JP2015165791A - L-lysine decarboxylative/oxidative enzyme and application thereof - Google Patents

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公安 礒部
Kimiyasu Isobe
公安 礒部
浅野 泰久
Yasuhisa Asano
泰久 浅野
大亮 松井
Daisuke Matsui
大亮 松井
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a L-lysine decarboxylative/oxidative enzyme having an extremely high substrate specificity to L-lysine and capable of measuring L-lysine in a sample containing a lot of impurities at a high accuracy, and measuring method of L-lysine using the enzyme; and to provide a L-lysine measuring kit and a L-lysine measurement enzyme sensor capable of being used in the measurement method and a new microorganism producing the new L-lysine decarboxylative/oxidative enzyme.SOLUTION: The L-lysine decarboxylative/oxidative enzyme of the present invention comprises a specific amino acid sequence.

Description

本発明は、L−リジンに対する基質特異性の高い新規なL−リジン脱炭酸/酸化酵素と、その利用方法などに関する。より詳しくは、本発明は、L−リジン脱炭素活性とL−リジン酸化活性の両方を有し、且つ、L−リジンに対する基質特異性の高い新規なL−リジン脱炭酸/酸化酵素、当該新規L−リジン脱炭酸/酸化酵素をコードする核酸、並びに、当該新規L−リジン脱炭酸/酸化酵素を用いるL−リジンの測定方法、当該測定方法に用いることができるL−リジン測定用キットおよびL−リジン測定用酵素センサ、また、当該新規L−リジン脱炭酸/酸化酵素を産生する新規微生物に関するものである。   The present invention relates to a novel L-lysine decarboxylase / oxidase having high substrate specificity for L-lysine, a method for using the same, and the like. More specifically, the present invention relates to a novel L-lysine decarboxylation / oxidase having both L-lysine decarbonization activity and L-lysine oxidation activity and high substrate specificity for L-lysine. Nucleic acid encoding L-lysine decarboxylation / oxidase, L-lysine measurement method using the novel L-lysine decarboxylation / oxidase, L-lysine measurement kit and L that can be used in the measurement method -An enzyme sensor for lysine measurement, and a novel microorganism that produces the novel L-lysine decarboxylation / oxidase.

L−リジンはタンパク質構成アミノ酸の一つであるが、体内で生成されない必須アミノ酸である。L−リジンを含むアミノ酸の濃度は、生体内では恒常性が維持されているが、先天性代謝異常や内臓疾患によりその血中濃度は大きく変動する。L−リジンに限らず、生体内のアミノ酸濃度の測定は、疾病を検出する有用な手段となり得る。このため、1種類もしくは多種類のアミノ酸の血中濃度を測定することにより、特定の疾病を検出することが可能となる(特許文献1および非特許文献1)。   L-lysine is one of the amino acids constituting the protein, but is an essential amino acid that is not produced in the body. Concentrations of amino acids containing L-lysine maintain homeostasis in vivo, but their blood concentrations vary greatly due to inborn errors of metabolism and visceral diseases. In addition to L-lysine, measurement of amino acid concentration in a living body can be a useful means for detecting a disease. For this reason, it becomes possible to detect a specific disease by measuring the blood concentration of one kind or many kinds of amino acids (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).

近年、アミノ酸の定量法として酵素を用いる方法が多数報告されている。酵素を用いる方法は、機器分析的手法と比べ、短時間に多数のサンプルの測定が可能であり、また安価で簡易的に行うことができる利点がある。定量用酵素としては、例えば、酸化酵素や脱水素酵素が多く用いられる。酸化酵素を用いる場合、アミノ酸に酸化酵素を作用させることで生成される過酸化水素をペルオキシダーゼで検出し、定量する方法が挙げられる(特許文献2)。この検出および定量には、比色法、蛍光法、電極法のいずれの方法も利用可能である。   In recent years, many methods using enzymes have been reported as amino acid quantification methods. The method using an enzyme has an advantage that a large number of samples can be measured in a short time compared to the instrumental analysis method, and can be easily performed at a low cost. As an enzyme for quantification, for example, an oxidase and a dehydrogenase are often used. In the case of using an oxidase, there is a method of detecting and quantifying hydrogen peroxide generated by allowing an oxidase to act on an amino acid with a peroxidase (Patent Document 2). For this detection and quantification, any of the colorimetric method, the fluorescence method, and the electrode method can be used.

L−リジンの定量法としても酵素を用いる方法が知られている。例えば、酸化酵素による定量には、L−リジンα−酸化酵素[EC1.4.3.14]が用いられてきた。トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)由来のL−リジンα−酸化酵素は、他のL−アミノ酸酸化酵素に比べて基質特異性が高く、市販もされていることから、酵素センサなどの素子に利用されてきた(非特許文献2,非特許文献3および非特許文献4)。しかし、本酵素は数種類の他のアミノ酸にも僅かながら作用することが報告されている。   A method using an enzyme is also known as a method for quantifying L-lysine. For example, L-lysine α-oxidase [EC1.4.3.14] has been used for quantification by oxidase. L-lysine α-oxidase derived from Trichoderma viride has a higher substrate specificity than other L-amino acid oxidases and is commercially available, so it is used for elements such as enzyme sensors. (Non-patent document 2, Non-patent document 3 and Non-patent document 4). However, it has been reported that this enzyme acts slightly on several other amino acids.

また、海洋バクテリアであるマリノモナス・メディテラネア(Marinomonas mediterranea)NBRC103028T株由来のL−リジンε−酸化酵素[EC1.4.3.20]を用いたL−リジン定量方法も報告されている(特許文献3および非特許文献4)。この酵素は、L−リジンに加え、僅かながらL−オルニチンを基質とする。 In addition, a method for quantifying L-lysine using L-lysine ε-oxidase [EC1.4.3.20] derived from a marine bacterium Marinomonas mediteranea NBRC 103028 T strain has also been reported (Patent Literature). 3 and Non-Patent Document 4). This enzyme uses L-ornithine as a substrate in addition to L-lysine.

また、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)由来のL−リジンモノオキシゲナーゼ[EC1.13.12.2]にL−リジン酸化酵素活性があるという報告がある(非特許文献6および非特許文献7)。この酵素は、L−リジン、L−オルニチン、L−アルギニンを基質とする。   In addition, there is a report that L-lysine monooxygenase [EC1.13.12.2] derived from Pseudomonas fluorescens has L-lysine oxidase activity (Non-patent Documents 6 and 7). . This enzyme uses L-lysine, L-ornithine, and L-arginine as substrates.

国際公開第2006/129513号パンフレットInternational Publication No. 2006/129513 Pamphlet 特開昭55−43409号公報JP-A-55-43409 特開2011−43396号公報JP 2011-43396 A

Anal.Chem.,81,pp.307−314(2009)Anal. Chem. , 81, pp. 307-314 (2009) Sens.Actuators,B,126,pp.424−430(2007)Sens. Actuators, B, 126, pp. 424-430 (2007) Anal.Bioanal.Chem.,391,pp.1255−1261(2008)Anal. Bioanal. Chem. , 391, pp. 1255-1261 (2008) Anal.Bioanal.Chem.,406,pp.19−23(2010)Anal. Bioanal. Chem. , 406, pp. 19-23 (2010) Appl.Microbiol.Biotechnol.,DOI 10.1007/S00253−00013−05168−00253(2013)Appl. Microbiol. Biotechnol. , DOI 10.1007 / S00253-00013-05168-00253 (2013) J.Biol.Chem.,249,pp.2579−2586(1974)J. et al. Biol. Chem. , 249, pp. 2579-2586 (1974) J.Biol.Chem.,249,pp.2587−2592(1974)J. et al. Biol. Chem. , 249, pp. 2587-2592 (1974)

上述したように、様々な微生物に由来するL−リジン酸化酵素が知られているが、アミノ酸の中でL−リジンに対してのみ作用する酸化酵素はなく、L−リジン以外のアミノ酸も酸化することから、L−リジンの定量に使用した場合、例えば、特に血漿のように様々な化合物を含む検体中のL−リジンを正確に測定できるものではなかった。   As described above, L-lysine oxidase derived from various microorganisms is known, but there is no oxidase that acts only on L-lysine among amino acids, and amino acids other than L-lysine are also oxidized. Therefore, when used for quantification of L-lysine, for example, L-lysine in a specimen containing various compounds such as plasma was not accurately measured.

そこで本発明は、L−リジンに対する基質特異性が極めて高く、夾雑物を多く含む検体におけるL−リジンも高い正確性をもって測定が可能になるL−リジン脱炭酸/酸化酵素と、当該酵素を用いたL−リジンの測定方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該測定方法に用いることができるL−リジン測定用キットおよびL−リジン測定用酵素センサ、また、当該新規L−リジン脱炭酸/酸化酵素を産生する新規微生物を提供することも目的とする。   Therefore, the present invention uses an L-lysine decarboxylase / oxidase that has a very high substrate specificity for L-lysine and that can measure L-lysine in a sample containing a large amount of impurities with high accuracy, and the enzyme. It is an object of the present invention to provide a method for measuring L-lysine. The present invention also provides an L-lysine measurement kit and an L-lysine measurement enzyme sensor that can be used in the measurement method, and a novel microorganism that produces the novel L-lysine decarboxylase / oxidase. Also aimed.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、L−リジンに対する基質特異性が極めて高い上に、脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方を有する新規酵素を見出した。本発明者らは、当該酵素を用いれば、血漿など夾雑物を多く含む検体におけるL−リジンも高い正確性をもって測定できることを見出した。   The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems. As a result, a novel enzyme having both a decarboxylase activity and an oxidase activity as well as a substrate specificity for L-lysine was found. The present inventors have found that when the enzyme is used, L-lysine in a sample containing a large amount of contaminants such as plasma can also be measured with high accuracy.

本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、下記の(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を有し、且つL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有するアミノ酸配列;
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、且つL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。
The L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention has any one of the following amino acid sequences (1) to (3).
(1) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(2) an amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of 1 to several amino acids and having L-lysine decarboxylase / oxidase activity in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(3) An amino acid sequence having 95% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having L-lysine decarboxylation / oxidase activity.

上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素は、バークホルデリア(Burkholderia)属細菌から、特にバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株(受託番号:NITE P−01796)から得ることができる。   The L-lysine decarboxylation / oxidase can be obtained from bacteria belonging to the genus Burkholderia, in particular from Burkholderia sp. AIU395 strain (accession number: NITE P-01796).

本発明に係る核酸は、下記の(1’)〜(3’)の何れかの塩基配列を有することを特徴とするものであり、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の製造に利用することができる。
(1’)配列番号1に記載の塩基配列
(2’)配列番号1に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換および/または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有する塩基配列
(3’)配列番号1に記載の塩基配列に対して95%以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有する塩基配列。
The nucleic acid according to the present invention has any one of the following base sequences (1 ′) to (3 ′), and is used for the production of the L-lysine decarboxylase / oxidase. Can do.
(1 ′) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (2 ′) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has one to several base deletions, substitutions and / or additions, and the nucleotide sequence is The base sequence in which the encoded protein has L-lysine decarboxylation / oxidase activity (3 ′) has a homology of 95% or more with respect to the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and the base sequence encodes A base sequence in which a protein has L-lysine decarboxylation / oxidase activity.

また、本発明に係る形質転換体は、上記核酸を含むことを特徴とする。   Moreover, the transformant according to the present invention is characterized by containing the above-described nucleic acid.

本発明に係るL−リジンの測定方法は、検体中のL−リジンを測定する方法であって、
(A)必要に応じて、L−リジンの量が明らかな複数の試料につき以降と同様の工程を行い、当該L−リジン量と下記工程(D)で計測すべき反応生成物の量との関係を明らかにしておく工程;
(B)必要に応じて、検体にプトレシン酸化酵素を作用させることにより検体中のカダベリンを酸化する工程;
(C)検体に上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素を作用させる工程;および
(D)上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする。
The method for measuring L-lysine according to the present invention is a method for measuring L-lysine in a specimen,
(A) If necessary, the same steps as described above are performed for a plurality of samples in which the amount of L-lysine is clear, and the amount of L-lysine and the amount of the reaction product to be measured in the following step (D) The process of clarifying the relationship;
(B) A step of oxidizing cadaverine in the specimen by allowing putrescine oxidase to act on the specimen, if necessary;
(C) a step of causing the L-lysine decarboxylase / oxidase to act on the specimen; and (D) a step of measuring at least one amount of a reaction product resulting from the action of the L-lysine decarboxylase / oxidase. It is characterized by.

上記工程(C)においては、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の作用により生成するカダベリンをプトレシン酸化酵素により酸化し、且つ、上記工程(D)において、反応生成物である過酸化水素の量を計測することが好ましい。かかる態様により、検体中のL−リジンをより一層正確に測定することが可能になる。   In the step (C), cadaverine produced by the action of the L-lysine decarboxylation / oxidase is oxidized by putrescine oxidase, and the amount of hydrogen peroxide as a reaction product in the step (D) Is preferably measured. Such an embodiment makes it possible to more accurately measure L-lysine in a specimen.

上記プトレシン酸化酵素としては、コクリア ロゼア(Kokuria rosea)NBRC 3768株由来のものが好ましい。かかるプトレシン酸化酵素の作用効果は、本発明者らの実験により確認されている。   The putrescine oxidase is preferably derived from Kokuria rosea NBRC 3768 strain. The effect of such putrescine oxidase has been confirmed by experiments of the present inventors.

本発明に係るL−リジン測定用キットは、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素を含むことを特徴とする。   The kit for measuring L-lysine according to the present invention is characterized by comprising the above-mentioned L-lysine decarboxylation / oxidase.

当該L−リジン測定用キットとしては、さらにプトレシン酸化酵素を含むもの、また、ペルオキシダーゼと発色試薬を含む過酸化水素検出用試薬を含むものが好ましい。   As the L-lysine measurement kit, a kit further containing putrescine oxidase, or a kit containing a hydrogen peroxide detection reagent containing peroxidase and a coloring reagent is preferable.

本発明に係る酸素センサは、L−リジンを測定するための酵素センサであって、過酸化水素検出用電極を有し、当該過酸化水素検出用電極の表面または近傍に上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素が配置されていることを特徴とする。   The oxygen sensor according to the present invention is an enzyme sensor for measuring L-lysine, and has an electrode for hydrogen peroxide detection, and the L-lysine decarboxylation is formed on or near the surface of the hydrogen peroxide detection electrode. / It is characterized in that an oxidase is arranged.

また、本発明は、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素を産生するバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株(受託番号:NITE P−01796)にも関する。   The present invention also relates to Burkholderia sp. AIU395 strain (Accession No .: NITE P-01796) that produces the L-lysine decarboxylation / oxidase.

本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、L−リジンに対する基質特異性が非常に高い。よって、このL−リジン脱炭酸/酸化酵素を用いることで、他のアミノ酸など多くの夾雑物を含む検体においても、L−リジンを特異的に迅速かつ簡便に測定することが可能である。特に、血漿、血清、尿のような生体試料に対し本発明は有効である。   The L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention has a very high substrate specificity for L-lysine. Therefore, by using this L-lysine decarboxylation / oxidase, L-lysine can be specifically and rapidly measured even in a sample containing many impurities such as other amino acids. In particular, the present invention is effective for biological samples such as plasma, serum, and urine.

