JP2015163056A - Intracellular introduction agent of target protein, nucleic acid, and intracellular introduction method of target protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標的タンパク質の細胞内導入剤、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び標的タンパク質の細胞内導入方法に関する。 The present invention relates to an intracellular introduction agent for a target protein, a nucleic acid encoding the intracellular introduction agent, and a method for introducing the target protein into the cell.
タンパク質は、酵素反応やシグナル伝達、遺伝子発現の調整等の細胞の機能制御に重要な役割を果たしている。このため、細胞内へのタンパク質導入技術の開発が求められている。 Proteins play an important role in controlling cellular functions such as enzyme reactions, signal transduction, and regulation of gene expression. For this reason, development of protein introduction technology into cells is required.
例えば、非特許文献１には、ポリエチレンイミンを用いてタンパク質を細胞内に導入したことが記載されている。 For example, Non-Patent Document 1 describes that a protein is introduced into cells using polyethyleneimine.
一方、バクテリオファージＴ４由来の針タンパク質は、宿主である大腸菌の細胞膜を透過することが知られている（例えば、非特許文献２を参照）。 On the other hand, it is known that a needle protein derived from bacteriophage T4 permeates the cell membrane of Escherichia coli as a host (see, for example, Non-Patent Document 2).
しかしながら、従来の標的タンパク質の細胞内導入技術では、細胞に対する毒性が高い場合があった。また、細胞内への標的タンパク質の導入効率が十分でない場合があった。また、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体から標的タンパク質を放出させることが困難である場合があった。 However, the conventional technique for introducing a target protein into a cell may be highly toxic to cells. Moreover, the introduction efficiency of the target protein into the cell may not be sufficient. Moreover, it may be difficult to release the target protein from the carrier after the intracellular introduction of the target protein.
そこで、本発明は、細胞に対する毒性が低く、細胞内への標的タンパク質の導入効率が高く、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出が容易な、標的タンパク質の細胞内導入剤を提供することを目的とする。本発明はまた、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び当該細胞内導入剤を用いた標的タンパク質の細胞内導入方法を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention has a low target cell toxicity, high efficiency of target protein introduction into the cell, and easy release of the target protein from the carrier (intracellular introduction agent) after introduction of the target protein into the cell. It is an object to provide a protein intracellular introduction agent. Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the intracellular introduction agent and a method for introducing a target protein into the cell using the intracellular introduction agent.
本発明は以下の通りである。
［ｉ］以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ａ）下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ …（１）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）のアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（２）：
［（Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’）３］２ …（２）
（式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（１）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
The present invention is as follows.
[I] An agent for introducing a target protein into a cell comprising a polypeptide having the following amino acid sequence (a) or (b):
(A) The following formula (1):
Xn -YZ (1)
(In the formula, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, and Z represents the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9). An amino acid sequence selected from the above, wherein n is an integer of 1 to 8.)
(B) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and the following formula (2):
[(X ′ n −Y′−Z ′) 3 ] 2 (2)
(In the formula, X ′, Y ′, and Z ′ are amino acid sequences in which 0 or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by X, Y, and Z in the formula (1), respectively. An amino acid sequence in which the polypeptide complex represented by (2) has an intracellular translocation activity.
［ｉｉ］以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチド複合体からなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｃ）下記式（３）：
［（Ｘｎ−Ｙ−Ｚ）３］２ …（３）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）で示されるポリペプチド複合体、
（ｄ）前記（ｃ）のポリペプチド複合体において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、かつ細胞内移行活性を有するポリペプチド複合体。
[Ii] An agent for introducing a target protein into the cell comprising the polypeptide complex of (c) or (d) below.
(C) The following formula (3):
[(X n -YZ) 3 ] 2 (3)
(In the formula, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, and Z represents the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9). A polypeptide complex represented by the following: n represents an amino acid sequence selected from the above, and n is an integer of 1 to 8.
(D) A polypeptide complex in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide complex of (c) and have intracellular translocation activity.
［ｉｉｉ］以下の（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸。
（ｅ）下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ …（１）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）のアミノ酸配列、
（ｆ）前記（ｅ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（２）：
［（Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’）３］２ …（２）
（式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（１）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
[Iii] A nucleic acid encoding a polypeptide having the following amino acid sequence (e) or (f):
(E) The following formula (1):
Xn -YZ (1)
(In the formula, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, and Z represents the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9). An amino acid sequence selected from the above, wherein n is an integer of 1 to 8.)
(F) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (e), and the following formula (2):
[(X ′ n −Y′−Z ′) 3 ] 2 (2)
(In the formula, X ′, Y ′, and Z ′ are amino acid sequences in which 0 or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by X, Y, and Z in the formula (1), respectively. An amino acid sequence in which the polypeptide complex represented by (2) has an intracellular translocation activity.
［ｉｖ］以下の（ｇ）又は（ｈ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｇ）下記式（４）：
ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ …（４）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数であり、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）のアミノ酸配列、
（ｈ）前記（ｇ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（５）：
［（ＷＡ−Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’−ＶＢ）３］２ …（５）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（４）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
[Iv] An agent for introducing a target protein into a cell comprising a polypeptide having the following amino acid sequence (g) or (h):
(G) The following formula (4):
W A -X n -Y-Z- V B ... (4)
(Wherein W and V represent the amino acid sequence of the target protein, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents the amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, Z represents an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9, n is an integer of 1 to 8, A and B are integers of 0 or 1, and A and B are simultaneously An amino acid sequence of 0)
(H) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (g), and the following formula (5):
[(W A -X 'n -Y' -Z'-V B) 3] 2 ... (5)
(Wherein, W and V represent the amino acid sequence of the target protein, and X ′, Y ′, and Z ′ are 0 or more in the amino acid sequence represented by X, Y, and Z in Formula (4), respectively. Wherein A and B are integers of 0 or 1, and A and B are not 0 at the same time.) An amino acid sequence having intracellular translocation activity.
［ｖ］以下の（ｉ）又は（ｊ）の融合タンパク質複合体からなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｉ）下記式（６）：
［（ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ）３］２ …（６）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数であり、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）で示される融合タンパク質複合体、
（ｊ）前記式（６）のＸｎ−Ｙ−Ｚで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された融合タンパク質複合体であって、かつ細胞内移行活性を有する融合タンパク質複合体。
[V] A target protein intracellular introduction agent comprising the fusion protein complex of (i) or (j) below.
