JP2015147744A

JP2015147744A - PAI-1 inhibitor

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Publication number: JP2015147744A
Application number: JP2014021457A
Authority: JP
Inventors: 哲盟浦野; Tetsumei Urano; 孝行岩城; Takayuki Iwaki; 優子鈴木; Yuko Suzuki; 和夫梅村; Kazuo Umemura
Original assignee: HAMAMATSU, University of; Hamamatsu University School of Medicine NUC
Current assignee: HAMAMATSU, University of; Hamamatsu University School of Medicine NUC
Priority date: 2014-02-06
Filing date: 2014-02-06
Publication date: 2015-08-20

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a novel PAI-1 inhibitor, and a method for inhibiting PAI-1 activity using the PAI-1 inhibitor.SOLUTION: The invention provides: a PAI-1 inhibitor which inhibits the intramolecular interaction between a first region consisting of 3-9 amino acid residues comprising the glycine residue at position 374 in PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1) and a second region comprising the region from the asparagine at position 31 to the serine at position 35 in PAI-1; and a method for inhibiting PAI-1 activity which inhibits the intramolecular interaction between the first region and the second region in PAI-1 by binding a substance capable of binding to the first region consisting of the 3-9 amino acid residues comprising the glycine residue at position 374 in PAI-1 or the second region comprising the region from the asparagine at position 31 to the serine at position 35 in PAI-1, to PAI-1, in vitro or in vivo (where in vivo of human is excluded).

Description

本発明は、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１（plasminogen activator inhibitor type 1（ＰＡＩ−１））における分子内相互作用を阻害することによりＰＡＩ−１活性を失活させるＰＡＩ−１阻害剤、及び当該ＰＡＩ−１阻害剤を用いてＰＡＩ−１活性を阻害する方法に関する。 The present invention relates to a PAI-1 inhibitor that inactivates PAI-1 activity by inhibiting intramolecular interaction in plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1), and the PAI-1 The present invention relates to a method for inhibiting PAI-1 activity using an inhibitor.

ＰＡＩ−１は、生体内に生理的に存在するプラスミノゲンアクチベータの特異的インヒビターであり、線維素溶解（線溶）活性発現を制御している。線溶活性の低下は、凝固活性の亢進や血小板活性化の亢進と同様に血栓症発症のリスクとなる。本発明者らによって、これまでに、血液の線溶活性が血漿中のｔＰＡ量とＰＡＩ−１量のバランスで決まること（非特許文献１及び２参照。）、肥満、高血圧、脂質異常、メンタルストレス等の心血管疾患のリスク時に血中ＰＡＩ−１濃度が増加することを報告した（非特許文献３及び４参照。）。メタボリック症候群等に伴い血漿中ＰＡＩ−１濃度が増加する事は他の施設からも多く報告されており、ＰＡＩ−１はこれらの病態時の血栓症発症の直接の原因因子として注目されている。また、ＰＡＩ−１は、急性相タンパクの一つであり、手術後に増加することや（非特許文献５参照。）、熱傷時に増加することが（非特許文献６参照。）報告されており、外傷や感染症合併時の微小血栓形成に伴う臓器障害の原因分子としても注目されている。また、炎症性細胞や腫瘍細胞の膜表面の特異受容体に結合したウロキナーゼ型ＰＡ（ｕＰＡ）に結合して細胞浸潤・増殖・転移を促進する機能も報告されている（非特許文献７及び８参照。）。 PAI-1 is a specific inhibitor of plasminogen activator that is physiologically present in the living body, and controls the expression of fibrinolytic (fibrinolytic) activity. A decrease in fibrinolytic activity is a risk of developing thrombosis, as is an increase in coagulation activity and an increase in platelet activation. The inventors have so far determined that the fibrinolytic activity of blood is determined by the balance between the amount of tPA in plasma and the amount of PAI-1 (see Non-Patent Documents 1 and 2), obesity, hypertension, lipid abnormalities, and mental. It has been reported that the concentration of PAI-1 in blood increases at the risk of cardiovascular diseases such as stress (see Non-Patent Documents 3 and 4). There have been many reports from other institutions that the plasma PAI-1 concentration increases with metabolic syndrome and the like, and PAI-1 has attracted attention as a direct causative factor of the onset of thrombosis in these pathological conditions. In addition, PAI-1 is one of the acute phase proteins, and it has been reported that it increases after surgery (see Non-Patent Document 5) or increases during burns (see Non-Patent Document 6). It is also attracting attention as a causative molecule for organ damage associated with microthrombus formation during trauma and infection. In addition, a function of binding to urokinase-type PA (uPA) bound to a specific receptor on the membrane surface of inflammatory cells or tumor cells to promote cell invasion / proliferation / metastasis has been reported (Non-Patent Documents 7 and 8). reference.).

さらに、本発明者らは、最近、出血傾向を示すＰＡＩ−１欠損症例を見いだし、世界第２例目の症例として報告した（非特許文献９参照。）。また、血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性又は濃度を測定することにより、早産又は流産の発症危険度を調べられることを見出した（特許文献１参照。）。 Furthermore, the present inventors recently found a PAI-1 deficient case showing a bleeding tendency and reported it as the second case in the world (see Non-Patent Document 9). Further, it has been found that the risk of developing premature or miscarriage can be examined by measuring the activity or concentration of plasminogen activator inhibitor in plasma (see Patent Document 1).

国際公開第２０１３／０７３１９１号International Publication No. 2013/073191

Urano，et al.，Thrombosis and Haemostasis，1990，vol.63，p.82−86．Urano, et al., Thrombosis and Haemostasis, 1990, vol.63, p.82-86. Urano，et al.，Thrombosis and Haemostasis，1991，vol.66，p.474−478．Urano, et al., Thrombosis and Haemostasis, 1991, vol. 66, p.474-478. Urano，et al.，The Japanese Journal of Physiology，1993，vol.43，p.221−228．Urano, et al., The Japanese Journal of Physiology, 1993, vol. 43, p.221-228. Urano，et al.，Thrombosis Research，1994，vol.74，p.595−603．Urano, et al., Thrombosis Research, 1994, vol.74, p.595-603. Aoki，et al.，Surgery Today（Official Journal of the Japan Surgical Society），1994，vol.24，p.1039−1043．Aoki, et al., Surgery Today (Official Journal of the Japan Surgical Society), 1994, vol. 24, pp. 1039-1043. Aoki，et al.，Burns，1998，vol.24，p.74−77．Aoki, et al., Burns, 1998, vol.24, p.74-77. Morita，et al.，International Journal of Cancer，1998，vol.78，p.286−292.Morita, et al., International Journal of Cancer, 1998, vol. 78, p.286-292. Abe，et al.，Cancer，1999，vol.86，p.2602−2611.Abe, et al., Cancer, 1999, vol.86, p.2602-2611. Iwaki，et al.，Journal of Thrombosis and Haemostasis，2011，vol.9，p.1200−1206．Iwaki, et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2011, vol. 9, p.1200-1206. Nukuna，et al.，Journal of Biological Chemistry，2004，vol.279，p.50132−50141．Nukuna, et al., Journal of Biological Chemistry, 2004, vol. 279, p. 50132-50141. Urano，et al.，European Journal of Biochemistry，1992，vol.209，p.985−992．Urano, et al., European Journal of Biochemistry, 1992, vol. 209, p. 985-992.