図1は、バークホルデリア(Burkholderia)属の16SrDNA塩基配列に基づく簡易分子系統樹である。図1中のSIID13564は、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株を示す。左下の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数値はブートストラップ値、株名の末尾のTはその種の規準株(Type strain)を示す。FIG. 1 is a simplified molecular phylogenetic tree based on the 16S rDNA base sequence of the genus Burkholderia. SID13564 in FIG. 1 indicates the Burkholderia sp. AIU395 strain. The lower left line is the scale bar, the numerical value located at the branch of the phylogenetic branch is the bootstrap value, and T at the end of the stock name indicates the type strain of that kind. 図2は、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株の生理・生化学性状試験の結果を表わす図である。図2(1)は結果を示し、図2(2)は試験項目の説明を示す。FIG. 2 is a diagram showing the results of physiological and biochemical property tests of Burkholderia sp. AIU395 strain. FIG. 2 (1) shows the results, and FIG. 2 (2) shows the test items. 図3は、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株の培養曲線と、L−リジン脱炭酸/酸化酵素の活性の経時的変化を表わす図である。●はL−リジン酸化酵素活性、■は菌株の生育曲線(OD660nm)、▲は培地のpHを示す。FIG. 3 is a diagram showing the culture curve of Burkholderia sp. AIU395 strain and the change over time in the activity of L-lysine decarboxylase / oxidase. ● indicates L-lysine oxidase activity, ■ indicates the growth curve of the strain (OD660 nm), and ▲ indicates the pH of the medium. 図4は、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株由来のL−リジン脱炭酸/酸化酵素のNative−PAGE(A)とSDS−PAGE(B)の写真である。なお(C)は分子量マーカーを示す。FIG. 4 is a photograph of Native-PAGE (A) and SDS-PAGE (B) of L-lysine decarboxylation / oxidase derived from Burkholderia sp. AIU395 strain. In addition, (C) shows a molecular weight marker. 図5は、精製酵素の吸収スペクトルを表わす図である。横軸が吸収波長、縦軸が吸光度値を示している。FIG. 5 is a diagram showing the absorption spectrum of the purified enzyme. The horizontal axis indicates the absorption wavelength, and the vertical axis indicates the absorbance value. 図6は、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株由来のL−リジン脱炭酸/酸化酵素の活性と安定性に対するpHの影響、並びに、コクリア ロゼア(Kokuria rosea)NBRC 3768株由来プトレシン酸化酵素の活性に対するpHの影響を示している。●は30℃での各pHにおけるL−リジン酸化酵素活性、○は各pHにおいて30℃で30分間加温した後の残存活性、▲はプトレシン酸化酵素のカダベリン酸化酵素活性に対するpHの影響を示している。FIG. 6 shows effects of pH on the activity and stability of L-lysine decarboxylase / oxidase derived from Burkholderia sp. Strain AIU395, and putrescine oxidation from Kokuria rosea NBRC 3768 strain. Figure 2 shows the effect of pH on enzyme activity. ● indicates L-lysine oxidase activity at each pH at 30 ° C, ○ indicates residual activity after heating at 30 ° C for 30 minutes at each pH, and ▲ indicates the effect of pH on cadaverine oxidase activity of putrescine oxidase ing. 図7は、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株由来のL−リジン脱炭酸/酸化酵素の温度による影響を示している。○は各温度でのL−リジン酸化酵素活性を示し、●は各温度で30分間加温した後の残存活性を示している。FIG. 7 shows the influence of the temperature of L-lysine decarboxylation / oxidase derived from Burkholderia sp. AIU395 strain. ○ indicates the L-lysine oxidase activity at each temperature, and ● indicates the residual activity after heating at each temperature for 30 minutes. 図8は、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株由来のL−リジン脱炭酸/酸化酵素と、バークホルデリア(Burkholderia)属細菌および大腸菌(Escherichia coli)由来の塩基性アミノ酸脱炭酸酵素とのアミノ酸配列のアライメントを示している。FIG. 8 shows L-lysine decarboxylation / oxidase derived from Burkholderia sp. Strain AIU395 and basic amino acid decarboxylase derived from bacteria belonging to the genus Burkholderia and Escherichia coli. The alignment of the amino acid sequence is shown. 図9は、1.0mLの反応液において、1.0mM L−リジンを基質としてL−リジン脱炭酸/酸化酵素添加量を変えて20分間反応させ、比色法で555nmの吸光度を測定した結果を示している。FIG. 9 shows the results of measuring the absorbance at 555 nm by a colorimetric method in a 1.0 mL reaction solution, using 1.0 mM L-lysine as a substrate and changing the amount of L-lysine decarboxylation / oxidase added for 20 minutes. Is shown. 図10は、1.0mLの反応液において、0〜1.0mM L−リジンを基質としてL−リジン脱炭酸/酸化酵素を1.3mU添加して555nmの吸光度を測定した結果を示している。FIG. 10 shows the results of measuring absorbance at 555 nm by adding 1.3 mU of L-lysine decarboxylation / oxidase using 0-1.0 mM L-lysine as a substrate in a 1.0 mL reaction solution. 図11は、1.0mLの反応液において、60μMのカダベリンを基質としてプトレシン酸化酵素(PUO)の添加量を変えて20分間または30分間反応させ、比色法で555nmの吸光度を測定した結果を示している。FIG. 11 shows the results of measuring absorbance at 555 nm by a colorimetric method in a reaction solution of 1.0 mL by changing the amount of putrescine oxidase (PUO) added using 60 μM cadaverine as a substrate and changing the amount of putrescine oxidase (PUO). Show. 図12は、1.0mLの反応液において、60μMのL−リジンを基質としてプトレシン酸化酵素(PUO)量を200mUに固定して、L−リジン脱炭酸/酸化酵素の添加量を変えて反応させ、比色法で555nmの吸光度を測定した結果を示している。FIG. 12 shows that in a 1.0 mL reaction solution, the amount of putrescine oxidase (PUO) was fixed to 200 mU using 60 μM L-lysine as a substrate, and the reaction was performed by changing the amount of L-lysine decarboxylation / oxidase added. The results of measuring the absorbance at 555 nm by a colorimetric method are shown. 図13は、1.0mLの反応液において、濃度0〜60μMのリジンに対してL−リジン脱炭酸/酸化酵素(1.5mU)とプトレシン酸化酵素(200mU)を添加して30分間反応させた後、比色法で555nmの吸光度を測定した結果を示している。FIG. 13 shows that in a 1.0 mL reaction solution, L-lysine decarboxylase / oxidase (1.5 mU) and putrescine oxidase (200 mU) were added to lysine at a concentration of 0 to 60 μM and reacted for 30 minutes. Thereafter, the results of measuring the absorbance at 555 nm by a colorimetric method are shown. 図14は、1.0mLの反応液において、60μMカダベリンと濃度0〜60μMのL−リジンを含む溶液に、プトレシン酸化酵素(200mU)と発色液I(ペルオキシダーゼと4−アミノアンチピリン)を添加して反応させ(Reaction I)、次いで、発色液II(TOOS)とL−リジン脱炭酸/酸化酵素(2.3mU)を添加して反応させ(Reaction II)、555nmの吸光度を30分間測定した結果を示している。(1)は経時的な吸光度変化を示し、(2)のグラフの横軸はL−リジン濃度を、縦軸は吸光度変化量を示している。FIG. 14 shows that in a 1.0 mL reaction solution, putrescine oxidase (200 mU) and chromogenic solution I (peroxidase and 4-aminoantipyrine) were added to a solution containing 60 μM cadaverine and L-lysine at a concentration of 0 to 60 μM. Reaction (Reaction I), followed by addition of Coloring Solution II (TOOS) and L-lysine decarboxylase / oxidase (2.3 mU) for reaction (Reaction II), and measurement of absorbance at 555 nm for 30 minutes. Show. (1) shows the change in absorbance over time, the horizontal axis of the graph of (2) shows the L-lysine concentration, and the vertical axis shows the change in absorbance.

以下、先ず、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素について説明する。   Hereinafter, first, the L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention will be described.

<L−リジン脱炭酸/酸化酵素>
本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、L−リジンに対する基質特異性が極めて高い。具体的には、5−ヒドロキシ−DL−リジンとジアミン有機化合物であるカダベリンに僅かな酸化酵素活性を示す以外、L−アルギニン、L−オルニチン、L−チロシン、L−アラニン、L−システイン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−メチオニン、L−アスパラギン、L−プロリン、L−グルタミン、L−アルギニン、L−セリン、L−スレオニン、L−バリンに対しては、全く活性を示さない。よって、本発明のL−リジン脱炭酸/酸化酵素を用いることにより、血漿など様々なアミノ酸などが含まれ得る生体試料などにおいてもL−リジンを正確に測定することが可能になる。
<L-lysine decarboxylation / oxidase>
The L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention has extremely high substrate specificity for L-lysine. Specifically, L-arginine, L-ornithine, L-tyrosine, L-alanine, L-cysteine, L, except that 5-hydroxy-DL-lysine and cadaverine which is a diamine organic compound show slight oxidase activity. -Aspartic acid, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-methionine, L-asparagine, L-proline, L-glutamine, L-arginine, L-serine, L-threonine, It does not show any activity against L-valine. Therefore, by using the L-lysine decarboxylase / oxidase of the present invention, L-lysine can be accurately measured even in biological samples that can contain various amino acids such as plasma.

本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、下記の(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を有し、且つL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有するアミノ酸配列;
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、且つL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。
The L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention has any one of the following amino acid sequences (1) to (3).
(1) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(2) an amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of 1 to several amino acids and having L-lysine decarboxylase / oxidase activity in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(3) An amino acid sequence having 95% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having L-lysine decarboxylation / oxidase activity.

なお、本発明において「L−リジン脱炭酸/酸化酵素」とは、L−リジンに対する脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方の活性を有する酵素をいう。   In the present invention, “L-lysine decarboxylase / oxidase” refers to an enzyme having both decarboxylase activity and oxidase activity for L-lysine.

本発明において「L−リジン脱炭酸酵素活性」とは、L−リジンを脱炭酸してカダベリンを生成する反応を触媒する酵素活性をいい、「L−リジン酸化酵素活性」とは、酸素と水の存在下、L−リジンを酸化してL−2−アミノアジピン酸 5−セミアルデヒド、過酸化水素およびアンモニアを生成する反応を触媒する酵素活性をいう。即ち、本発明のL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、下記式の反応を触媒する。   In the present invention, “L-lysine decarboxylase activity” refers to an enzyme activity that catalyzes a reaction of decarboxylating L-lysine to produce cadaverine, and “L-lysine oxidase activity” refers to oxygen and water. In the presence of, L-lysine is oxidized, and L-2-aminoadipic acid refers to an enzyme activity that catalyzes a reaction that produces 5-semialdehyde, hydrogen peroxide, and ammonia. That is, the L-lysine decarboxylation / oxidase of the present invention catalyzes a reaction of the following formula.

また、本発明において酵素が「(特定の)アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、ジスルフィド結合などの架橋構造などが挙げられる。   Further, in the present invention, an enzyme “having a (specific) amino acid sequence” means that the amino acid sequence of the enzyme only needs to contain the specified amino acid sequence, and the function of the enzyme is maintained. Means. Examples of sequences other than the amino acid sequence specified in the enzyme include a histidine tag, a linker sequence for immobilization, and a crosslinked structure such as a disulfide bond.

上記アミノ酸配列(1)は、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列である。当該アミノ酸配列を有する酵素は、L−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有するものであり、本発明者らが自然界から見出した新規なバークホルデリア属菌株が産生する酵素として単離精製したものである。   The amino acid sequence (1) is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. The enzyme having the amino acid sequence has L-lysine decarboxylase / oxidase activity, and has been isolated and purified as an enzyme produced by a novel Burkholderia strain found by the present inventors from nature. is there.

上記アミノ酸配列(1)(配列番号2)を有するL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株により産生されるものである。当該AIU395株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
(i) 寄託機関の名称およびあて名
名称: 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名: 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8
(ii) 受託日: 2014年1月24日
(iii) 受託番号: NITE P−01796
The L-lysine decarboxylase / oxidase having the amino acid sequence (1) (SEQ ID NO: 2) is produced by Burkholderia sp. AIU395 strain, which is a novel microorganism according to the present invention. . The AIU395 strain is deposited with the depository as follows.
(I) Name and address of depositary institution Name: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center Address: 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan
(Ii) Date of accession: January 24, 2014 (iii) Accession number: NITE P-01796

その他、本発明者らの実験的知見により、AIU395株以外の複数のバークホルデリアも、L−リジンに対する脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方の活性を有するL−リジン脱炭酸/酸化酵素を産生することが確認されている。   In addition, according to the experimental findings of the present inventors, a plurality of Burkholderia other than AIU395 strain also has L-lysine decarboxylation / oxidase having both decarboxylase activity and oxidase activity against L-lysine. Has been confirmed to produce.

本発明に係るアミノ酸配列(2)の「1から数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を有するアミノ酸配列」における「1から数個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質が、L−リジンに対する脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方の活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記「1から数個」の範囲は、前記L−リジン脱炭酸/酸化酵素を有するタンパク質である割合が高いことから、例えば、1個以上、30個以下、好ましくは1個以上、20個以下、より好ましくは1個以上、10個以下、さらに好ましくは1個以上、7個以下、一層好ましくは1個以上、5個以下、特に好ましくは1個以上、3個以下程度であることができる。   The range of “1 to several” in the “amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of 1 to several amino acids” of the amino acid sequence (2) according to the present invention includes a protein having a deletion, etc. The enzyme is not particularly limited as long as it has both decarboxylase activity and oxidase activity for L-lysine. In the range of “1 to several”, since the ratio of the protein having the L-lysine decarboxylase / oxidase is high, for example, 1 or more and 30 or less, preferably 1 or more and 20 or less. More preferably 1 or more, 10 or less, further preferably 1 or more and 7 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, and particularly preferably 1 or more and 3 or less. .

本発明に係るアミノ酸配列(3)の「配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、当該相同性を有するタンパク質が、L−リジンに対する脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方の活性を有する酵素である限り、特に限定されない。当該相同性は95%以上であれば特に限定されないが、好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、特に好ましくは99.5%以上である。   The homology in the “amino acid sequence having 95% or more homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2” of the amino acid sequence (3) according to the present invention is such that the protein having the homology is L-lysine. There is no particular limitation as long as the enzyme has both decarboxylase activity and oxidase activity. The homology is not particularly limited as long as it is 95% or more, preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and particularly preferably 99.5% or more. It is.

なお、上記の配列番号2に記載のアミノ酸配列との相同性は、比較すべきタンパク質のアミノ酸配列が明らかであれば、当業者であればアライメント解析ソフトを用いて容易に求めることができる。   The homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 can be easily determined by those skilled in the art using alignment analysis software if the amino acid sequence of the protein to be compared is clear.

上記アミノ酸配列(2)およびアミノ酸配列(3)において、「L−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有する」とは、例えば後記の実施例に記載の条件で、L−リジンを脱炭酸してカダベリンを生成する反応を触媒する酵素活性を有し、且つ、酸素と水の存在下、L−リジンを酸化してL−2−アミノアジピン酸 5−セミアルデヒド、過酸化水素およびアンモニアを生成する反応を触媒する酵素活性を有することをいう。   In the above amino acid sequence (2) and amino acid sequence (3), “having L-lysine decarboxylation / oxidase activity” means, for example, that cadaverine is obtained by decarboxylating L-lysine under the conditions described in the Examples below. Reaction that has an enzymatic activity to catalyze the reaction to form L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde, hydrogen peroxide and ammonia by oxidizing L-lysine in the presence of oxygen and water It has the enzyme activity which catalyzes.

本発明の上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素は、上記アミノ酸配列(1)〜(3)を有し、且つ、L−リジンに対して高い基質特異性を示し、L−リジン酸化活性とL−リジン脱炭酸活性を有する酵素であれば、その由来は特に限定されるものではない。   The L-lysine decarboxylase / oxidase of the present invention has the amino acid sequences (1) to (3) and exhibits high substrate specificity for L-lysine. As long as the enzyme has lysine decarboxylation activity, its origin is not particularly limited.

例えば、本発明のL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよく、或いは配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるL−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子ホモログを有する特定の生物種(例えば、細菌)から、或いは、当該生物種に変異原を与えることによりアミノ酸配列(2)または(3)を有するL−リジン脱炭酸/酸化酵素を産生し得る変異体を獲得して、産生するタンパク質を抽出および精製することによって製造したタンパク質であってもよい。   For example, the L-lysine decarboxylase / oxidase of the present invention may be a recombinant protein produced by various genetic engineering techniques, a synthetic protein produced by chemical synthesis, or SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence (2) or (2) or (2) or (2) or (2) or (2) or (2) or (2) or (2) by giving a mutagen to the biological species having an L-lysine decarboxylase / oxidase gene homologue It may be a protein produced by obtaining a mutant capable of producing L-lysine decarboxylase / oxidase having 3), and extracting and purifying the produced protein.

異種発現による生産法としては、例えば、同様の活性を有する生物種より抽出したゲノムDNAから該当する遺伝子をPCRにて増幅し、pETもしくはpUCなどに組み込んだプラスミドベクターを構築したのち、BL21やJM109などの宿主菌株に形質転換し、培養する方法が挙げられる。これら以外の公知の方法も適宜用いることができる。   As a production method by heterologous expression, for example, a corresponding gene is amplified by PCR from a genomic DNA extracted from a biological species having the same activity, and a plasmid vector incorporated into pET or pUC is constructed, and then BL21 or JM109 is constructed. And a method of transforming into a host strain such as Other known methods other than these can also be used as appropriate.

本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するように当該タンパク質をコードする遺伝子(DNA)を取得する。このDNAを適当な発現系に導入することにより、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素を産生することができる。   The method for obtaining L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a gene recombination technique. When producing a recombinant protein, a gene (DNA) encoding the protein is obtained as described later. By introducing this DNA into an appropriate expression system, the above-mentioned L-lysine decarboxylase / oxidase can be produced.

本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素をコードする遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む方法により製造することができる。   The L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention includes a gene encoding the above-mentioned L-lysine decarboxylase / oxidase on a vector, a host cell transformed with this vector, and the transformed host. It can be produced by a method comprising culturing cells, accumulating the protein encoded by the gene in the culture, and collecting the accumulated protein.

<L−リジン脱炭酸/酸化酵素をコードする核酸>
本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素をコードする遺伝子は、本発明の一態様である。即ち、本発明は、下記の何れかの塩基配列を有する核酸を包含する。
(1’)配列番号1に記載の塩基配列
(2’)配列番号1に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換および/または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有する塩基配列
(3’)配列番号1に記載の塩基配列に対して95%以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有する塩基配列。
<Nucleic acid encoding L-lysine decarboxylation / oxidase>
A gene encoding L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention is one embodiment of the present invention. That is, the present invention includes a nucleic acid having any of the following base sequences.
(1 ′) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (2 ′) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has one to several base deletions, substitutions and / or additions, and the nucleotide sequence is The base sequence in which the encoded protein has L-lysine decarboxylation / oxidase activity (3 ′) has a homology of 95% or more with respect to the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and the base sequence encodes A base sequence in which a protein has L-lysine decarboxylation / oxidase activity.

上記核酸における各文言の定義は、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の定義などを準用する。なお、配列番号1に記載の塩基配列に対して95%以上の相同性の塩基配列を有する核酸を用いれば、配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性のアミノ酸配列を有するL−リジン脱炭酸/酸化酵素を製造することができる。   For the definition of each word in the nucleic acid, the definition of the L-lysine decarboxylation / oxidase is applied mutatis mutandis. If a nucleic acid having a base sequence of 95% or more homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is used, an amino acid sequence having a homology of 95% or more with respect to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is obtained. L-lysine decarboxylation / oxidase can be produced.

