JP2015146786A - Method to collectively detect food poisoning-causing bacteria by multiplex shuttle pcr - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、食中毒原因菌の検出法、例えば核酸増幅反応を用いた食中毒原因菌の一括検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting food poisoning causative bacteria, for example, a method for collectively detecting food poisoning causative bacteria using a nucleic acid amplification reaction.
食中毒原因施設からの患者の発生を最小限に留めるためには、当該施設に対し適切かつ早急な行政対応を行う必要があり、そのために検査法に迅速性が求められている。食中毒事件が発生した際には、行政処分等の対応が行われることにより新たな患者の発生が防止されているが、病因物質や原因食品及び施設の特定には科学的な根拠が必要とされている。一般的に食中毒原因菌の検索には培養操作が必要となるため、通常３〜７日間を要する。また近年、生化学的性状が通常と異なる細菌による食中毒事件が報告されており（非特許文献１、非特許文献２）、原因菌を検出するためには豊富な知識や経験を要する。
In order to minimize the occurrence of patients from food poisoning-causing facilities, it is necessary to take appropriate and prompt administrative responses to the facilities, and thus the testing method is required to be rapid. In the event of a food poisoning incident, the occurrence of a new patient is prevented by taking administrative measures, etc., but scientific evidence is required to identify the causative agent, the causative food, and the facility. ing. In general, searching for food poisoning causative bacteria requires a culture operation, and therefore usually requires 3 to 7 days. In recent years, food poisoning cases due to bacteria having different biochemical properties have been reported (Non-Patent
2011年には欧州を中心に腸管出血性大腸菌O104による集団食中毒が発生したが、この当時、国内においてはO104の抗血清は入手困難であったため、発生があった場合には抗血清による同定は非常に困難であったと考えられる。このような状況を改善するために遺伝子検査が有効となることがある。生化学的、血清学的特徴が定型でなかった場合であっても、病原性が不変であれば関連遺伝子を検出することが可能と考えられる。 Massive food poisoning due to enterohemorrhagic Escherichia coli O104 occurred mainly in Europe in 2011, but since antiserum of O104 was difficult to obtain in Japan at that time, identification by antiserum would occur if it occurred It seems to have been very difficult. Genetic testing may be effective to improve this situation. Even if biochemical and serological characteristics are not typical, it is considered possible to detect related genes if the pathogenicity remains unchanged.
また、遺伝子検査は培養と比較し、結果までに数時間と迅速性が期待されることから、近年複数遺伝子を同時に検出することができるマルチプレックスPCRを用いた検査法の検討がなされている（非特許文献３〜６）。非特許文献５に記載の食中毒起因微生物検出方法では、１つの検体当たり３つの反応液を要する。
In addition, genetic testing is expected to be as quick as several hours before results compared to culture, and recently, examination methods using multiplex PCR that can detect multiple genes simultaneously have been studied ( Non-patent
大規模で広域的な食中毒事件が発生した場合、原因食品の特定が急務であり、スクリーニング法としてマルチプレックスPCRは有効であるが、このような場合は食品を含む大量の検体に対応でき、広範囲の細菌を検出できる能力が要求される。また、検体搬入即日に結果の判定が可能で、その後の培養操作に反映できる迅速性が望まれる。さらに、日常搬入される全ての検体のスクリーニングで用いる場合については操作性や1検体当たりの経済性も求められる。 In the case of a large-scale wide-area food poisoning incident, it is urgent to identify the causative food, and multiplex PCR is effective as a screening method. The ability to detect bacteria is required. Further, it is possible to determine the result on the same day as the sample is brought in, and it is desired to be quick enough to be reflected in the subsequent culture operation. Furthermore, operability and economic efficiency per sample are also required for screening of all samples that are carried in on a daily basis.
非特許文献７にはinvA遺伝子を増幅するためのプライマー対が記載されている。該プライマー対の塩基配列は本願明細書の配列番号７及び配列番号８に相当する。
Non-Patent
非特許文献８にはlt遺伝子を増幅するためのプライマー対が記載されている（491頁、表１）。該プライマーLT-1の塩基配列は本願明細書の配列番号１７に相当する。該プライマーLT-2の塩基配列は本願明細書の配列番号１８の１〜２０位の塩基配列に相当する。
Non-Patent
非特許文献９には種々の食中毒原因菌が記載されている。食中毒の原因菌として多いのはサルモネラ属菌、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリであり、他にはブドウ球菌、ボツリヌス菌、腸炎ビブリオ、病原大腸菌、他にはウエルシュ菌、セレウス菌、エルシニア・エンテロコリチカ、ナグビブリオ、コレラ菌、赤痢菌、チフス菌、パラチフスＡ菌等が挙げられる（非特許文献９）。
Non-patent
非特許文献１０はcadF遺伝子を用いたカンピロバクター・ジェジュニ及びカンピロバクター・コリの同定法を記載している。同文献は専らカンピロバクター属細菌の同定が目的であり、カンピロバクター・ジェジュニとカンピロバクター・コリとを鑑別することには主眼が置かれていない。
Non-Patent
非特許文献１１はリアルタイムPCR法による食中毒原因菌のスクリーニング法を記載している。
Non-Patent
非特許文献１２は食中毒原因菌の24標的遺伝子を一斉検出するためのMultiplexリアルタイムSYBR Green PCR法を記載している。この方法では１検体の検査には８つの反応液が必要とされる。
Non-Patent
非特許文献１３はリアルタイムPCR法における蛍光消光現象を利用した蛍光マルチプレックスPCR法による細菌性嘔吐毒関連遺伝子の同時検出および識別を記載している。開示されている方法は、一般的な食中毒原因菌の一部のみを同定するものである。検出時間は４〜５時間程度であり、反応液当たりの検出感度は107〜108cfu/反応である。 Non-Patent Document 13 describes simultaneous detection and identification of bacterial vomiting toxin-related genes by fluorescence multiplex PCR method using fluorescence quenching phenomenon in real-time PCR method. The disclosed method identifies only some of the common food poisoning pathogens. The detection time is about 4 to 5 hours, and the detection sensitivity per reaction solution is 10 7 to 10 8 cfu / reaction.