これらの知見から、メタボリック症候群等の血栓症の高リスク者における血栓症予防や、外傷や感染症時の多臓器不全予防、悪性腫瘍の増殖・浸潤・転移の抑制などを目的として、ＰＡＩ−１阻害薬の開発が試みられている。しかしながら、現時点ではまだいずれの阻害薬も市場に出ていないのが現状である。 Based on these findings, PAI-1 is used for the purpose of preventing thrombosis in high-risk individuals with thrombosis such as metabolic syndrome, preventing multiple organ failure during trauma and infection, and suppressing proliferation / invasion / metastasis of malignant tumors. Attempts have been made to develop inhibitors. However, at present, none of the inhibitors are currently on the market.

本発明は、新規なＰＡＩ−１阻害剤、及び当該ＰＡＩ−１阻害剤を用いてＰＡＩ−１活性を阻害する方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the novel PAI-1 inhibitor and the method of inhibiting PAI-1 activity using the said PAI-1 inhibitor.

本発明者らは、新しく血漿中ＰＡＩ−１欠損症例を見出し、当該症例におけるＰＡＩ−１の変異を解析したところ、反応部位（Ｒ３４６−Ｍ３４７）のＣ末端側にあるＧ３７４Ｒ（３７４位のグリシンがアルギニンに置換された変異）の１アミノ酸置換変異体であり、このＧ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１は発現細胞内で多量体を形成していることを見出した。さらにＧ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１について解析を進めたところ、３７４位のグリシン残基（Ｇ３７４）及びその近傍の領域の分子内相互作用を阻害することにより、ＰＡＩ−１活性を失活させられることを見出し、本発明を完成させた。 When the present inventors discovered a PAI-1-deficient case in plasma newly and analyzed the mutation of PAI-1 in the said case, G374R (Glycine at the 374 position was located on the C-terminal side of the reaction site (R346-M347)). It was found that this G374R mutant PAI-1 forms a multimer in the expression cell. Further analysis of the G374R mutant PAI-1 shows that PAI-1 activity can be inactivated by inhibiting intramolecular interaction of the glycine residue at position 374 (G374) and its nearby region. The headline and the present invention were completed.

すなわち、本発明は、以下のＰＡＩ−１阻害剤、ＰＡＩ−１活性の阻害方法、及びＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法を提供するものである。
（１）ＰＡＩ−１（プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１）中の３７４位のグリシン残基を含む９以下のアミノ酸残基からなる第１領域又はＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域に結合可能な物質からなることを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤。
（２）前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７１位のロイシンから３７９位のプロリンまでの領域である、前記（１）のＰＡＩ−１阻害剤。
（３）前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７２位のフェニルアラニンから３７６位のバリンまでの領域である、前記（１）のＰＡＩ−１阻害剤。
（４）前記第２領域が、ＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域である、前記（１）〜（３）のいずれかのＰＡＩ−１阻害剤。
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、前記（１）のＰＡＩ−１阻害剤。
（６）ＰＡＩ−１中のｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域又はＰＡＩ−１中のｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質からなることを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤。
（７）ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏ（但し、ヒトの生体内を除く。）において、ＰＡＩ−１を、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む９以下のアミノ酸残基からなる第１領域又はＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域に結合可能な物質と結合させることにより、ＰＡ（プラスミノゲンアクチベータ）に対する阻害活性を低下させることを特徴とする、ＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（８）前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７１位のロイシンから３７９位のプロリンまでの領域である、前記（７）のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（９）前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７２位のフェニルアラニンから３７６位のバリンまでの領域である、前記（７）のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（１０）前記第２領域が、ＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域である、前記（７）〜（９）のいずれかのＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（１１）前記物質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、前記（７）のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（１２）ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏ（但し、ヒトの生体内を除く。）において、ＰＡＩ−１を、ＰＡＩ−１中のｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域又はＰＡＩ−１中のｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質と結合させることにより、ＰＡに対する阻害活性を低下させることを特徴とする、ＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（１３）被験物質と、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列からなる野生型ペプチドとの結合性を評価する工程と、
前記被験物質と、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列のうち、３７４位のグリシン残基のみが酸性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる変異型ペプチドとの結合性を評価する工程と、
変異型ペプチドとの結合性よりも、野生型ペプチドとの結合性の方が有意に強かった被検物質を、ＰＡＩ−１阻害剤の候補物質として選択する工程と、
を有することを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法。
（１４）前記野生型ペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記変異型ペプチドが、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、前記（１３）に記載のＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法。 That is, the present invention provides the following PAI-1 inhibitors, methods for inhibiting PAI-1 activity, and methods for screening for PAI-1 inhibitors.
(1) From PAL-1 (plasminogen activator inhibitor-1) in the first region consisting of 9 or less amino acid residues including the glycine residue at position 374 or from asparagine at position 31 to serine at position 35 of PAI-1. A PAI-1 inhibitor comprising a substance capable of binding to a second region including a region.
(2) The PAI-1 inhibitor according to (1), wherein the first region is a region from leucine at position 371 to proline at position 379 of PAI-1.
(3) The PAI-1 inhibitor according to (1), wherein the first region is a region from phenylalanine at position 372 to valine at position 376 of PAI-1.
(4) The PAI-1 inhibitor according to any one of (1) to (3), wherein the second region is a region from asparagine at position 31 to serine at position 35 of PAI-1.
(5) A peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a third glycine residue comprising the fourth glycine residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: The PAI-1 inhibitor according to the above (1), which is a peptide consisting of a partial amino acid sequence of 9 amino acids or a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(6) A PAI-1 comprising a substance capable of binding to a region forming s2B (β sheet 2B) in PAI-1 or a region forming s1B (β sheet 1B) in PAI-1. Inhibitor.
(7) A first region comprising 9 or less amino acid residues including glycine residue at position 374 in PAI-1 in in vitro or in vivo (except in the human body) Or, the inhibitory activity against PA (plasminogen activator) is reduced by binding to a substance capable of binding to the second region including the region from asparagine at position 31 to serine at position 35 of PAI-1. Method for inhibiting PAI-1 activity.
(8) The method for inhibiting PAI-1 activity according to (7), wherein the first region is a region from leucine at position 371 to proline at position 379 of PAI-1.
(9) The method for inhibiting PAI-1 activity according to (7), wherein the first region is a region from phenylalanine at position 372 to valine at position 376 of PAI-1.
(10) The method for inhibiting PAI-1 activity according to any one of (7) to (9), wherein the second region is a region from asparagine at position 31 to serine at position 35 of PAI-1.
(11) The substance is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the fourth glycine residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The method for inhibiting PAI-1 activity according to the above (7), which is a peptide consisting of a partial amino acid sequence of 3 to 9 amino acids or a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(12) In vitro or in vivo (excluding human in vivo), PAI-1 is a region that forms s2B (β sheet 2B) in PAI-1, or s1B in PAI-1 (β A method for inhibiting PAI-1 activity, which comprises reducing the inhibitory activity against PA by binding to a substance capable of binding to the region forming sheet 1B).
(13) A step of evaluating the binding between a test substance and a wild-type peptide consisting of the same amino acid sequence as the first region consisting of 3 to 9 amino acid residues including the glycine residue at position 374 in PAI-1. When,
Of the same amino acid sequence as the test substance and the first region consisting of 3 to 9 amino acid residues including glycine residue at position 374 in PAI-1, only the amino acid residue at position 374 is an acidic amino acid residue. Or a step of evaluating the binding to a mutant peptide consisting of an amino acid sequence substituted with a basic amino acid residue;
Selecting a test substance that is significantly stronger in binding to a wild-type peptide than binding to a mutant peptide as a candidate substance for a PAI-1 inhibitor;
A method for screening a PAI-1 inhibitor, comprising:
(14) The wild-type peptide is the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or the fourth amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A peptide consisting of a partial amino acid sequence of 3 to 9 amino acids containing a glycine residue,
The method for screening a PAI-1 inhibitor according to the above (13), wherein the mutant peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤及びＰＡＩ−１活性の阻害方法を用いることにより、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏにおいてＰＡＩ−１活性を効果的に抑制することができる。このため、当該ＰＡＩ−１阻害剤は、血栓症や多臓器不全等のようなＰＡＩ−１活性に起因して生じる各種の疾患に対する予防や治療のための医薬用組成物として有用である。また、当該ＰＡＩ−１阻害剤は、より優れたＰＡＩ−１阻害剤の開発にも資する。 By using the PAI-1 inhibitor and the method for inhibiting PAI-1 activity according to the present invention, PAI-1 activity can be effectively suppressed in vitro or in vivo. Therefore, the PAI-1 inhibitor is useful as a pharmaceutical composition for preventing or treating various diseases caused by PAI-1 activity such as thrombosis and multiple organ failure. The PAI-1 inhibitor also contributes to the development of a more excellent PAI-1 inhibitor.

