JP2015159760A - 核酸増幅チップ - Google Patents

Abstract

【課題】ウェルに試薬等を収納する回数を削減して、ウェルの汚染を防止することのできる核酸増幅チップ及び前記チップの使用方法の提供。
【解決手段】核酸増幅チップは、２本鎖核酸の増幅のための複数のウェル３が形成された基板２を備え、複数のウェル３のそれぞれは、底面に沿って区分けされた複数の物質収納部４を有する。複数の物質収納部４のうち少なくとも２つの物質収納部４には、２本鎖核酸の増幅に用いられるそれぞれ異なる物質が収納され、少なくとも一つには、プライマが収納され、他の少なくとも一つには、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた光量の蛍光を生じさせる試薬が収納される。
【選択図】図３

Description

本発明は、２本鎖核酸を増幅させる核酸増幅チップに関する。

膨大な数の遺伝子配列の中から特定の遺伝子配列を選択的に増幅させる技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法と呼ばれる技術が知られている。ＰＣＲ法では、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させた後、特定の１本鎖ＤＮＡの特定の部位にのみ結合するプライマを用いて、特定の２本鎖ＤＮＡのみを増幅させる技術である。増幅させた特定の２本鎖ＤＮＡに蛍光分子を結合させると、２本鎖ＤＮＡの増幅数が多いほど蛍光量が増加するため、この蛍光量を測定することで、増幅した２本鎖ＤＮＡを有する病原体等を特定することができる。

ＰＣＲ法は、増幅に要する時間が２時間ほどと短く、増幅のプロセスも簡易であるため、全自動の卓上用のＰＣＲ測定装置で２本鎖ＤＮＡの増幅と特定とを行うことができる。従来のＰＣＲ測定装置では、例えばチューブの中に、検体、複数の試薬、酵素およびプライマなどを収納して、蛍光の光量を測定していた。ＰＣＲ法では、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させる際には高い温度に設定し、また１本鎖ＤＮＡにプライマを結合させた後は冷却する必要があり、温度を迅速に変化させることが測定時間の短縮化のためにも重要となる。

特開2008-232899号公報 特開2010-32487号公報

ＰＣＲ測定装置では、２本鎖ＤＮＡの増幅を行わせるために核酸増幅チップを用いる。マイクロウェルタイプの核酸増幅チップには複数のウェルが設けられており、各ウェルには、それぞれ異なるプライマが収納された状態でＰＣＲ測定装置にセットされ、その状態で、各ウェルに複数の試薬と検体が複数回に分けて入れられて、２本鎖ＤＮＡの増幅処理が開始される。

このように、従来は、ウェルに試薬や検体を複数回に分けて収納しており、試薬等の収納の際に汚染物質がウェルに混入するおそれがあった。特に、試薬等をウェルに収納する回数が多いほど、汚染すなわちコンタミネーションの可能性が高くなるという問題がある。

本発明は、上述した課題を解決するためになされたものであり、その目的は、ウェル内の汚染を防止可能な核酸増幅チップを提供することである。

上記の課題を解決するために、本発明の一態様では、２本鎖核酸の増幅のための複数のウェルが形成された基板を備え、
前記複数のウェルのそれぞれは、区分けされた複数の物質収納部を底面に有する核酸増幅チップが提供される。

前記複数の物質収納部のうち少なくとも２つの物質収納部には、２本鎖核酸の増幅に用いられるそれぞれ異なる物質が収納されてもよい。

前記複数の物質収納部の一つには、前記複数のウェルのそれぞれごとに異なる１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマが収納され、
前記複数の物質収納部の他の一つには、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた光量の蛍光を生じさせる試薬が収納されてもよい。

前記複数の物質収納部は、対応する前記ウェルの底面に形成される複数の凹部であってもよい。

前記複数の物質収納部は、対応する前記ウェルの底面に形成される凸部および凹部の少なくとも一方を用いて形成される領域であってもよい。

前記複数の物質収納部の内壁の少なくとも一部は曲面であってもよい。

前記複数のウェルのそれぞれには、検体と、この検体に含まれる２本鎖核酸を抽出する試薬と、特定の１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマと、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた蛍光を生じさせる試薬と、前記２本鎖核酸の転写を促す酵素と、が収納されてもよい。