本発明のL−リジン脱炭酸/酸化酵素をコードする遺伝子の取得方法は特に限定されない。本発明のL−リジン脱炭酸/酸化酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号2に記載のアミノ酸配列および配列番号1に記載した塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。   The method for obtaining a gene encoding the L-lysine decarboxylase / oxidase of the present invention is not particularly limited. The gene encoding the L-lysine decarboxylase / oxidase of the present invention can be obtained by, for example, chemical synthesis, genetic engineering technique or the like based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the base sequence information shown in SEQ ID NO: 1. It can be made by any method known to those skilled in the art, such as mutagenesis.

例えば、配列表の配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning:A laboratory Mannual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.,1989(以下、モレキュラークローニング第2版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1〜38,John Wiley & Sons(1987−1997)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)等に記載の方法に準じて行うことができる。   For example, the DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing can be performed by using a method of contacting with a mutagen drug, a method of irradiating with ultraviolet rays, a genetic engineering method, or the like. Site-directed mutagenesis, which is one of genetic engineering techniques, is useful because it is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position. Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1989 (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 2nd edition), Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter abbreviated as Current Protocols in Molecular Biology). ) And the like.

配列表の配列番号2に記載したアミノ酸配列または配列番号1に示す塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株のcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。cDNAまたはゲノムライブラリーは、常法により作製することができる。   Appropriate probes and primers were prepared based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing or the base sequence information shown in SEQ ID NO: 1, and using them, Burkholderia sp. The gene of the present invention can be isolated by screening a cDNA or genomic library. A cDNA or genomic library can be prepared by a conventional method.

PCR法により本発明のL−リジン脱炭酸/酸化酵素をコードする遺伝子を取得することもできる。例えば、上記バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株のcDNAまたはゲノムライブラリーを鋳型として使用し、配列番号1に記載した塩基配列等を増幅できるように設計した1対のプライマーを用いてPCRを行う。PCRの反応条件は適宜設定すればよい。次いで、増幅されたDNA断片を、大腸菌(E.coli)等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。   A gene encoding the L-lysine decarboxylase / oxidase of the present invention can also be obtained by PCR. For example, using the above-described Burkholderia sp. AIU395 strain cDNA or genomic library as a template, and using a pair of primers designed to amplify the base sequence described in SEQ ID NO: 1, etc. Perform PCR. PCR reaction conditions may be set as appropriate. The amplified DNA fragment can then be cloned into a suitable vector that can be amplified in a host such as E. coli.

上記したプローブまたはプライマーの調製、ゲノムライブラリーの構築、ゲノムライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、上記モレキュラークローニング第2版や上記カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。   Operations such as the preparation of the probe or primer, construction of the genomic library, screening of the genomic library, and cloning of the target gene are known to those skilled in the art. For example, the molecular cloning 2nd edition and the current protocols are described. -It can be performed according to the method described in In-Molecular Biology etc.

上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター(例えばプラスミド等)でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記遺伝子は、転写に必要な要素(例えば、プロモーター等)が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。   The gene for L-lysine decarboxylase / oxidase can be used by inserting it into an appropriate vector. The type of vector used in the present invention is not particularly limited. For example, the vector may be a self-replicating vector (for example, a plasmid), or may be integrated into the host cell genome when introduced into the host cell. It may be replicated together with other chromosomes. Preferably the vector is an expression vector. In the expression vector, elements necessary for transcription (for example, a promoter and the like) are functionally linked to the gene. A promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected depending on the type of host.

細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、ジェオバチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha−amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Subtilis alkaline protease gene)、バチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ;ファージ・ラムダのPRプロモータやPLプロモータ;大腸菌(E.coli)のlacプロモータ、trpプロモータおよびtacプロモータなどが挙げられる。   Promoters that can operate in bacterial cells include the Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene, the Bacillus licheniformis α-amylase gene (Bacillus licheniformis amyliformis α amylase gene). Bacteria BAN amylase gene (Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene), Bacillus subtilis alkaline protease gene (Bacillus subtilis alkaline protease gene), Bacillus pumilusoxysidase Child (Bacillus pumilus xylosldase gene) promoter; phage lambda PR promoter and PL promoter; lac promoter of E. coli (E. coli), such as trp promoter and tac promoter and the like.

哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、SV40プロモータ、MT−1(メタロチオネイン遺伝子)プロモータ、アデノウイルス2主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、P10プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュロウイルス即時型初期遺伝子1プロモータ、バキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、TPI1プロモータ、ADH2−4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ADH3プロモータ、tpiAプロモータなどがある。   Examples of promoters operable in mammalian cells include the SV40 promoter, MT-1 (metallothionein gene) promoter, adenovirus 2 major late promoter, and the like. Examples of promoters operable in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa, calihornica, polyhedrosic basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, baculovirus 39K delayed early gene promoter, and the like. is there. Examples of promoters operable in yeast host cells include promoters derived from yeast glycolytic genes, alcohol dehydrogenase gene promoters, TPI1 promoters, ADH2-4c promoters, and the like. Examples of promoters that can operate in filamentous fungal cells include the ADH3 promoter and the tpiA promoter.

また、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。L−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばSV40またはアデノウイルス5E1b領域由来のもの)、転写エンハンサ配列(例えばSV40エンハンサ)などの要素を有していてもよい。L−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするDNA配列を具備してもよく、その一例としてはSV40複製起点(宿主細胞が哺乳類細胞のとき)が挙げられる。   The L-lysine decarboxylase / oxidase gene may be operably linked to an appropriate terminator as necessary. The recombinant vector containing the gene for L-lysine decarboxylase / oxidase further has elements such as a polyadenylation signal (eg, derived from SV40 or adenovirus 5E1b region), a transcription enhancer sequence (eg, SV40 enhancer), and the like. May be. A recombinant vector containing the gene for L-lysine decarboxylase / oxidase may further comprise a DNA sequence that allows the vector to replicate in the host cell, an example of which is the SV40 origin of replication (host And when the cell is a mammalian cell).

L−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)やシゾサッカロマイセス・ポンベTPI遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、および、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンのような薬剤の耐性遺伝子を挙げることができる。L−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび/または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。   The recombinant vector containing the gene for L-lysine decarboxylation / oxidase may further contain a selectable marker. Selectable markers include, for example, genes lacking their complement such as dihydrofolate reductase (DHFR) and Schizosaccharomyces pombe TPI gene, and ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, Examples include resistance genes of drugs such as neomycin and hygromycin. Methods for ligating L-lysine decarboxylase / oxidase genes, promoters, and optionally terminators and / or secretory signal sequences, respectively, and inserting them into appropriate vectors are well known to those skilled in the art.

<形質転換体>
L−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。L−リジン脱炭酸/酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターを導入される宿主細胞は、L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。かかる形質転換体は、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素の製造に利用できる点で有用である。
<Transformant>
A transformant can be prepared by introducing a recombinant vector containing the gene for L-lysine decarboxylation / oxidase into an appropriate host. The host cell into which the recombinant vector containing the gene for L-lysine decarboxylase / oxidase is introduced may be any cell as long as it can express the L-lysine decarboxylase / oxidase gene. Bacteria, yeast, fungi and higher eukaryotes Examples thereof include cells. Such a transformant is useful in that it can be used for the production of L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention.

細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌または大腸菌(E.coli)等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、HEK293細胞、HeLa細胞、COS細胞、BHK細胞、CHL細胞、CHO細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたDNA配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。   Examples of bacterial cells include Gram positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces or Gram negative bacteria such as E. coli. Transformation of these bacteria may be performed by using competent cells by a protoplast method or a known method. Examples of mammalian cells include HEK293 cells, HeLa cells, COS cells, BHK cells, CHL cells, CHO cells and the like. Methods for transforming mammalian cells and expressing DNA sequences introduced into the cells are also known, and for example, electroporation method, calcium phosphate method, lipofection method and the like can be used.

酵母細胞の例としては、サッカロマイセスやシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)やサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。   Examples of yeast cells include cells belonging to Saccharomyces and Schizosaccharomyces, and examples thereof include Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces kluyveri. Examples of the method for introducing a recombinant vector into a yeast host include an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, and the like.

他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、DNA構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。   Examples of other fungal cells are cells belonging to filamentous fungi such as Aspergillus, Neurospora, Fusarium, or Trichoderma. When filamentous fungi are used as host cells, transformation can be performed by integrating the DNA construct into the host chromosome to obtain a recombinant host cell. Integration of the DNA construct into the host chromosome can be performed according to known methods, for example, by homologous recombination or heterologous recombination.

昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる(例えば、Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manua1;およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology,6,47(1988)等に記載)。   When insect cells are used as the host, the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into the insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected with the insect cells. And protein can be expressed (for example, as described in Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual 1; and Current Protocols in Molecular Biology, Bio / Technology, 6, 47 (1988), etc.).

バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。   As the baculovirus, for example, Autographa californica nucleopolyhedrosis virus, which is a virus that infects Coleoptera insects, can be used.

昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W.H.Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHiFive(インビトロジェン社製)等を用いることができる。   Insect cells include Spodoptera frugiperda ovarian cells Sf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York ( New York) (1992)], HiFive (manufactured by Invitrogen), which is an ovary cell of Trichoplusia ni, and the like can be used.

組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法またはリポフェクション法等を挙げることができる。   Examples of the method for co-introducing a recombinant gene introduction vector into insect cells and the baculovirus for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method and a lipofection method.

上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明で用いるL−リジン脱炭酸/酸化酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明で用いるL−リジン脱炭酸/酸化酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ法、S−Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明のL−リジン脱炭酸/酸化酵素を精製標品として得ることができる。   The transformant is cultured in an appropriate nutrient medium under conditions that allow expression of the introduced gene. In order to isolate and purify the L-lysine decarboxylase / oxidase used in the present invention from the culture of the transformant, ordinary protein isolation and purification methods may be used. For example, when the L-lysine decarboxylase / oxidase used in the present invention is expressed in a dissolved state in the cells, after completion of the culture, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to ultrasonic disruption. Cells are disrupted by a machine or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary protein isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) sepharose, cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), and a resin such as butyl sepharose and phenyl sepharose were used. A method such as hydrophobic chromatography, gel filtration using a molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, electrophoresis such as isoelectric focusing, etc. may be used alone or in combination, and L-lysine decarboxylation / Oxidase can be obtained as a purified sample.

<L−リジンの測定方法>
本発明に係る検体中のL−リジンの測定方法は、
(A)必要に応じて、L−リジンの量が明らかな複数の試料につき以降と同様の工程を行い、当該L−リジン量と下記工程(D)で計測すべき反応生成物の量との関係を明らかにしておく工程;
(B)必要に応じて、検体にプトレシン酸化酵素を作用させることにより検体中のカダベリンを酸化する工程;
(C)検体に本発明の上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素を作用させる工程;および
(D)上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする。
<Measurement method of L-lysine>
The method for measuring L-lysine in a sample according to the present invention includes:
(A) If necessary, the same steps as described above are performed for a plurality of samples in which the amount of L-lysine is clear, and the amount of L-lysine and the amount of the reaction product to be measured in the following step (D) The process of clarifying the relationship;
(B) A step of oxidizing cadaverine in the specimen by allowing putrescine oxidase to act on the specimen, if necessary;
(C) a step of allowing the L-lysine decarboxylation / oxidase of the present invention to act on a specimen; and (D) a step of measuring the amount of at least one reaction product resulting from the action of the L-lysine decarboxylation / oxidase. It is characterized by including.

上記本発明方法には、検体中におけるL−リジンの有無を判断するための検出方法と、検体中におけるL−リジンの濃度や量を測定する定量方法などが含まれるものとする。   The above-described method of the present invention includes a detection method for determining the presence or absence of L-lysine in a sample, a quantitative method for measuring the concentration and amount of L-lysine in the sample, and the like.

本発明のL−リジン測定方法で検体として用いられる生体試料は、L−リジンの有無を判断すべきものや、L−リジンの量などを測定すべき試料であれば、如何なるものでもよい。例えば、血液、血清、血漿、臓器の一部のホモジェネート、尿などの生体試料を挙げることができる。また、生体試料にL−リジン脱炭酸/酸化酵素を作用させて生じる生成物を如何なる方法で測定するかに応じて、生体試料の種類を適宜選択することができる。より具体的には、発色剤や蛍光剤を利用して上記生成物を定量する場合には無色の水溶液であることが好ましく、血清や血漿などが例として挙げられる。なお、本発明において、L−リジンなどの「量」には、L−リジンなどの濃度も含まれるものとする。   The biological sample used as a specimen in the L-lysine measurement method of the present invention may be any sample as long as it should be determined whether L-lysine is present or the amount of L-lysine should be measured. For example, biological samples such as blood, serum, plasma, homogenate of a part of an organ, urine and the like can be mentioned. In addition, the type of biological sample can be appropriately selected depending on the method for measuring the product produced by the action of L-lysine decarboxylase / oxidase on the biological sample. More specifically, when the product is quantified using a color former or a fluorescent agent, it is preferably a colorless aqueous solution, and examples thereof include serum and plasma. In the present invention, the “amount” of L-lysine and the like includes the concentration of L-lysine and the like.

以下、本発明に係るL−リジンの測定方法を、実施の順番に従って説明する。   Hereinafter, the L-lysine measurement method according to the present invention will be described in the order of execution.

工程(A):検量線の作成工程
本工程では、必要に応じて、L−リジンの量が明らかな複数の試料につき以降と同様の工程を行い、当該L−リジン量と下記工程(D)で計測すべき反応生成物の量との関係を明らかにしておく。即ち、本工程では、必要に応じて検量線を作成する。
Step (A): Preparation of calibration curve In this step, if necessary, the same steps as those described below are performed for a plurality of samples in which the amount of L-lysine is clear, and the amount of L-lysine and the following step (D) The relationship with the amount of reaction product to be measured in is clarified. That is, in this process, a calibration curve is created as necessary.

本発明に係るL−リジンの測定方法では、工程(D)において反応生成物の量を計測し、検体中のL−リジンの量を間接的に決定する。この際、反応生成物の絶対量を計測すれば、L−リジンの絶対量も決定できる。しかし、反応生成物の絶対量の計測は、容易でないことがある。そこで、本工程で検量線を作成しておくことにより、L−リジンの測定がより一層簡便になる。   In the method for measuring L-lysine according to the present invention, the amount of the reaction product is measured in step (D), and the amount of L-lysine in the sample is indirectly determined. At this time, if the absolute amount of the reaction product is measured, the absolute amount of L-lysine can also be determined. However, measurement of the absolute amount of reaction product may not be easy. Therefore, by preparing a calibration curve in this step, the measurement of L-lysine is further simplified.

本工程で用いるL−リジンの量が明らかな試料の数は、検体に含まれると予測されるL−リジンの量が十分に含まれる範囲で、3以上とすることが好ましい。当該試料数が多いほど正確な測定が可能になるので、当該試料数としては4以上がより好ましく、5以上がさらに好ましい。当該試料数の上限は特に制限されないが、多過ぎると測定効率が低下するおそれがあり得るので、当該試料数としては10以下が好ましい。   The number of samples with a clear amount of L-lysine used in this step is preferably 3 or more as long as the amount of L-lysine expected to be contained in the specimen is sufficiently contained. As the number of samples increases, more accurate measurement is possible, so the number of samples is more preferably 4 or more, and even more preferably 5 or more. The upper limit of the number of samples is not particularly limited, but if it is too large, the measurement efficiency may be lowered, and therefore the number of samples is preferably 10 or less.

検量線の作成では、各試薬の濃度、反応温度、反応時間などの反応条件を、予定されている以降の工程の条件と同一にして、上記試料につき反応生成物の量を計測する。計測された反応生成物の量と、事前に分かっている各試料中のL−リジンの量のデータから、常法に従って検量線を作成する。   In preparing the calibration curve, the reaction conditions such as the concentration of each reagent, reaction temperature, reaction time, etc. are made the same as the conditions for the subsequent steps, and the amount of reaction product is measured for the sample. A calibration curve is prepared according to a conventional method from the measured amount of the reaction product and the data of the amount of L-lysine in each sample that is known in advance.

工程(B):カダベリンの処理工程
本工程では、必要に応じて、検体にプトレシン酸化酵素を作用させることにより検体中のカダベリンを酸化する。
Step (B): Cadaverine treatment step In this step, cadaverine in the specimen is oxidized by allowing putrescine oxidase to act on the specimen, if necessary.

本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、L−リジンに対する基質特異性が極めて高く、血漿など、様々な夾雑物を含む検体であってもL−リジンを正確に測定することができる。しかし、非常に僅かではあるが、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素はカダベリンを基質にして酸化する。よって、検体にカダベリンが含まれる場合や含まれる可能性がある場合には、本工程を行ってカダベリンを事前に酸化しておくことが好ましい。逆に、検体にカダベリンが含まれていないことが明らかであれば、本工程を行う必要はない。   The L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention has extremely high substrate specificity for L-lysine, and can accurately measure L-lysine even in a specimen containing various contaminants such as plasma. . However, the L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention oxidizes using cadaverine as a substrate, though very little. Therefore, when cadaverine is included or may be included in the specimen, it is preferable to oxidize cadaverine in advance by performing this step. Conversely, if it is clear that the sample does not contain cadaverine, this step is not necessary.