(I) The following formula (6):
[(W A -X n -Y- Z-V B) 3] 2 ... (6)
(Wherein W and V represent the amino acid sequence of the target protein, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents the amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, Z represents an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9, n is an integer of 1 to 8, A and B are integers of 0 or 1, and A and B are simultaneously A fusion protein complex represented by:
(J) a fusion protein complex in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by X n -YZ in the above formula (6), and its intracellular translocation activity A fusion protein complex having:
［ｖｉ］前記標的タンパク質が、分子量３０ｋＤａ以下のタンパク質である、［ｉｖ］又は［ｖ］に記載の標的タンパク質の細胞内導入剤。 [Vi] The target protein intracellular introduction agent according to [iv] or [v], wherein the target protein is a protein having a molecular weight of 30 kDa or less.
［ｖｉｉ］［ｉｖ］〜［ｖｉ］のいずれか一項に記載の標的タンパク質の細胞内導入剤を対象細胞に接触させる工程を含む、標的タンパク質の細胞内導入方法。 [Vii] A method for intracellularly introducing a target protein, comprising the step of bringing the target protein intracellularly introducing agent according to any one of [iv] to [vi] into contact with a target cell.
本発明によれば、細胞に対する毒性が低く、細胞内への標的タンパク質の導入効率が高く、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出が容易な、標的タンパク質の細胞内導入剤を提供することができる。本発明はまた、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び当該細胞内導入剤を用いた標的タンパク質の細胞内導入方法を提供することができる。 According to the present invention, the target has low toxicity to cells, high efficiency of introducing the target protein into the cell, and easy release of the target protein from the carrier (intracellular introduction agent) after the target protein is introduced into the cell. An agent for introducing a protein into a cell can be provided. The present invention can also provide a nucleic acid encoding the intracellular introduction agent and a method for intracellular introduction of a target protein using the intracellular introduction agent.
《標的タンパク質の細胞内導入剤》
バクテリオファージは、細菌や動物細胞に、核酸とともに必要なタンパク質を注入する。本発明の標的タンパク質の細胞内導入剤は、バクテリオファージが核酸やタンパク質を細胞に導入する機構を応用したものである。
《Target protein intracellular introduction agent》
Bacteriophages inject bacteria and animal cells with necessary proteins along with nucleic acids. The target protein intracellular introduction agent of the present invention applies a mechanism by which bacteriophages introduce nucleic acids and proteins into cells.
１実施形態に係る標的タンパク質の細胞内導入剤は、下記式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる。
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ …（１）
式（１）中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。
The target protein intracellular introduction agent according to one embodiment comprises a polypeptide consisting of an amino acid sequence of the following formula (1).
Xn -YZ (1)
In formula (1), X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, and Z represents the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 6 to 9. An amino acid sequence selected from the group consisting of n is an integer of 1-8.
式（１）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、バクテリオファージの尾（Ｔａｉｌ）の針部分（細胞内導入部）に基づいて設計されたものである。このポリペプチドは、後述するように安定な６量体を形成する。この６量体は、細胞にダメージを与えることなく細胞膜を貫通することができる。さらに、この６量体は、１００℃の温度環境下、ｐＨ２〜１１の環境下、有機溶媒を５０〜７０容量％含む溶媒中等の環境下でも非常に安定である。 The polypeptide having the amino acid sequence represented by the formula (1) is designed based on the needle portion (intracellular introduction portion) of the bacteriophage tail. This polypeptide forms a stable hexamer as described below. This hexamer can penetrate the cell membrane without damaging the cells. Furthermore, this hexamer is very stable even under an environment such as a temperature environment of 100 ° C., an environment of pH 2 to 11, and an environment containing 50 to 70% by volume of an organic solvent.
式（１）中、ＸはバクテリオファージＴ４の三重らせんβヘリックスの部分のアミノ酸配列であり、この配列を繰り返すことにより、式（１）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの長さを調節することができる。ポリペプチドが長くなると、その分修飾可能な領域を増加させることができ、例えば金属錯体や蛍光色素等の追加的な機能を付加することが可能になる。Ｘのアミノ酸配列としては、配列番号１のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１１に示す。 In formula (1), X is the amino acid sequence of the triple helix β helix part of bacteriophage T4, and by repeating this sequence, the length of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by formula (1) is regulated. be able to. When the polypeptide becomes longer, the region that can be modified can be increased accordingly, and for example, an additional function such as a metal complex or a fluorescent dye can be added. The amino acid sequence of X includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 11.
式（１）中、Ｘｎにおけるｎは繰り返しの数を示す。例えば、ｎ＝２の場合、式（１）のアミノ酸配列は「Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｚ」のアミノ酸配列を意味する。 In formula (1), n in Xn represents the number of repetitions. For example, when n = 2, the amino acid sequence of the formula (1) means an amino acid sequence of “XXYZ”.
式（１）中、Ｙはバクテリオファージのニードル蛋白質のＣ末端部分のアミノ酸配列である。Ｙに使用可能なアミノ酸配列としては、例えば、バクテリオファージＴ４のｇｐ５のアミノ酸配列、バクテリオファージＰ２のｇｐＶのアミノ酸配列、バクテリオファージＭｕのｇｐ４５のアミノ酸配列、バクテリオファージφ９２のｇｐ１３８のアミノ酸配列が挙げられる。より具体的には、バクテリオファージＴ４のｇｐ５のアミノ酸配列として配列番号２のアミノ酸配列が、バクテリオファージＰ２のｇｐＶのアミノ酸配列として配列番号３のアミノ酸配列が、バクテリオファージＭｕのｇｐ４５のアミノ酸配列として配列番号４のアミノ酸配列が、バクテリオファージφ９２のｇｐ１３８のアミノ酸配列として配列番号５のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号２〜５のアミノ酸配列をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１２〜１５に示す。 In formula (1), Y is the amino acid sequence of the C-terminal part of the bacteriophage needle protein. Examples of amino acid sequences that can be used for Y include the gp5 amino acid sequence of bacteriophage T4, the gpV amino acid sequence of bacteriophage P2, the gp45 amino acid sequence of bacteriophage Mu, and the gp138 amino acid sequence of bacteriophage φ92. . More specifically, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as the gp5 amino acid sequence of bacteriophage T4, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as the amino acid sequence of gpV of bacteriophage P2, and the amino acid sequence of gp45 of bacteriophage Mu As the amino acid sequence of No. 4, the amino acid sequence of SEQ ID No. 5 is exemplified as the amino acid sequence of gp138 of bacteriophage φ92. The nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5 are shown in SEQ ID NOs: 12 to 15, respectively.