ヒトＰＡＩ−１のアミノ酸配列（配列番号５）を示した図である。It is the figure which showed the amino acid sequence (sequence number 5) of human PAI-1. ヒトＰＡＩ−１の活性型の構造解析結果を示した図である。It is the figure which showed the structural-analysis result of the active form of human PAI-1. ヒトＰＡＩ−１の潜在型の構造解析結果を示した図である。It is the figure which showed the structural analysis result of the latent form of human PAI-1. 実施例１において、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。In Example 1, it is the figure which showed the result of 10% SDS-PAGE. 実施例２において、各反応溶液における４０５ｎｍの吸光度の増加の測定結果を示した図である。In Example 2, it is the figure which showed the measurement result of the increase in the light absorbency of 405 nm in each reaction solution. 実施例２において、図５に示した結果から算出した各ペプチドのＰＡＩ阻害活性を示した図である。In Example 2, it is the figure which showed the PAI inhibitory activity of each peptide computed from the result shown in FIG.

ＰＡＩ−１は、セリンプロテアーゼインヒビター（serine protease inhibitor（Ｓｅｒｐｉｎ））スーパーファミリーの一つであり、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（urokinase type plasminogen activator（ｕＰＡ））及び組織型プラスミノゲンアクチベータ（tissue type plasminogen activator（ｔＰＡ））の主要な生理的な制御因子である。 PAI-1 is one of the serine protease inhibitor (Serpin) superfamily, urokinase type plasminogen activator (uPA) and tissue type plasminogen activator (tPA). ) Is the main physiological regulator.

ＰＡＩ−１には、反応部位ループ（反応部位を含むループ）が分子外に持ち上がっており、基質と結合可能な活性型（active form）と、ｕＰＡやｔＰＡとの相互作用により反応部位（ヒトＰＡＩ−１では、Ｒ３４６−Ｍ３４７）のペプチド結合が切断されて反応部位ループのＮ末端側が分子内のシャッター領域の間に入り込んで新たなβシートを形成する開裂型（cleaved form）と、反応部位が結合されることなく、反応部位ループのＮ末端側が分子内に入り込んで新たなβシートを形成する潜在型（latent form）とがある。シャッター領域とは、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６のβシート構造からなる領域であり、開裂型と潜在型においては、反応部位ループのＮ末端側はＳ３シートとＳ５シートの間に入り込み、新たにＳ４シートを形成する。３７９アミノ酸からなるヒトＰＡＩ−１のアミノ酸配列（配列番号５）を図１に示す。また、ヒトＰＡＩ−１の活性型の構造解析結果を図２に、潜在型の構造解析結果を図３に、それぞれ示す（非特許文献１０から引用。）。なお、図１のアミノ酸配列には、非特許文献１０において報告されているデータに基づき、各二次構造の情報も示した。 In PAI-1, a reaction site loop (a loop including a reaction site) is raised outside the molecule, and an active form capable of binding to a substrate (active form) and the reaction site (human PAI) by interaction with uPA or tPA. -1, the cleaved form in which the peptide bond of R346-M347) is cleaved and the N-terminal side of the reaction site loop enters between the shutter regions in the molecule to form a new β sheet; There is a latent form in which the N-terminal side of the reaction site loop enters the molecule without being bound to form a new β sheet. The shutter region is a region having a β sheet structure of S2, S3, S5, and S6. In the cleavage type and the latent type, the N-terminal side of the reaction site loop enters between the S3 sheet and the S5 sheet, and newly An S4 sheet is formed. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of human PAI-1 consisting of 379 amino acids is shown in FIG. Moreover, the structural analysis result of the active form of human PAI-1 is shown in FIG. 2, and the structural analysis result of the latent form is shown in FIG. 3 (cited from Non-Patent Document 10). In addition, based on the data reported in the nonpatent literature 10, the information of each secondary structure was also shown in the amino acid sequence of FIG.

Ｇ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１を発現している症例では、Ｇ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１は発現細胞内で多量体を形成しており、血漿中ＰＡＩ−１は欠損している、Serpinopathyに分類される病態を示していた。一般的に、ＰＡＩ−１をはじめとするＳｅｒｐｉｎの多量体は、Ｓｅｒｐｉｎの反応部位ループが他分子のシャッター領域内にＳ４シートとして入り込み、これにより押し出された他分子の反応部位ループが、更に別のシャッター領域に入り込む事により形成される。したがって、多量体形成を示す分子異常の多くはシャッター領域に多い。しかしながら、Ｇ３７４は、シャッター領域ではなく、反応部位ループのＣ末端側の領域に存在している。つまり、ＰＡＩ−１のＧ３７４の変異は、機能不全又は機能欠損の新規に発見された変異である。 In cases where G374R mutant PAI-1 is expressed, G374R mutant PAI-1 forms a multimer in the expressed cell, and plasma PAI-1 is deficient, a pathological condition classified as Serpinopathy Was showing. In general, in Serpin multimers such as PAI-1, the reaction site loop of Serpin enters into the shutter region of other molecules as an S4 sheet, and the reaction site loops of other molecules pushed out by this are further separated. It is formed by entering the shutter area. Therefore, many of the molecular abnormalities that indicate multimer formation are many in the shutter region. However, G374 exists not in the shutter region but in the region on the C-terminal side of the reaction site loop. That is, the G374 mutation of PAI-1 is a newly discovered mutation that is dysfunctional or defective.