本発明によれば、ウェルに試薬等を収納する回数を削減するため、ウェルの汚染を防止できる。

本発明の一実施形態に係る核酸増幅チップ１の上面図。 図１のＡ−Ａ線断面図。 図２の一部の拡大断面図。 物質収納部４の一変形例を示す拡大断面図。 本実施形態による核酸増幅チップ１を用いたＰＣＲ法の処理手順の一例を示すフローチャート。 相補的に結合した２本鎖ＤＮＡを示す図。 相補的に結合した２本鎖DNAが１本鎖DNAに分離されることを示す図 。 １本鎖ＤＮＡにプライマが結合した様子を示す図。 ２つの２本鎖ＤＮＡが生成された様子を示す図。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本件明細書に添付する図面においては、図示と理解のしやすさの便宜上、縮尺および縦横の寸法比等を、実物のそれらから適宜変更したり、誇張してある。

図１は本発明の一実施形態に係る核酸増幅チップ１の上面図、図２は図１のＡ−Ａ線断面図、図３は図２の一部の拡大断面図である。

本実施形態に係る核酸増幅チップ１は、例えばＰＣＲ法による２本鎖ＤＮＡの核酸増幅を行うものであり、図１に示すように、基板２の一主面に沿って離隔して配置される複数のウェル３を備えている。図１では、一主面に４つのウェル３を設ける例を示しているが、ウェル３の数には特に制限はない。

核酸増幅チップ１は、例えば矩形状の基板２を用いて構成されており、基板２の一辺は１０〜１５ｍｍ程度で、その厚さは０．５〜３．０ｍｍ程度である。また、ウェル３の開口径は１〜２ｍｍ程度、ウェル３の深さは１．０〜２．０ｍｍ程度である。なお、核酸増幅チップ１の縦横サイズと厚さ、およびウェル３の開口径と深さには特に制限はない。ただし、本実施形態では、一つのウェル３内に収納可能な試薬の量をできるだけ少なくすることを念頭に置いており、例えば、ウェル３内に収納される試薬の総量を０．５〜３．０μリットル程度に抑えることを想定している。

後述するように、核酸増幅チップ１は、ウェル３内の温度を短時間で５０℃以上上下させる必要があるため、基板２の材料として、熱伝導性に優れていることと、例えば０〜１００℃程度の温度範囲での耐熱性が求められる。

本実施形態による核酸増幅チップ１が増幅する対象となる核酸とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、その他のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどである。以下では、ＤＮＡを増幅する例について説明する。

図３に示すように、複数のウェル３のそれぞれは、底面に沿って区分けされた複数の物質収納部４を有する。図３では、各物質収納部４が凹部５である例を示しているが、物質収納部４の具体的な形状は図示されたものに限定されない。例えば、図４（ａ）に示すように、底面に一つまたは複数の凸部６を形成して、凸部６を側面とする領域に物質収納部４を設けてもよい。あるいは、図４（ｂ）に示すように、ウェル３の底面に凹部５と凸部６を形成して、凸部６の側面とウェル３の内壁面とで形成された物質収納部４と、凹部５の内部に形成された物質収納部４とを設けてもよい。あるいは、図４（ｃ）に示すように、ウェル３の底面に複数の凸部６を形成して、凸部６間に形成された物質収納部と、凸部６とウェル３の内壁面とで形成された物質収納部４とを設けてもよい。あるいは図４（ｄ）に示すように、複数の凸部６の間に凹部６を形成して、この凹部６内の物質収納部４としてもよい。このように、物質収納部４の形状および配置場所には種々の変形例が考えられるが、ウェル３の底面に凹部５と凸部６の少なくとも一方を用いて形成された物質収納部４であればよい。

また、図３では、各凹部の内壁が半球状の例を示しているが、各凹部の内壁形状は図示されたものに限定されない。同様に、各凸部の具体的な形状も問わない。

各ウェル３内の複数の物質収納部４には、それぞれ別種類の物質が収納される。これら物質は、ＰＣＲ法等の遺伝子解析法で用いる試薬等であり、具体的な試薬の種類は個々の遺伝子解析法の種類によって変わりうる。

