JP2015156844A5 - - Google Patents
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Claims (11)
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有し、且つ
枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とが強化された、
枯草菌変異株。 Bacillus subtilis mutant strain,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-ROCR region has ycxB-sipU region, SKIN-Pro7 region, sbo-ywhH region, a genome yybP-yyaJ region and yncM-fosB area have been deleted, and Enhanced expression of Bacillus subtilis dipicolinate synthase gene or a gene corresponding thereto, and Bacillus subtilis pyruvate carboxylase gene or a gene corresponding thereto,
Bacillus subtilis mutant.
（i）下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
（ａ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで該ストリンジェントな条件が、５×ＳＳＣ中、８５℃以上でハイブリダイゼーションし、且つ１×ＳＳＣ中、７３℃以上で洗浄する条件である；
（ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ii）下記（ｊ）〜（ｏ）からなる群より選択される、少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
（ｊ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで該ストリンジェントな条件が、５×ＳＳＣ中、８５℃以上でハイブリダイゼーションし、且つ１×ＳＳＣ中、７３℃以上で洗浄する条件である；
（ｍ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオ
チド；
（ｎ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号６に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The Bacillus subtilis mutant according to claim 1, wherein the Bacillus subtilis dipicolinate synthase gene or a gene corresponding thereto is at least one selected from the group consisting of the genes described in (i) and (ii) below:
(I) the following (a) ~ (f) is selected from the group consisting of at least one B. subtilis dipicolinic acid synthase subunit A gene or gene corresponding thereto:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(B) a protein comprising a nucleotide sequence having 90 % or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and exhibiting dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the gene described in (ii) A polynucleotide to:
(C) Dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by the gene according to (ii), which hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 Wherein the stringent conditions are conditions in which hybridization occurs in 5 × SSC at 85 ° C. or higher and washing in 1 × SSC at 73 ° C. or higher ;
(D) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
(E) Dipicoline in the presence of a protein encoded by the gene according to (ii), comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 A polynucleotide encoding a protein that exerts acid synthase activity;
(F) a protein comprising an amino acid sequence having 90 % or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and exhibiting dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by the gene described in (ii) A polynucleotide to:
(Ii) below (j) ~ (o) is selected from the group consisting of at least one B. subtilis dipicolinic acid synthase subunit B gene or gene corresponding thereto:
(J) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(K) a protein comprising a nucleotide sequence having 90 % or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and exhibiting dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the gene described in (i) A polynucleotide to:
(L) Dipicolinate synthase activity in the presence of a protein that is hybridized under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and that is encoded by the gene according to (i) Wherein the stringent conditions are conditions in which hybridization occurs in 5 × SSC at 85 ° C. or higher and washing in 1 × SSC at 73 ° C. or higher ;
(M) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(N) Dipicoline in the presence of a protein encoded by the gene according to (i), comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 A polynucleotide encoding a protein that exerts acid synthase activity;
(O) a protein comprising an amino acid sequence having 90 % or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and exhibiting dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the gene described in (i) Polynucleotide.
（ｐ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで該ストリンジェントな条件が、５×ＳＳＣ中、８５℃以上でハイブリダイゼーションし、且つ１×ＳＳＣ中、７３℃以上で洗浄する条件である；
（ｓ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｕ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The Bacillus subtilis mutant according to claim 1 or 2, wherein the Bacillus subtilis pyruvate carboxylase gene or a gene corresponding thereto is at least one selected from the group consisting of the following (p) to (u):
(P) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(Q) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a nucleotide sequence of 90 % or more and encoding a protein having pyruvate carboxylase activity;
(R) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having pyruvate carboxylase activity , wherein the stringent The conditions are the conditions for hybridization at 85 ° C. or higher in 5 × SSC and washing at 73 ° C. or higher in 1 × SSC;
(S) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(T) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having pyruvate carboxylase activity;
(U) A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 90 % or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having pyruvate carboxylase activity.