活性型ＰＡＩ−１において、Ｇ３７４及びその近傍の領域（ｓ２Ｂ：βシート２Ｂ）は、ｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）と互いに結合している。これに対してＧ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１では、疎水性アミノ酸であるグリシン残基が塩基性アミノ酸であるアルギニン残基に変異したことにより、分子内相互作用が損なわれる結果、活性型構造が維持できず、潜在型になっているのではないかと推察される。 In the active PAI-1, G374 and a region in the vicinity thereof (s2B: β sheet 2B) are bonded to each other with s1B (β sheet 1B). On the other hand, in G374R mutant PAI-1, the glycine residue, which is a hydrophobic amino acid, is mutated to the arginine residue, which is a basic amino acid, and as a result, the intramolecular interaction is impaired, so that the active structure can be maintained. It is speculated that it is a latent type.

＜ＰＡＩ−１阻害剤及びＰＡＩ−１活性の阻害方法＞
本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤は、ＰＡＩ−１中のｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域又はＰＡＩ−１中のｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質からなることを特徴とする。活性型ＰＡＩ−１において、ｓ２Ｂは、ｓ１Ｂの一部と分子内相互作用により互いに結合する。ｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質（以下、「ｓ２Ｂ結合物質」ということがある。）又はｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質（以下、「ｓ１Ｂ結合物質」ということがある。）とＰＡＩ−１を結合させることにより、ＰＡＩ−１分子内における第１領域と第２領域の相互作用が阻害される結果、活性型の安定性が損なわれて潜在型となる結果、ＰＡＩ活性が阻害される。 <PAI-1 inhibitor and method for inhibiting PAI-1 activity>
The PAI-1 inhibitor according to the present invention comprises a substance capable of binding to a region forming s2B (β sheet 2B) in PAI-1 or a region forming s1B (β sheet 1B) in PAI-1. It is characterized by. In active PAI-1, s2B binds to a part of s1B by intramolecular interaction. A substance capable of binding to the region forming s2B (β sheet 2B) (hereinafter sometimes referred to as “s2B binding substance”) or a substance capable of binding to the region forming s1B (β sheet 1B) (hereinafter referred to as “s1B”). By binding PAI-1 to PAI-1, the interaction between the first region and the second region in the PAI-1 molecule is inhibited, and as a result, the stability of the active form is impaired. As a result of the latent form, PAI activity is inhibited.

ｓ２Ｂ結合物質及びｓ１Ｂ結合物質としては、ペプチドであってもよく、抗体等のタンパク質であってもよく、糖鎖や脂肪鎖等により修飾されたタンパク質又は核酸であってもよく、低分子化合物であってもよい。抗体としては、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体であってもよく、人工抗体であってもよい。また、ｓ２Ｂ結合物質としては、ｓ２Ｂを形成する領域と特異的に結合可能な物質が好ましく、ｓ１Ｂ結合物質としては、ｓ１Ｂを形成する領域と特異的に結合可能な物質が好ましい。また、ＰＡＩ−１に対する結合能を損なわない限度において、糖鎖修飾、脂質修飾、リン酸化、ペプチド修飾等の各種修飾が行われていてもよい。ｓ１Ｂ結合物質としては、例えば、ｓ２Ｂを形成する領域又はその部分領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、ｓ２Ｂを形成する領域中のヒトＰＡＩ−１のＦ３７２（３７２位のフェニルアラニン）からＶ３７６（３７６位のバリン）までの５アミノ酸からなる領域（ＦＭＧＱＶ領域、図１の最下段の四角で囲われた領域）に相当する領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。 The s2B binding substance and s1B binding substance may be peptides, proteins such as antibodies, proteins or nucleic acids modified with sugar chains, fatty chains, etc. There may be. The antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, or an artificial antibody. The s2B binding substance is preferably a substance that can specifically bind to the region that forms s2B, and the s1B binding substance is preferably a substance that can specifically bind to the region that forms s1B. In addition, various modifications such as sugar chain modification, lipid modification, phosphorylation, and peptide modification may be performed as long as the binding ability to PAI-1 is not impaired. Examples of the s1B binding substance include a peptide comprising the same amino acid sequence as the region forming s2B or a partial region thereof, and from human PAI-1 F372 (phenylalanine at position 372) to V376 in the region forming s2B. Peptides having the same amino acid sequence as the region corresponding to the region consisting of 5 amino acids up to (valin at position 376) (FMGQV region, the region surrounded by the bottom square in FIG. 1) are preferred.

特に、ヒトＰＡＩ−１又はヒトＰＡＩ−１とのアミノ酸配列の相同性（配列同一性）が高い（例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上）ＰＡＩ−１に対する阻害剤の場合、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤は、ＰＡＩ−１中の部分領域のうち、Ｇ３７４を含む部分領域である第１領域、又はＰＡＩ−１のＮ３１（３１位のアスパラギン）からＳ３５（３５位のセリン）までの領域を含む第２領域に結合可能な物質からなることが好ましい。活性型ＰＡＩ−１において、第１領域と第２領域は、分子内相互作用により互いに結合する領域である。第１領域に結合可能な物質（以下、「第１領域結合物質」ということがある。）とＰＡＩ−１を結合させることにより、ＰＡＩ−１分子内における第１領域と第２領域の相互作用が阻害される結果、活性型の安定性が損なわれて潜在型となる結果、ＰＡＩ活性が阻害される。同様に、第２領域に結合可能な物質（以下、「第２領域結合物質」ということがある。）とＰＡＩ−１を結合させることにより、ＰＡＩ−１分子内における第１領域と第２領域の相互作用が阻害される結果、活性型の安定性が損なわれて潜在型となる結果、ＰＡＩ活性が阻害される。 In particular, in the case of an inhibitor against PAI-1, which has high amino acid sequence homology (sequence identity) with human PAI-1 or human PAI-1, (for example, 80% or more, preferably 90% or more) The PAI-1 inhibitor is a first region which is a partial region including G374, or a PAI-1 N31 (31st asparagine) to S35 (35th serine). It is preferable that it consists of a substance which can be couple | bonded with the 2nd area | region containing this area | region. In the active PAI-1, the first region and the second region are regions that are bonded to each other by intramolecular interaction. The interaction between the first region and the second region in the PAI-1 molecule by binding PAI-1 to a substance capable of binding to the first region (hereinafter sometimes referred to as “first region binding substance”). As a result, the stability of the active form is impaired, resulting in a latent form. As a result, the PAI activity is inhibited. Similarly, the first region and the second region in the PAI-1 molecule can be obtained by binding PAI-1 to a substance that can bind to the second region (hereinafter also referred to as “second region binding substance”). As a result, the stability of the active form is lost, resulting in a latent form, and as a result, the PAI activity is inhibited.