プトレシン酸化酵素は、本来、水と酸素の存在下、プトレシン(2HN−(CH24−NH2)を酸化して4−アミノブタナール(OHC−(CH23−NH2)、アンモニアおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であるが、カダベリン(2HN−(CH25−NH2)も基質とし、5−アミノペンタナール(OHC−(CH24−NH2)、アンモニアおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。即ち、本工程では、下記の反応が進行する。 Putrescine oxidase originally oxidizes putrescine ( 2 HN- (CH 2 ) 4 —NH 2 ) in the presence of water and oxygen to give 4-aminobutanal (OHC— (CH 2 ) 3 —NH 2 ), Although it is an enzyme that catalyzes a reaction that generates ammonia and hydrogen peroxide, cadaverine ( 2 HN— (CH 2 ) 5 —NH 2 ) is also used as a substrate, and 5-aminopentanal (OHC— (CH 2 ) 4 —NH 2 ) Catalyze the reaction to produce ammonia and hydrogen peroxide. That is, in this step, the following reaction proceeds.

プトレシン酸化酵素としては、特に制限されないが、例えば、コクリア ロゼア(Kokuria rosea)NBRC 3768株(旧ミクロコッカス ルーベンス(Micrococcus rubens)IFO3768株)に由来するプトレシン酸化酵素を用いることができる。   The putrescine oxidase is not particularly limited, and for example, putrescine oxidase derived from Kokuria rosea NBRC 3768 strain (formerly Micrococcus rubens IFO3768 strain) can be used.

反応液のpH、反応温度、反応条件、プトレシン酸化酵素の添加量などの反応条件は、検体中に含まれるカダベリンが十分に酸化されるよう調節する。例えば、プトレシン酸化酵素は、一般的にpH6.5以上で活性を示すので、反応液のpHを6.5以上にする。具体的な条件は、予備実験で決定したり、検体中のカダベリンがクロマトグラフィなどで確認できなくなるよう調整すればよい。   Reaction conditions such as pH of the reaction solution, reaction temperature, reaction conditions, and the amount of putrescine oxidase added are adjusted so that cadaverine contained in the sample is sufficiently oxidized. For example, since putrescine oxidase generally shows activity at pH 6.5 or higher, the pH of the reaction solution is set to 6.5 or higher. Specific conditions may be determined in a preliminary experiment or adjusted so that cadaverine in a sample cannot be confirmed by chromatography or the like.

反応後は、検体中のカダベリンの量を決定するために、生成した5−アミノペンタナール、アンモニアまたは過酸化水素の量を計測することが好ましい。測定条件は、後記する。   After the reaction, it is preferable to measure the amount of 5-aminopentanal, ammonia or hydrogen peroxide produced in order to determine the amount of cadaverine in the sample. The measurement conditions will be described later.

或いは、本工程で生成した過酸化水素の一部または全部は分解する可能性があるため、例えば工程(D)で過酸化水素の量を計測する場合には、過酸化水素の量の計測の代わりに、または過酸化水素の量の計測に加えて、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼなどにより積極的に分解しておいてもよい。   Alternatively, since part or all of the hydrogen peroxide generated in this step may be decomposed, for example, when measuring the amount of hydrogen peroxide in step (D), the measurement of the amount of hydrogen peroxide Alternatively, or in addition to the measurement of the amount of hydrogen peroxide, the generated hydrogen peroxide may be actively decomposed with peroxidase or the like.

工程(C):L−リジン脱炭酸/酸化酵素による反応工程
本工程では、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素を検体に作用させることにより、検体中に含まれるL−リジンを脱炭酸してカダベリンとし、また、当該L−リジンを酸化してL−2−アミノアジピン酸 5−セミアルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素を生成させる。
Step (C): Reaction step with L-lysine decarboxylation / oxidase In this step, L-lysine contained in the sample is removed by allowing the L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention to act on the sample. Carbonate to cadaverine, and L-lysine is oxidized to produce L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde, ammonia and hydrogen peroxide.

上記反応を十分に進行せしめるために、本工程の反応液におけるL−リジン脱炭酸/酸化酵素の量は、反応液1.0mLあたり1.0mU以上とすることが好ましい。なお、ここでの1Uは、リジン1μmolを1分間で消費する活性をいうものとする。   In order to allow the above reaction to proceed sufficiently, the amount of L-lysine decarboxylation / oxidase in the reaction solution in this step is preferably 1.0 mU or more per 1.0 mL of the reaction solution. In addition, 1U here shall mean the activity which consumes 1 micromol of lysine in 1 minute.

溶媒としては水を用い、緩衝液などを用いて、反応液のpHをL−リジン脱炭酸/酸化酵素の至適pHを考慮したpHに調整することが好ましい。pHは適宜調整すればよいが、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素がpH5.0以上、8.5以下で活性を示すので、この範囲で用いることができる。   It is preferable to use water as the solvent and adjust the pH of the reaction solution to a pH taking into consideration the optimum pH of L-lysine decarboxylation / oxidase using a buffer solution or the like. The pH may be adjusted as appropriate, but the L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention shows activity at pH 5.0 or more and 8.5 or less, and can be used within this range.

また、本工程において、L−リジン脱炭酸/酸化酵素に加えてプトレシン酸化酵素を用い、L−リジン脱炭酸/酸化酵素の作用により生成したカダベリンを酸化してもよい。それにより、L−リジンをより正確に測定できる。詳しくは、L−リジン脱炭酸/酸化酵素はL−リジン脱炭酸酵素活性とL−リジン酸化酵素活性の両活性を示すため、例えば、L−リジンから生成するカダベリンまたはL−2−アミノアジピン酸 5−セミアルデヒドの生成量は、検体に含まれるL−リジンの量とは異なるので、続く工程(D)でカダベリンまたはL−2−アミノアジピン酸 5−セミアルデヒドの量を計測する場合には、工程(A)を行って事前に検量線を作成しておくことが必要となる。しかし、プトレシン酸化酵素を共存させてL−リジンから生成するカダベリンを酸化すると、工程(B)の反応と同様に、カダベリンと等モルのアンモニアと過酸化水素が生成する。即ち、L−リジン脱炭酸/酸化酵素とプトレシン酸化酵素を併用して十分に反応を進行させれば、検体中に含まれるL−リジンと等モルのアンモニアおよび過酸化水素が生成するため、このアンモニアまたは過酸化水素の量を計測することにより、検体中のL−リジンをより正確に測定することが可能になる。   Further, in this step, cadaverine produced by the action of L-lysine decarboxylase / oxidase may be oxidized using putrescine oxidase in addition to L-lysine decarboxylase / oxidase. Thereby, L-lysine can be measured more accurately. Specifically, since L-lysine decarboxylase / oxidase exhibits both L-lysine decarboxylase activity and L-lysine oxidase activity, for example, cadaverine or L-2-aminoadipic acid produced from L-lysine Since the amount of 5-semialdehyde produced is different from the amount of L-lysine contained in the sample, when measuring the amount of cadaverine or L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde in the following step (D) It is necessary to prepare a calibration curve in advance by performing the step (A). However, when cadaverine produced from L-lysine is oxidized in the presence of putrescine oxidase, ammonia and hydrogen peroxide in an equimolar amount with cadaverine are produced, as in the reaction of step (B). That is, if L-lysine decarboxylase / oxidase and putrescine oxidase are used together and the reaction is sufficiently advanced, L-lysine and equimolar amounts of ammonia and hydrogen peroxide contained in the sample are produced. By measuring the amount of ammonia or hydrogen peroxide, it becomes possible to measure L-lysine in a sample more accurately.

生成したカダベリンを十分に酸化するために、本工程の反応液におけるプトレシン酸化酵素の量は、反応液1.0mLあたり100mU以上とすることが好ましい。なお、ここでの1Uは、カダベリン1μmolを1分間で消費する活性をいうものとする。   In order to sufficiently oxidize the produced cadaverine, the amount of putrescine oxidase in the reaction solution in this step is preferably 100 mU or more per 1.0 mL of the reaction solution. In addition, 1U here shall mean the activity which consumes 1 micromol of cadaverine in 1 minute.

上記のとおり、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素がpH5.0以上、8.5以下で活性を示し、また、プトレシン酸化酵素はpH6.5以上で活性を示すので、プトレシン酸化酵素を用いる場合には反応液のpHを6.5以上、8.5以下に調整することが好ましい。   As described above, since L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention exhibits activity at pH 5.0 or more and 8.5 or less, and putrescine oxidase exhibits activity at pH 6.5 or more, putrescine oxidase When is used, it is preferable to adjust the pH of the reaction solution to 6.5 or more and 8.5 or less.

本工程の反応条件は、上記酵素反応が十分に進行するよう調整する。例えば、L−リジン脱炭酸/酸化酵素によるL−リジンの酸化反応には酸素が必要であり、通常、酸化反応に必要とされる酸素量が微量であり溶存酸素により十分に賄えるため、空気などの酸素含有気体を反応液に供給する必要はないが、供給してもかまわない。反応温度は適宜調整すればよいが、L−リジン脱炭酸/酸化酵素の至適温度は40℃付近であるので、例えば、20℃以上、50℃以下とすることができる。酵素反応時間は、使用する酵素量などにもよるが、例えば、10分間以上、1時間以下程度の範囲とすることができる。しかし、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。   The reaction conditions in this step are adjusted so that the enzyme reaction sufficiently proceeds. For example, oxygen is required for the oxidation reaction of L-lysine by L-lysine decarboxylation / oxidase, and since the amount of oxygen required for the oxidation reaction is usually very small and can be sufficiently covered by dissolved oxygen, air or the like It is not necessary to supply the oxygen-containing gas to the reaction solution, but it may be supplied. The reaction temperature may be adjusted as appropriate, but the optimum temperature for L-lysine decarboxylation / oxidase is around 40 ° C., and can be, for example, 20 ° C. or more and 50 ° C. or less. Although the enzyme reaction time depends on the amount of enzyme used, it can be in the range of, for example, about 10 minutes to 1 hour. However, it is not intended to be limited to this range, and can be adjusted as appropriate.

工程(D):反応生成物量の計測工程
本工程では、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する。得られた計測値から、検体中におけるL−リジンの量を把握できる。
Step (D): Measurement step of reaction product amount In this step, the amount of at least one reaction product produced by the action of the L-lysine decarboxylation / oxidase is measured. From the obtained measured value, the amount of L-lysine in the sample can be grasped.

L−リジン脱炭酸/酸化酵素の作用による反応生成物は、具体的には、カダベリン、L−2−アミノアジピン酸 5−セミアルデヒド、アンモニア、過酸化水素を挙げることができる。なお、上記工程(C)においてプトレシン酸化酵素を併用すると、生成したカダベリンは5−アミノヘプタナールに変換され、カダベリンと等モルのアンモニアと過酸化水素が別途生成する。   Specific examples of the reaction product resulting from the action of L-lysine decarboxylation / oxidase include cadaverine, L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde, ammonia, and hydrogen peroxide. In addition, when putrescine oxidase is used together in the above step (C), the produced cadaverine is converted to 5-aminoheptanal, and cadaverine, equimolar ammonia and hydrogen peroxide are separately produced.

反応生成物の量の計測方法は、選択された反応生成物に応じて公知方法から適宜選択することができる。例えば、測定対象である反応生成物が過酸化水素である場合、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法など公知の方法により、過酸化水素の定量が可能である。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼは過酸化水素の定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。また、使用するペルオキシダーゼの基質となり得るものであれば発色剤として使用可能であり、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合には、4−アミノアンチピリンとフェノールとの組み合せや4−アミノアンチピリンとN−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOOS)との組み合わせなどが、発色剤として挙げられる。なお、発色剤は、使用されるペルオキシダーゼの種類によって適宜選択することが可能である。西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、4−アミノアンチピリンおよびフェノールを用いる過酸化水素定量のための反応は、以下に示す通りである。
2H22 + 4−アミノアンチピリン + フェノール → キノンイミン色素 + 4H2
The method for measuring the amount of the reaction product can be appropriately selected from known methods according to the selected reaction product. For example, when the reaction product to be measured is hydrogen peroxide, hydrogen peroxide can be quantified by a known method such as a method using a peroxidase reaction. When measuring using a peroxidase reaction, the peroxidase which can be used should just be an enzyme which can be utilized for fixed_quantity | quantitative_assay of hydrogen peroxide, for example, a horseradish origin peroxidase is mentioned. Moreover, if it can become a substrate of the peroxidase to be used, it can be used as a color former, and when using horseradish peroxidase, a combination of 4-aminoantipyrine and phenol, 4-aminoantipyrine and N-ethyl- A combination with N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS) can be mentioned as a color former. The color former can be appropriately selected depending on the type of peroxidase used. The reaction for hydrogen peroxide determination using horseradish peroxidase, 4-aminoantipyrine and phenol is as follows.
2H 2 O 2 + 4-aminoantipyrine + phenol → quinoneimine dye + 4H 2 O

上記工程(C)でプトレシン酸化酵素を用いた場合には、生成したアンモニアと過酸化水素のモル数は検体中に含まれるL−リジンのモル数と同じである。また、アンモニアに比べて、過酸化水素の量の計測はより容易である。よって、上記工程(C)でプトレシン酸化酵素を用いた場合には、過酸化水素の量を計測することが好ましい。   When putrescine oxidase is used in the step (C), the number of moles of ammonia and hydrogen peroxide produced is the same as the number of moles of L-lysine contained in the sample. In addition, it is easier to measure the amount of hydrogen peroxide than ammonia. Therefore, when putrescine oxidase is used in the step (C), it is preferable to measure the amount of hydrogen peroxide.

L−リジン脱炭酸/酸化酵素の反応生成物である過酸化水素は、過酸化水素電極を用いた電流検出型センサを用いて測定することもできる。過酸化水素電極を用いた電流検出型センサとしては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサを挙げることができる。   Hydrogen peroxide, which is a reaction product of L-lysine decarboxylation / oxidase, can also be measured using a current detection type sensor using a hydrogen peroxide electrode. As a current detection type sensor using a hydrogen peroxide electrode, for example, a sensor using a film in which peroxidase is immobilized on glutaraldehyde together with bovine serum albumin and ferrocene in a carbon paste is used as an electrode.

測定すべき反応生成物をアンモニアとする場合には、アンモニア検出薬を用いて測定することができる。アンモニア検出薬としては、例えば、フェノールと次亜塩素酸の組み合わせによるインドフェノール法を挙げることができる。具体的には、サンプルをフェノール・ニトロプルシド溶液および過塩素酸溶液と混合して発色させ、635nmの吸光度を測定することにより、アンモニア定量が可能である。   When the reaction product to be measured is ammonia, it can be measured using an ammonia detection agent. Examples of the ammonia detection agent include an indophenol method using a combination of phenol and hypochlorous acid. Specifically, ammonia can be quantified by mixing a sample with a phenol / nitroprusside solution and a perchloric acid solution to develop a color and measuring the absorbance at 635 nm.

定量に用いられる反応生成物がL−リジンの脱アミノ化生成物であるL−2−アミノアジピン酸5−セミアルデヒドである場合には、5−グアニジノ−2−オキソペンタン酸を3−メチル−2−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン 塩酸塩と反応させてヒドラゾン誘導体を分光測定することにより、L−2−アミノアジピン酸5−セミアルデヒドの量を計測することができる。   When the reaction product used for quantification is L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde, which is a deamination product of L-lysine, 5-guanidino-2-oxopentanoic acid is converted to 3-methyl- By reacting with 2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride and spectroscopically measuring the hydrazone derivative, the amount of L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde can be measured.

<L−リジンの測定用キット>
プトレシン酸化酵素を用いずに本発明に係るL−リジン測定方法を実施するためのL−リジン測定用キットは、例えば、以下の試薬を含む。
<Measurement kit for L-lysine>
An L-lysine measurement kit for carrying out the L-lysine measurement method according to the present invention without using putrescine oxidase includes, for example, the following reagents.

本発明のL−リジン測定用キットは、(K1−1)L−リジン脱炭酸/酸化酵素を含むことを特徴とする。   The kit for measuring L-lysine of the present invention is characterized by containing (K1-1) L-lysine decarboxylation / oxidase.

本発明のキットは、さらに、(K1−2)過酸化水素検出用試薬、(K1−3)アンモニア検出薬および(K1−4)L−リジンの脱アミノ化生成物であるL−2−アミノアジピン酸 5−セミアルデヒド検出薬の少なくとも一つを含むことができる。   The kit of the present invention further comprises (K1-2) a reagent for detecting hydrogen peroxide, (K1-3) an ammonia detector, and (K1-4) L-2-amino which is a deamination product of L-lysine. At least one of the adipic acid 5-semialdehyde detector may be included.

(K1−2)過酸化水素検出用試薬は、例えば、過酸化水素を発色により定量するものを挙げることができる。発色光は、蛍光であってもよい。過酸化水素検出用試薬としては、例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組合せであることができる。具体的には、西洋わさびペルオキシダーゼと4−アミノアンチピリンとフェノールの組み合わせを挙げることができる。   (K1-2) Examples of the hydrogen peroxide detection reagent include one that quantifies hydrogen peroxide by color development. The color light may be fluorescent. The hydrogen peroxide detection reagent can be, for example, a combination of a peroxidase and a color former that can be a substrate thereof. Specifically, a combination of horseradish peroxidase, 4-aminoantipyrine and phenol can be mentioned.