式（１）中、ＺはバクテリオファージＴ４のｆｏｌｄｏｎと呼ばれる領域のアミノ酸配列、又は、バクテリオファージＰ２若しくはバクテリオファージＭｕ若しくはバクテリオファージφ９２のｔｉｐと呼ばれる領域のアミノ酸配列である。 In formula (1), Z is the amino acid sequence of the region called foldon of bacteriophage T4, or the amino acid sequence of the region called tip of bacteriophage P2 or bacteriophage Mu or bacteriophage φ92.
ｆｏｌｄｏｎ又はｔｉｐは、バクテリオファージのフィブリチンと呼ばれる構造体の３量体化を促進する領域である。ｆｏｌｄｏｎ又はｔｉｐのアミノ酸配列を有することにより、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、３量体化して安定化すると考えられる。 Foldon or tip is a region that promotes trimerization of a structure called bacteriophage fibrin. By having the amino acid sequence of foldon or tip, it is considered that the polypeptide consisting of the amino acid sequence of formula (1) is trimerized and stabilized.
バクテリオファージＴ４のｆｏｌｄｏｎのアミノ酸配列を配列番号６に、ｆｏｌｄｏｎをコードする塩基配列を配列番号１６に示す。バクテリオファージＰ２のｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号７に、バクテリオファージＰ２のｔｉｐをコードする塩基配列を配列番号１７に示す。バクテリオファージＭｕのｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号８に、バクテリオファージＭｕのｔｉｐをコードする塩基配列を配列番号１８に示す。バクテリオファージφ９２のｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号９に、バクテリオファージφ９２のｔｉｐをコードする塩基配列を配列番号１９に示す。 The amino acid sequence of foldon of bacteriophage T4 is shown in SEQ ID NO: 6, and the nucleotide sequence encoding foldon is shown in SEQ ID NO: 16. The amino acid sequence of the tip of bacteriophage P2 is shown in SEQ ID NO: 7, and the nucleotide sequence encoding the tip of bacteriophage P2 is shown in SEQ ID NO: 17. The amino acid sequence of the bacteriophage Mu tip is shown in SEQ ID NO: 8, and the base sequence encoding the bacteriophage Mu tip is shown in SEQ ID NO: 18. The amino acid sequence of the tip of bacteriophage φ92 is shown in SEQ ID NO: 9, and the base sequence encoding the tip of bacteriophage φ92 is shown in SEQ ID NO: 19.
式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、目的とする活性、すなわち、後述する６量体を形成した場合に、細胞内移行活性、すなわち、細胞膜を通過して細胞内に移行する活性を有している限り、変異を有していてもよい。例えば、式（１）で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。ここで、１若しくは数個とは、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。ここで、上記６量体はホモ６量体であってもヘテロ６量体であってもよい。 The polypeptide consisting of the amino acid sequence of formula (1) has a target activity, that is, an intracellular translocation activity, that is, an activity to migrate into the cell through the cell membrane when a hexamer described later is formed. As long as it has, you may have a variation | mutation. For example, the amino acid sequence represented by the formula (1) may be an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added. Here, 1 or several means 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5. Here, the hexamer may be a homo hexamer or a hetero hexamer.
１実施形態において、本発明は、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸を提供する。式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、これをコードする核酸を遺伝子組換え技術により連結し、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主細胞内で、あるいは大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等の無細胞発現系で発現させることにより製造することができる。ここで、発現後に精製を容易にするために、ポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側にヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ等のペプチド鎖を付加してもよい。 In one embodiment, the present invention provides a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of formula (1). A polypeptide consisting of the amino acid sequence of formula (1) is obtained by linking nucleic acids encoding the polypeptide by genetic recombination technology, in a host cell such as E. coli, yeast, insect cell, animal cell, etc. It can be produced by expressing it in a cell-free expression system such as erythrocyte extract or wheat germ extract. Here, in order to facilitate purification after expression, a peptide chain such as a histidine tag, GST tag, or FLAG tag may be added to the N-terminal side or C-terminal side of the polypeptide.
《６量体》
式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、その構造特性に基づいて、自発的に３量体化する。さらにこの３量体２分子がＮ末端側で会合して６量体を形成する。ここで、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが形成した３量体を、式（７）：
（Ｘｎ−Ｙ−Ｚ）３ …（７）
のように示し、この３量体２分子がＮ末端側で会合して形成した６量体を式（３）：
[（Ｘｎ−Ｙ−Ｚ）３]２ …（３）
のように示す。上述したように、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは変異を有していてもよい。また、上記の６量体はホモ６量体であってもヘテロ６量体であってもよい。以下の実施例で示すように、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現させると、このポリペプチドは自然に自己会合して上記式（３）で示される６量体を形成する。この６量体のポリペプチド複合体は、細胞内移行活性、すなわち、細胞膜を通過して細胞内に移行する活性を有する。このため、このポリペプチド複合体に標的タンパク質を結合させることにより、標的タンパク質を対象細胞の細胞内に導入することが可能となる。
<< hexamer >>
A polypeptide consisting of the amino acid sequence of formula (1) spontaneously trimers based on its structural characteristics. Furthermore, these 2 molecules of trimer associate on the N-terminal side to form a hexamer. Here, a trimer formed by a polypeptide having the amino acid sequence of formula (1) is represented by formula (7):
( Xn -YZ) 3 ... (7)
A hexamer formed by associating two molecules of this trimer on the N-terminal side is represented by the formula (3):
[(X n -YZ) 3 ] 2 (3)
As shown. As described above, the polypeptide consisting of the amino acid sequence of formula (1) may have a mutation. The hexamer may be a homo hexamer or a hetero hexamer. As shown in the following examples, when a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the formula (1) is expressed, the polypeptide spontaneously self-associates to form a hexamer represented by the formula (3). This hexameric polypeptide complex has an intracellular translocation activity, that is, an activity of translocating into the cell through the cell membrane. Therefore, the target protein can be introduced into the target cell by binding the target protein to the polypeptide complex.
