detecting a disease-related autoantibody in a biological sample using an evanescent wave excitation fluorescence method, comprising a substrate on which a disease-related antigen is immobilized, a disease-related autoantibody A kit is provided comprising an antibody against.
（抗疾患関連自己抗体に対する抗体）
上述したように、本実施形態に係るキットにおける疾患関連自己抗体に対する抗体は、蛍光物質で標識されていてもよい。また、上述したように、本キットにおける疾患関連自己抗体は、難治性疾患関連自己抗体であり、基板に固定された疾患関連抗原は難治性疾患関連抗原であってもよい。また、上述したように、本キットにおける難治性疾患関連自己抗体は、腫瘍関連自己抗体であり、基板に固定された疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原であってもよい。また、上述したように、本キットにおける腫瘍関連自己抗体は、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であり、基板に固定された腫瘍関連抗原は、ｐ５３タンパク質であってもよい。また、上述したように、本キットにおけるｐ５３タンパク質に対する自己抗体は、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体であってもよく、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部は、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインであってもよい。また、例えばリン酸化やアセチル化など、修飾されたものでもよい。
(Antibodies to anti-disease related autoantibodies)
As described above, the antibody against the disease-related autoantibody in the kit according to this embodiment may be labeled with a fluorescent substance. Further, as described above, the disease-related autoantibody in the kit may be an intractable disease-related autoantibody, and the disease-related antigen immobilized on the substrate may be an intractable disease-related antigen. Further, as described above, the refractory disease-related autoantibody in the kit may be a tumor-related autoantibody, and the disease-related antigen immobilized on the substrate may be a tumor-related antigen. Further, as described above, the tumor-related autoantibody in this kit is an autoantibody against p53 protein, and the tumor-related antigen immobilized on the substrate may be p53 protein. Further, as described above, the autoantibody against the p53 protein in this kit may be an antibody against at least a part of the wild-type full-length p53 protein, and at least a part of the wild-type full-length p53 protein It may be the N-terminal domain or core domain or C-terminal domain of the long p53 protein. Further, for example, it may be modified such as phosphorylation or acetylation.
本実施形態に係るキットは、生体試料や抗疾患関連自己抗体に対する抗体を希釈するための緩衝液を更に含んでいてもよい。 The kit according to the present embodiment may further include a buffer solution for diluting the antibody against the biological sample or the anti-disease related autoantibody.
［抗疾患関連自己抗体検出用検出装置］
１実施形態において、本発明は、疾患関連自己抗体検出用検出装置であって、疾患関連抗原が固定された基板と、前記基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段と、前記エバネッセント波により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段と、を備える、検出装置を提供する。
[Detection device for anti-disease-related autoantibody detection]
In one embodiment, the present invention provides a detection apparatus for detecting a disease-related autoantibody, a substrate on which a disease-related antigen is fixed, an irradiation unit that generates an evanescent wave on the surface of the substrate, and excited by the evanescent wave And a detecting means for detecting the fluorescence emitted from the fluorescent material.
検出装置は、疾患関連自己抗体検出用であり、疾患関連抗原は、難治性疾患関連抗原でもよい。また、検出装置は、腫瘍関連自己抗体検出用であり、疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原であってもよい。また、検出装置は、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体検出用であり、腫瘍関連抗原がｐ５３タンパク質であってもよい。また、本検出装置が検出対象とするｐ５３タンパク質に対する自己抗体は、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体であってもよい。また、本検出装置が検出対象とするｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、抗原として認識する、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部は、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインであってもよい。また、野生型完全長ｐ５３タンパク質が、例えばリン酸化やアセチル化など、修飾されたものでもよい。 The detection device is for detecting a disease-related autoantibody, and the disease-related antigen may be an intractable disease-related antigen. The detection device may be for detecting tumor-related autoantibodies, and the disease-related antigen may be a tumor-related antigen. The detection apparatus is for detecting autoantibodies against p53 protein, and the tumor-associated antigen may be p53 protein. In addition, the autoantibody against the p53 protein to be detected by the present detection apparatus may be an antibody against at least a part of the wild-type full-length p53 protein. Further, at least a part of the wild-type full-length p53 protein that is recognized as an antigen by the autoantibody against the p53 protein to be detected by this detection apparatus is the N-terminal domain, core domain, or C-terminal of the wild-type full-length p53 protein. It may be a domain. The wild-type full-length p53 protein may be modified, for example, by phosphorylation or acetylation.