(K1−3)アンモニア検出薬としては、フェノールとの次亜塩素酸の組み合わせを挙げることができる。かかるアンモニア検出薬により、インドフェノール法でのアンモニアの検出が可能になる。   (K1-3) As an ammonia detection agent, the combination of hypochlorous acid with phenol can be mentioned. Such an ammonia detection agent makes it possible to detect ammonia by the indophenol method.

(K1−4)L−リジンの脱アミノ化生成物であるL−2−アミノアジピン酸5−セミアルデヒド検出薬としては、3−メチル−2−ベンゾチアゾロン ヒドラジン 塩酸塩を挙げることができる。例えば、L−2−アミノアジピン酸5−セミアルデヒドと3−メチル−2−ベンゾチアゾロン ヒドラジン 塩酸塩を反応させて生成するヒドラゾン誘導体を分光測定することができる。   (K1-4) L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde detection agent which is a deamination product of L-lysine includes 3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine hydrochloride. For example, a hydrazone derivative produced by reacting L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde with 3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine hydrochloride can be spectroscopically measured.

本発明のキットは、さらに、(K1−5)反応用緩衝液を含むものであってもよい。反応用緩衝液は、反応液中を定量反応に適したpHに維持するために用いられる。L−リジン脱炭酸/酸化酵素は、pH5.0以上、8.5以下で活性を示すことから、反応用緩衝液のpHも5.0以上、8.5以下が好ましい。当該pH範囲としては、6.0以上、7.0以下がより好ましい。   The kit of the present invention may further contain (K1-5) a reaction buffer. The reaction buffer is used to maintain the reaction solution at a pH suitable for quantitative reaction. Since L-lysine decarboxylation / oxidase shows activity at pH 5.0 or more and 8.5 or less, the pH of the reaction buffer is preferably 5.0 or more and 8.5 or less. The pH range is more preferably 6.0 or more and 7.0 or less.

プトレシン酸化酵素を用いて本発明に係るL−リジン測定方法を実施するためのL−リジン測定用キットは、(K2−1)L−リジン脱炭酸/酸化酵素と(K2−2)プトレシン酸化酵素を含む。(K2−2)プトレシン酸化酵素としては、コクリア ロゼア(Kokuria rosea)NBRC 3768株由来のプトレシン酸化酵素を挙げることができる。   The kit for measuring L-lysine for carrying out the method for measuring L-lysine according to the present invention using putrescine oxidase comprises (K2-1) L-lysine decarboxylase / oxidase and (K2-2) putrescine oxidase. including. Examples of (K2-2) putrescine oxidase include putrescine oxidase derived from Kokuria rosea NBRC 3768 strain.

(K2−3)過酸化水素検出用試薬、(K2−4)アンモニア検出薬および(K2−5)L−リジンの脱アミノ化生成物であるL−2−アミノアジピン酸 5−セミアルデヒド検出薬の少なくとも一つを含むことができる。これらの説明などは、プトレシン酸化酵素を用いずに本発明に係るL−リジン測定方法を実施するためのL−リジン測定用キットのものと同様である。   (K2-3) Reagent for detecting hydrogen peroxide, (K2-4) Ammonia detector and (K2-5) L-2-aminoadipic acid 5-semialdehyde detector which is a deamination product of L-lysine At least one of the following. These explanations are the same as those of the L-lysine measurement kit for carrying out the L-lysine measurement method according to the present invention without using putrescine oxidase.

本発明のキットは、さらに、(K2−6)反応用緩衝液を含むものであってもよい。反応用緩衝液は、反応液中を定量反応に適したpHに維持するために用いられる。一般的に、L−リジン脱炭酸/酸化酵素はpH5.0以上、8.5以下で活性を示し、プトレシン酸化酵素はpH6.5以上で活性を示すので、反応用緩衝液のpHは6.0以上、8.5以下が好ましい。   The kit of the present invention may further contain (K2-6) a reaction buffer. The reaction buffer is used to maintain the reaction solution at a pH suitable for quantitative reaction. In general, L-lysine decarboxylase / oxidase exhibits activity at pH 5.0 or more and 8.5 or less, and putrescine oxidase exhibits activity at pH 6.5 or more, so the pH of the reaction buffer is 6. It is preferably 0 or more and 8.5 or less.

<L−リジン測定用酵素センサ>
本発明に係るL−リジン測定用酵素センサは、過酸化水素検出用電極を有し、当該過酸化水素検出用電極の表面または近傍に本発明に係る上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素が配置されていることを特徴とする。
<Enzyme sensor for L-lysine measurement>
The enzyme sensor for L-lysine measurement according to the present invention has an electrode for hydrogen peroxide detection, and the L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention is disposed on or near the surface of the hydrogen peroxide detection electrode. It is characterized by being.

過酸化水素検出用電極は、過酸化水素が水と酸素に分解するにあたって生じる電子を検出することにより、過酸化水素を検出するものである。過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極であることができる。   The hydrogen peroxide detection electrode detects hydrogen peroxide by detecting electrons generated when hydrogen peroxide decomposes into water and oxygen. The hydrogen peroxide detection electrode can be an enzymatic hydrogen peroxide electrode or a diaphragm hydrogen peroxide electrode.

上記L−リジン測定用酵素センサによれば、L−リジン脱炭酸/酸化酵素がL−リジンと反応することで過酸化水素が生成するので、この過酸化水素を過酸化水素検出用電極で検出することができる。酵素式過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させた電極を挙げることができる。隔膜式過酸化水素電極は、隔膜により過酸化水素と反応する電極が隔離されたタイプの電極である。   According to the enzyme sensor for L-lysine measurement, hydrogen peroxide is generated by reacting L-lysine decarboxylation / oxidase with L-lysine, and this hydrogen peroxide is detected by the hydrogen peroxide detection electrode. can do. Examples of the enzyme hydrogen peroxide electrode include a film in which peroxidase is immobilized on glutaraldehyde together with bovine serum albumin and an electrode containing ferrocene in carbon paste. The diaphragm type hydrogen peroxide electrode is a type of electrode in which an electrode that reacts with hydrogen peroxide is isolated by a diaphragm.

本発明に係る酵素センサにおいて、L−リジン脱炭酸/酸化酵素は、検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置されることが好ましく、検出用電極の表面に配置される場合には、検出用電極の表面に固定化されても固定化されなくてもよい。検出用電極の表面に固定化されることで、本発明のセンサを繰り返し利用できる利点がある。   In the enzyme sensor according to the present invention, the L-lysine decarboxylase / oxidase is preferably disposed on the surface of the detection electrode or in the vicinity of the detection electrode, and when disposed on the surface of the detection electrode, It may or may not be immobilized on the surface of the detection electrode. By being immobilized on the surface of the detection electrode, there is an advantage that the sensor of the present invention can be used repeatedly.

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。   EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited by the following examples, but may be appropriately modified within a range that can meet the purpose described above and below. Of course, it is possible to implement them, and they are all included in the technical scope of the present invention.

実施例1: 本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素産生菌の探索
(1) スクリーニング
日本国内各地から土壌試料を採取し、下記条件により各土壌に含まれる微生物のL−リジン酸化酵素活性を試験し、L−リジン酸化酵素活性を有する微生物をスクリーニングした。
Example 1: Search for L-lysine decarboxylation / oxidase producing bacteria according to the present invention (1) Screening Soil samples were collected from various places in Japan, and L-lysine oxidase activity of microorganisms contained in each soil under the following conditions Were screened for microorganisms having L-lysine oxidase activity.

L−リジン酸化酵素活性は、酵素によるL−リジンの酸化反応により生成される過酸化水素量を、比色法で求めることにより測定した。具体的には、各培養微生物の菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を粗酵素液として用いた。当該粗酵素液0.1mLと、表1に示す化合物を混合して得られた酸化酵素活性測定用反応液0.9mLを1cm石英セル中でし、30℃で反応させた。吸光度計を用い、反応開始から約1秒間間隔で連続的に555nmの吸光度を測定した。基質としては、L−リジンの5mM水溶液を調製して添加した。また、ブランクでは、基質の代わりに100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を添加した。   L-lysine oxidase activity was measured by determining the amount of hydrogen peroxide produced by the oxidation reaction of L-lysine with an enzyme by a colorimetric method. Specifically, the supernatant obtained by crushing and centrifuging the cells of each cultured microorganism was used as a crude enzyme solution. 0.1 mL of the crude enzyme solution and 0.9 mL of a reaction solution for measuring oxidase activity obtained by mixing the compounds shown in Table 1 were placed in a 1 cm quartz cell and reacted at 30 ° C. Using an absorptiometer, absorbance at 555 nm was continuously measured at intervals of about 1 second from the start of the reaction. As a substrate, a 5 mM aqueous solution of L-lysine was prepared and added. In the blank, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) was added instead of the substrate.

得られた吸光度変化により、下記計算式に基づいて酸化酵素活性を算出した。尚、上記条件で1分間に1マイクロモルの基質を与える酵素量を1Uとした。
酸化酵素活性値(U/mL)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×3.1(mL)×希釈倍率}/{13×1.0(cm)×0.1(mL)}
3.1(mL): 全液量
13: ミリモル吸光係数
1.0(cm): セルの光路長
0.1(mL): 酵素サンプル液量
Based on the obtained change in absorbance, the oxidase activity was calculated based on the following formula. The amount of enzyme that gives 1 micromole of substrate per minute under the above conditions was 1 U.
Oxidase activity value (U / mL) = {ΔOD / min (ΔODtest−ΔODblank) × 3.1 (mL) × dilution factor} / {13 × 1.0 (cm) × 0.1 (mL)}
3.1 (mL): total liquid volume 13: millimolar extinction coefficient 1.0 (cm): optical path length of cell 0.1 (mL): volume of enzyme sample liquid

その結果、L−リジン酸化酵素活性を有するAIU395株を見出した。当該AIU395株について、以下のとおり検討した。   As a result, AIU395 strain having L-lysine oxidase activity was found. The AIU395 strain was examined as follows.

(2)16SrDNA塩基配列
上記AIU395株から常法に従ってゲノムDNAを抽出し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、PCRにより16SrDNAを増幅し、その塩基配列を決定した。当該微生物の16SrDNA塩基配列を配列番号9に示す。決定された配列に基づいて、アポロンDB−BA9.0 Blastにより、相同性の高い微生物を検索した。結果を表2に示す。
(2) 16S rDNA base sequence Genomic DNA was extracted from the AIU395 strain according to a conventional method, 16S rDNA was amplified by PCR using the obtained genomic DNA as a template, and the base sequence was determined. The 16S rDNA base sequence of the microorganism is shown in SEQ ID NO: 9. Based on the determined sequence, microorganisms with high homology were searched by Apollon DB-BA9.0 Blast. The results are shown in Table 2.

また、図1に、当該微生物の16SrDNA塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示した。表2と図1のとおり、AIU395株の16SrDNA塩基配列は、Burkholderia属の16SrDNA塩基配列に対し高い相同性を示し、B.arboris R−24201株に対して99.9%と最も高い相同性を示したが、何れの規準菌株の16SrDNA塩基配列とも一致しなかった。また、アポロンDB−BA9.0に対する相同性検索で得られた上位10塩基配列を用いた16SrDNA塩基配列に基づく簡易分子系統解析の結果、AIU395株は、Burkholderia属の種で形成されるクラスターに含まれ、B.arborisとクラスターを形成し、近縁であることが示された。   FIG. 1 shows a simple molecular phylogenetic tree based on the 16S rDNA base sequence of the microorganism. As shown in Table 2 and FIG. 1, the 16S rDNA base sequence of AIU395 strain showed high homology to the 16S rDNA base sequence of Burkholderia genus. Although it showed the highest homology of 99.9% with respect to the arboris R-24201 strain, it did not match the 16S rDNA base sequence of any reference strain. In addition, as a result of simple molecular phylogenetic analysis based on the 16S rDNA base sequence using the top 10 base sequences obtained by homology search for Apollon DB-BA9.0, AIU395 strain is included in the cluster formed by Burkholderia species. B. It formed a cluster with arboris and was shown to be closely related.

以上の通り、本発明に係るAIU395株は、Burkholderia属に属する新規な微生物であることが明らかとなった。   As described above, it was revealed that the AIU395 strain according to the present invention is a novel microorganism belonging to the genus Burkholderia.

(3) 生理・生化学性状試験
本発明に係るAIU395株の生理・生化学性状を試験した。第一次試験の結果を表3に、第二次試験の結果を図2と表4に示す。
(3) Physiological / biochemical property test The physiological / biochemical property of the AIU395 strain according to the present invention was tested. The results of the primary test are shown in Table 3, and the results of the secondary test are shown in FIG.

第一次試験の結果、AIU395株は運動性を有するグラム陰性桿菌であり、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応に陽性、オキシダーゼ反応に陰性を示した(表3)。第二次試験の結果、AIU395株は硝酸塩を還元し、アルギニンジヒドロラーゼおよびウレアーゼなどの活性を示さず、エスクリンおよびゼラチンを加水分解せず、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、グルコース、L−アラビノースおよびD−マンノースなどを資化した(図2)。また、追加試験の結果、42℃で生育せず、マッコンキー寒天で生育し、羊血をβ−溶血した(表4)。これらの性状は、16SrDNA塩基配列解析の結果において近縁性が示唆されたB.arborisの性状と類似性があるものの、相違も確認された。特に、エスクリンおよびゼラチンを加水分解しない点はB.arborisの性状と異なった。   As a result of the first test, AIU395 strain was a gram-negative gonococcus having motility, did not oxidize glucose, and was positive for catalase reaction and negative for oxidase reaction (Table 3). As a result of the second test, AIU395 strain reduced nitrate, showed no activity such as arginine dihydrolase and urease, did not hydrolyze esculin and gelatin, showed β-galactosidase activity, glucose, L-arabinose and D -Mannose and others were assimilated (Fig. 2). Further, as a result of additional tests, it did not grow at 42 ° C., but grew on McConkey agar, and β-hemolyzed sheep blood (Table 4). These properties are related to B. cerevisiae, which was suggested in the results of 16S rDNA nucleotide sequence analysis. Although similar to the properties of arboris, differences were also confirmed. In particular, esculin and gelatin are not hydrolyzed. It was different from the properties of arboris.

以上の結果から、本発明に係るAIU395株は、B.arborisに最も近縁なBurkholderia sp.であるが、B.arborisとは異なる新規なものであると判断した。   From the above results, the AIU395 strain according to the present invention is B.I. Burkholderia sp. most closely related to arboris B. It was judged to be a new one different from arboris.

実施例2: 本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素の取得
(1) AIU395株由来のL−リジン酸化酵素の誘導剤の検討
0.3%グルコース、0.2%リン酸二水素カリウム、0.1%リン酸水素ナトリウム、および0.05%硫酸マグネシウム七水和物を含む培地(pH7.0)に、窒素源として、表5に示す6−アミノヘキサン酸、L−リジン、プトレシン、カダベリンまたは硫酸アンモニウムをそれぞれ添加した。当該培地に上記実施例1で得られたバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株を接種して30℃で36時間培養し、培養後の培地pH、培養濁度、L−リジン酸化酵素活性を測定した。結果を表5に示す。
Example 2: Acquisition of L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention (1) Examination of inducer of L-lysine oxidase derived from AIU395 strain 0.3% glucose, 0.2% potassium dihydrogen phosphate 6-aminohexanoic acid, L-lysine and putrescine shown in Table 5 as a nitrogen source in a medium (pH 7.0) containing 0.1% sodium hydrogenphosphate and 0.05% magnesium sulfate heptahydrate Cadaverine or ammonium sulfate was added, respectively. The medium was inoculated with Burkholderia sp. AIU395 strain obtained in Example 1 and cultured at 30 ° C. for 36 hours, and the culture medium pH, culture turbidity, L-lysine oxidase after culture Activity was measured. The results are shown in Table 5.

表5に示す結果のとおり、6−アミノヘキサン酸(以下、「6−AHA」と略記する)を添加した培地において、最も高いL−リジン酸化酵素活性が認められた。よって、以降の実験では6−AHAを培地に添加し、L−リジン脱炭酸/酸化酵素の誘導を行った。   As shown in Table 5, the highest L-lysine oxidase activity was observed in the medium supplemented with 6-aminohexanoic acid (hereinafter abbreviated as “6-AHA”). Therefore, in subsequent experiments, 6-AHA was added to the medium to induce L-lysine decarboxylation / oxidase.

(2) AIU395株の培養時間
上記実施例1のバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株を、6−AHA培地(0.5% 6−AHA,0.3%グルコース,0.2%リン酸二水素カリウム,0.1%リン酸水素ナトリウム,0.05%硫酸マグネシウム七水和物,pH7.0)に植菌し、30℃、115行程/分で4日間培養した。0、12、24、36、48、72、96時間ごとに、培養濁度(660nm)、培地pH、L−リジン酸化酵素活性を測定した。結果を図3に示す。培養濁度とL−リジン酸化酵素活性の関係から、36時間の培養後集菌し、精製を行った。
(2) Culture time of AIU395 strain Burkholderia sp. AIU395 strain of Example 1 above was transformed into 6-AHA medium (0.5% 6-AHA, 0.3% glucose, 0.2%). Potassium dihydrogen phosphate, 0.1% sodium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, pH 7.0) and inoculated at 30 ° C. and 115 strokes / minute for 4 days. Culture turbidity (660 nm), medium pH, and L-lysine oxidase activity were measured every 0, 12, 24, 36, 48, 72, and 96 hours. The results are shown in FIG. From the relationship between culture turbidity and L-lysine oxidase activity, the cells were collected after 36 hours of culture and purified.