１実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入剤は、上記式（３）で示されるポリペプチド複合体からなる。 In one embodiment, the intracellular introduction agent of the target protein consists of a polypeptide complex represented by the above formula (3).
《標的タンパク質の細胞内導入剤への結合》
１実施形態において、細胞内導入剤への標的タンパク質の結合は、遺伝子組み換えにより、上述した式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を作製して発現させることによって行うことができる。ここで、核酸としては、上記の融合タンパク質を発現させることができる限り、使用する発現系に応じてＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
<Binding of target protein to intracellular agent>
In one embodiment, binding of a target protein to an intracellular introduction agent is performed by producing a nucleic acid encoding a fusion protein of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of formula (1) and the target protein by genetic recombination. Can be done. Here, the nucleic acid may be DNA or RNA depending on the expression system used as long as the above fusion protein can be expressed.
標的タンパク質としては、分子量３０ｋＤａ以下のタンパク質；ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質；Ａｓｃｌ１、Ａｔｏｈ１等の転写因子タンパク質が挙げられる。 Target proteins include proteins with a molecular weight of 30 kDa or less; fluorescent proteins such as GFP (green fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein), BFP (blue fluorescent protein), CFP (cyan fluorescent protein); transcription factors such as Ascl1 and Atoh1 Examples include proteins.
標的タンパク質は、細胞内導入剤のＮ末端に結合してもＣ末端に結合してもよい。また、Ｎ末端とＣ末端の両方に結合してもよく、Ｎ末端とＣ末端の両方に、それぞれ異なる標的タンパク質を結合してもよい。細胞導入剤と標的タンパク質は、リンカーを介して結合してもよい。リンカーとしては、例えばアミノ酸配列「ＳＳＶＰＰ」、「ＤＶＥＤ」等からなるリンカーが挙げられる。 The target protein may be bound to the N-terminus or C-terminus of the intracellular introduction agent. Moreover, you may couple | bond with both N terminal and C terminal, and you may couple | bond different target proteins with both N terminal and C terminal, respectively. The cell introduction agent and the target protein may be bound via a linker. Examples of the linker include linkers composed of amino acid sequences “SSVPP”, “DVED” and the like.
例えば、標的タンパク質が結合した細胞内導入剤のアミノ酸配列は、下記式（４）で示されるものであってよい。
ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ …（４）
For example, the amino acid sequence of the intracellular introduction agent to which the target protein is bound may be represented by the following formula (4).
W A -X n -Y-Z- V B ... (4)
式（４）中、Ｘｎ−Ｙ−Ｚで示される部分については、上述した通りである。式（４）中、Ｗは細胞内導入剤のＮ末端側に結合された標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｖは細胞内導入剤のＣ末端側に結合された標的タンパク質のアミノ酸配列を示す。式（４）において、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。すなわち、少なくとも細胞内導入剤のＮ末端側とＣ末端側のいずれか一方には標的タンパク質のアミノ酸配列が結合されている。 In formula (4), the part represented by X n -YZ is as described above. In formula (4), W represents the amino acid sequence of the target protein bound to the N-terminal side of the intracellular introduction agent, and V represents the amino acid sequence of the target protein bound to the C-terminal side of the intracellular introduction agent. In formula (4), A and B are integers of 0 or 1, and A and B are not 0 at the same time. That is, the amino acid sequence of the target protein is bound to at least one of the N-terminal side and the C-terminal side of the intracellular introduction agent.
１実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入剤は、上記式（４）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる。 In one embodiment, the intracellular introduction agent of the target protein consists of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the above formula (4).
式（４）のアミノ酸配列をコードする核酸は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主細胞内で、あるいは大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等の無細胞発現系で発現させることができる。式（４）のアミノ酸配列をコードする核酸の発現用ベクターとしては、各発現系に応じたものを用いることができ、例えば大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ−１、動物細胞発現用のｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ、小麦胚芽抽出液発現用のｐＦ３Ａ等が挙げられる。ここで、発現後に精製を容易にするために、ポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側にヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ等のペプチド鎖を付加してもよい。 The nucleic acid encoding the amino acid sequence of the formula (4) can be used in a host cell such as Escherichia coli, yeast, insect cell, animal cell, or cell-free such as Escherichia coli extract, rabbit reticulocyte extract, wheat germ extract, etc. It can be expressed in an expression system. As a vector for expression of a nucleic acid encoding the amino acid sequence of formula (4), a vector suitable for each expression system can be used, for example, pET for expression of E. coli, pAUR for expression of yeast, pIEx for expression of insect cells. -1, pBApo-CMV for animal cell expression, pF3A for wheat germ extract expression, and the like. Here, in order to facilitate purification after expression, a peptide chain such as a histidine tag, GST tag, or FLAG tag may be added to the N-terminal side or C-terminal side of the polypeptide.
標的タンパク質が結合した細胞内導入剤である融合タンパク質は、上述したいずれかの発現系で発現させると、自然に自己会合して、下記式（６）で示される６量体を形成する。式（６）中、ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢで示される部分については上述した通りである。この融合タンパク質の複合体を、対象細胞への標的タンパク質の導入に使用することができる。
［（ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ）３］２ …（６）
When expressed in any of the expression systems described above, the fusion protein, which is an intracellular introduction agent to which the target protein is bound, spontaneously self-associates to form a hexamer represented by the following formula (6). In the formula (6) is as described above for the moiety represented by W A -X n -Y-Z- V B. This fusion protein complex can be used to introduce a target protein into a target cell.
[(W A -X n -Y- Z-V B) 3] 2 ... (6)
１実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入剤は、上記式（６）で示される融合タンパク質の複合体からなる。 In one embodiment, the intracellular introduction agent of the target protein consists of a complex of the fusion protein represented by the above formula (6).