特許文献１はカンピロバクターのcdtB遺伝子を標的とする検出法を記載している。同文献の手法はリアルタイムPCR法であり、カンピロバクター属細菌のみに着目しており、他の属の食中毒原因菌の記載はない。
このように、現状では1検体当たり複数の反応液が必要となる方法や、高価な試薬・機器を用いる方法、発生する食中毒原因菌のうち一部にしか対応できない方法、判定に1日以上かかってしまう方法等しか提供されていない。迅速性、操作性、経済性、合理性を同時に持ち、上記のような事例に対応できる検出方法はない。 In this way, currently, a method that requires multiple reaction solutions per sample, a method that uses expensive reagents and instruments, a method that can handle only a part of the food poisoning pathogens that occur, and the determination takes more than one day. Only a method to end up is provided. There is no detection method that can respond to the above-mentioned cases simultaneously with quickness, operability, economy and rationality.
本発明は、上記の問題点に対処可能な食中毒原因菌同定法を提供することを目的とする。例えば本発明は迅速性、操作性、経済性、合理性を同時に備えた食中毒原因菌同定法を提供することを課題とする。 An object of this invention is to provide the food poisoning causative bacteria identification method which can cope with said problem. For example, an object of the present invention is to provide a method for identifying food poisoning causative bacteria having simultaneously quickness, operability, economy and rationality.
本発明は、1検体当たり1反応液で検査可能であり、発生する食中毒原因菌の大部分に対応でき、かつ短時間で結果判定が可能であるマルチプレックスPCR法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a multiplex PCR method that can be tested with one reaction solution per specimen, can cope with the majority of the food poisoning causative bacteria, and can determine the result in a short time. .
例えばある実施形態において本発明は(i)大量の検体数（１００検体前後）に対応でき、(ii)細菌性感染型食中毒の原因菌のほとんどを検出でき、(iii)試料搬入当日に結果が判定でき（所要時間２時間程度）、(iv)操作が簡便であり（１検体を１反応液で処理可能）、かつ(v)市販プライマーを用いたPCRと比較して検体当たりのランニングコストが安い、という５つの要件を満たす食中毒原因菌の検出方法を提供することを目的とする。 For example, in one embodiment, the present invention can cope with (i) a large number of specimens (around 100 specimens), (ii) can detect most causative bacteria of bacterial infectious food poisoning, and (iii) results on the day of sample delivery. (V) Simple operation (1 sample can be treated with 1 reaction solution), and (v) Running cost per sample compared to PCR using commercially available primers An object of the present invention is to provide a method for detecting a causative agent of food poisoning that satisfies the five requirements of being inexpensive.
本発明者は上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、食中毒原因菌の遺伝子を特異的に増幅できるマルチプレックスPCR用プライマーを作製し、多くの臨床分離株を含む食中毒原因菌についてマルチプレックスPCRの評価を行い、複数の食中毒原因菌を同時に検出できることを見出し本発明を完成させた。本発明のプライマーを用いたマルチプレックスPCRは、高い特異性を有し、複数の食中毒原因菌を同時に検出できる。また、本発明の方法は、多数の検体について、一回の操作によって菌種レベルで食中毒原因菌を同定できる。すなわち本発明は、以下の実施形態を提供する。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have produced primers for multiplex PCR that can specifically amplify genes of causative agents of food poisoning, and multiplex the causative agents of food poisoning including many clinical isolates. PCR was evaluated, and it was found that a plurality of bacteria causing food poisoning could be detected simultaneously, thereby completing the present invention. Multiplex PCR using the primers of the present invention has high specificity and can simultaneously detect a plurality of food poisoning causative bacteria. In addition, the method of the present invention can identify food poisoning causative bacteria at a bacterial species level for a large number of specimens by a single operation. That is, the present invention provides the following embodiments.
第１の実施形態において、本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、
食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いて試料について核酸増幅反応を行う工程及び増幅産物を確認する工程を含む、試料中の食中毒原因菌を検出する方法を提供する。配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対を用いると、カンピロバクターのcadF遺伝子が増幅される。例えば配列番号２５に示すCampylobacter coli JV20 contig00034のcadF遺伝子（391-936位）が増幅され507bpの増幅産物が得られるか、または配列番号２６に示すCampylobacter jejuni subsp. jejuni CG8421 CPSのcadF遺伝子（391-897位）が増幅され546bpの増幅産物が得られる。こうした増幅産物は電気泳動等により確認することができ、これによりカンピロバクター・ジェジュニ及び／又はカンピロバクター・コリを検出できる。本願明細書において増幅産物とは、核酸増幅反応により標的遺伝子が複製される結果生じる核酸をいう。
In the first embodiment, the present invention is a method for detecting food poisoning causative bacteria in a sample, comprising:
The following primer pair consisting of two polynucleotides that can specifically bind to the genomic DNA of a food poisoning bacterium:
(A) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for amplifying the cadF gene;
A method for detecting food poisoning causative bacteria in a sample is provided, which comprises a step of performing a nucleic acid amplification reaction on the sample using the method and a step of confirming the amplification product. When a primer pair consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is used, Campylobacter cadF gene is amplified. For example, the cadF gene (positions 391-936) of Campylobacter coli JV20 contig00034 shown in SEQ ID NO: 25 is amplified to obtain an amplification product of 507 bp, or the cadF gene of Campylobacter jejuni subsp. Jejuni CG8421 CPS shown in SEQ ID NO: 26 (391- 897) is amplified, and an amplified product of 546 bp is obtained. Such amplification products can be confirmed by electrophoresis or the like, whereby Campylobacter jejuni and / or Campylobacter coli can be detected. As used herein, an amplification product refers to a nucleic acid resulting from the replication of a target gene by a nucleic acid amplification reaction.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（b）のプライマー対を使用すると配列番号２７のcpe遺伝子が増幅され378bpの増幅産物が得られる。該増幅産物からウエルシュ菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(B) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for amplifying the cpe gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (b) is used, the cpe gene of SEQ ID NO: 27 is amplified and an amplification product of 378 bp is obtained. Clostridium perfringens can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（c）のプライマー対を使用すると配列番号２８のipaH遺伝子が増幅され332bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から赤痢菌及び／又は腸管侵入性大腸菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(C) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for amplifying the ipaH gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (c) is used, the ipaH gene of SEQ ID NO: 28 is amplified, and an amplified product of 332 bp is obtained. Shigella and / or intestinal invasive Escherichia coli can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｄ）invA遺伝子を増幅するための配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（d）のプライマー対を使用すると配列番号２９のinvA遺伝子が増幅され284bpの増幅産物が得られる。