(3) AIU395株由来L−リジン酸化酵素の精製
(3−1) AIU395株の培養
上記実施例1のバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株を、5mLの上記6−AHA培地に植菌し、30℃、115行程/分で2日間前培養した。その後、150mLの6−AHA培地を含む500mLフラスコで同様の条件で2日間培養した。本培養として、2Lの6−AHA培地を含む3Lのフラスコに前培養したAIU395株を植菌し、30℃で36時間培養した。培養後、10,000×gで10分間遠心後、10mMカリウムリン酸緩衝液(pH6.0,以下、「KPB」と略記する)で洗菌し、菌体を得た。
(3) Purification of AIU395 strain-derived L-lysine oxidase (3-1) Cultivation of AIU395 strain Burkholderia sp. AIU395 strain of Example 1 was planted in 5 mL of the 6-AHA medium. The cells were precultured at 30 ° C. and 115 strokes / min for 2 days. Thereafter, the cells were cultured in a 500 mL flask containing 150 mL of 6-AHA medium under the same conditions for 2 days. As the main culture, AIU395 strain pre-cultured in a 3 L flask containing 2 L of 6-AHA medium was inoculated and cultured at 30 ° C. for 36 hours. After culturing, the cells were centrifuged at 10,000 × g for 10 minutes and washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0, hereinafter abbreviated as “KPB”) to obtain bacterial cells.

(3−2) 無細胞抽出液の調製
培地8L分の菌体をKPBに懸濁し、細胞破砕機(安井器械社製,「マルチビーズショッカー(登録商標)」)を使って、2,200rpmで2分間、菌体を破砕する操作を4回繰り返した。次いで、10,000×gで15分間遠心分離し、得られた上清を回収した。遠心で得られたペレットを再度40mM KPB(pH6.0)に懸濁し、同様の操作を3回繰り返した。全ての上清(計2,150mL)を回収し、無細胞抽出液とした。
(3-2) Preparation of cell-free extract Suspended cells of 8 L of medium in KPB, and using a cell crusher ("Multi Bead Shocker (registered trademark)" manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.) at 2,200 rpm The operation of crushing the cells for 2 minutes was repeated 4 times. Next, the resultant was centrifuged at 10,000 × g for 15 minutes, and the resulting supernatant was recovered. The pellet obtained by centrifugation was suspended again in 40 mM KPB (pH 6.0), and the same operation was repeated three times. All the supernatants (total 2,150 mL) were collected and used as cell-free extracts.

(3−3) DEAE樹脂を使った陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
40mM KPB(pH6.0)により平衡化したDEAE樹脂(TOSOH社製,「TOYOPEARL(登録商標) DEAE−650」)を充填したカラム(直径2.4cm×27cm)に、上記無細胞抽出液を吸着させた。40mM KPB(pH6.0)でカラムを洗浄した後、0.2M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)を用いて、酵素を溶出させた。得られた酵素液を10mM KPB(pH6.0)で透析した。
(3-3) Anion exchange column chromatography using DEAE resin Column (diameter) packed with DEAE resin (manufactured by TOSOH, “TOYOPEARL (registered trademark) DEAE-650”) equilibrated with 40 mM KPB (pH 6.0) The cell-free extract was adsorbed to 2.4 cm × 27 cm. After washing the column with 40 mM KPB (pH 6.0), the enzyme was eluted with 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.2 M NaCl. The obtained enzyme solution was dialyzed against 10 mM KPB (pH 6.0).

(3−4) アガロースビーズを使った陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
0.14M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)により平衡化したアガロースビーズ(GEヘルスケアバイオサイエンス,「Q セファロース」)を充填したカラム(直径2.4cm×11cm)に、上記酵素液を吸着させた。0.14M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)で洗浄した後、0.14M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)250mLおよび0.26M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)250mLを用いて、グラジエントによりNaCl濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。活性が得られたフラクションは、10mM KPB(pH6.0)で、透析した。
(3-4) Anion exchange column chromatography using agarose beads Column packed with agarose beads (GE Healthcare Bioscience, “Q Sepharose”) equilibrated with 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.14 M NaCl. The enzyme solution was adsorbed on (diameter 2.4 cm × 11 cm). After washing with 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.14 M NaCl, 250 mL of 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.14 M NaCl and 250 mL of 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.26 M NaCl were used. The NaCl concentration was gradually increased by the gradient to elute the enzyme. Using a fraction collector, the fraction was collected in a test tube, and the fractions showing activity were collected. The fraction from which activity was obtained was dialyzed against 10 mM KPB (pH 6.0).

(3−5) DEAE樹脂を使った陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
0.1M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)により平衡化したDEAE樹脂(TOSOH社製,「TOYOPEARL(登録商標) DEAE−650」)を充填したカラム(直径1.2cm×36cm)に、上記酵素液を吸着させた。0.1M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)で洗浄した後、0.1M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)200mLおよび0.24M NaClを含む40mM KPB(pH6.0)200mLを用いて、グラジエントによりNaCl濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。活性が得られたフラクションは、10mM KPB(pH6.0)で、透析した。
(3-5) Anion-exchange column chromatography using DEAE resin DEAE resin equilibrated with 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.1 M NaCl (TOOSOH, “TOYOPEARL (registered trademark) DEAE-650”) The above enzyme solution was adsorbed on a column (diameter 1.2 cm × 36 cm) packed with. After washing with 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.1 M NaCl, 200 mL of 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.1 M NaCl and 200 mL of 40 mM KPB (pH 6.0) containing 0.24 M NaCl were used. The NaCl concentration was gradually increased by the gradient to elute the enzyme. Using a fraction collector, the fraction was collected in a test tube, and the fractions showing activity were collected. The fraction from which activity was obtained was dialyzed against 10 mM KPB (pH 6.0).

(3−6) ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
10mM KPB(pH6.0)により平衡化したハイドロキシアパタイト樹脂を充填したカラム(直径1.2cm×18cm)に、上記酵素液を吸着させた。10mM KPB(pH6.0)100mLおよび0.1MKPB(pH6.0)100mLを用いて、グラジエントによりKPB濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。活性が得られたフラクションは、10mM KPB(pH6.0)で、透析した。以上の精製状況を表6にまとめる。
(3-6) Hydroxyapatite column chromatography The enzyme solution was adsorbed onto a column (diameter 1.2 cm × 18 cm) packed with hydroxyapatite resin equilibrated with 10 mM KPB (pH 6.0). Using 100 mL of 10 mM KPB (pH 6.0) and 100 mL of 0.1 M KPB (pH 6.0), the KPB concentration was gradually increased by a gradient to elute the enzyme. Using a fraction collector, the fraction was collected in a test tube, and the fractions showing activity were collected. The fraction from which activity was obtained was dialyzed against 10 mM KPB (pH 6.0). The above purification status is summarized in Table 6.

(4) SDS−PAGEによる上記株由来L−リジン酸化酵素の分子量測定
泳動ゲルとして、36%アクリルアミド5.25mL、0.68Mトリス−HCL緩衝液(pH8.8)8.25mL、1%SDS 1.58mL、10%TEMED 187μL、2%APS 562.5μLの組成を有するゲルに、36%ポリアクリルアミド0.5mL、0.179Mトリス−HCl(pH6.8)3.5mL、1%SDS 0.5mL、10%TEMED 125μL、2%APS 375μLの組成を有する濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液(グリセロール200μL,1Mトリス−HCl(pH8.0)40μL,水360μL,2−メルカプトエタノール200μLおよび10%SDS 200μL)と等量混合した上記精製酵素サンプル10μLを、ランニング緩衝液(トリス3.0g,グリシン14.1gおよびSDS 10g)中、30mAで電気泳動を行った。その後、ゲルをタンパク染色液(CBB2.5g,メタノール500mL,酢酸50mLおよび水450mL)で1時間染色し、脱色液(メタノール:酢酸:水=3:1:6)でバンドが鮮明になるまで脱色した。分子量マーカーとしては、20kDa、25kDa、37kDa、50kDa、75kDa、100kDa、150kDa、250kDaの組換えタンパク質を含む分子量マーカーを用いた。
(4) Molecular weight measurement of L-lysine oxidase derived from the strain by SDS-PAGE As an electrophoresis gel, 5.25 mL of 36% acrylamide, 8.25 mL of 0.68 M Tris-HCL buffer (pH 8.8), 1% SDS 1 In a gel having a composition of .58 mL, 10% TEMED 187 μL, 2% APS 562.5 μL, 36% polyacrylamide 0.5 mL, 0.179 M Tris-HCl (pH 6.8) 3.5 mL, 1% SDS 0.5 mL 10% TEMED 125 [mu] L, 2% APS 375 [mu] L overlaid concentrated gel was used, buffer solution (glycerol 200 [mu] L, 1M Tris-HCl (pH 8.0) 40 [mu] L, water 360 [mu] L, 2-mercaptoethanol 200 [mu] L and 10 % SDS 200 μL) and the above purified enzyme sample 10 L, and the conducted running buffer (Tris 3.0 g, Glycine 14.1g and SDS 10 g), to electrophoresis with 30 mA. Thereafter, the gel is stained with a protein staining solution (CBB 2.5 g, methanol 500 mL, acetic acid 50 mL and water 450 mL) for 1 hour, and decolorized with a decoloring solution (methanol: acetic acid: water = 3: 1: 6) until the band becomes clear. did. As molecular weight markers, molecular weight markers including recombinant proteins of 20 kDa, 25 kDa, 37 kDa, 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 150 kDa, and 250 kDa were used.

図4にバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株由来L−リジン酸化酵素のSDS−PAGEの写真を示した。SDS−PAGEで明らかなように、上記の方法で酵素は単一のタンパク質まで精製されたので、精製酵素を用いて性質を明らかにした。   FIG. 4 shows a photograph of SDS-PAGE of L-lysine oxidase derived from Burkholderia sp. AIU395 strain. As is apparent from SDS-PAGE, the enzyme was purified to a single protein by the above method, and the properties were revealed using the purified enzyme.

(5) AIU395株由来L−リジン酸化酵素の吸収スペクトル解析
L−リジン酸化酵素の精製酵素の吸収スペクトルを測定した。結果を図5に示す。279nmと415nmに吸収極大が見られたことから、本酵素はピリドキサール5’−リン酸(PLP)依存型の酵素であることが示唆された。
(5) Absorption spectrum analysis of L-lysine oxidase derived from AIU395 strain The absorption spectrum of the purified enzyme of L-lysine oxidase was measured. The results are shown in FIG. Absorption maximums were observed at 279 nm and 415 nm, suggesting that this enzyme is a pyridoxal 5′-phosphate (PLP) -dependent enzyme.

(6) AIU395株由来L−リジン酸化酵素の基質特異性
上記実施例1(1)の酸化酵素活性測定用反応液中の基質を表7に示すアミノ酸およびアミン有機化合物に変更して、上記精製酵素の酸化酵素活性を測定した。結果を表7に示す。
(6) Substrate Specificity of L-Lysine Oxidase Derived from AIU395 Strain The substrate in the reaction solution for measuring oxidase activity of Example 1 (1) above was changed to the amino acid and amine organic compound shown in Table 7 and purified as described above. The oxidase activity of the enzyme was measured. The results are shown in Table 7.

表7に示す結果のとおり、本酵素は、L−リジンに対する酸化活性が極めて高い一方、5−ヒドロキシ−L−リジンおよびカダベリンをわずかに基質とするのみで、その他のアミノ酸やアミンには全く活性を示さないという基質特異性の高いものであった。   As shown in Table 7, this enzyme has an extremely high oxidative activity against L-lysine, but only slightly uses 5-hydroxy-L-lysine and cadaverine as substrates, and is completely active against other amino acids and amines. The substrate specificity was high.

(7) L−リジン脱炭酸酵素活性の測定
L−リジン脱炭酸酵素活性は、脱炭酸反応により生成するカダベリンをプトレシン酸化酵素により酸化し、この酸化反応に伴って、反応したカダベリンと等モル生成する過酸化水素量を比色法で求めることにより測定した。具体的には、1cm石英セル中、表8に示す基質量に相当するL−リジン溶液を基質として含む表8に示す脱炭酸酵素活性測定用反応液0.9mLと酵素液1mLを混合し、30℃で反応させた。吸光度計を用い、反応開始から約1秒間間隔で連続的に550nmの吸光度を測定した。また、プトレシン酸化酵素を添加せず、同様の実験を行った。ブランクでは、基質の代わりに100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を添加した。
(7) Measurement of L-lysine decarboxylase activity L-lysine decarboxylase activity is obtained by oxidizing cadaverine produced by decarboxylation reaction with putrescine oxidase and generating equimolar amounts with the reacted cadaverine. The amount of hydrogen peroxide to be measured was determined by a colorimetric method. Specifically, in a 1 cm quartz cell, 0.9 mL of a decarboxylase activity measurement reaction solution shown in Table 8 containing an L-lysine solution corresponding to the base mass shown in Table 8 as a substrate was mixed with 1 mL of enzyme solution, The reaction was performed at 30 ° C. Using an absorptiometer, absorbance at 550 nm was continuously measured at intervals of about 1 second from the start of the reaction. The same experiment was performed without adding putrescine oxidase. In the blank, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) was added instead of the substrate.

得られた吸光度変化により、下記計算式に基づいて脱炭酸酵素活性を算出した。尚、上記条件で1分間に1マイクロモルの基質を与える酵素量を1Uとした。
脱炭酸酵素活性値(U/mL)={ΔOD/min(プトレシン酸化酵素を添加した場合の測定値)−ΔOD/min(プトレシン酸化酵素を添加しない場合の測定値)}×3.1(mL)×希釈倍率}/{13×1.0(cm)×0.1(mL)}
3.1(mL): 全液量
13: ミリモル吸光係数
1.0(cm): セルの光路長
0.1(mL): 酵素サンプル液量
Based on the change in absorbance obtained, decarboxylase activity was calculated based on the following formula. The amount of enzyme that gives 1 micromole of substrate per minute under the above conditions was 1 U.
Decarboxylase activity value (U / mL) = {ΔOD / min (measured value when putrescine oxidase is added) −ΔOD / min (measured value when no putrescine oxidase is added)} × 3.1 (mL ) × dilution ratio} / {13 × 1.0 (cm) × 0.1 (mL)}
3.1 (mL): total liquid volume 13: millimolar extinction coefficient 1.0 (cm): optical path length of cell 0.1 (mL): volume of enzyme sample liquid

その結果、AIU395株から単離されたL−リジン酸化酵素は、L−リジン脱炭酸酵素活性をも有することが明らかとなった。   As a result, it was revealed that L-lysine oxidase isolated from AIU395 strain also has L-lysine decarboxylase activity.

(8) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素のKmおよびVmaxの測定
上記の酸化酵素活性測定方法と脱炭酸酵素活性測定方法において、基質の濃度を変更して各酵素活性を測定することによって、KmとVmaxを求めた。酸化酵素活性の測定では、L−リジンの他、僅かに活性が認められた5−ヒドロキシ−L−リジンとカダベリンを基質として用いた。脱炭酸酵素活性の測定では、L−リジンのみ基質として用いた。結果を表9に示す。
(8) In AIU395 strain derived L- Lysine decarboxylation / K m and V max measured above oxidase activity measurement method and decarboxylase activity measuring method of the oxidase, measure each enzyme activity by changing the concentration of the substrate As a result, K m and V max were obtained. In the measurement of oxidase activity, in addition to L-lysine, 5-hydroxy-L-lysine and cadaverine, which were slightly active, were used as substrates. In the measurement of decarboxylase activity, only L-lysine was used as a substrate. The results are shown in Table 9.

表9に示す結果のとおり、本酵素はL−リジンに対して親和性が非常に高いことが明らかとなった。また、本酵素の脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性との比率は、最大速度で比較すると0.79:122と脱炭酸酵素活性の方が高いことが分かった。さらに、特に低濃度の5−ヒドロキシ−L−リジンおよびカダベリンでは反応速度は著しく遅くなることから、本酵素のL−リジンに対する高い基質特異性が証明された。   As shown in Table 9, this enzyme was found to have a very high affinity for L-lysine. In addition, the ratio of the decarboxylase activity and the oxidase activity of this enzyme was 0.79: 122 when compared at the maximum rate, and it was found that the decarboxylase activity was higher. Furthermore, the reaction rate was significantly slow, especially at low concentrations of 5-hydroxy-L-lysine and cadaverine, demonstrating the high substrate specificity of the enzyme for L-lysine.

(9) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素のN末端アミノ酸配列の決定
上記精製酵素のN末端アミノ酸配列の分析を、株式会社ニッピに依頼し、N末端側から15残基が決定された。
(9) Determination of N-terminal amino acid sequence of L-lysine decarboxylase / oxidase from AIU395 strain Nippi Co., Ltd. was requested to analyze the N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme, and 15 residues were determined from the N-terminal side. It was.

実施例3: L−リジン脱炭酸/酸化酵素の最適pHとpH安定性の検討
上記のL−リジン酸化酵素活性方法において、緩衝液を変更することにより反応液のpHを5〜8.5に変化させ、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素の酸化酵素活性を測定した。結果を図6に示す。
Example 3: Examination of optimum pH and pH stability of L-lysine decarboxylase / oxidase In the above-mentioned L-lysine oxidase activity method, the pH of the reaction solution was changed to 5 to 8.5 by changing the buffer solution. The oxidase activity of L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention was measured. The results are shown in FIG.