１実施形態において、細胞内導入剤への標的タンパク質の結合は、化学修飾により行ってもよい。例えば、細胞内導入剤上のリシン残基又はシステイン残基と、標的タンパク質上のリシン残基又はシステイン残基とを、スクシンイミド基又はマレイミド基を有するリンカーによって連結する等の方法により、標的タンパク質を化学修飾で細胞内導入剤に結合させることができる。 In one embodiment, binding of the target protein to the intracellular introduction agent may be performed by chemical modification. For example, the target protein can be obtained by linking a lysine residue or cysteine residue on the intracellular introduction agent to a lysine residue or cysteine residue on the target protein with a linker having a succinimide group or a maleimide group. It can be bound to an intracellular introduction agent by chemical modification.
《標的タンパク質の細胞内導入方法》
１実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入方法は、標的タンパク質が結合した細胞内導入剤である、上記式（６）で示される融合タンパク質の複合体を、対象細胞に接触させる工程を含む。
<Intracellular introduction method of target protein>
In one embodiment, the method for introducing a target protein into a cell includes a step of contacting a target cell with a complex of a fusion protein represented by the above formula (6), which is an intracellular introduction agent to which the target protein is bound.
対象細胞は、インビトロで培養された培養細胞であっても、生体内の細胞であってもよい。１実施形態において、生体はヒト以外の動物である。 The target cell may be a cultured cell cultured in vitro or an in vivo cell. In one embodiment, the living body is a non-human animal.
１実施形態において、対象細胞に融合タンパク質の複合体を接触させる工程は、対象細胞である培養細胞の培地に上述の融合タンパク質の複合体を添加することによって行うことができる。例えば、融合タンパク質の複合体は、好ましくは終濃度０．５〜１．０μＭ、より好ましくは終濃度１．０〜５．０μＭの濃度で培地中に添加すればよい。 In one embodiment, the step of bringing the fusion protein complex into contact with the target cell can be performed by adding the above-described fusion protein complex to the culture medium of the cultured cell that is the target cell. For example, the fusion protein complex is preferably added to the medium at a final concentration of 0.5 to 1.0 μM, more preferably at a final concentration of 1.0 to 5.0 μM.
１実施形態において、対象細胞に融合タンパク質の複合体を接触させる工程は、対象細胞が存在する動物の組織に、融合タンパク質の複合体の懸濁液を注入することによって行うことができる。注入量は、対象細胞が存在する動物の組織に応じて適宜調整すればよい。例えば、マウス胎児の脳に注入する場合、１〜１０μＭの融合タンパク質の複合体を０．５〜１．０μＬ注入すればよい。 In one embodiment, the step of bringing the fusion protein complex into contact with the target cells can be performed by injecting a suspension of the fusion protein complex into the tissue of an animal in which the target cells are present. The injection amount may be appropriately adjusted according to the animal tissue in which the target cells are present. For example, when injecting into the brain of a mouse fetus, 0.5 to 1.0 μL of a 1 to 10 μM fusion protein complex may be injected.
《標的タンパク質の細胞内での放出》
後述するように、本実施形態の方法により細胞内に導入された標的タンパク質は、細胞内で、容易に細胞内導入剤から開裂させ、放出することができる。例えば、上記式（４）のＷで示される標的タンパク質のアミノ酸配列中に、プロテアーゼにより切断されやすいアミノ酸配列を導入してもよい。このようなアミノ酸配列として、具体的には、ＳＳＶＰＰ、ＤＶＥＤ等のアミノ酸配列が挙げられる。アミノ酸配列「ＳＳＶＰＰ」は、キモトリプシンで切断することができる。また、アミノ酸配列「ＤＶＥＤ」は、カスパーゼ３で切断することができる。細胞内導入剤から切断され、放出された標的タンパク質は、細胞内で標的タンパク質本来の機能を発揮することができる。
<< Release of target protein in cells >>
As described later, the target protein introduced into the cell by the method of the present embodiment can be easily cleaved and released from the intracellular introduction agent in the cell. For example, an amino acid sequence that is easily cleaved by a protease may be introduced into the amino acid sequence of the target protein represented by W in the above formula (4). Specific examples of such amino acid sequences include amino acid sequences such as SSVPP and DVED. The amino acid sequence “SSVPP” can be cleaved with chymotrypsin. The amino acid sequence “DVED” can be cleaved with caspase-3. The target protein cleaved and released from the intracellular introduction agent can exert its original function in the cell.
ところで、例えばアミノ酸配列「ＳＳＶＰＰ」は、キモトリプシンにより切断されるが、サーモリシンでは切断されない。そこで、このようなプロテアーゼ特異的なアミノ酸配列を導入することにより、標的タンパク質の放出に酵素選択性を付与することもできる。 By the way, for example, the amino acid sequence “SSVPP” is cleaved by chymotrypsin, but is not cleaved by thermolysin. Therefore, by introducing such a protease-specific amino acid sequence, enzyme selectivity can be imparted to the release of the target protein.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
（実施例１）
＜「ＧＦＰ−ｇｐ５−ｆｏｌｄｏｎ」発現用プラスミドの作製＞
「ＧＦＰ−ｇｐ５−ｆｏｌｄｏｎ」（以下、「ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ」という場合がある。）発現用プラスミドを作製した。ここで、「ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ」とは、下記式（４）
ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ …（４）
において、Ａ及びｎが１であり、Ｂが０であり、Ｗが標的タンパク質のアミノ酸配列、すなわち、「ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のアミノ酸配列（配列番号１０）」であり、Ｘが配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｙが「ｇｐ５のアミノ酸配列（配列番号２）」であり、Ｚが「ｆｏｌｄｏｎのアミノ酸配列（配列番号６）」であるポリペプチドである。なお、配列番号１０に示すＧＦＰのアミノ酸配列のＣ末端側には、プロテアーゼにより切断されやすいアミノ酸配列「ＳＳＶＰＰ」が導入されている。配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２０に示す。
Example 1
<Preparation of “GFP-gp5-foldon” expression plasmid>
An expression plasmid for “GFP-gp5-foldon” (hereinafter sometimes referred to as “GFP-gp5f”) was prepared. Here, “GFP-gp5f” means the following formula (4)
W A -X n -Y-Z- V B ... (4)
, A and n are 1, B is 0, W is the amino acid sequence of the target protein, ie, “GFP (green fluorescent protein) amino acid sequence (SEQ ID NO: 10)”, and X is SEQ ID NO: 1 A polypeptide in which Y is “amino acid sequence of gp5 (SEQ ID NO: 2)” and Z is “amino acid sequence of foldon (SEQ ID NO: 6)”. An amino acid sequence “SSVPP” that is easily cleaved by protease is introduced into the C-terminal side of the amino acid sequence of GFP shown in SEQ ID NO: 10. The base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is shown in SEQ ID NO: 20.