該増幅産物からサルモネラ属菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(D) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for amplifying the invA gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (d) is used, the invA gene of SEQ ID NO: 29 is amplified and an 284 bp amplification product is obtained. Salmonella spp. Can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（e）のプライマー対を使用すると配列番号３０のeae遺伝子が増幅され252bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管病原性大腸菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(E) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for amplifying the eae gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (e) is used, the eae gene of SEQ ID NO: 30 is amplified and an amplification product of 252 bp is obtained. Enteropathogenic E. coli can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（f）のプライマー対を使用すると配列番号３１のtdh遺伝子が増幅され195bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸炎ビブリオを検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(F) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for amplifying the tdh gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (f) is used, the tdh gene of SEQ ID NO: 31 is amplified and an amplification product of 195 bp is obtained. Vibrio parahaemolyticus can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（g）のプライマー対を使用すると配列番号３２のst1b遺伝子が増幅され169bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管毒素原性大腸菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(G) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 for amplifying the st1b gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (g) is used, the st1b gene of SEQ ID NO: 32 is amplified and an amplified product of 169 bp is obtained. Enterotoxigenic Escherichia coli can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（h）のプライマー対を使用すると配列番号３３のst1a遺伝子が増幅され150bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管毒素原性大腸菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(H) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for amplifying the st1a gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (h) is used, the st1a gene of SEQ ID NO: 33 is amplified and an amplification product of 150 bp is obtained. Enterotoxigenic Escherichia coli can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｉ）lt遺伝子を増幅するための配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（i）のプライマー対を使用すると配列番号３４のlt遺伝子が増幅され132bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から毒素原性大腸菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(I) a primer comprising the sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for amplifying the lt gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (i) is used, the lt gene of SEQ ID NO: 34 is amplified and a 132 bp amplification product is obtained. Toxigenic E. coli can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（j）のプライマー対を使用すると配列番号３５のstx2遺伝子が増幅され117bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管出血性大腸菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(J) a primer comprising the sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for amplifying the stx2 gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (j) is used, the stx2 gene of SEQ ID NO: 35 is amplified and a 117 bp amplification product is obtained. Enterohemorrhagic Escherichia coli can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（k）のプライマー対を使用すると配列番号３６のstx1遺伝子が増幅され100bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管出血性大腸菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(K) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for amplifying the stx1 gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (k) is used, the stx1 gene of SEQ ID NO: 36 is amplified and a 100 bp amplified product is obtained. Enterohemorrhagic Escherichia coli can be detected from the amplified product.
さらなる実施形態において本発明は、試料中の食中毒原因菌を検出する方法であって、食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、食中毒原因菌を検出する方法を提供する。（l）のプライマー対を使用すると配列番号３７のaggR遺伝子が増幅され76bpの増幅産物が得られる。該増幅産物から腸管凝集付着性大腸菌を検出することができる。
In a further embodiment, the present invention provides a method for detecting a food poisoning pathogen in a sample, the following primer pair consisting of two polynucleotides capable of specifically binding to the food poisoning pathogen genomic DNA:
(L) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 for amplifying the aggR gene;
A method for detecting a food poisoning causative bacterium is provided. When the primer pair (l) is used, the aggR gene of SEQ ID NO: 37 is amplified and a 76 bp amplification product is obtained. Escherichia coli adhering to the intestinal tract can be detected from the amplified product.
これらの(a)〜(l)のプライマー対は、単一の対で、又は複数の対を任意に組み合わせて、又は(a)〜(l)の全ての対を組み合わせて同時に、又は逐次的に核酸増幅反応に用いることができる。複数のプライマー対を使用し、同一溶液中でPCRを行う場合、これをマルチプレックスPCRという。増幅産物の有無は電気泳動等により確認することができ、これにより試料から増幅された遺伝子を有する食中毒原因菌を検出することができる。 These primer pairs (a) to (l) may be a single pair, or any combination of multiple pairs, or a combination of all pairs (a) to (l), simultaneously or sequentially. It can be used for nucleic acid amplification reaction. When PCR is performed in the same solution using a plurality of primer pairs, this is called multiplex PCR. Presence or absence of the amplification product can be confirmed by electrophoresis or the like, and thereby food poisoning bacteria having the gene amplified from the sample can be detected.
さらなる実施形態において核酸増幅反応はシャトルPCRとすることができる。またシャトルPCRにおいて試料溶液を(i)９４℃で１分間変性させ、その後、(ii)９４℃で５秒間変性させ(iii)６１℃以上の温度、例えば６１℃、６２℃、６３℃又は６４℃で４５秒間アニーリング及び伸長させる(ii)及び(iii)からなるサイクルを所定の回数、例えば３０回以上、３１回、３２回、３３回、３４回、又は３５回以上繰り返すことができる。これをさらに、その後７２℃にて５分保持することができる。 In a further embodiment, the nucleic acid amplification reaction can be shuttle PCR. In shuttle PCR, the sample solution is (i) denatured at 94 ° C. for 1 minute, and then (ii) denatured at 94 ° C. for 5 seconds. (Iii) a temperature of 61 ° C. or higher, for example 61 ° C., 62 ° C., 63 ° C. or 64 ° C. The cycle consisting of (ii) and (iii), which is annealed and elongated at 45 ° C. for 45 seconds, can be repeated a predetermined number of times, for example, 30 times, 31 times, 32 times, 33 times, 34 times, or 35 times or more. This can then be held at 72 ° C. for 5 minutes.