本発明において、第１領域とは、ＰＡＩ−１中のＧ３７４を含む９以下のアミノ酸残基からなる領域である。第１領域中におけるＧ３７４の位置は特に限定されるものではなく、領域の真ん中付近であってもよく、領域の端付近であってもよく、領域のＮ末端であってもよく、領域のＣ末端であってもよい。また、第１領域のアミノ酸長は、９以下であれば特に限定されるものではないが、３〜９アミノ酸であることが好ましく、３〜８アミノ酸であることがより好ましく、４〜６アミノ酸であることがさらに好ましく、５アミノ酸であることがよりさらに好ましい。なお、第１領域としては、Ｇ３７４のみであってもよい。 In the present invention, the first region is a region consisting of 9 or less amino acid residues including G374 in PAI-1. The position of G374 in the first region is not particularly limited, and may be near the center of the region, near the end of the region, or at the N-terminus of the region, or in the region C. The terminal may be sufficient. The amino acid length of the first region is not particularly limited as long as it is 9 or less, but is preferably 3 to 9 amino acids, more preferably 3 to 8 amino acids, and 4 to 6 amino acids. More preferably, it is more preferably 5 amino acids. Note that the first region may be only G374.

本発明における第１領域としては、ＰＡＩ−１のＦ３７２からＶ３７６までの５アミノ酸からなる領域（ＦＭＧＱＶ領域）を含む領域であることが好ましい。ＦＭＧＱＶ領域は、ｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域内にある。中でも、ＰＡＩ−１のＬ３７１（３７１位のロイシン）からＰ３７９（３７９位のプロリン）までの領域のうちのＧ３７４を含む１〜９のアミノ酸からなる部分領域であることがより好ましく、ＰＡＩ−１のＬ３７１からＰ３７９までの領域のうちのＧ３７４を真ん中又はその近傍に含む１〜８のアミノ酸からなる部分領域であることがさらに好ましく、ＰＡＩ−１のＦ３７２からＶ３７６までの領域がよりさらに好ましい。 The first region in the present invention is preferably a region including a region consisting of 5 amino acids from F372 to V376 (FMGQV region) of PAI-1. The FMGQV region is in the region forming s2B (β sheet 2B). Among these, a partial region consisting of 1 to 9 amino acids including G374 of PAI-1 from L371 (leucine at position 371) to P379 (proline at position 379) is more preferable. Of the regions from L371 to P379, a partial region consisting of 1 to 8 amino acids containing G374 in the middle or the vicinity thereof is more preferable, and a region from P372 to F376 of V372 is even more preferable.

本発明において、第２領域は、ＰＡＩ−１のＮ３１からＳ３５までの５アミノ酸からなる領域（ＮＶＶＦＳ領域、図１の最上段の四角で囲われた領域）を含む領域である。ＮＶＶＦＳ領域は、ｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域内にある。第２領域中におけるＮＶＶＦＳ領域の位置は特に限定されるものではなく、領域の真ん中付近であってもよく、領域の端付近であってもよく、領域のＮ末端であってもよく、領域のＣ末端であってもよい。また、第２領域は、ＮＶＶＦＳ領域を含むＰＡＩ−１の部分領域であれば特に限定されるものではないが、ｓ１Ｂを形成する領域内にあることが好ましい。本発明における第２領域としては、ＮＶＶＦＳ領域を含む１２以下のアミノ酸からなる領域であることが好ましく、ＮＶＶＦＳ領域を含む８以下のアミノ酸からなる領域であることがより好ましく、ＮＶＶＦＳ領域を真ん中又はその近傍に含む８以下のアミノ酸からなる領域であることがさらに好ましく、ＮＶＶＦＳ領域がよりさらに好ましい。 In the present invention, the second region is a region comprising a region consisting of 5 amino acids from N31 to S35 of PAI-1 (NVVFS region, the region surrounded by the uppermost square in FIG. 1). The NVVFS region is in the region that forms s1B (β sheet 1B). The position of the NVVFS region in the second region is not particularly limited, and may be near the center of the region, near the end of the region, or at the N-terminus of the region, It may be C-terminal. The second region is not particularly limited as long as it is a partial region of PAI-1 including the NVVFS region, but is preferably in the region where s1B is formed. The second region in the present invention is preferably a region consisting of 12 or less amino acids including the NVVFS region, more preferably a region consisting of 8 or less amino acids including the NVVFS region, and the NVVFS region in the middle or its A region consisting of 8 or less amino acids contained in the vicinity is more preferable, and an NVVFS region is even more preferable.

第１領域結合物質及び第２領域結合物質としては、ペプチドであってもよく、抗体等のタンパク質であってもよく、糖鎖や脂肪鎖等により修飾されたタンパク質又は核酸であってもよく、低分子化合物であってもよい。抗体としては、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体であってもよく、人工抗体であってもよい。また、第１領域結合物質としては、第１領域と特異的に結合可能な物質が好ましく、第２領域結合物質としては、第２領域と特異的に結合可能な物質が好ましい。 The first region binding substance and the second region binding substance may be peptides, may be proteins such as antibodies, may be proteins or nucleic acids modified by sugar chains or fatty chains, It may be a low molecular compound. The antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, or an artificial antibody. The first region binding substance is preferably a substance that can specifically bind to the first region, and the second region binding substance is preferably a substance that can specifically bind to the second region.

第１領域結合物質がペプチドの場合、第１領域結合物質としては、前記第２領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＮＶＶＦＳからなるペプチド（配列番号３）がより好ましい。 When the first region binding substance is a peptide, the first region binding substance is preferably a peptide consisting of the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the second region, more preferably a peptide consisting of NVVFS (SEQ ID NO: 3).

第２領域結合物質がペプチドの場合、第２領域結合物質としては、前記第１領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。具体的には、ＬＦＭＧＱＶＭＥＰ（ＰＡＩ−１のＬ３７１からＰ３７９までの領域と同一のアミノ酸配列、配列番号２）からなるペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜８アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＦＭＧＱＶ（ＰＡＩ−１のＦ３７２からＶ３７６までの領域と同一のアミノ酸配列、配列番号１）からなるペプチドがより好ましい。 When the second region binding substance is a peptide, the second region binding substance is preferably a peptide having the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the first region. Specifically, the peptide consisting of LFMGQVMEP (amino acid sequence identical to the region from L371 to P379 of PAI-1, SEQ ID NO: 2), or the fourth glycine residue in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A peptide consisting of a partial amino acid sequence of 3 to 8 amino acids is preferable, and a peptide consisting of FMGQV (the same amino acid sequence as the region from F372 to V376 of PAI-1, SEQ ID NO: 1) is more preferable.

本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤となる第１領域結合物質又は第２領域結合物質は、ＰＡＩ−１に対する結合能を損なわない限度において、糖鎖修飾、脂質修飾、リン酸化、ペプチド修飾等の各種修飾が行われていてもよい。 The first region-binding substance or the second region-binding substance, which is a PAI-1 inhibitor according to the present invention, can be used for sugar chain modification, lipid modification, phosphorylation, peptide modification, etc. as long as the binding ability to PAI-1 is not impaired. Various modifications may be made.