各ウェル３内の物質収納部４の数は、ＰＣＲ測定装置等の遺伝子解析装置にセットする前に、予め核酸増幅チップ１内の各ウェル３に収納しておく物質の数によって依存する。例えば、ＰＣＲ法の場合、各ウェル３に２つの物質収納部４が設けられ、そのうちの一つにはプライマが収納され、他の一つには、二本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光を生じさせるＰＣＲ反応用の試薬が収納される。なお、遺伝子解析手法としてＰＣＲ法を採用する場合であっても、各ウェル３に設ける物質収納部４の数は必ずしも２つに限定されない。後述するように、ＰＣＲ法には、複数の試薬や酵素を使用するため、そのうちの３つ以上を収納する物質収納部４を各ウェル３に設けてもよい。したがって、本実施形態では、各ウェル３に２つ以上の物質収納部４を設けることに特徴がある。また、一つの物質収納部４には、１種類の試薬や酵素が収納されるのが原則であるが、化学反応を起こさない試薬や酵素であれば、２種類以上の試薬や酵素を一つの物質収納部４に収納してもよい。

遺伝子解析の対象となる検体は、核酸増幅チップ１を遺伝子解析装置にセットした後に、各ウェル３に入れることになるため、その際、検体と混合する必要のある試薬は、予めウェル３に入れておくのは望ましくない。よって、検体と混合してからウェル３に入れる必要のある試薬以外の試薬や酵素の少なくとも一部を、予め物質収納部４に収納しておくことになる。

本実施形態による核酸増幅チップ１は、ＰＣＲ測定装置等の遺伝子解析装置にセットされた後に、各ウェル３内に、検体やその他の試料が入れられて混合され、遺伝子解析が開始される。

各ウェル３内の複数の物質収納部４に収納される各物質は、遺伝子解析装置にセットされるまでは、混ざり合わないようにするのが望ましい。すなわち、拡散増幅チップ１は、ウェル３内に予め試薬を入れた状態で、各試薬に適した保存条件や組成で保存することを想定している。そのため、遺伝子解析装置にセットする前にウェル３内の試薬が混合してしまうと、その保存条件や組成が変わってしまうことが容易に想像できる）。このため、物質収納部４の側壁の傾斜角度は、少なくとも開口部付近では、ウェル３の底面に対して、できるだけ急峻な構造にするのが望ましい。これにより、多少の振動では、各物質収納部４内の各物質が混合しなくなる。なお、混ざり合っても構わない試料や酵素だけを予め複数の物質収納部４に収納しておく場合は、物質収納部４の形状は特に問わない。

各物質収納部４のサイズは、遺伝子解析にて使用する各物質の量に依存して決定される。例えば、物質収納部４に収納される物質が、ウェル３内に収納される試料等の総量の２０％程度であれば、物質収納部４の体積は、ウェル３の体積の２０％程度でよい。

核酸増幅チップ１を遺伝子解析装置にセットした後に、核酸増幅チップ１内の各ウェル３に入れられる検体やＤＮＡ抽出用の試薬等は、予めウェル３内の物質収納部４に収納されていた各物質と混ぜ合わせる必要がある。ウェル３の径が小さくて物理的な手法により混合することは困難なため、ウェル３に熱を加えたときの対流により、ウェル３と物質収納部４内の各試薬等は混合されることになるが、図３に示すように物質収納部４の内壁の少なくとも一部を曲面にするのが望ましい。これにより、ウェル３と物質収納部４内の各試薬等が対流で均一に混合しやすくなる。

なお、図３や図４では、物質ごとに物質収納部４を１個ずつ設ける例を説明したが、少なくとも一部の物質については、複数個の物質収納部４に分けて収納してもよい。例えば、複数の物質収納部４に収納する複数の物質の中に、他の物質よりも使用量が多い物質が存在する場合は、この物質については、複数の物質収納部４に分けて収納してもよい。これにより、ウェル３内に設ける各物質収納部４のサイズを同じにすることができ、核酸増幅チップ１の作製が容易になる。あるいは、作製は困難になる可能性があるが、各物質の使用量に合わせて、サイズがそれぞれ異なる複数の物質収納部４をウェル３内に設けてもよい。また、拡散増幅チップ１内の各ウェル３には通常はそれぞれ別個の病原体等の１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマが収納されるが、特に重要なプライマについては、２以上のウェル３のそれぞれに収納してもよい。この場合、このプライマを上述した物質収納部４に収納してもよい。