さらなる実施形態において本発明は、食中毒原因菌を検出する方法に用いるためのキットを提供する。該キットは上記（ａ）〜（ｌ）のプライマー対のいずれか、それらの任意の組合せ、又は全部を含み得る。また場合によりキットは他の試薬や使用説明書を含みうる。 In a further embodiment, the present invention provides a kit for use in a method for detecting food poisoning pathogens. The kit may include any of the primer pairs (a) to (l) above, any combination thereof, or all. In some cases, the kit may contain other reagents and instructions for use.
本発明のマルチプレックスシャトルPCR法により食中毒原因菌を一括検出することができる。具体的には、食中毒原因菌として頻繁に検出されるカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni)及びカンピロバクター・コリ(C. coli)、ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)、シゲラ属菌(Shigella spp.)、サルモネラ属菌(Salmonella spp.)、ビブリオ・パラヘモリティカス(Vibrio parahaemolyticus)、腸管出血性大腸菌（EHEC）、腸管毒素原性大腸菌（ETEC）、腸管侵入性大腸菌（EIEC）、腸管病原性大腸菌（EPEC）、腸管凝集付着性大腸菌（EAggEC）を一括検出することができる。 Food poisoning causative bacteria can be collectively detected by the multiplex shuttle PCR method of the present invention. Specifically, Campylobacter jejuni and Campylobacter jejuni, C. coli, Clostridium perfringens, Shigella spp., Salmonella spp. Frequently detected as food poisoning causative bacteria (Salmonella spp.), Vibrio parahaemolyticus, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Intestinal agglutination-adherent Escherichia coli (EAggEC) can be collectively detected.
ある実施形態において、本発明の方法はシャトルPCRを用いるため検出所要時間は、温度変化が遅い機器を使用し電気泳動を含めても2時間以内に検出が可能であった。 In one embodiment, since the method of the present invention uses shuttle PCR, the time required for detection was able to be detected within 2 hours even when electrophoresis was used using an instrument with a slow temperature change.
本発明の方法は、特殊で高価な試薬を必要とせず、ある実施形態では1検体当たりの検出にかかる費用は試薬や電気泳動を全て含めて約130円であり、従来法と比較して低価格で効率的に食中毒原因菌を検出同定できる。また、リアルタイムPCRやLAMP法などと比べ高価な機器を導入する必要もない。さらに本発明の方法は多種の食中毒原因菌を一括検出するが、その際の特異度と感度も高く、菌株を用いたある実施形態では感度は99.1%、特異度は100%であった。検出感度は全ての遺伝子が102 CFU/反応以下となった。ある実施形態では、消化器症状事例において糞便からテンプレートDNAを抽出し、本発明の方法と培養結果を比較したところ、感度は83.3%、特異度は96.4%であった。 The method of the present invention does not require a special and expensive reagent, and in one embodiment, the cost for detection per specimen is about 130 yen including all reagents and electrophoresis, which is lower than the conventional method. Efficiently detect and identify food poisoning bacteria at a low price. Moreover, it is not necessary to introduce expensive equipment as compared with real-time PCR, LAMP method and the like. Further, the method of the present invention collectively detects various food poisoning causative bacteria, and the specificity and sensitivity at that time are also high. In an embodiment using a strain, the sensitivity was 99.1% and the specificity was 100%. The detection sensitivity of all genes was 10 2 CFU / reaction or less. In one embodiment, template DNA was extracted from feces in digestive symptom cases, and the sensitivity was 83.3% and the specificity was 96.4% when the method of the present invention was compared with the culture results.
このように本発明の方法は大規模な食中毒などが発生した際の大量の検体などに用いることができる迅速・安価・簡便な有用なスクリーニング法である。1検体当たりに1反応液を使用するため、複雑な操作も必要としない。本発明の検出方法は臨床検体の検査や、食中毒事例における食品中からの細菌検出に用いることができる。 As described above, the method of the present invention is a rapid, inexpensive and simple useful screening method that can be used for a large amount of specimens when large-scale food poisoning occurs. Since one reaction solution is used per sample, no complicated operation is required. The detection method of the present invention can be used for examination of clinical specimens and detection of bacteria in foods in food poisoning cases.
ある実施形態において本発明は試料中の食中毒原因菌の存在の有無を検出する方法を提供する。食中毒原因菌の検出は、食中毒原因菌に汚染された食品の迅速診断、食品加工工程の安全性確認、食中毒発生時における原因菌の同定などに有用である。 In certain embodiments, the present invention provides a method for detecting the presence or absence of food poisoning bacteria in a sample. Detection of food poisoning causative bacteria is useful for rapid diagnosis of food contaminated with food poisoning causal bacteria, safety confirmation of food processing processes, identification of causative bacteria when food poisoning occurs.
ある実施形態において本発明の食中毒原因菌検出方法は、食中毒原因菌のゲノムDNA又はmRNAに特異的に結合可能なプライマー対を使用し、核酸増幅反応を行うことにより試料中の食中毒原因菌を検出するものである。 In one embodiment, the food poisoning pathogen detection method of the present invention detects a food poisoning pathogen in a sample by performing a nucleic acid amplification reaction using a primer pair that can specifically bind to the genomic DNA or mRNA of the food poisoning pathogen. To do.
本願明細書において試料は、生物学的材料を含むあらゆる試料を包含する。試料としては、食品や食品由来試料、動物飼料や飼料由来の試料、糞便、尿、直腸のスワブ、唾液、血液、体液等が挙げられる。試料は、適宜材料を希釈して検査に用いることができる。一例として試料が糞便である場合、これに適当量の試薬を添加してDNAを抽出し、抽出DNAについてPCRを行うことができる。 As used herein, a sample includes any sample that contains biological material. Samples include food and food-derived samples, animal feed and feed-derived samples, feces, urine, rectal swabs, saliva, blood, body fluids, and the like. The sample can be used for inspection by appropriately diluting the material. As an example, when the sample is feces, DNA can be extracted by adding an appropriate amount of a reagent to this, and PCR can be performed on the extracted DNA.