本発明に係るＰＡＩ−１活性の阻害方法は、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤を用いることを特徴とする。ＰＡＩ−１を、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤と結合させることにより、ＰＡに対する阻害活性を低下させることができる。本発明に係るＰＡＩ−１活性の阻害方法において、活性を阻害する対象となるＰＡＩ−１は、いずれの生物種由来のものであってもよいが、哺乳類由来のものが好ましく、ヒト、マウスやラット、サル等の実験動物、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜若しくは愛玩動物等に由来するものがより好ましく、ヒト由来のＰＡＩ−１が特に好ましい。また、活性を阻害する対象となるＰＡＩ−１は、生体中に存在するものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。 The method for inhibiting PAI-1 activity according to the present invention is characterized by using the PAI-1 inhibitor according to the present invention. By binding PAI-1 to the PAI-1 inhibitor according to the present invention, the inhibitory activity against PA can be reduced. In the method for inhibiting PAI-1 activity according to the present invention, PAI-1 to be the target of inhibiting activity may be derived from any biological species, but is preferably derived from mammals, such as human, mouse and Those derived from laboratory animals such as rats and monkeys, domestic animals such as rabbits, dogs, cows, horses and sheep, or pet animals are more preferred, and human-derived PAI-1 is particularly preferred. Moreover, PAI-1 used as the object which inhibits activity may exist in a biological body, and may be artificially synthesize | combined.

具体的には、ＰＡＩ−１に、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤を接触させることにより、両者を結合させる。ｉｎｖｉｔｒｏで行う場合には、ＰＢＳ（リン酸生理食塩水）、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー等のバッファー中に、ＰＡＩ−１とＰＡＩ−１阻害剤とを共に含有させた状態で所定の時間インキュベートすることにより、両者を結合させることができる。ｉｎｖｉｖｏで行う場合には、例えば、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤を静脈注射等により投与することによって、血液中のＰＡＩ−１にＰＡＩ−１阻害剤を結合させることができる。 Specifically, PAI-1 is brought into contact with the PAI-1 inhibitor according to the present invention, whereby both are bound. When performing in vitro, incubate with PAI-1 and a PAI-1 inhibitor for a predetermined time in a buffer such as PBS (phosphate physiological saline), Tris buffer, HEPES buffer, etc. Thus, both can be combined. When performed in vivo, for example, by administering the PAI-1 inhibitor according to the present invention by intravenous injection or the like, the PAI-1 inhibitor can be bound to PAI-1 in the blood.

本発明に係るＰＡＩ−１活性の阻害方法においては、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤と共に、その他のＰＡＩ−１阻害剤を併用してもよい。その他のＰＡＩ−１阻害剤としては、ＰＡＩ−１のシャッター領域を標的とした阻害剤が挙げられる。 In the method for inhibiting PAI-1 activity according to the present invention, other PAI-1 inhibitors may be used in combination with the PAI-1 inhibitor according to the present invention. Examples of other PAI-1 inhibitors include inhibitors that target the shutter region of PAI-1.

＜ＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法＞
本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法（以下、単に「本発明に係るスクリーニング方法」ということがある。）は、被験物質の中から、ＰＡＩ−１中のＧ３７４を含む部分領域と同一のアミノ酸配列からなる野生型ペプチドとは結合するが、Ｇ３７４が変異した変異型ペプチドには結合しない若しくは極弱くしか結合しない物質を選択することを特徴とする。野生型ペプチドと結合する物質は、ＰＡＩ−１の前記第１領域と結合でき、ＰＡＩ−１分子内における第１領域と第２領域の相互作用が阻害される結果、ＰＡＩ活性を阻害できる可能性が高い。一方で、変異型ペプチドと結合する物質は、野生型ペプチドと結合可能であったとしても、野生型ペプチドとの結合は非特異的な結合である可能性が高く、ＰＡＩ−１阻害剤としては好ましくない。すなわち、野生型ペプチドと強く結合し、変異型ペプチドとはほとんど結合しない物質が、ＰＡＩ−１阻害剤として好適である可能性が高いといえる。 <Screening method of PAI-1 inhibitor>
The screening method for a PAI-1 inhibitor according to the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “screening method according to the present invention”) is the same as a partial region containing G374 in PAI-1 among test substances. It is characterized by selecting a substance that binds to a wild-type peptide consisting of the above amino acid sequence but does not bind to a mutant peptide in which G374 is mutated or binds very weakly. A substance that binds to a wild-type peptide can bind to the first region of PAI-1, and the possibility of inhibiting PAI activity as a result of inhibition of the interaction between the first region and the second region in the PAI-1 molecule. Is expensive. On the other hand, even if the substance that binds to the mutant peptide can bind to the wild-type peptide, the binding to the wild-type peptide is likely to be non-specific, and as a PAI-1 inhibitor, It is not preferable. That is, it can be said that a substance that binds strongly to the wild-type peptide and hardly binds to the mutant peptide is likely to be suitable as a PAI-1 inhibitor.

当該野生型ペプチドは、具体的には、ＰＡＩ−１中のＧ３７４を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチドである。当該変異型ペプチドは、具体的には、ＰＡＩ−１中のＧ３７４を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列のうち、Ｇ３７４のみが酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基）又は塩基性アミノ酸残基（アルギニン残基、ヒスチジン残基、リジン残基）に置換されているアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明に係るスクリーニング方法において用いられる野生型ペプチドと変異型ペプチドは、Ｇ３７４に相当するグリシン残基以外は同一であることが好ましい。 Specifically, the wild type peptide is a peptide consisting of the same amino acid sequence as the first region consisting of 3 to 9 amino acid residues including G374 in PAI-1. Specifically, in the mutant peptide, only G374 is an acidic amino acid residue (aspartic acid residue) in the same amino acid sequence as the first region consisting of 3 to 9 amino acid residues including G374 in PAI-1. Group, glutamic acid residue) or a basic amino acid residue (arginine residue, histidine residue, lysine residue). The wild-type peptide and mutant peptide used in the screening method according to the present invention are preferably the same except for the glycine residue corresponding to G374.

本発明に係るスクリーニング方法において用いられる野生型ペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜８アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。本発明に係るスクリーニング方法において用いられる変異型ペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基のみが酸性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基に置換されている３〜８アミノ酸の全長又は部分アミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。 The wild-type peptide used in the screening method according to the present invention includes a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or the amino acid represented by SEQ ID NO: 2. A peptide consisting of a partial amino acid sequence of 3 to 8 amino acids including the fourth glycine residue in the sequence is preferred, and a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is more preferred. As a mutant peptide used in the screening method according to the present invention, only the fourth glycine residue in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with an acidic amino acid residue or a basic amino acid residue 3 A peptide consisting of a full-length or partial amino acid sequence of ˜8 amino acids is preferred, and a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is more preferred.

具体的には、被験物質と前記野生型ペプチドとの結合性を評価し、被験物質と前記変異型ペプチドとの結合性を評価した後、変異型ペプチドとの結合性よりも、野生型ペプチドとの結合性の方が有意に強かった被検物質を、ＰＡＩ−１阻害剤の候補物質として選択する。野生型ペプチドとの結合性と変異型ペプチドとの結合性の評価は、いずれを先に行ってもよく、同時に行ってもよい。 Specifically, after evaluating the binding between the test substance and the wild-type peptide, and evaluating the binding between the test substance and the mutant peptide, the wild-type peptide and the binding with the mutant peptide A test substance having significantly stronger binding is selected as a candidate substance for a PAI-1 inhibitor. Evaluation of the binding property with the wild-type peptide and the binding property with the mutant-type peptide may be performed either first or simultaneously.