図３や図４に示す物質収納部４を形成するには、例えば、基板２を一体成形するための成形型を用意し、この成形型に予めウェル３の形状と、ウェル３の底面部分の物質収納部４の形状とを作り込んでおき、この成形型に硬化性樹脂等を流し込んで硬化させることにより、図３の物質収納部４を有するウェル３を基板２とともに一体成形することができる。あるいは、基板２にエッチングや切削加工等によりウェル３を形成した後に、ウェル３の底面にレーザ加工等により複数の物質収納部４を形成してもよい。あるいは、他の手法により複数の物質収納部４を形成してもよい。

基板２の材料としては、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステルなどが用いられ、これらの材料に熱伝導性を向上させるための導電性フィラー（熱伝導率の高いフィラー）を含有させるのが望ましい。

図３や図４に示すように、ウェル３の底面に複数の物質収納部４を設けると、ウェル３の底面の表面積が増大することから、基板２の裏面側に配置される不図示の熱源からの熱がウェル３に伝達しやすくなる。これにより、熱源の温度に応じて、迅速にウェル３内の試薬の温度を調整できるようになる。なお、熱源としては、例えばペルチェ素子が用いられる。ペルチェ素子は、基板２の裏面側に例えば２層に分けて配置され、これら２層に流す直流電流の向きを変えることで、発熱と吸熱を切り替えることができる。あるいは、熱源として、温度を調整可能な液体が流れる流路をウェル３の底面に沿って配置して、液体の温度を変えることで、ウェル３の温度を調節してもよい。

図５は本実施形態による核酸増幅チップ１を用いたＰＣＲ法の処理手順の一例を示すフローチャートである。図５のフローチャートは、不図示のＰＣＲ測定装置にて行われる。
ＰＣＲ測定装置に、核酸増幅チップ１をセットするにあたって、遺伝子解析を行う対象である検体とＤＮＡ抽出用の試薬とを所定の容器に入れて混合し、その一部を核酸増幅チップ１の各ウェル３内に注入する（ステップＳ１）。なお、各ウェル３内には、それぞれ別個のプライマが予め収納されているものとする。プライマは、特定の１本鎖ＤＮＡの特定の部位に結合する性質を持っている。よって、例えば、核酸増幅チップ１に４個のウェル３があり、各ウェル３に別種類のプライマをそれぞれ収納しておけば、検体に４種類のプライマのいずれかに対応する１本鎖ＤＮＡが含まれているか否かを検出できることになる。なお、場合によっては、２つ以上のウェル３内に、同一のプライマを入れておいてもよい。

この他、ウェル３内には、２本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光を発生させるためのＰＣＲ反応用の試薬や、二本鎖ＤＮＡの転写を促す酵素であるポリメラーゼも収納される。このように、ウェル３には、検体と、ＤＮＡ抽出用の試薬と、プライマと、ＰＣＲ反応用の試薬および酵素とが少なくとも収納される。なお、ＤＮＡ抽出用の試薬で抽出されるＤＮＡは、図６に示すように、相補的に結合した２本鎖ＤＮＡ１１である。

次に、ウェル３内の温度を上げることで、図７に示すように、検体中の２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離させる（ステップＳ２）。このときの温度は９０℃以上に設定される。２本鎖ＤＮＡが分離されることで、２つの１本鎖ＤＮＡ１２が生成されることになる。

次に、温度を４０〜６５℃程度に下げて、図８に示すように、分離した１本鎖ＤＮＡの特定の部位にプライマ１３を結合させる（ステップＳ３）。

その後、温度を７０℃程度にまで上げて、図９に示すように、プライマ１３部分の２本鎖ＤＮＡを伸長させる（ステップＳ４）。この２つの１本鎖ＤＮＡのそれぞれが２本鎖ＤＮＡ１１になるため、元の２本鎖ＤＮＡ１１が２倍に増えたことになる。ステップＳ４の処理が終了すると、ステップＳ２の処理に戻って、所定回数に達するまでステップＳ２〜Ｓ４の処理が繰り返される。