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とを強化することを含む、方法。 A method for producing a Bacillus subtilis mutant,
profile6 region, profile1 region, profile4 region, PBSX region, profile5 region, profile3 region, spb region, pks region, skin region, pps region, profile2 region, ydcL-ydeK-ydhU region, ysB-yitD region, yunA-yurT region cgeE-ypmQ region, yeeK-yesX region, pdp-ROCR region, ycxB-sipU region, SKIN-Pro7 region, sbo-ywhH region, Bacillus subtilis mutant having a genome yybP-yyaJ region and yncM-fosB area have been deleted In the strain, the expression of the Bacillus subtilis dipicolinate synthase gene or the equivalent gene and the expression of the Bacillus subtilis pyruvate carboxylase gene or the equivalent gene are strongly enhanced. Comprising, method.
（i）下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
（ａ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで該ストリンジェントな条件が、５×ＳＳＣ中、８５℃以上でハイブリダイゼーションし、且つ１×ＳＳＣ中、７３℃以上で洗浄する条件である；
（ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ii）下記（ｊ）〜（ｏ）からなる群より選択される、少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
（ｊ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで該ストリンジェントな条件が、５×ＳＳＣ中、８５℃以上でハイブリダイゼーションし、且つ１×ＳＳＣ中、７３℃以上で洗浄する条件である；
（ｍ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号６に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The method according to claim 6, wherein the Bacillus subtilis dipicolinate synthase gene or a gene corresponding thereto is at least one selected from the group consisting of the genes described in (i) and (ii) below:
(I) the following (a) ~ (f) is selected from the group consisting of at least one B. subtilis dipicolinic acid synthase subunit A gene or gene corresponding thereto:
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(B) a protein comprising a nucleotide sequence having 90 % or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and exhibiting dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the gene described in (ii) A polynucleotide to:
(C) Dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by the gene according to (ii), which hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 Wherein the stringent conditions are conditions in which hybridization occurs in 5 × SSC at 85 ° C. or higher and washing in 1 × SSC at 73 ° C. or higher ;
(D) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
(E) Dipicoline in the presence of a protein encoded by the gene according to (ii), comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 A polynucleotide encoding a protein that exerts acid synthase activity;
(F) a protein comprising an amino acid sequence having 90 % or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and exhibiting dipicolinate synthase activity in the presence of a protein encoded by the gene described in (ii) A polynucleotide to:
(Ii) below (j) ~ (o) is selected from the group consisting of at least one B. subtilis dipicolinic acid synthase subunit B gene or gene corresponding thereto:
(J) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5;
(K) a protein comprising a nucleotide sequence having 90 % or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and exhibiting dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the gene described in (i) A polynucleotide to:
(L) Dipicolinate synthase activity in the presence of a protein that is hybridized under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and that is encoded by the gene according to (i) Wherein the stringent conditions are conditions in which hybridization occurs in 5 × SSC at 85 ° C. or higher and washing in 1 × SSC at 73 ° C. or higher ;
(M) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(N) Dipicoline in the presence of a protein encoded by the gene according to (i), comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 A polynucleotide encoding a protein that exerts acid synthase activity;
(O) a protein comprising an amino acid sequence having 90 % or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and exhibiting dipicolinate synthase activity in the presence of the protein encoded by the gene described in (i) Polynucleotide.
（ｐ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで該ストリンジェントな条件が、５×ＳＳＣ中、８５℃以上でハイブリダイゼーションし、且つ１×ＳＳＣ中、７３℃以上で洗浄する条件である；
（ｓ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｕ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The method according to claim 6 or 7, wherein the Bacillus subtilis pyruvate carboxylase gene or a gene corresponding thereto is at least one selected from the group consisting of the following (p) to (u):
(P) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(Q) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a nucleotide sequence of 90 % or more and encoding a protein having pyruvate carboxylase activity;
(R) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having pyruvate carboxylase activity , wherein the stringent The conditions are the conditions for hybridization at 85 ° C. or higher in 5 × SSC and washing at 73 ° C. or higher in 1 × SSC;
(S) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(T) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having pyruvate carboxylase activity;
(U) A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 90 % or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having pyruvate carboxylase activity.
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