（疾患関連抗原が固定された基板）
本実施形態の検出装置において、疾患関連抗原が固定された基板の材質、固定される疾患関連抗原、固定方法等は、上述した基板と同様であってもよい。
(Substrate on which disease-related antigen is immobilized)
In the detection apparatus of the present embodiment, the material of the substrate on which the disease-related antigen is fixed, the disease-related antigen to be fixed, the fixing method, and the like may be the same as those of the above-described substrate.
（基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段）
基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段（発生手段）としては、全反射によりエバネッセント波を発生させるものであればよい。このような照射手段として、具体的には、例えば、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ １２００、グライコテクニカ社製）のエバネッセント波照射部を使用することができる。エバネッセント波の光源としては、レーザー、ＬＥＤ、水銀ランプ、ハロゲンランプ等が挙げられる。照射するエバネッセント波の波長は、光源やダイクロックミラー、フィルター等を変更することにより、変更可能であることが好ましい。
(Irradiation means for generating evanescent waves on the surface of the substrate)
Any irradiation means (generating means) for generating evanescent waves on the surface of the substrate may be used as long as it generates evanescent waves by total reflection. Specifically, for example, an evanescent wave irradiation unit of a fluorescence detection device (trade name: GlycoStation (trademark) Reader 1200, manufactured by Glyco Technica) using an evanescent wave excitation fluorescence method can be used as such irradiation means. . Examples of the light source of the evanescent wave include a laser, an LED, a mercury lamp, and a halogen lamp. The wavelength of the evanescent wave to be irradiated is preferably changeable by changing a light source, a dichroic mirror, a filter, or the like.
（エバネッセント波により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段）
エバネッセント波の発生（照射）により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段としては、例えばＣＣＤカメラが挙げられる。検出装置は、基板の蛍光画像を取得し、基板上の特定のスポットの蛍光強度を数値化するプログラムを備えていてもよい。このような検出手段として、具体的には、例えば、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ １２００、グライコテクニカ社製）の蛍光検出部を使用することができる。
(Detection means for detecting the fluorescence emitted from the fluorescent material excited by the evanescent wave)
As a detection means for detecting the fluorescence emitted from the fluorescent material excited by the generation (irradiation) of the evanescent wave, for example, a CCD camera can be cited. The detection apparatus may include a program for acquiring a fluorescence image of the substrate and digitizing the fluorescence intensity of a specific spot on the substrate. Specifically, for example, a fluorescence detection unit of a fluorescence detection apparatus (trade name: GlycoStation (trademark) Reader 1200, manufactured by Glyco Technica) using an evanescent wave excitation fluorescence method can be used as such a detection means.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
［実験例１］
乳癌患者及び健常者を対象とし、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法でｐ５３タンパク質に対する自己抗体を検出し比較した。
[Experimental Example 1]
For breast cancer patients and healthy subjects, autoantibodies against p53 protein were detected and compared by ELISA and evanescent wave excitation fluorescence.