本発明の検出法を用いることにより、食品中の食中毒原因菌、例えばC.コリ、C.ジェジュニ、ウエルシュ菌、シゲラ属菌、サルモネラ属菌、ビブリオ・パラヘモリティカス、腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管凝集付着性大腸菌等の存在について、簡便かつ迅速に、菌種毎に知ることができる。 By using the detection method of the present invention, food poisoning causative bacteria in foods such as C. coli, C. jejuni, Clostridium perfringens, Shigella spp., Salmonella spp., Vibrio parahemolyticus, enterohemorrhagic Escherichia coli, intestinal tract The presence of enterotoxigenic Escherichia coli, intestinal invasive Escherichia coli, enteropathogenic Escherichia coli, intestinal agglutinating Escherichia coli, etc. can be easily and quickly known for each bacterial species.
本発明の方法を実施する際は、食中毒原因菌による汚染が疑われる食品等の生物学的試料から周知のポリヌクレオチド調製方法、例えばアルカリ-SDS法やボイル法等によってポリヌクレオチドを調製し、得られたポリヌクレオチドを本発明の被験試料とすることができる。例えば菌株を加熱後、遠心分離した上清をテンプレートDNAとしうる。 When carrying out the method of the present invention, a polynucleotide is prepared from a biological sample such as food suspected of being contaminated with food poisoning causative bacteria by a well-known polynucleotide preparation method, for example, alkali-SDS method or boil method. The obtained polynucleotide can be used as a test sample of the present invention. For example, a supernatant obtained by heating and then centrifuging a strain can be used as a template DNA.
本明細書においてポリヌクレオチドとは、複数の塩基または塩基対からなるリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド重合体をいう。ポリヌクレオチドは、RNA、一本鎖および二本鎖のDNAを含む。ポリヌクレオチドは、未修飾の天然の状態のもの、及び修飾塩基の両方を包含する。 In the present specification, a polynucleotide refers to a ribonucleotide or deoxynucleotide polymer composed of a plurality of bases or base pairs. Polynucleotides include RNA, single stranded and double stranded DNA. Polynucleotides include both unmodified native forms and modified bases.
本願明細書において塩基配列について特異的に結合とは、一方の塩基配列が他方の塩基配列と相補的に塩基対を形成し結合することを言い、ランダムな配列同士の非特異的な結合は除かれる。この場合、一方の塩基配列と他方の塩基配列とは、完全に対形成するよう相補性が一致していると高温でも特異的に結合するが、適当な温度等の条件下で一方の塩基配列と他方の塩基配列とが対形成できるならば配列中に不一致の塩基が一部存在してもよい。例えば配列番号１及び２のプライマーは、それぞれカンピロバクター・コリのcadF遺伝子（配列番号２５）の配列と不一致の塩基を１又は２つ有するが、Tm値は59.8℃及び61℃であり、これと特異的に結合しうる。また配列番号２のプライマーはカンピロバクター・ジェジュニのcadF遺伝子（配列番号２６）と不一致の塩基を１つ有するが、Tm値が61℃であり、これと特異的に結合しうる。 In the present specification, specific binding of a base sequence means that one base sequence forms a base pair in a complementary manner with the other base sequence and binds, and non-specific binding between random sequences is excluded. It is burned. In this case, one base sequence and the other base sequence bind specifically even at high temperatures if the complementarity matches so that they completely form a pair. If the base sequence can be paired with the other base sequence, a part of mismatched bases may exist in the sequence. For example, the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 have one or two bases that do not match the sequence of Campylobacter coli cadF gene (SEQ ID NO: 25), but the Tm values are 59.8 ° C and 61 ° C, respectively. Can be combined. The primer of SEQ ID NO: 2 has one base mismatched with Campylobacter jejuni cadF gene (SEQ ID NO: 26), but has a Tm value of 61 ° C. and can specifically bind to it.
本願明細書において遺伝子とは、生物またはウイルスのゲノムの遺伝情報をコードする塩基配列からなる核酸をいう。遺伝子は狭義には構造遺伝子をさすが、本願明細書中では一部の実施形態においては非コード領域や、認識配列をも包含することがある。本発明のマルチプレックスシャトルPCR法は、Campylobacter coliのcadF遺伝子（配列番号２５）、Campylobacter jejuni subsp. jejuniのcadF遺伝子（配列番号２６）、Clostridium perfringensのcpe遺伝子（配列番号２７）、Shigella flexneriのipaH遺伝子（配列番号２８）、Salmonella entericaのinvA遺伝子（配列番号２９）、大腸菌のeae遺伝子（配列番号３０）、Vibrio parahaemolyticusのtdh遺伝子（配列番号３１）、大腸菌のSt1b遺伝子（配列番号３２）、大腸菌のST1a遺伝子（配列番号３３）、大腸菌のLT遺伝子（配列番号３４）、大腸菌のstr2遺伝子（配列番号３５）、大腸菌のstx1遺伝子（配列番号３６）、及び大腸菌のaggR遺伝子（配列番号３７）等の遺伝子を増幅しうる。また、これらの他に、さらなる遺伝子を増幅してもよい。本発明では、目的遺伝子を検出するために、当該遺伝子を標的とするプライマーを使用できるほか、当該遺伝子に対応するmRNAを標的とするプライマーを使用してもよい。ある遺伝子に対応するmRNAとは、ゲノムにコードされる遺伝子が転写されたmRNA産物をいう。ゲノム中の遺伝子の塩基配列が特定されていれば、当業者は適宜、これに対応するmRNAを標的とするプライマーを設計することができる。 In the present specification, a gene refers to a nucleic acid having a base sequence that encodes genetic information of the genome of an organism or virus. A gene refers to a structural gene in a narrow sense, but may include a non-coding region and a recognition sequence in some embodiments in the present specification. The multiplex shuttle PCR method of the present invention comprises Campylobacter coli cadF gene (SEQ ID NO: 25), Campylobacter jejuni subsp. Jejuni cadF gene (SEQ ID NO: 26), Clostridium perfringens cpe gene (SEQ ID NO: 27), Shigella flexneri ipaH. Gene (SEQ ID NO: 28), Salmonella enterica invA gene (SEQ ID NO: 29), Eae coli eae gene (SEQ ID NO: 30), Vibrio parahaemolyticus tdh gene (SEQ ID NO: 31), E. coli St1b gene (SEQ ID NO: 32), E. coli ST1a gene (SEQ ID NO: 33), E. coli LT gene (SEQ ID NO: 34), E. coli str2 gene (SEQ ID NO: 35), E. coli stx1 gene (SEQ ID NO: 36), E. coli aggR gene (SEQ ID NO: 37), etc. Can be amplified. In addition to these, additional genes may be amplified. In the present invention, in order to detect a target gene, a primer targeting the gene can be used, and a primer targeting mRNA corresponding to the gene may be used. The mRNA corresponding to a certain gene refers to an mRNA product in which a gene encoded in the genome is transcribed. If the base sequence of the gene in the genome is specified, those skilled in the art can appropriately design a primer that targets the corresponding mRNA.