このように、図５のステップＳ２〜Ｓ４の処理を行うたびに、２本鎖ＤＮＡを２倍に増やすことができる。ＰＣＲ法では、ステップＳ２〜Ｓ４の処理を３０回程度繰り返して、２本鎖ＤＮＡの数を増幅する。一つのウェル３内で増幅する２本鎖ＤＮＡは、そこに収納されているプライマに依存する１種類だけであるため、それぞれ異なるプライマを入れた複数のウェル３では、それぞれ異なる２本鎖ＤＮＡを増やすことができる。よって、例えば、検体の中に、ある特定の病原体が含まれているか否かを検査する際には、この特定の病原体に対応した１本鎖ＤＮＡに結合するプライマをいずれかのウェル３の中に入れておけば、このウェル３内の２本鎖ＤＮＡの数が増えるかどうかで、検体に特定の病原体が含まれているか否かを検出できる。

ＰＣＲ測定装置では、核酸増幅チップ１内の各ウェル３に対して励起光を照射して、蛍光の光量すなわち強度を測定する。２本鎖ＤＮＡの数が多いほど、蛍光の光量は増大するため、蛍光の光量により、各ウェル３内で２本鎖ＤＮＡが増幅したか否かを判別することができる。ＰＣＲ測定装置では、各ウェル３に入れたプライマの種類を把握しているため、蛍光の光量により、２本鎖ＤＮＡの数が増幅したと判断されたウェル３内のプライマの種類により、検体に含まれる特定の病原体等の遺伝子配列を特定することができる。

図５では、ＰＣＲ法による遺伝子増幅の処理手順を説明したが、本実施形態は、ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅手法にも適用可能である。より具体的には、本実施形態は、ＳＭＡＰ（SMart Amplification Process）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法などに幅広く適用可能である。

これらの方法はいずれも、結果として、２本鎖ＤＮＡを増幅するため、２本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光を発する試薬をウェル３の中に入れておくことで、ＰＣＲ法と同様に、特定の遺伝子配列が増幅したか否かを判別できる。

上述した実施形態では、２本鎖ＤＮＡを増幅する例を説明したが、本実施形態は、ＤＮＡではなく、ＲＮＡを増幅する場合にも適用可能である。すなわち、本実施形態による核酸増幅チップ１は、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる２本鎖核酸を増幅する場合に適用可能である。

このように、本実施形態では、核酸増幅チップ１に設けられた複数のウェル３の底面に沿って、区分けされた複数の物質収納部４を設けるため、これら物質収納部４に、遺伝子解析にて使用するいくつかの物質をそれぞれ別個に収納することができる。これにより、核酸増幅チップ１を遺伝子解析装置にセットした後に、ウェル３内に物質を入れる回数を削減でき、ウェル３が汚染される可能性が低くなる。このため、精度の高い遺伝子解析が可能となる。

本発明の態様は、上述した個々の実施形態に限定されるものではなく、当業者が想到しうる種々の変形も含むものであり、本発明の効果も上述した内容に限定されない。すなわち、特許請求の範囲に規定された内容およびその均等物から導き出される本発明の概念的な思想と趣旨を逸脱しない範囲で種々の追加、変更および部分的削除が可能である。

１ 核酸増幅チップ、２ 基板、３ ウェル、４ 物質収納部、５ 凸部、１１ ２本鎖ＤＮＡ、１２ １本鎖ＤＮＡ、１３ プライマ

Claims (7)

1. ２本鎖核酸の増幅のための複数のウェルが形成された基板を備え、
   前記複数のウェルのそれぞれは、区分けされた複数の物質収納部を底面に有する核酸増幅チップ。
2. 前記複数の物質収納部のうち少なくとも２つの物質収納部には、２本鎖核酸の増幅に用いられるそれぞれ異なる物質が収納される請求項１に記載の核酸増幅チップ。
3. 前記複数の物質収納部の少なくとも一つには、所定の１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマが収納され、
   前記複数の物質収納部の他の少なくとも一つには、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた光量の蛍光を生じさせる試薬が収納される請求項２に記載の核酸増幅チップ。
4. 前記複数の物質収納部は、対応する前記ウェルの底面に形成される複数の凹部である請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
5. 前記複数の物質収納部は、対応する前記ウェルの底面に形成される凸部および凹部の少なくとも一方を用いて形成される領域である請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
6. 前記複数の物質収納部の内壁の少なくとも一部は曲面である請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
7. 前記複数のウェルのそれぞれには、検体と、この検体に含まれる２本鎖核酸を抽出する試薬と、特定の１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマと、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた蛍光を生じさせる試薬と、前記２本鎖核酸の転写を促す酵素と、が収納される請求項１乃至６のいずれかに記載の核酸増幅チップ。