図6のとおり、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、pH6.0で最も高い活性を示し、pH5.0からpH7.0付近まで安定であることが明らかとなった。なお、図6の縦軸は、L−リジン酸化酵素活性についてはpH6.0の活性値を100%とした場合の相対活性値を示し、残存活性についてはpH6.5の活性値を100%とした場合の相対活性値を示す。ちなみに、破線はプトレシン酸化酵素のpHに対する相対活性を示している。   As shown in FIG. 6, the L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention showed the highest activity at pH 6.0 and was found to be stable from pH 5.0 to around pH 7.0. In addition, the vertical axis | shaft of FIG. 6 shows the relative activity value when the activity value of pH 6.0 is set to 100% about L-lysine oxidase activity, and the activity value of pH 6.5 is set to 100% about residual activity. The relative activity value is shown. Incidentally, the broken line indicates the relative activity of putrescine oxidase with respect to pH.

実施例4: L−リジン脱炭酸/酸化酵素の最適温度と熱安定性の検討
上記のL−リジン酸化酵素活性方法において、反応温度を20〜60℃に変化させ、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素の酸化酵素活性を測定した。結果を図7に示す。
Example 4 Examination of Optimum Temperature and Thermal Stability of L-Lysine Decarboxylase / Oxidase In the above L-lysine oxidase activity method, the reaction temperature was changed to 20-60 ° C., and L-lysine according to the present invention was used. The oxidase activity of decarboxylation / oxidase was measured. The results are shown in FIG.

図7のとおり、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、50℃で最も高い活性を示し、45℃付近まで安定であることが明らかとなった。なお、図7の縦軸は、L−リジン酸化酵素活性については50℃における活性値を100%とした場合の相対活性値であり、残存活性については30℃における活性値を100%とした場合の相対活性値である。   As shown in FIG. 7, L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention showed the highest activity at 50 ° C. and was stable up to around 45 ° C. In addition, the vertical axis | shaft of FIG. 7 is a relative activity value when the activity value in 50 degreeC is set to 100% about L-lysine oxidase activity, and the activity value in 30 degreeC is set to 100% about residual activity Is the relative activity value.

実施例5: L−リジン脱炭酸/酸化酵素の阻害剤の検討
上記のL−リジン酸化酵素活性方法において、阻害剤を添加し、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素の酸化酵素活性を測定した。結果を表10に示す。
Example 5: Examination of inhibitors of L-lysine decarboxylase / oxidase In the above-mentioned L-lysine decarboxylase activity method, an inhibitor was added and the oxidase activity of L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention. Was measured. The results are shown in Table 10.

表10に示す結果のとおり、本発明酵素には、PLP依存型酵素の阻害剤であるファニルヒドラジンやヒドロキシルアミンで著しい酸化酵素活性の減少が見られた。また、CuCl2やZnCl2により、酸化反応に阻害が見られた。 As shown in Table 10, in the enzyme of the present invention, a significant decrease in oxidase activity was observed with fanylhydrazine and hydroxylamine, which are inhibitors of PLP-dependent enzymes. In addition, inhibition of the oxidation reaction was observed with CuCl 2 and ZnCl 2 .

実施例6: 本発明に係る組換えL−リジン脱炭酸/酸化酵素の取得
(1) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子のクローニング
(1−1) AIU395株の染色体DNAの抽出
上記実施例1のバークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株をTGY培地(0.5%トリプトン,0.25%イースト抽出物,0.1%グルコース,pH7.0)3mLに植菌し、30℃、200rpmで12時間培養した。培養液1mLを、15,000rpm、4℃で5分間遠心分離し、集菌した。菌体をSTE緩衝液(NaCl 0.58g,1Mトリス−HCl(pH8.0)1mLおよび0.5M EDTA(pH8.0)200μLを水で100mLに定量したもの)1mLで洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。68℃で15分間加熱した後、15,000rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を除いた。別途、リゾチーム5mgと10mg/mL RNase 10mLを含む溶液(以下、当該溶液を「1液」という)を準備した。また、グルコース0.9g、1Mトリス−HCl(pH8.0)2.5mL、0.5M EDTA(pH8.0)2mLを含む溶液に超純水を加え、総量を100mLにした。当該溶液1mLと、上記1液10mLを混合した。上記遠心分離沈殿物を、当該混合液300μLに懸濁した。37℃で30分間インキュベートした後、プロテイナーゼK液(プロテイナーゼK 10mg/1液1mL)6μLを加え、穏やかに混合し、37℃で10分間インキュベートした。N−ラウロイルザルコシン3mgを加えて、穏やかに混合した後、37℃で3時間インキュベートし、フェノール−クロロホルム処理を穏やかに2回行った。上清300μLに5M NaCl溶液10μLとエタノール600μLを加えて混合した後、15,000rpm、4℃で10分間遠心分離した。70%エタノールで洗浄した後、風乾し、TE緩衝液100μLに溶解し、目的とする染色体DNAを得た。
Example 6: Acquisition of recombinant L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention (1) Cloning of AIU395 strain-derived L-lysine decarboxylase / oxidase gene (1-1) Extraction of chromosomal DNA of AIU395 strain Burkholderia sp. AIU395 strain of Example 1 was inoculated into 3 mL of TGY medium (0.5% tryptone, 0.25% yeast extract, 0.1% glucose, pH 7.0), The cells were cultured at 30 ° C. and 200 rpm for 12 hours. 1 mL of the culture solution was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes to collect bacteria. The cells were washed with 1 mL of STE buffer (NaCl 0.58 g, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 1 mL and 0.5 M EDTA (pH 8.0) 200 μL quantified to 100 mL with water), and then the same buffer. It was suspended in the liquid. After heating at 68 ° C. for 15 minutes, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was removed. Separately, a solution containing 5 mg of lysozyme and 10 mL of 10 mg / mL RNase (hereinafter, this solution is referred to as “one solution”) was prepared. In addition, ultrapure water was added to a solution containing 0.9 g of glucose, 2.5 mL of 1 M Tris-HCl (pH 8.0), and 2 mL of 0.5 M EDTA (pH 8.0) to make the total amount 100 mL. 1 mL of the solution and 10 mL of the first solution were mixed. The centrifugal precipitate was suspended in 300 μL of the mixed solution. After incubating at 37 ° C. for 30 minutes, 6 μL of proteinase K solution (proteinase K 10 mg / 1 solution 1 mL) was added, mixed gently, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. After adding 3 mg of N-lauroylsarcosine and mixing gently, it incubated at 37 degreeC for 3 hours, and performed phenol-chloroform treatment twice gently. 10 μL of 5M NaCl solution and 600 μL of ethanol were added to 300 μL of the supernatant and mixed, followed by centrifugation at 15,000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes. After washing with 70% ethanol, it was air-dried and dissolved in 100 μL of TE buffer to obtain the target chromosomal DNA.

(1−2) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子内部配列の増幅
PCR反応液の組成は、水35μL、10×LA Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmolプライマー1(5’−ATGACCGCTTCCTTGACCCAAC−3’,配列番号3)1μL、100pmolプライマー2(5’−TGCACGCGATCCGGTACACGCC−3’,配列番号4)1μL、鋳型DNA2μLおよびLA Taq 1μLとした。PCR反応の条件は、(i)98℃で5分間の後、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)72℃で2分間の(ii)〜(iv)を30回繰返した。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をVIOGENE(USA)社のGel−Mゲル抽出キットを用いて抽出した。
(1-2) AIU395 strain-derived L-lysine decarboxylation / oxidase gene internal sequence amplification The composition of the PCR reaction solution was water 35 μL, 10 × LA Taq buffer 5 μL, 2 mM dNTP 5 μL, 100 pmol primer 1 (5′-ATGACCGCTCTCTTGACCCAAC −3 ′, SEQ ID NO: 3) 1 μL, 100 pmol primer 2 (5′-TGCACGCGATCCGGTACACCGCC-3 ′, SEQ ID NO: 4) 1 μL, template DNA 2 μL and LA Taq 1 μL. The conditions for the PCR reaction were (ii) 98 ° C. for 5 minutes, (ii) 96 ° C. for 10 seconds, (iii) 50 ° C. for 5 seconds, (iv) 72 ° C. for 2 minutes (ii) to (iv) ) Was repeated 30 times. The amplified gene was confirmed by agarose gel electrophoresis. The amplified gene was extracted using a Gel-M gel extraction kit manufactured by VIOGENE (USA).

(1−3) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子内部配列のシーケンシング
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー1とプライマー2を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、1.6μLの各プライマー、1.6μLの鋳型DNA、1μLのBigDyeプレミックスソリューション、1.5μLの5xBigDyeシーケンシングバッファーと4.9μLの滅菌水とし、全量10μLとした。PCR反応の条件は、(i)96℃で2分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間、(v)(ii)〜(iv)を25回、および(vi)72℃で5分間とした。PCR産物に、1μLの3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)、1μLの0.125M EDTAと25μLのエタノールを加え、室温で15分間放置した後、15,000rpm、4℃で8分間遠心分離することにより沈殿させた。上清を廃棄した後、10μLの Hi Di Formamideを加え、100℃で5分間加熱した後に、氷水で急冷したものをABI PRISM 3500 Genetic Analyzerで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はGenetyxで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片を連結した。
(1-3) Sequencing of L-Lysine Decarboxylase / Oxidase Gene Internal Sequence from AIU395 Strain In order to perform sequencing on both strands of the gene, a sequence reaction was performed using primer 1 and primer 2. The reaction solution composition was 1.6 μL of each primer, 1.6 μL of template DNA, 1 μL of BigDye premix solution, 1.5 μL of 5 × BigDye sequencing buffer and 4.9 μL of sterilized water for a total volume of 10 μL. The conditions of the PCR reaction were (i) 96 ° C. for 2 minutes, (ii) 96 ° C. for 10 seconds, (iii) 50 ° C. for 5 seconds, (iv) 60 ° C. for 4 minutes, (v) (ii) to ( iv) 25 times, and (vi) 5 minutes at 72 ° C. By adding 1 μL of 3M sodium acetate (pH 5.2), 1 μL of 0.125M EDTA and 25 μL of ethanol to the PCR product, leaving it at room temperature for 15 minutes, and then centrifuging at 15,000 rpm, 4 ° C. for 8 minutes. Precipitated. After discarding the supernatant, 10 μL of Hi Di Formamide was added, heated at 100 ° C. for 5 minutes, and then rapidly cooled with ice water, and the base sequence was decoded with ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer. The obtained sequence data was analyzed by Genetyx, and the fragments amplified with the respective primers were ligated.

(1−4) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子末端配列の増幅
プライマー3(5’−ATGTCGCGATCACGACGTCGACGAGCCG−3’,配列番号5)と、プライマー4(5’−GCTGATGCCCGGCGAGAACGCGGGG−3’,配列番号6)を用いて、TaKaRa LA PCRTM Cloning Kit(タカラバイオ社)のマニュアルに従って、末端配列の増幅を行った。上記同様にシーケンシングを行った。配列番号2に、バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子から予測される一次構造を示した(図8)。
(1-4) Amplification of L-lysine decarboxylase / oxidase gene terminal sequence derived from AIU395 strain Primer 3 (5′-ATGTTCCGGATCACGACGTCGACGAGCCCG-3 ′, SEQ ID NO: 5) and Primer 4 (5′-GCTGATGCCCGCGCGAGAACGCGGGG-3 ′, sequence No. 6) was used to amplify the terminal sequence according to the manual of TaKaRa LA PCR ™ Cloning Kit (Takara Bio). Sequencing was performed as described above. SEQ ID NO: 2 shows the primary structure predicted from the L-lysine decarboxylation / oxidase gene derived from Burkholderia sp. AIU395 strain (FIG. 8).

(1−5) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子の発現系構築
L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子(配列番号1)を増幅するためのPCR反応液として、滅菌水(MilliQ)34μL、プライマー5(5’−GGAGATATACATATGACCGCTTCCTTGACCCAAC−3’,配列番号7,100pmol)1μL、プライマー2(5’−TTAGCAGCCGGATCCTCACCGCGTGTTGGTATCGC−3’,配列番号8,100pmol)1μL、ポリメラーゼ(TOYOBO社製,製品名「KOD−Plus−」,1U/μL水溶液)1μL、10×PCRバッファー、2mM dNTPs水溶液5μL、25mM塩化マグネシウム水溶液2μL、および鋳型DNA1μLを混合した。PCR反応の条件は、(i)94℃で2分間、(ii)94℃で15秒間、(iii)55℃で30秒間、(iv)68℃で2分間とし、(i)と(ii)を30サイクル繰返した。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子を、DNA精製キット(Promega社製,製品名「Wizard(登録商標) Genomic DNA Purification Kit)を用いて抽出した。
(1-5) Construction of AIU395 strain-derived L-lysine decarboxylation / oxidase gene expression system Sterile water (MilliQ) as a PCR reaction solution for amplifying the L-lysine decarboxylation / oxidase gene (SEQ ID NO: 1) 34 μL, Primer 5 (5′-GGAGATATACATGACCGCCTTCCTTGACCCAAC-3 ′, SEQ ID NO: 7,100 pmol), 1 μL Primer 2 (5′-TTAGCAGCCGGATCCTCACCCGCGTTGTTGTATCGC-3 ′, product OD OD manufactured by TOY K -Plus- ", 1 U / μL aqueous solution) 1 μL, 10 × PCR buffer, 2 mM dNTPs aqueous solution 5 μL, 25 mM magnesium chloride aqueous solution 2 μL, and template DNA 1 μL were mixed. The PCR reaction conditions were (i) 94 ° C for 2 minutes, (ii) 94 ° C for 15 seconds, (iii) 55 ° C for 30 seconds, (iv) 68 ° C for 2 minutes, (i) and (ii) Was repeated 30 cycles. The amplified gene was confirmed by agarose gel electrophoresis. The amplified gene was extracted using a DNA purification kit (manufactured by Promega, product name “Wizard (registered trademark) Genomic DNA Purification Kit).

(1−6) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子のベクターへの組換え
制限酵素NdeIおよびBamHIで処理したpET11a 1μL、上記で得たL−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子のPCR産物3μL、およびクローニングキット(タカラバイオ社製,製品名「5×In−Fusion HD Enzyme Premix」)1μLを混合して50℃で15分間反応させることにより、プラスミドベクターpET11aにL−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子を導入した。大腸菌JM109(DE3)のコンピテントセル50μLに、5μLの上記反応液を加え、ヒートショック法で形質転換を行った。100μg/mLのアンピシリンを含むLB培地に生育したコロニーから数株選抜してプラスミドを抽出し、0.7%アガロース電気泳動により、L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子の導入の有無を確認した。
(1-6) Recombination of AIU395 strain-derived L-lysine decarboxylase / oxidase gene into vector 1 μL of pET11a treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, PCR product of L-lysine decarboxylase / oxidase gene obtained above 3 μL and 1 μL of a cloning kit (product name “5 × In-Fusion HD Enzyme Premix”, manufactured by Takara Bio Inc.) were mixed and reacted at 50 ° C. for 15 minutes, whereby L-lysine decarboxylation / oxidation was performed on the plasmid vector pET11a. An enzyme gene was introduced. 5 μL of the above reaction solution was added to 50 μL of E. coli JM109 (DE3) competent cell, and transformation was performed by the heat shock method. Several strains were selected from colonies grown on LB medium containing 100 μg / mL ampicillin, plasmids were extracted, and the presence or absence of L-lysine decarboxylase / oxidase gene introduction was confirmed by 0.7% agarose electrophoresis.

(1−7) AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素遺伝子の発現と精製
80μg/mLのアンピシリンを含む4LのLB培地(1.0%ポリペプトン,0.5%イースト抽出物,1.0%NaCl,pH7.0)に組換え大腸菌(BL21)を植菌し、16℃で12時間培養後、0.5mM IPTGを添加して、引き続き30℃で12時間培養してL−アミノ酸オキシダーゼを誘導した。大型遠心機を用いて5,000rpm、4℃で10分間遠心分離することにより集菌し、生理食塩水(0.9%NaCl)で洗浄した後、100mLの20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁した。100mLの菌体液を15分間超音波処理し、8,000rpm、4℃で20分間遠心分離することにより得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を実施例2(3−3)〜(3−6)と同様の手法で精製を行った。
(1-7) Expression and purification of AIU395 strain-derived L-lysine decarboxylation / oxidase gene 4 L of LB medium (1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1.0) containing 80 μg / mL ampicillin % NaCl, pH 7.0), inoculated with recombinant E. coli (BL21), cultured at 16 ° C. for 12 hours, added with 0.5 mM IPTG, and subsequently cultured at 30 ° C. for 12 hours to obtain L-amino acid oxidase. Induced. Bacteria were collected by centrifugation at 5,000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes using a large centrifuge, washed with physiological saline (0.9% NaCl), and then 100 mL of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7. 0). A supernatant obtained by sonicating 100 mL of the cell solution for 15 minutes and centrifuging at 8,000 rpm, 4 ° C. for 20 minutes was used as a cell-free extract. The cell-free extract was purified by the same method as in Example 2 (3-3) to (3-6).