本発明の検出方法では、目的遺伝子を増幅するために、当該遺伝子に特異的なプライマーを用いる。プライマーとしては特に断らない限り、目的遺伝子のある領域を挟んで5'側及び3'側から伸長するよう設計されたプライマー対を用いる。増幅されるのは全長遺伝子であっても、その一部の領域であってもよい。プライマーとしては、上記のcadFやcpe遺伝子等を増幅するものが挙げられる。設計したプライマーはBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）といった支援ツールを用いて融点や特異性を確認することができる。本発明のプライマーとしては、例えば配列番号１〜２４の塩基配列を有するプライマーが挙げられる。本発明の検出方法に用いるプライマーはこれらに限定されず、同じ遺伝子の一部又は全部を増幅し、類似の長さの増幅産物を生じ、類似のTm温度を有するものであれば、塩基配列が前後したり、一部にミスマッチ、置換、付加塩基を有するものであってもよい。またプライマーは検出のため、適宜標識化することができる。標識としては蛍光物質、放射性同位元素、酵素活性物質等が挙げられる。 In the detection method of the present invention, in order to amplify the target gene, a primer specific to the gene is used. Unless otherwise specified, primer pairs designed to extend from the 5 ′ side and the 3 ′ side across a region with the target gene are used. A full-length gene may be amplified or a partial region thereof may be amplified. Examples of the primer include those that amplify the cadF and cpe genes described above. The designed primer can be checked for melting point and specificity using a support tool such as Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). As a primer of this invention, the primer which has the base sequence of sequence number 1-24 is mentioned, for example. Primers used in the detection method of the present invention are not limited to these, and a base sequence may be used as long as it amplifies a part or all of the same gene to produce an amplification product of a similar length and has a similar Tm temperature. It may be one that has a mismatch, substitution, or an added base. The primer can be appropriately labeled for detection. Examples of the label include a fluorescent substance, a radioisotope, an enzyme active substance, and the like.
本発明の方法は、（a）〜（l）のプライマー対を別々に用いてもよいが、単一の核酸増幅反応において（a）〜（l）のプライマー対の一部又は全部を適当に組み合わせて同時に使用することもできる。複数のプライマーを単一反応に使用する手法を、マルチプレックスPCR法という。また変性ステップ、アニーリングステップ、伸長ステップを通常３段階で行うところを、変性ステップ及びアニーリングと伸長を兼ねたステップからなる２段階でPCRを行う手法をシャトルPCR法という。これらを組み合わせた方法をマルチプレックスシャトルPCR法という。本発明の食中毒原因菌の検出同定方法は、核酸増幅反応工程を含み、好ましくはマルチプレックスPCR法、さらに好ましくはマルチプレックスシャトルPCR法を用いる。本発明の方法ではPCRによる増幅産物を電気泳動し、増幅産物のバンドのサイズを観察することで複数の菌種を同時に鑑別することができる。本発明における核酸増幅方法は、目的産物が得られる限りどのような手法を用いてもよい。例えば本発明の核酸増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることができる。 In the method of the present invention, the primer pairs (a) to (l) may be used separately, but a part or all of the primer pairs (a) to (l) are appropriately used in a single nucleic acid amplification reaction. It can also be used in combination. A technique using a plurality of primers in a single reaction is called a multiplex PCR method. A method of performing PCR in two steps consisting of a denaturation step, a step that combines annealing and extension, where the denaturation step, annealing step, and extension step are usually performed in three steps is called shuttle PCR method. A method combining these is called multiplex shuttle PCR. The method for detection and identification of food poisoning causative bacteria of the present invention includes a nucleic acid amplification reaction step, preferably using a multiplex PCR method, more preferably a multiplex shuttle PCR method. In the method of the present invention, it is possible to simultaneously distinguish a plurality of bacterial species by electrophoresis of amplification products by PCR and observing the size of the bands of the amplification products. The nucleic acid amplification method in the present invention may use any technique as long as the target product can be obtained. For example, the nucleic acid amplification method of the present invention can use polymerase chain reaction (PCR).