被験物質と野生型ペプチド又は変異型ペプチドの結合性の評価は、２つの物質が互いに結合している量について、定量的又は半定量的に測定可能な方法の中から適宜選択して実施することができる。当該方法としては、例えば、ＢＩＡＣＯＡ、免疫沈降法等が挙げられる。 Evaluation of the binding between the test substance and the wild-type peptide or mutant peptide should be performed by appropriately selecting the amount of the two substances bound to each other from methods that can be measured quantitatively or semi-quantitatively. Can do. Examples of the method include BIACOA and immunoprecipitation.

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.

なお、以下の実施例において用いた配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（ＦＭＧＱＶペプチド）及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド（ＦＭＲＱＶペプチド）は、いずれもGenscript社により合成及び精製されたもの（ＨＰＬＣによる精製度が９９％以上）を購入したものを、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させた状態で使用した。ヒト遺伝子組み換えＰＡＩ−１は、Oxford Biomedical Research社（米国）より購入したものを用い、ヒト遺伝子組み換え一本鎖ｔＰＡは、東洋紡第一製薬社より供与頂いたものを用い、ｕＰＡは三菱ウェルファーマ社より購入したものを用いた。Ｓ２４４４は、Chromogenix社より購入したものを用いた。 The peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (FMGQV peptide) and the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (FMRQV peptide) used in the following examples were both synthesized and purified by Genscript ( Those purchased with a purity of 99% or more by HPLC were used in a state dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide). Human genetically modified PAI-1 was purchased from Oxford Biomedical Research (USA), human genetically modified single-stranded tPA was provided by Toyobo Daiichi Pharmaceutical, and uPA was from Mitsubishi Pharma. The purchased one was used. S2444 used was purchased from Chromogenix.

［実施例１］
ＦＭＧＱＶペプチド（野生型ＰＡＩ−１のＧ３７４を含む５アミノ酸からなる領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチド）と、ＦＭＲＱＶペプチド（Ｇ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１のＧ３７４を含む５アミノ酸からなる領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチド）が、ＰＡＩ−１とｔＰＡとの高分子複合体形成に与える影響を調べた。
まず、ＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．４、１００ｍＭＮａＣｌ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む。）に、ＦＭＧＱＶペプチド（１０ｍＭ）又はＦＭＲＱＶペプチド（１０ｍＭ）とＰＡＩ−１（３μＭ）含有する反応溶液を調製し、室温で１時間震盪してプレインキュベーションした。次いで、当該反応溶液にｔＰＡを最終濃度が１μＭとなるように添加し、３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベート後の反応溶液を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥすることにより、ｔＰＡ−ＰＡＩ−１高分子複合体が形成されたかどうかを確認した。ＦＭＧＱＶペプチド又はＦＭＲＱＶペプチドに代えて、等量の前記ＨＥＰＥＳバッファーを添加して同様にインキュベートしたものをコントロール１、等量のＤＭＳＯを添加して同様にインキュベートしたものをコントロール２とした。 [Example 1]
FMGQV peptide (peptide consisting of the same amino acid sequence as the region consisting of 5 amino acids including G374 of wild type PAI-1) and FMRQV peptide (amino acid identical to the region consisting of 5 amino acids including G374 of G374R mutant PAI-1) The effect of the peptide comprising a sequence on the formation of a polymer complex between PAI-1 and tPA was examined.
First, a reaction solution containing FMGQV peptide (10 mM) or FMRQV peptide (10 mM) and PAI-1 (3 μM) in HEPES buffer (containing 20 mM, pH 7.4, 100 mM NaCl and 0.1% Tween 80) is prepared. Preincubation with shaking for 1 hour at room temperature. Next, tPA was added to the reaction solution to a final concentration of 1 μM, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction solution after the incubation was subjected to 10% SDS-PAGE to confirm whether a tPA-PAI-1 polymer complex was formed. Instead of the FMGQV peptide or FMRQV peptide, an equivalent amount of the HEPES buffer added and incubated in the same manner was used as control 1, and an equivalent amount of DMSO added and incubated in the same manner was used as control 2.

１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。図４中、レーン１はＰＡＩ−１のみを、レーン２はｔＰＡのみを、レーン３はコントロール１（バッファー添加）を、レーン４はコントロール２（ＤＭＳＯ添加）を、レーン５はＦＭＧＱＶペプチドを添加した反応溶液を、レーン６はＦＭＲＱＶペプチドを添加した反応溶液を、それぞれ泳動した結果である。この結果、ＦＭＧＱＶペプチドはｔＰＡ−ＰＡＩ−１高分子複合体形成を阻害したが、溶媒として使用したＤＭＳＯとＦＭＲＱＶペプチドは阻害しなかった。 The results of 10% SDS-PAGE are shown in FIG. In FIG. 4, lane 1 contains only PAI-1, lane 2 contains only tPA, lane 3 contains control 1 (added buffer), lane 4 contains control 2 (DMSO added), and lane 5 contains FMGQV peptide. Lane 6 is the result of electrophoresis of the reaction solution, and Lane 6 is the result of electrophoresis of the reaction solution to which FMRQV peptide was added. As a result, FMGQV peptide inhibited tPA-PAI-1 polymer complex formation, but DMSO and FMRQV peptide used as solvents did not.

［実施例２］
ＦＭＧＱＶペプチド及びＦＭＲＱＶペプチドが、ｕＰＡに対するＰＡＩ−１のＰＡＩ活性に与える影響を調べた。ｕＰＡに対するＰＡＩ活性は、非特許文献１１に記載の方法に準じて行った。
具体的には、ＰＡＩ−１（５ｎＭ）とＦＭＧＱＶペプチド又はＦＭＲＱＶペプチド（０、０．０３、０．０７、０．１３、０．２５、０．５、又は１．０ｍＭ）を含有する反応溶液を調製し、当該反応溶液を室温で１０分間プレインキュベーションした。次いで、当該反応溶液にｕＰＡを最終濃度が２ｎＭとなるように添加し、１０分間３７℃でインキュベートした。インキュベート後の反応溶液の残存ｕＰＡ活性を、特異発色合成基質であるＳ２４４４（最終濃度０．４ｍＭ）を用いて、４０５ｎｍの吸光度の増加分として測定した。ＦＭＧＱＶペプチド又はＦＭＲＱＶペプチドに代えて、等量のＤＭＳＯを添加して同様にインキュベートし測定したものをコントロールとした。 [Example 2]
The effects of FMGQV peptide and FMRQV peptide on PAI activity of PAI-1 against uPA were examined. The PAI activity against uPA was performed according to the method described in Non-Patent Document 11.
Specifically, a reaction solution containing PAI-1 (5 nM) and FMGQV peptide or FMRQV peptide (0, 0.03, 0.07, 0.13, 0.25, 0.5, or 1.0 mM) And the reaction solution was preincubated for 10 minutes at room temperature. Then, uPA was added to the reaction solution so that the final concentration was 2 nM, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The residual uPA activity of the reaction solution after the incubation was measured as an increase in absorbance at 405 nm using S2444 (final concentration 0.4 mM), which is a specific chromogenic substrate. Instead of the FMGQV peptide or FMRQV peptide, an equivalent amount of DMSO was added and incubated and measured in the same manner as a control.