より具体的には、次のようにして、ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ発現用プラスミドを作製した。まず、Ｔ４ファージのｗａｃ蛋白質の４６１から４８４残基目に対応する遺伝子をＴ４ファージゲノムよりＰＣＲで増幅してｐＵＣ１８にクローニングし、ｆｏｌｄｏｎをコードする遺伝子を得た。続いて、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理したプラスミドｐＥＴ２９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、プラスミドｐＭＴｆ１−３を得た。また、Ｔ４ファージのｇｐ５の４７４から５７５残基目に対応する遺伝子をＴ４ファージゲノムよりＰＣＲにより増幅してｐＵＣ１８にクローニングし、ｇｐ５をコードする遺伝子を得た。続いて、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理した上述のプラスミドｐＭＴｆ１−３に挿入し、プラスミドｐＫＡ１７６を得た。また、群馬大・高橋より提供されたＧＦＰ発現ベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ＧＦＰをコードする遺伝子を得、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで処理した上述のプラスミドｐＫＡ１７６に組み込み、プラスミドｐＫＮ１−１（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ発現用プラスミド）を得た。 More specifically, a GFP-gp5f expression plasmid was prepared as follows. First, a gene corresponding to residues 461 to 484 of the Tac phage wac protein was amplified by PCR from the T4 phage genome and cloned into pUC18 to obtain a gene encoding foldon. Subsequently, this plasmid was cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI and inserted into plasmid pET29b (Novagen) treated with EcoRI and XhoI to obtain plasmid pMTf1-3. Further, a gene corresponding to residues 474 to 575 of gp5 of T4 phage was amplified from the T4 phage genome by PCR and cloned into pUC18 to obtain a gene encoding gp5. Subsequently, this plasmid was cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI and inserted into the above-described plasmid pMTf1-3 treated with EcoRI and XhoI to obtain plasmid pKA176. Further, the GFP expression vector provided by Gunma University and Takahashi was cleaved with restriction enzymes NdeI and EcoRI to obtain a gene encoding GFP, which was incorporated into the above-described plasmid pKA176 treated with the restriction enzymes NdeI and EcoRI, and the plasmid pKN1-1 (GFP-gp5f expression plasmid) was obtained.
＜ＧＦＰ−ｇｐ５ｆの発現及び精製＞
作製したＧＦＰ−ｇｐ５ｆの発現用プラスミドを大腸菌に導入して大量に発現させて精製し、以下の実験に用いた。
<Expression and purification of GFP-gp5f>
The prepared GFP-gp5f expression plasmid was introduced into Escherichia coli, expressed in large quantities and purified, and used in the following experiments.
＜ＧＦＰ−ｇｐ５ｆの超遠心分析＞
上述のようにして調製したＧＦＰ−ｇｐ５ｆの超遠心分析を行った。より具体的には、１．２μＭのＧＦＰ−ｇｐ５ｆを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、Ｏｐｔｉｍａｌ ＸＬ−Ｉ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ （Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて５００，０００ｒｐｍ、２０℃で分析を行った。
<Ultracentrifugation analysis of GFP-gp5f>
Ultracentrifugation analysis of GFP-gp5f prepared as described above was performed. More specifically, 1.2 μM GFP-gp5f was dialyzed with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), and Optimal XL-I analytical ultrafuge (Beckman) was used at 500,000 rpm at 20 ° C. Analysis was carried out.
図１にＧＦＰ−ｇｐ５ｆの分析結果を示す。その結果、融合タンパク質ＧＦＰ−ｇｐ５ｆは、そのほとんどが自然に自己会合して、ＧＦＰ−ｇｐ５ｆの３量体（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３が２個会合した６量体[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の形態で存在していることが確認された。 FIG. 1 shows the analysis result of GFP-gp5f. As a result, most of the fusion protein GFP-gp5f spontaneously self-associates, and a hexamer [(GFP-gp5f) 3 ] 2 in which two GFP-gp5f trimers (GFP-gp5f) 3 are associated. It was confirmed to exist in the form of
（実験例１）
＜標的タンパク質の細胞への導入及び担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出＞
実施例１で調製した[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体を、ＨｅＬａ細胞の培地に０．８μＭの濃度で添加した。融合タンパク質複合体の添加１２時間後の細胞中のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。図２に蛍光顕微鏡写真を示す。図２中、「Ｎ」はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した核を示し、「Ｇ」はＧＦＰの蛍光を示す。以上の結果から、ＧＦＰが効率よくＨｅＬａ細胞の細胞内に導入されたことが確認された。
(Experimental example 1)
<Introduction of target protein into cells and release of target protein from carrier (intracellular introduction agent)>
The fusion protein complex of [(GFP-gp5f) 3 ] 2 prepared in Example 1 was added to the medium of HeLa cells at a concentration of 0.8 μM. The fluorescence of GFP in the cells 12 hours after the addition of the fusion protein complex was observed with a fluorescence microscope. FIG. 2 shows a fluorescence micrograph. In FIG. 2, “N” indicates a nucleus stained with Hoechst 33342, and “G” indicates fluorescence of GFP. From the above results, it was confirmed that GFP was efficiently introduced into the cells of HeLa cells.