（ｐ５３タンパク質に対する自己抗体のＥＬＩＳＡ法による検出）
乳癌患者６４人から血清サンプルを採取した。これらの血清サンプル中に存在する、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。測定には、現在日常の臨床検査で使用されている測定キット（ＭＥＳＡＣＵＰ ａｎｔｉ−ｐ５３テスト、株式会社医学生物学研究所製）を使用した。野生型完全長ｐ５３タンパク質を固定化したプラスチックプレートのウェルに、検査対象の血清を添加して反応させ、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体でｐ５３タンパク質に対する自己抗体を検出した。
(Detection of autoantibodies against p53 protein by ELISA)
Serum samples were collected from 64 breast cancer patients. Autoantibodies against the p53 protein present in these serum samples were measured by ELISA. For the measurement, a measurement kit (MESACUP anti-p53 test, manufactured by Medical Biology Laboratory Co., Ltd.) currently used in daily clinical tests was used. Serum to be tested was added to the well of a plastic plate on which wild-type full-length p53 protein was immobilized and reacted, and autoantibodies against p53 protein were detected with a peroxidase-conjugated anti-human IgG antibody.
その結果、後述するように、６４サンプル中１０サンプルでｐ５３タンパク質に対する自己抗体が検出された。また、残りの５４サンプルからはｐ５３タンパク質に対する自己抗体が検出されなかった。 As a result, as described later, autoantibodies against p53 protein were detected in 10 out of 64 samples. In addition, autoantibodies against p53 protein were not detected from the remaining 54 samples.
（ｐ５３タンパク質に対する自己抗体のエバネッセント波励起蛍光法による検出）
上述したＥＬＩＳＡ法で検査対象としたものと同一の６４人の血清サンプルについて、エバネッセント波励起蛍光法によりｐ５３タンパク質に対する自己抗体を検出した。また、健常者２０人についても同様に測定し、カットオフ値をノンパラメトリックな９５パーセンタイルで設定した。
(Detection of autoantibodies against p53 protein by evanescent wave excitation fluorescence method)
Autoantibodies against p53 protein were detected by the evanescent wave excitation fluorescence method for the same 64 serum samples as those examined by the ELISA method described above. Further, 20 healthy subjects were measured in the same manner, and the cutoff value was set at a non-parametric 95th percentile.
まず、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ １２００、グライコテクニカ社製）用のガラス基板のウェルに、野生型完全長ｐ５３タンパク質（産業総合研究所、Ｅｎｔｒｙ ｃｌｏｎｅ ＩＤ；ＦＬＪ９２９４３ＡＡＡＦ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で４ｎＬずつスポット状に滴下し、基板上のエポシキ基とｐ５３タンパク質のアミノ基とを反応させ固定化した。続いて、ガラス基板を界面活性剤添加リン酸緩衝液で洗浄後、界面活性剤添加リン酸緩衝液にて１０倍希釈した上述の血清サンプルを１ウェルあたり１００μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた。続いて、１ウェルあたり１００μＬずつ、１００倍希釈したＣｙ３標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製、型番１０９−１６５−０９８）を添加し、室温で０．５時間反応させた。続いて、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ １２００、グライコテクニカ社製）でＣｙ３の蛍光を検出し、蛍光強度を数値化した。 First, a wild-type full-length p53 protein (Industry Research Institute, Entry Clone ID) is placed in a well of a glass substrate for a fluorescence detection apparatus (trade name: GlycoStation (trademark) Reader 1200, manufactured by Glyco Technica) using an evanescent wave excitation fluorescence method. FLJ92943AAAF) was added dropwise at a concentration of 10 μg / mL in 4 nL spots, and the epoxy group on the substrate and the amino group of the p53 protein were reacted and immobilized. Subsequently, after washing the glass substrate with a surfactant-added phosphate buffer, 100 μL of the above-mentioned serum sample diluted 10-fold with a surfactant-added phosphate buffer is added to each well and reacted at room temperature for 1 hour. I let you. Subsequently, 100 μL per well of 100-fold diluted Cy3-labeled goat anti-human IgG (Fc) antibody (Jackson, model number 109-165-098) was added and reacted at room temperature for 0.5 hour. Subsequently, the fluorescence of Cy3 was detected with a fluorescence detection apparatus (trade name: GlycoStation (trademark) Reader 1200, manufactured by Glyco Technica) using an evanescent wave excitation fluorescence method, and the fluorescence intensity was digitized.