各反応溶液における４０５ｎｍの吸光度の増加の測定結果を図５に示す。横軸はＳ２４４４添加後の反応時間、縦軸は４０５ｎｍの吸光度を示す。また、図６に、図５の結果から算出した各ペプチドのＰＡＩ阻害活性を示す。横軸は反応溶液に添加したペプチド濃度、縦軸はＰＡＩ−１阻害活性（ｕＰＡのみを添加した反応溶液におけるＳ２４４４水解能を１００％として算出した活性（％））を示す。この結果、ＦＭＧＱＶペプチドは濃度依存性にＰＡＩ−１のｕＰＡ活性阻害活性を抑制し、残存ｕＰＡ活性が検出できた。特に、１ｍＭのＦＭＧＱＶペプチド存在下では、ｕＰＡ残存活性はほぼＰＡＩ−１非存在時（図中、「ｕＰＡａｌｏｎｅ」）と同等であった。一方、溶媒として使用したＤＭＳＯ及びＦＭＲＱＶペプチドは、ｕＰＡ活性阻害活性を阻害せず、残存ｕＰＡ活性が検出できなかった。 The measurement result of the increase in absorbance at 405 nm in each reaction solution is shown in FIG. The horizontal axis represents the reaction time after addition of S2444, and the vertical axis represents the absorbance at 405 nm. FIG. 6 shows the PAI inhibitory activity of each peptide calculated from the results of FIG. The horizontal axis represents the peptide concentration added to the reaction solution, and the vertical axis represents PAI-1 inhibitory activity (activity (%) calculated with the S2444 water-dissolving ability in the reaction solution containing only uPA as 100%). As a result, the FMGQV peptide suppressed the uPA activity inhibitory activity of PAI-1 in a concentration-dependent manner, and the residual uPA activity could be detected. In particular, in the presence of 1 mM FMGQV peptide, the residual uPA activity was almost equivalent to that in the absence of PAI-1 ("uPA alone" in the figure). On the other hand, the DMSO and FMRQV peptides used as solvents did not inhibit uPA activity inhibitory activity, and residual uPA activity could not be detected.

実施例１及び２の結果から、野生型のアミノ酸配列であるＦＭＧＱＶペプチドは、ｔＰＡ−ＰＡＩ−１高分子複合体形成を阻害し、ＰＡＩ−１のｕＰＡ活性阻害活性を抑制したが、Ｇ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１のアミノ酸配列であるＦＭＲＱＶペプチドは、どちらの効果も示さなかった。ＦＭＧＱＶペプチドは、Ｇ３７４近傍と対応するｓ１ＢのＮＶＶＦＳ配列部位との結合を競合的に阻害し、高次構造を変化させてＰＡＩ−１活性を阻害したと推察された。 From the results of Examples 1 and 2, FMGQV peptide, which is a wild-type amino acid sequence, inhibited tPA-PAI-1 polymer complex formation and suppressed uPA activity inhibitory activity of PAI-1, but G374R mutant type The FMRQV peptide, the amino acid sequence of PAI-1, did not show either effect. It was speculated that the FMGQV peptide competitively inhibited binding between the vicinity of G374 and the corresponding NVVFS sequence site of s1B, and changed the higher-order structure to inhibit PAI-1 activity.

本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤及びＰＡＩ−１活性の阻害方法を用いることにより、ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏにおいてＰＡＩ−１活性を効果的に抑制することができるため、当該ＰＡＩ−１阻害剤等は、血栓症や多臓器不全の予防や治療の分野や、より優れたＰＡＩ−１阻害剤の開発や製造等の分野で利用が可能である。 Since the PAI-1 activity can be effectively suppressed in vitro or in vivo by using the PAI-1 inhibitor and the method for inhibiting PAI-1 activity according to the present invention, the PAI-1 inhibitor, etc. Can be used in the field of prevention and treatment of thrombosis and multi-organ failure, and in the field of development and production of better PAI-1 inhibitors.

Claims

1st region consisting of 9 or less amino acid residues including glycine residue at position 374 in PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) or a region from asparagine at position 31 to serine at position 35 of PAI-1 A PAI-1 inhibitor comprising a substance capable of binding to the second region.

The PAI-1 inhibitor according to claim 1, wherein the first region is a region from leucine at position 371 to proline at position 379 of PAI-1.

The PAI-1 inhibitor according to claim 1, wherein the first region is a region from phenylalanine at position 372 to valine at position 376 of PAI-1.

The PAI-1 inhibitor according to any one of claims 1 to 3, wherein the second region is a region from asparagine at position 31 to serine at position 35 of PAI-1.

A peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and 3 to 9 amino acids including the fourth glycine residue in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The PAI-1 inhibitor according to claim 1, which is a peptide consisting of a partial amino acid sequence or a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.

A PAI-1 inhibitor comprising a substance capable of binding to a region forming s2B (β sheet 2B) in PAI-1 or a region forming s1B (β sheet 1B) in PAI-1.

In vitro or in vivo (excluding human in vivo), PAI-1 is a first region consisting of 9 or less amino acid residues including glycine residue at position 374 in PAI-1, or PAI- PAI-1 is characterized in that the inhibitory activity against PA (plasminogen activator) is reduced by binding to a substance capable of binding to the second region including the region from asparagine at position 31 to serine at position 35 in 1 Method of inhibiting activity.

The method for inhibiting PAI-1 activity according to claim 7, wherein the first region is a region from leucine at position 371 to proline at position 379 of PAI-1.

The method for inhibiting PAI-1 activity according to claim 7, wherein the first region is a region from phenylalanine at position 372 to valine at position 376 of PAI-1.

The method for inhibiting PAI-1 activity according to any one of claims 7 to 9, wherein the second region is a region from asparagine at position 31 to serine at position 35 of PAI-1.

3 wherein the substance comprises a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the fourth glycine residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The method for inhibiting PAI-1 activity according to claim 7, which is a peptide consisting of a partial amino acid sequence of -9 amino acids or a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.

In vitro or in vivo (excluding human in vivo), PAI-1 is a region forming s2B (β sheet 2B) in PAI-1 or s1B in PAI-1 (β sheet 1B) A method for inhibiting PAI-1 activity, which comprises reducing the inhibitory activity against PA by binding to a substance capable of binding to a region that forms a protein.

Evaluating the binding between the test substance and a wild-type peptide consisting of the same amino acid sequence as the first region consisting of 3 to 9 amino acid residues including a glycine residue at position 374 in PAI-1,
Of the same amino acid sequence as the test substance and the first region consisting of 3 to 9 amino acid residues including glycine residue at position 374 in PAI-1, only the amino acid residue at position 374 is an acidic amino acid residue. Or a step of evaluating the binding to a mutant peptide consisting of an amino acid sequence substituted with a basic amino acid residue;
Selecting a test substance that is significantly stronger in binding to a wild-type peptide than binding to a mutant peptide as a candidate substance for a PAI-1 inhibitor;
A method for screening a PAI-1 inhibitor, comprising:

The wild-type peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or the fourth glycine residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A peptide consisting of a partial amino acid sequence of 3 to 9 amino acids,
The method for screening a PAI-1 inhibitor according to claim 13, wherein the mutant peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.