（実験例２）
＜[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体の細胞内での開裂＞
実施例１で調製した[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体を、実験例１と同様にしてＨｅＬａ細胞の培地に添加し、細胞内に導入した。続いて、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いたゲル濾過解析により、細胞内に導入した[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体の分子量の変化を経時的に解析した。具体的には、ＨｅＬａ細胞の培地に１．７μＭの濃度で[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２を添加し、２４時間後及び４８時間後に細胞を回収した。続いて、１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で細胞膜を破壊し、得られた溶液をＨＰＬＣで解析した。カラムにはＧＦ−５１０ ＨＱ（Ａｓａｈｉｐａｋ）を使用した。
(Experimental example 2)
<Intracellular cleavage of [(GFP-gp5f) 3 ] 2 fusion protein complex>
The fusion protein complex of [(GFP-gp5f) 3 ] 2 prepared in Example 1 was added to the HeLa cell medium in the same manner as in Experimental Example 1 and introduced into the cells. Subsequently, changes in the molecular weight of the fusion protein complex of [(GFP-gp5f) 3 ] 2 introduced into the cells were analyzed over time by gel filtration analysis using HPLC (high performance liquid chromatography). Specifically, [(GFP-gp5f) 3 ] 2 was added to the HeLa cell culture medium at a concentration of 1.7 μM, and the cells were collected after 24 and 48 hours. Subsequently, the cell membrane was disrupted with 10% Triton X-100, and the resulting solution was analyzed by HPLC. GF-510 HQ (Asahipak) was used for the column.
図３は、ＨＰＬＣを用いたゲル濾過解析の結果を示すグラフである。図３中、横軸は溶出時間（分）を示し、縦軸は励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍの蛍光強度を示す。（ａ）は、[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体のみをゲル濾過解析した結果を示し、（ｂ）は[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２をＨｅＬａ細胞に導入してから２４時間後の解析結果を示し、（ｃ）は[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２をＨｅＬａ細胞に導入してから４８時間後の解析結果を示し、（ｄ）はＨｅＬａ細胞のみの解析結果を示す。溶出時間１２分付近のピークは[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２であり、溶出時間１５分付近のピークはＧＦＰである。細胞内に導入された[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質は、経時的に担体（細胞内導入剤）から開裂し、ほぼ４８時間後に完全に開裂したことが明らかとなった。この結果は、担体からの標的タンパク質の放出が容易であることを示す。 FIG. 3 is a graph showing the results of gel filtration analysis using HPLC. In FIG. 3, the horizontal axis indicates the elution time (min), and the vertical axis indicates the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 485 nm and a fluorescence wavelength of 510 nm. (A) from the introduction to the [(GFP-gp5f) 3] Only 2 of the fusion protein complex shows the results of gel filtration analysis, (b) is [(GFP-gp5f) 3] 2 HeLa cells The analysis results after 24 hours are shown, (c) shows the analysis results after 48 hours from the introduction of [(GFP-gp5f) 3 ] 2 into HeLa cells, and (d) shows the analysis results of only HeLa cells. Show. The peak around the elution time 12 minutes is [(GFP-gp5f) 3 ] 2 and the peak around the elution time 15 minutes is GFP. It was revealed that the fusion protein of [(GFP-gp5f) 3 ] 2 introduced into the cells was cleaved from the carrier (intracellular introduction agent) with time, and completely cleaved after about 48 hours. This result shows that the release of the target protein from the carrier is easy.
（実験例３）
＜動物実験＞
実験例１で調製した[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体を、マウス胎児に注入し、ＧＦＰの蛍光を観察した。具体的には、Ｅ１３．５でマウス胎児を子宮内から取り出し、側脳室に１０μＭの［（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３］２を１μＬ注射し、子宮内へと戻した。続いて２４時間後に胎児を取り出し、蛍光顕微鏡による解析を行った。図４に、顕微鏡写真を示す。図４（Ａ）は、マウス胎児の明視野観察の写真であり、（Ｂ）は、ＧＦＰの蛍光観察（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）の写真であり、（Ｃ）は、核染色試薬であるＤＡＰＩで染色したマウス脳の組織切片の蛍光観察（励起波長４０２ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）の写真であり、（Ｄ）は、マウス脳の組織切片におけるＧＦＰの蛍光観察（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）の写真である。この結果、マウスの脳内の細胞にＧＦＰが均一に導入されたことが明らかとなった。脳内の細胞にこのように均一にタンパク質を導入することは通常困難である。[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体の細胞内への導入効率が非常に高いことが確認された。
(Experimental example 3)
<Animal experiment>
The fusion protein complex of [(GFP-gp5f) 3 ] 2 prepared in Experimental Example 1 was injected into a mouse fetus, and GFP fluorescence was observed. Specifically, the mouse fetus was removed from the uterus at E13.5, and 1 μL of 10 μM [(GFP-gp5f) 3 ] 2 was injected into the lateral ventricle and returned into the uterus. Then, 24 hours later, the fetus was taken out and analyzed by a fluorescence microscope. FIG. 4 shows a photomicrograph. FIG. 4A is a photograph of bright field observation of a mouse fetus, FIG. 4B is a photograph of fluorescence observation of GFP (excitation wavelength 485 nm, fluorescence wavelength 510 nm), and FIG. 4C is a nuclear staining reagent. It is the photograph of the fluorescence observation (excitation wavelength 402nm, fluorescence wavelength 450nm) of the mouse brain tissue section dye | stained with a certain DAPI, (D) is the fluorescence observation (excitation wavelength 485nm, fluorescence wavelength 510nm) in the mouse brain tissue section. ) As a result, it was revealed that GFP was uniformly introduced into cells in the mouse brain. It is usually difficult to introduce proteins uniformly in this way into cells in the brain. It was confirmed that the efficiency of introducing the fusion protein complex of [(GFP-gp5f) 3 ] 2 into cells was very high.