(2) AIU395株由来組換えL−リジン脱炭酸/酸化酵素の活性測定
上記精製酵素の酸化酵素活性を、表7におけるアミノ酸およびアミンをそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定した。その結果、表7の結果と同様に、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、L−リジンを基質として酸化する一方で、5−ヒドロキシL−リジンおよびカダベリンをわずかに基質とするのみで、その他のアミノ酸には全く活性を示さなかった。このように、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素は、組み換え酵素においても、L−リジンに対して高い特異性を示すことが明らかとなった。
(2) Activity measurement of AIU395 strain-derived recombinant L-lysine decarboxylation / oxidase The oxidase activity of the purified enzyme was measured with a measurement reagent containing each of the amino acids and amines in Table 7. As a result, similar to the results in Table 7, the L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention oxidizes using L-lysine as a substrate, while using 5-hydroxy L-lysine and cadaverine slightly as substrates. Only, it did not show any activity against other amino acids. Thus, it was revealed that the L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention exhibits high specificity for L-lysine even in recombinant enzymes.

実施例7: AIU395株由来L−リジン脱炭酸/酸化酵素を用いたL−リジンの定量
上記実施例1(1)の酸化酵素活性測定用試薬を調製した。次に、上記実施例1(1)において、L−リジン脱炭酸/酸化酵素の添加量を変えて、吸光度変化を測定した。L−リジン脱炭酸/酸化酵素の各添加量における20分後の吸光度変化を図9に示す。図9に示す結果によれば、1.3m unit以上で、L−リジン定量に問題なく使用できることが示唆された。
Example 7: Quantification of L-lysine using AIU395 strain-derived L-lysine decarboxylation / oxidase The reagent for measuring oxidase activity of Example 1 (1) was prepared. Next, in Example 1 (1) above, the change in absorbance was measured by changing the amount of L-lysine decarboxylation / oxidase added. FIG. 9 shows the change in absorbance after 20 minutes for each addition amount of L-lysine decarboxylation / oxidase. According to the result shown in FIG. 9, it was suggested that it can be used for L-lysine determination without problems at 1.3 munit or more.

また、上記試薬組成物を用い、L−リジン測定を実施した。検体として、反応液中の最終濃度が0〜1.0mMのL−リジン水溶液を調製した。L−リジンの各濃度における20分後の吸光度変化を図10に示す。   Moreover, L-lysine measurement was implemented using the said reagent composition. As a sample, an L-lysine aqueous solution having a final concentration in the reaction solution of 0 to 1.0 mM was prepared. FIG. 10 shows the change in absorbance after 20 minutes at each concentration of L-lysine.

図10のとおり、L−リジン溶液を検体とした場合には十分な反応性が認められ、水溶液において、L−リジン濃度と吸光度測定データは良好な正の相関を示した。従って、本発明のL−リジン測定用試薬組成物を用いることにより、正確なL−リジンの測定を行うことができることが実証された。   As shown in FIG. 10, when the L-lysine solution was used as a specimen, sufficient reactivity was observed, and in the aqueous solution, the L-lysine concentration and the absorbance measurement data showed a good positive correlation. Therefore, it was demonstrated that accurate L-lysine measurement can be performed by using the reagent composition for L-lysine measurement of the present invention.

実施例8: プトレシン酸化酵素によるカダベリンの定量
上記実施例2(7)のとおり、プトレシン酸化酵素は、L−リジンの脱炭酸により生じたカダベリンを定量するのに用いることができるので、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素と組合わせることにより、試料中のL−リジンを定量することができる。そこで、プトレシン酸化酵素につき詳しく調べた。
Example 8: Quantification of cadaverine with putrescine oxidase As described in Example 2 (7) above, putrescine oxidase can be used to quantify cadaverine produced by decarboxylation of L-lysine. By combining with such L-lysine decarboxylation / oxidase, L-lysine in the sample can be quantified. Therefore, the putrescine oxidase was examined in detail.

具体的には、上記実施例2(7)において、60μMカダベリンを基質とし、プトレシン酸化酵素の添加量を変えて吸光度変化を測定した。プトレシン酸化酵素の各添加量に対する20分後または30分後の吸光度変化を図11に示す。これらの結果により、200m unit以上のプトレシン酸化酵素を用いれば、カダベリン定量に問題なく使用できることが示唆された。   Specifically, in Example 2 (7) above, changes in absorbance were measured using 60 μM cadaverine as a substrate and varying the amount of putrescine oxidase added. FIG. 11 shows changes in absorbance after 20 minutes or 30 minutes with respect to each addition amount of putrescine oxidase. From these results, it was suggested that if putrescine oxidase of 200 munit or more is used, it can be used for cadaverine quantification without problems.

実施例9: 本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素とプトレシン酸化酵素とのカップリングにおける他のアミノ酸およびアミンの影響
表11は、30μMのL−リジンのみ、或いは、30μMのL−リジンと30μMのL−リジン以外のアミノ酸あるいはアミンを混和した液に、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素とプトレシン酸化酵素を、上記実施例2(7)と同じ割合で添加してpH7.0で30分間反応し,555nmの吸光度を測定した結果を示している。
Example 9: Effect of other amino acids and amines on the coupling of L-lysine decarboxylase / oxidase and putrescine oxidase according to the present invention Table 11 shows 30 μM L-lysine alone or 30 μM L-lysine And L-lysine decarboxylase / oxidase and putrescine oxidase according to the present invention were added to a solution in which an amino acid or amine other than L-lysine and 30 μM were mixed at the same ratio as in Example 2 (7) above, to pH 7 The result of having reacted at 0.0 for 30 minutes and measuring the absorbance at 555 nm is shown.

表11に示す結果のとおり、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素を用いれば、L−リジン以外のアミノ酸やアミンの存在下でも、プトレシン酸化酵素とのカップリングによるL−リジンの定量が可能であることが分かった。   As shown in Table 11, when the L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention is used, L-lysine quantification by coupling with putrescine oxidase even in the presence of amino acids and amines other than L-lysine. Was found to be possible.

実施例10: 本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素の添加量の検討
60μMのL−リジンを基質として、200mUのプトレシン酸化酵素を併用し、L−リジン脱炭酸/酸化酵素の添加量を変えて、pH7.0で30分間反応させた後、555nmの吸光度を測定した。結果を図12に示す。
Example 10: Examination of the addition amount of L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention The addition amount of L-lysine decarboxylation / oxidase using 200 μU of putrescine oxidase with 60 μM L-lysine as a substrate The reaction was carried out at pH 7.0 for 30 minutes, and the absorbance at 555 nm was measured. The results are shown in FIG.

図12に示す結果の通り、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素を用いれば、1.0mU以上の添加量で、L−リジンを十分に測定できることが明らかとなった。   As shown in the results shown in FIG. 12, it was revealed that L-lysine can be sufficiently measured with an addition amount of 1.0 mU or more when the L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention is used.

実施例11: 本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素を用いたL−リジン定量
0〜60μMのL−リジンに対してL−リジン脱炭酸/酸化酵素(1.5mU)とPUO(200mU)を添加して、pH7.0で30分間反応させた後、555nmの吸光度を測定した。結果を図13に示す。
Example 11: L-lysine quantification using L-lysine decarboxylase / oxidase according to the present invention L-lysine decarboxylase / oxidase (1.5 mU) and PUO (200 mU) for 0-60 μM L-lysine ) Was added and reacted at pH 7.0 for 30 minutes, and the absorbance at 555 nm was measured. The results are shown in FIG.

図13に示す結果の通り、本発明に係るL−リジン脱炭酸/酸化酵素を用いて検量線において、直線性が得られた。   As a result shown in FIG. 13, linearity was obtained in a calibration curve using the L-lysine decarboxylation / oxidase according to the present invention.

実施例12: カダベリン存在下でのプトレシン酸化酵素を用いたL−リジン測定方法
L−リジンの脱炭酸により生じるカダベリンは生体内でも生成するものであることから、試料中にカダベリンが存在すると、試料中のL−リジンを正確に測定できないおそれがある。そこで、図14(1)に示すように、基質として0〜60nmolのL−リジンを、60mmolのカダベリンと共に、200mU プトレシン酸化酵素、0.12μmol 4−AA、1.8U ペルオキシダーゼ、0.75mmol リン酸カリウムを含む反応液I(pH7.0)と混合し(総量:750μL)、30℃で20分間反応させた(Reaction I)。次いで、2.3UのL−リジン脱炭酸/酸化酵素と0.38μmol TOOSを含む反応液II(250μL)を添加し、30℃で30分間反応させ(Reaction II)、Reaction II中、生成する過酸化水素量を、555nmの吸収により確認した。
Example 12: Method for measuring L-lysine using putrescine oxidase in the presence of cadaverine Since cadaverine produced by decarboxylation of L-lysine is also generated in vivo, when cadaverine is present in the sample, There is a possibility that L-lysine contained therein cannot be measured accurately. Therefore, as shown in FIG. 14 (1), 0 to 60 nmol of L-lysine as a substrate together with 60 mmol of cadaverine, 200 mU putrescine oxidase, 0.12 μmol 4-AA, 1.8 U peroxidase, 0.75 mmol phosphoric acid It was mixed with a reaction solution I (pH 7.0) containing potassium (total amount: 750 μL) and reacted at 30 ° C. for 20 minutes (Reaction I). Then, reaction solution II (250 μL) containing 2.3 U of L-lysine decarboxylase / oxidase and 0.38 μmol TOOS was added, and the mixture was reacted at 30 ° C. for 30 minutes (Reaction II). The amount of hydrogen oxide was confirmed by absorption at 555 nm.

図14(2)に示す結果のとおり、試料中のL−リジンの濃度と生成する過酸化水素量による吸光度変化には相関関係が見られる。これは、試料中にカダベリンが存在していても、上記Reaction Iにおいてプトレシン酸化酵素により酸化され、且つ当該反応により生じた過酸化水素がペルオキシダーゼにより分解されるため、L−リジン脱炭酸/酸化酵素によるL−リジンの測定結果に影響は及ばないことによる。かかる結果により、プトレシン酸化酵素を先に添加することで、試料中に存在するカダベリンを除去することが可能であり、L−リジン定量に影響が出ないことが明らかとなった。   As shown in FIG. 14 (2), there is a correlation between the L-lysine concentration in the sample and the change in absorbance due to the amount of hydrogen peroxide produced. This is because even if cadaverine is present in the sample, it is oxidized by putrescine oxidase in the above Reaction I, and hydrogen peroxide generated by the reaction is decomposed by peroxidase. This is because there is no influence on the measurement result of L-lysine. From these results, it was clarified that cadaverine existing in the sample can be removed by adding putrescine oxidase first, and L-lysine quantification is not affected.

実施例13: Burkholderia属細菌由来のL−リジン脱炭酸/酸化酵素の活性
上記実施例2と同様の条件で、岩手大学が保有していたBurkholderia sp. AIU129株と、微生物株保存機関NBRCより購入したBurkholderia ginsengisoli NBRC100965、Burkholderia ferrariae NBRC106233およびBurkholderia terrae NBRC100964を培養し、粗酵素液を調製した。なお、各菌株の最適培養温度が異なるが、培養温度は25℃とした。得られた各酵素について、上記実施例1および実施例2と同様にして、L−リジンに対する酸化酵素活性と脱炭酸酵素活性を測定した。結果を、Burkholderia sp. AIU395株の結果と共に表12に示す。
Example 13: Activity of L-lysine decarboxylation / oxidase derived from Burkholderia bacteria Under the same conditions as in Example 2 above, Burkholderia sp. AIU129 strain and Burkholderia ginsengolii NBRC100655, Burkholderia ferrariae NBRC106233, and Burkholderia terrae NBRC100964, which were purchased from the microbial strain storage organization NBRC, were prepared and cultured. In addition, although the optimal culture | cultivation temperature of each strain differs, culture | cultivation temperature was 25 degreeC. About each obtained enzyme, it carried out similarly to the said Example 1 and Example 2, and measured the oxidase activity and decarboxylase activity with respect to L-lysine. The results are shown in Burkholderia sp. It shows in Table 12 with the result of AIU395 strain | stump | stock.

表12に示した結果のとおり、いずれのBurkholderia属細菌にもL−リジン脱炭酸酵素活性とL−リジン酸化酵素活性の両方が認められた。従って、Burkholderia属細菌において、L−リジン脱炭酸/酸化酵素が保存されている可能性が示唆された。   As shown in Table 12, both Burkholderia bacteria showed both L-lysine decarboxylase activity and L-lysine oxidase activity. Therefore, it was suggested that L-lysine decarboxylation / oxidase may be conserved in Burkholderia bacteria.

Claims (13)

下記の(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とするL−リジン脱炭酸/酸化酵素。
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を有し、且つL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有するアミノ酸配列;
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、且つL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。
An L-lysine decarboxylase / oxidase having an amino acid sequence of any one of (1) to (3) below:
(1) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(2) an amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of 1 to several amino acids and having L-lysine decarboxylase / oxidase activity in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(3) An amino acid sequence having 95% or more homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having L-lysine decarboxylation / oxidase activity.
バークホルデリア(Burkholderia)属細菌由来のものである請求項1に記載のL−リジン脱炭酸/酸化酵素。   The L-lysine decarboxylation / oxidase according to claim 1, which is derived from a bacterium belonging to the genus Burkholderia. バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株(受託番号:NITE P−01796)由来のものである請求項1に記載のL−リジン脱炭酸/酸化酵素。   The L-lysine decarboxylation / oxidase according to claim 1, which is derived from Burkholderia sp. AIU395 strain (Accession number: NITE P-01796). 下記の(1’)〜(3’)の何れかの塩基配列を有することを特徴とする核酸。
(1’)配列番号1に記載の塩基配列
(2’)配列番号1に記載の塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換および/または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有する塩基配列
(3’)配列番号1に記載の塩基配列に対して95%以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がL−リジン脱炭酸/酸化酵素活性を有する塩基配列。
A nucleic acid having any one of the following base sequences (1 ′) to (3 ′):
(1 ′) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (2 ′) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has one to several base deletions, substitutions and / or additions, and the nucleotide sequence is The base sequence in which the encoded protein has L-lysine decarboxylation / oxidase activity (3 ′) has a homology of 95% or more with respect to the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and the base sequence encodes A base sequence in which a protein has L-lysine decarboxylation / oxidase activity.
請求項4に記載の核酸を含むことを特徴とする形質転換体。   A transformant comprising the nucleic acid according to claim 4. 検体中のL−リジンを測定する方法であって、
(A)必要に応じて、L−リジンの量が明らかな複数の試料につき以降と同様の工程を行い、当該L−リジン量と下記工程(D)で計測すべき反応生成物の量との関係を明らかにしておく工程;
(B)必要に応じて、検体にプトレシン酸化酵素を作用させることにより検体中のカダベリンを酸化する工程;
(C)検体に請求項1〜3のいずれかに記載のL−リジン脱炭酸/酸化酵素を作用させる工程;および
(D)上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする方法。
A method for measuring L-lysine in a specimen,
(A) If necessary, the same steps as described above are performed for a plurality of samples in which the amount of L-lysine is clear, and the amount of L-lysine and the amount of the reaction product to be measured in the following step (D) The process of clarifying the relationship;
(B) A step of oxidizing cadaverine in the specimen by allowing putrescine oxidase to act on the specimen, if necessary;
(C) a step of allowing the L-lysine decarboxylation / oxidase according to any one of claims 1 to 3 to act on a specimen; and (D) at least a reaction product produced by the action of the L-lysine decarboxylation / oxidase. A method comprising the step of measuring a kind of quantity.
上記工程(C)において、上記L−リジン脱炭酸/酸化酵素の作用により生成するカダベリンをプトレシン酸化酵素により酸化し、且つ、上記工程(D)において、反応生成物である過酸化水素の量を計測する請求項6に記載の方法。   In the step (C), cadaverine produced by the action of the L-lysine decarboxylase / oxidase is oxidized by putrescine oxidase, and in the step (D), the amount of hydrogen peroxide as a reaction product is determined. The method of Claim 6 which measures. 上記プトレシン酸化酵素として、コクリア ロゼア(Kokuria rosea)NBRC 3768株由来のものを用いる請求項6または7に記載の方法。   The method according to claim 6 or 7, wherein the putrescine oxidase is derived from Kokuria rosea NBRC 3768 strain. 請求項1〜3のいずれかに記載のL−リジン脱炭酸/酸化酵素を含むことを特徴とするL−リジン測定用キット。   A kit for measuring L-lysine, comprising the L-lysine decarboxylation / oxidase according to any one of claims 1 to 3. さらにプトレシン酸化酵素を含む請求項9に記載のL−リジン測定用キット。   The kit for measuring L-lysine according to claim 9, further comprising putrescine oxidase. さらに、ペルオキシダーゼと発色試薬を含む過酸化水素検出用試薬を含む請求項9または10に記載のL−リジン測定用キット。   The kit for measuring L-lysine according to claim 9 or 10, further comprising a hydrogen peroxide detection reagent containing peroxidase and a coloring reagent. L−リジンを測定するための酵素センサであって、過酸化水素検出用電極を有し、当該過酸化水素検出用電極の表面または近傍に請求項1〜3のいずれかに記載のL−リジン脱炭酸/酸化酵素が配置されていることを特徴とするL−リジン測定用酵素センサ。   An enzyme sensor for measuring L-lysine, comprising an electrode for hydrogen peroxide detection, wherein the L-lysine according to any one of claims 1 to 3 is disposed on or near the surface of the hydrogen peroxide detection electrode. An enzyme sensor for L-lysine measurement, wherein a decarboxylation / oxidase is arranged. バークホルデリア・エスピー(Burkholderia sp.)AIU395株(受託番号:NITE P−01796)。   Burkholderia sp. AIU395 strain (Accession number: NITE P-01796).
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