図１は、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による、血清サンプル中のｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出結果をまとめたグラフである。２０００ＲＬＵ（相対蛍光単位）をカットオフ値とし、２０００ＲＬＵ以上の蛍光が検出されたサンプルを陽性、２０００ＲＬＵ未満の蛍光が検出されたサンプルを陰性と判断した。 FIG. 1 is a graph summarizing the detection results of autoantibodies against p53 protein in serum samples by ELISA and evanescent wave excitation fluorescence. A cut-off value was set to 2000 RLU (relative fluorescence unit), and a sample in which fluorescence of 2000 RLU or more was detected was judged as positive, and a sample in which fluorescence of less than 2000 RLU was detected was judged as negative.
表１は、図１と同じ結果を表にしたものである。ＥＬＩＳＡ法による検出結果が陰性でも、エバネッセント波励起蛍光法で測定すると陽性となる例が存在することが明らかとなった。 Table 1 tabulates the same results as FIG. Even if the detection result by the ELISA method is negative, it has been clarified that there is an example that becomes positive when measured by the evanescent wave excitation fluorescence method.
（ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出結果の相関）
上述したｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出結果について、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による検出結果の相関関係を検討した。図２及び図３は、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による検出結果の相関関係を示すグラフである。図２及び図３において、横軸は、ＥＬＩＳＡ法による検出結果を、抗体量（Ｕ／ｍＬ）で示したものであり、縦軸はエバネッセント波励起蛍光法で測定された蛍光の強度を、相対蛍光単位（ＲＬＵ）で示したものである。図２及び図３は、同一の検出結果を異なるスケールで示したものである。
(Correlation of detection results of autoantibodies against p53 protein by ELISA method and evanescent wave excitation fluorescence method)
About the detection result of the autoantibody with respect to p53 protein mentioned above, the correlation of the detection result by ELISA method and evanescent wave excitation fluorescence method was examined. 2 and 3 are graphs showing correlations between detection results obtained by the ELISA method and the evanescent wave excitation fluorescence method. 2 and 3, the horizontal axis indicates the detection result by ELISA method in the amount of antibody (U / mL), and the vertical axis indicates the intensity of fluorescence measured by the evanescent wave excitation fluorescence method. It is shown in fluorescence units (RLU). 2 and 3 show the same detection results on different scales.
その結果、ＥＬＩＳＡ法によりｐ５３タンパク質に対する自己抗体が高濃度に検出された血清サンプルは、エバネッセント波励起蛍光法でもｐ５３タンパク質に対する自己抗体が高濃度に検出されており、相関関係が認められた。また、ＥＬＩＳＡ法による検出結果が陰性の血清サンプルであっても、エバネッセント波励起蛍光法で測定すると蛍光強度が幅広く分布していることが示された。 As a result, serum samples in which autoantibodies against p53 protein were detected at a high concentration by ELISA method showed autoantibodies against p53 protein at a high concentration even by evanescent wave excitation fluorescence method, and a correlation was recognized. Moreover, even if it was a serum sample with the negative detection result by ELISA method, when it measured by the evanescent wave excitation fluorescence method, it was shown that the fluorescence intensity is widely distributed.