（実施例２）
＜長さの異なる細胞内導入剤の作製および確認＞
実施例１と同様にして、長さの異なる細胞内導入剤を作製し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した。より具体的には、下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ …（１）
において、Ｘが配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｙが「ｇｐ５のアミノ酸配列（配列番号２）」であり、Ｚが「ｆｏｌｄｏｎのアミノ酸配列（配列番号６）」であるポリペプチドであって、ｎが１、５及び８であるポリペプチドの発現用プラスミドをそれぞれ作製し、大腸菌で発現させた。得られた各長さのタンパク質（細胞内導入剤）を２μｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に懸濁した。これらの各溶液をマイカ基板に載せ、４時間放置後に溶液中ＡＦＭによる観察を行った。結果を図５に示す。（ａ）はｎが１である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像であり、（ｂ）はｎが５である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像であり、（ｃ）はｎが８である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像である。上記式（１）のＸで示されるアミノ酸配列の繰り返し数を増加させることにより、細胞内導入剤の長さの伸長が確認された。
(Example 2)
<Preparation and confirmation of intracellular introduction agents with different lengths>
In the same manner as in Example 1, intracellular introduction agents having different lengths were prepared and observed with an atomic force microscope (AFM). More specifically, the following formula (1):
Xn -YZ (1)
Wherein X is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y is the “amino acid sequence of gp5 (SEQ ID NO: 2)”, and Z is the “amino acid sequence of foldon (SEQ ID NO: 6)”, Plasmids for expressing polypeptides with n of 1, 5 and 8 were prepared and expressed in E. coli. The obtained proteins (intracellular introduction agents) of each length were suspended in 20 mM glycine buffer (pH 3.0) at a concentration of 2 μg / mL. Each of these solutions was placed on a mica substrate and allowed to stand for 4 hours, and then observed with AFM in the solution. The results are shown in FIG. (A) is an AFM observation image of an intracellular introduction agent where n is 1, (b) is an AFM observation image of an intracellular introduction agent where n is 5, and (c) is a cell where n is 8. It is an AFM observation image of an internally introduced agent. The increase in the length of the intracellular introduction agent was confirmed by increasing the number of repetitions of the amino acid sequence represented by X in the above formula (1).
本発明によれば、細胞に対する毒性が低く、細胞内への標的タンパク質の導入効率が高く、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出が容易な、標的タンパク質の細胞内導入剤を提供することができる。本発明はまた、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び当該細胞内導入剤を用いた標的タンパク質の細胞内導入方法を提供することができる。 According to the present invention, the target has low toxicity to cells, high efficiency of introducing the target protein into the cell, and easy release of the target protein from the carrier (intracellular introduction agent) after the target protein is introduced into the cell. An agent for introducing a protein into a cell can be provided. The present invention can also provide a nucleic acid encoding the intracellular introduction agent and a method for intracellular introduction of a target protein using the intracellular introduction agent.
Claims (7)
（ａ）下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ …（１）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）のアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（２）：
［（Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’）３］２ …（２）
（式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（１）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。 An agent for intracellularly introducing a target protein comprising a polypeptide comprising the following amino acid sequence (a) or (b):
(A) The following formula (1):
Xn -YZ (1)
(In the formula, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, and Z represents the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9). An amino acid sequence selected from the above, wherein n is an integer of 1 to 8.)
(B) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and the following formula (2):
[(X ′ n −Y′−Z ′) 3 ] 2 (2)
(In the formula, X ′, Y ′, and Z ′ are amino acid sequences in which 0 or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by X, Y, and Z in the formula (1), respectively. An amino acid sequence in which the polypeptide complex represented by (2) has an intracellular translocation activity.
（ｃ）下記式（３）：
［（Ｘｎ−Ｙ−Ｚ）３］２ …（３）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）で示されるポリペプチド複合体、
（ｄ）前記（ｃ）のポリペプチド複合体において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、かつ細胞内移行活性を有するポリペプチド複合体。 A target protein intracellular introduction agent comprising the following polypeptide complex (c) or (d).
(C) The following formula (3):
[(X n -YZ) 3 ] 2 (3)
(In the formula, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, and Z represents the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9). A polypeptide complex represented by the following: n represents an amino acid sequence selected from the above, and n is an integer of 1 to 8.
(D) A polypeptide complex in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the polypeptide complex of (c) and have intracellular translocation activity.
（ｅ）下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ …（１）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）のアミノ酸配列、
（ｆ）前記（ｅ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（２）：
［（Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’）３］２ …（２）
（式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（１）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。 A nucleic acid encoding a polypeptide comprising the following amino acid sequence (e) or (f):
(E) The following formula (1):
Xn -YZ (1)
(In the formula, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, and Z represents the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9). An amino acid sequence selected from the above, wherein n is an integer of 1 to 8.)
(F) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (e), and the following formula (2):
[(X ′ n −Y′−Z ′) 3 ] 2 (2)
(In the formula, X ′, Y ′, and Z ′ are amino acid sequences in which 0 or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by X, Y, and Z in the formula (1), respectively. An amino acid sequence in which the polypeptide complex represented by (2) has an intracellular translocation activity.
（ｇ）下記式（４）：
ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ …（４）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数であり、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）のアミノ酸配列、
（ｈ）前記（ｇ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（５）：
［（ＷＡ−Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’−ＶＢ）３］２ …（５）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（４）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。 A target protein intracellular introduction agent comprising a polypeptide comprising the following amino acid sequence (g) or (h):
(G) The following formula (4):
W A -X n -Y-Z- V B ... (4)
(Wherein W and V represent the amino acid sequence of the target protein, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents the amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, Z represents an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9, n is an integer of 1 to 8, A and B are integers of 0 or 1, and A and B are simultaneously An amino acid sequence of 0)
(H) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (g), and the following formula (5):
[(W A -X 'n -Y' -Z'-V B) 3] 2 ... (5)
(Wherein, W and V represent the amino acid sequence of the target protein, and X ′, Y ′, and Z ′ are 0 or more in the amino acid sequence represented by X, Y, and Z in Formula (4), respectively. Wherein A and B are integers of 0 or 1, and A and B are not 0 at the same time.) An amino acid sequence having intracellular translocation activity.
（ｉ）下記式（６）：
［（ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ）３］２ …（６）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数であり、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）で示される融合タンパク質複合体、
（ｊ）前記式（６）のＸｎ−Ｙ−Ｚで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された融合タンパク質複合体であって、かつ細胞内移行活性を有する融合タンパク質複合体。 A target protein intracellular introduction agent comprising the following fusion protein complex (i) or (j):
(I) The following formula (6):
[(W A -X n -Y- Z-V B) 3] 2 ... (6)
(Wherein W and V represent the amino acid sequence of the target protein, X represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Y represents the amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5, Z represents an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9, n is an integer of 1 to 8, A and B are integers of 0 or 1, and A and B are simultaneously A fusion protein complex represented by:
(J) a fusion protein complex in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by X n -YZ in the above formula (6), and its intracellular translocation activity A fusion protein complex having:
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