ある実施形態において本発明の核酸増幅反応はシャトルPCR法により行う。シャトルPCR法の条件は、増幅産物が特異的に得られるよう適当に設定することができる。一例として本発明のPCR法の条件は、試料溶液を９４℃で１分、次いで９４℃で５秒、次いで６４℃で４５秒にて伸長させるサイクルを所定の回数繰り返し、その後７２℃にて５分保持する、というものであり得る。ここでアニーリングと伸長を兼ねたステップ（以下、本願明細書においてアニーリング・伸長ステップということがある）は、温度に敏感であり、６４℃以上であれば非特異的バンドの出現を防止できるが、６０℃で行うと非特異的増幅産物が生じる場合がある。したがって本発明のシャトルPCR法は６４℃以上、６３℃以上、６２℃以上、又は６１℃以上で行うことが望ましい。ある実施形態において本発明のシャトルPCR法のアニーリング・伸長ステップは温度が６０℃以下ではない。サイクル数は増幅産物が確認できればよく、例えば２０回以上、２５回以上、３０回以上、例えば３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回等とすることができる。サイクル数は試薬中の標的遺伝子または標的微生物の存在量に応じて適宜変更することができる。逆にサイクル数を一定とし、試薬を順次希釈した系列を用意することもできる。 In one embodiment, the nucleic acid amplification reaction of the present invention is performed by shuttle PCR. The conditions of the shuttle PCR method can be appropriately set so that an amplification product can be specifically obtained. As an example, the conditions of the PCR method of the present invention are as follows: a sample solution is extended at 94 ° C. for 1 minute, then at 94 ° C. for 5 seconds, and then at 64 ° C. for 45 seconds. Hold for minutes. Here, the step that combines annealing and extension (hereinafter sometimes referred to as annealing / elongation step in the present specification) is sensitive to temperature, and can prevent the appearance of non-specific bands at 64 ° C. or higher. If it is carried out at 60 ° C., non-specific amplification products may be produced. Therefore, the shuttle PCR method of the present invention is desirably performed at 64 ° C. or higher, 63 ° C. or higher, 62 ° C. or higher, or 61 ° C. or higher. In one embodiment, the annealing / extension step of the shuttle PCR method of the present invention does not have a temperature of 60 ° C. or lower. The number of cycles is not limited as long as the amplification product can be confirmed, for example, 20 times or more, 25 times or more, 30 times or more, for example, 31 times, 32 times, 33 times, 34 times, 35 times, 36 times, 37 times, 38 times, 39 times. , 40 times, etc. The number of cycles can be appropriately changed according to the abundance of the target gene or target microorganism in the reagent. Conversely, a series in which the number of cycles is constant and the reagents are sequentially diluted can be prepared.
本願明細書において検出とは、遺伝子について用いる場合、ある試料中に目的の遺伝子が存在するか否かを決定することをいう。また検出とは、微生物について用いる場合、ある試料中に当該微生物が存在するか否かを決定することをいい、定性的又は定量的な検出があり得る。本願明細書において同定とは、ある試料中に存在する遺伝子又は微生物の種類を特定することをいう。 In the present specification, detection refers to determining whether or not a target gene is present in a sample when used for a gene. In addition, detection refers to determining whether or not a microorganism is present in a certain sample when used for a microorganism, and can be qualitative or quantitative detection. In the specification of the present application, identification refers to specifying the type of gene or microorganism present in a certain sample.
本発明の方法は、１検体を１反応液で検査できるため、１回の検査で大量の検体を処理できる。これは大規模な食中毒事件を処理する場合や、原因特定のために汚染の疑われる食品試料が一度に多く持ち込まれる場合などに特に有利である。本発明の方法では、例えば96ウェルプレートを用いる場合、コントロール（陽性対照）とブランク（陰性対照）を除き94検体が１プレートで検査可能である。 Since the method of the present invention can test one sample with one reaction solution, a large amount of samples can be processed in one test. This is particularly advantageous when dealing with large food poisoning incidents or when many food samples suspected of being contaminated are brought in at once to identify the cause. In the method of the present invention, for example, when a 96-well plate is used, 94 specimens can be examined on one plate except for a control (positive control) and a blank (negative control).
本発明の方法は病原遺伝子を標的遺伝子とし、１菌種に複数存在する場合は保有率が高く、病原性に深く関わっている遺伝子を標的とする。カンピロバクター属については増幅産物のサイズからC. jejuniとC. coliの鑑別ができるような遺伝子を標的とする。これにより本発明の方法は複数の食中毒原因菌、例えば１１種又は１２種の食中毒原因菌の検出について、高い感度と特異度を実現した。食中毒原因菌の検出について感度が高い、とは試料中に存在する標的微生物が少なくても検出できることをいい、100〜106 cfu/反応、例えば100〜105 cfu/反応、100〜104 cfu/反応、100〜103cfu/反応又は100〜102 cfu/反応の検出感度が挙げられる。例えばある実施形態においてアニーリング・伸長反応を64℃にて行うと、全ての遺伝子は102 CFU/反応以下となる。試料当たりのテンプレートDNA添加量が1.25μLあれば、最も検出感度が低い遺伝子であっても8×104 CFU/mL以上のテンプレートDNAは検出可能である。一般に急性期の食中毒患者の糞便中には106 CFU/g以上の食中毒原因菌が排出されることが多いため（非特許文献１１）、最も検出感度が低い遺伝子であっても検出可能となる。また、本願明細書において食中毒原因菌の検出について特異度が高い、とは、ある検査について陰性の検体を正しく陰性と判定する確率が高いことをいう。 In the method of the present invention, a pathogenic gene is used as a target gene, and when a plurality of bacteria are present in one bacterial species, the gene has a high retention rate and targets genes that are deeply involved in pathogenicity. For Campylobacter, a gene that can distinguish C. jejuni and C. coli from the size of the amplified product is targeted. As a result, the method of the present invention achieves high sensitivity and specificity for detection of a plurality of food poisoning causative bacteria, for example, 11 or 12 food poisoning causative bacteria. Sensitive detection of food poisoning bacteria, means that the detectable even with small target microorganism is present in the sample and, 10 0 to 10 6 cfu / reaction, for example, 10 0 to 10 5 cfu / reaction, 10 0 ~ Examples include detection sensitivity of 10 4 cfu / reaction, 10 0 to 10 3 cfu / reaction or 10 0 to 10 2 cfu / reaction. For example, in one embodiment, when the annealing / extension reaction is performed at 64 ° C., all genes are 10 2 CFU / reaction or less. If the amount of template DNA added per sample is 1.25 μL, a template DNA of 8 × 10 4 CFU / mL or more can be detected even for a gene with the lowest detection sensitivity. In general, since 10 6 CFU / g or more of food poisoning causative bacteria are often excreted in the feces of patients with acute food poisoning (Non-patent Document 11), even the gene with the lowest detection sensitivity can be detected. . In the specification of the present application, high specificity for detection of food poisoning-causing bacteria means that there is a high probability that a negative sample is correctly determined to be negative for a certain test.