［実験例２］
（癌組織の免疫染色）
血清サンプル中のｐ５３タンパク質に対する自己抗体のＥＬＩＳＡ法による検出結果が陰性であり、エバネッセント波励起蛍光法による検出結果が陽性であった乳癌患者６例の癌組織を抗ｐ５３抗体で免疫染色し、ｐ５３の発現を検討した。癌組織の組織切片に、抗ヒトｐ５３抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＤＯ−７，ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ７００１，Ｄａｋｏ）を反応させた。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識高分子ポリマー試薬（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）＋Ｄｕａｌ Ｌｉｎｋ Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４０６１，Ｄａｋｏ）を二次抗体として反応させた。次に、３，３’−ジアミノベンジジン−４ＨＣｌ（ＤＡＢ）基質溶液（Ｓｔａｂｌｅ ＤＡＢ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＡ０１１８Ｌ，ファルマ）を反応させて発色させた。続いて、ヘマトキシリン染色を行い、光学顕微鏡で観察した。
[Experiment 2]
(Immunostaining of cancer tissue)
Immunostaining of cancer tissues of 6 breast cancer patients whose detection results by ELISA for autoantibodies against p53 protein in serum samples were negative and positive for detection by evanescent wave excitation fluorescence was performed with anti-p53 antibody. The expression of was examined. Anti-human p53 antibody (Clone: DO-7, cat. No. M7001, Dako) was reacted with a tissue section of cancer tissue. Subsequently, horseradish peroxidase-labeled high molecular weight polymer reagent (EnVision (trademark) + Dual Link System-HRP, cat. No. K4061, Dako) was reacted as a secondary antibody. Next, 3,3′-diaminobenzidine-4HCl (DAB) substrate solution (Stable DAB, cat. No. FA0118L, Pharma) was reacted to cause color development. Subsequently, hematoxylin staining was performed and observed with an optical microscope.
図４（ａ）及び（ｂ）は、血清中抗ｐ５３自己抗体がＥＬＩＳＡ法陰性、エバネッセント波励起蛍光法陽性例のそれぞれ異なる患者２例に由来する乳癌組織のｐ５３タンパク質に対する免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。「Ｎ」は、ヘマトキシリンで染色された核を示し、「ｐ５３」は、ＤＡＢの発色により検出されたｐ５３タンパク質を示す。図４の結果から、これらの組織では、ｐ５３タンパク質の発現が異常に上昇していることが確認された。すなわち、血清サンプル中のｐ５３タンパク質に対する自己抗体のＥＬＩＳＡ法による検出結果が陰性であり、エバネッセント波励起蛍光法による検出結果が陽性であった患者において、癌組織におけるｐ５３タンパク質の異常発現が確認され、エバネッセント波励起蛍光法による検出の有効性が確認された。加えて、図４に示す２例を含む同様の結果乖離例で免疫染色が可能だった合計６例は、すべて乳癌組織中でｐ５３タンパク質の異常発現が確認された。 4 (a) and 4 (b) show the results of immunostaining for p53 protein of breast cancer tissue derived from two different patients whose serum anti-p53 autoantibodies are ELISA-negative and evanescent-wave-excited fluorescence-positive cases, respectively. It is an optical micrograph. “N” indicates a nucleus stained with hematoxylin, and “p53” indicates a p53 protein detected by DAB color development. From the results of FIG. 4, it was confirmed that the expression of p53 protein was abnormally increased in these tissues. That is, in a patient in which the detection result of the autoantibody against the p53 protein in the serum sample is negative and the detection result by the evanescent wave excitation fluorescence method is positive, abnormal expression of the p53 protein in the cancer tissue is confirmed, The effectiveness of detection by the evanescent wave excitation fluorescence method was confirmed. In addition, in all of the 6 cases where immunostaining was possible in the similar result divergence cases including 2 cases shown in FIG. 4, abnormal expression of p53 protein was confirmed in all breast cancer tissues.
本発明により、抗ｐ５３タンパク質自己抗体検出での実験例で判るように、生体試料中の抗疾患関連自己抗体を、種々の微量抗体測定時汎用されているＥＬＩＳＡ法より、高感度に検出することが可能な検出方法を提供することができる。また、本発明により、生体試料中の抗疾患関連自己抗体を検出するためのキット及び抗疾患関連自己抗体検出用検出装置を提供することができる。 According to the present invention, anti-disease-related autoantibodies in biological samples can be detected with higher sensitivity than the ELISA method that is widely used for measuring various trace antibodies, as can be seen in the experimental examples of anti-p53 protein autoantibody detection. It is possible to provide a detection method capable of. In addition, the present invention can provide a kit for detecting anti-disease related autoantibodies in a biological sample and a detection apparatus for detecting anti-disease related autoantibodies.
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