ある実施形態において本発明は、上記の食中毒原因菌の検出に用いるためのキットを提供する。該キットを用い、試料について核酸増幅反応、例えばマルチプレックスシャトルPCR法を行うことにより、試料中の食中毒の原因菌を高感度にて特異的に検出することができる。本発明のキットは、
（a）配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるcadF遺伝子、または前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（b）配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるcpe遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（c）配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるipaH遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（d）配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるinvA遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（e）配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるeae遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（f）配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるtdh遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（g）配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるst1b遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（h）配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるst1a遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（i）配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるlt遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（j）配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるstx2遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、
（k）配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるstx1遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対、及び
（l）配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対によって増幅されるaggR遺伝子、又は前記遺伝子に対応するmRNAを増幅しうるプライマー対のいずれか、それらの任意の組合せ、又は全てを含みうる。キットは、本発明のプライマー対の他、使用説明書を含み得る。本発明のキットはさらに、蛍光プローブ、インターカレーター、ポリヌクレオチド調製用試薬、陽性又は陰性プライマー対等を含み得る。陽性プライマーは、公知のデータベースから取得した塩基配列情報などから適宜設計することができる。陰性プライマーは、標的遺伝子のいずれとも無関係のランダムな配列とすることができる。本発明の方法及びキットは、さらに黄色ブドウ球菌及びセレウス菌を検出するための手段（プライマー対等）をさらに含みうる。
本明細書に引用した全ての文献は、参照により本明細書に組み入れるものとする。
In one embodiment, the present invention provides a kit for use in detecting the above-mentioned food poisoning pathogen. By using the kit and performing a nucleic acid amplification reaction such as a multiplex shuttle PCR method on the sample, the causative agent of food poisoning in the sample can be specifically detected with high sensitivity. The kit of the present invention comprises
(A) a cadF gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, or a primer pair capable of amplifying mRNA corresponding to the gene,
(B) a cpe gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, or a primer pair capable of amplifying mRNA corresponding to the gene,
(C) a primer pair that can amplify the ipaH gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, or mRNA corresponding to the gene;
(D) an invA gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, or a primer pair capable of amplifying mRNA corresponding to the gene,
(E) a primer pair capable of amplifying an eae gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, or mRNA corresponding to the gene;
(F) a tdh gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, or a primer pair capable of amplifying mRNA corresponding to the gene,
(G) a st1b gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, or a primer pair capable of amplifying mRNA corresponding to the gene,
(H) a primer pair capable of amplifying a st1a gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, or mRNA corresponding to the gene;
(I) an lt gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, or a primer pair capable of amplifying mRNA corresponding to the gene;
(J) a primer pair capable of amplifying a stx2 gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20, or mRNA corresponding to the gene;
(K) a stx1 gene amplified by a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22, or a primer pair capable of amplifying mRNA corresponding to the gene, and (l) SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 The aggR gene amplified by a primer pair consisting of the sequences described in 1), or a primer pair capable of amplifying mRNA corresponding to the gene, any combination thereof, or all of them may be included. The kit may contain instructions for use in addition to the primer pair of the present invention. The kit of the present invention may further comprise a fluorescent probe, an intercalator, a polynucleotide preparation reagent, a positive or negative primer pair, and the like. The positive primer can be appropriately designed from the base sequence information obtained from a known database. The negative primer can be a random sequence unrelated to any of the target genes. The methods and kits of the present invention may further comprise means (primer pairs etc.) for detecting S. aureus and Bacillus cereus.
All documents cited herein are hereby incorporated by reference.
以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、何ら本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製する。 The following examples are intended for illustration only and are not intended to limit the technical scope of the present invention. Unless otherwise specified, the reagents are commercially available, or are obtained or prepared according to methods commonly used in the art and known literature procedures.
材料及び方法
１ 使用菌株とテンプレート調整
本実施例で検出の対象とした細菌はCampylobacter jejuni及びC. coli、Clostridium perfringens、Shigella spp.、Salmonella spp.、Vibrio parahaemolyticus、腸管出血性大腸菌（EHEC）、腸管毒素原性大腸菌（ETEC）、腸管侵入性大腸菌（EIEC）、腸管病原性大腸菌（EPEC）、腸管凝集付着性大腸菌（EAEC）である。使用菌株は臨床分離株である場合については、同一事例由来で1菌株、または血清型や遺伝子型が異なる株とした（表１）。菌株の一部は山梨県食肉衛生検査所から分与されたものである。使用した培地はC. jejuni及びC. coliはCCDA（Oxoid）培地、Clostridium perfringensはCW寒天培地（ニッスイ）、Shigella spp.及びSalmonella spp. はSS寒天培地（栄研化学）、Vibrio parahaemolyticusはTCBS寒天培地（ニッスイ）、EHEC、ETEC、EIEC、EPEC、EAECはマッコンキー寒天培地（ニッスイ）であった。培養した菌株を滅菌精製水100μLに浮遊させ、100℃、10分間加熱し、10,000rpm、5分間遠心した上清をテンプレートDNAとした。
Materials and
２ プライマーの設計
使用したプライマー及び標的遺伝子を表２に示す。プライマーは、上から順に配列番号１〜２４である。配列番号１〜６、９〜１６、１９〜２４の配列を有するプライマーは本発明において新規に設計したものである。配列番号７及び８のプライマーは非特許文献７に記載されているものを使用した。配列番号１７のプライマーは非特許文献８に記載のものを使用した。配列番号１８のプライマーは非特許文献８に記載の配列を延長したものである。設計したプライマーはBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）を用いて特異性を確認した。Tm値（℃）は試薬メーカーの添付文書を参照した。プライマーはHQ-PCRグレード（TaKaRa）を用いた。TEバッファー（Wako）で100μMとなるよう調整し、−30℃で保存した。
2 Primer design Table 2 shows the primers and target genes used. The primers are SEQ ID NOS: 1 to 24 in order from the top. Primers having the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6, 9 to 16, and 19 to 24 are newly designed in the present invention. As the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8, those described in
３ 設計プライマーの感度・特異度の検討
全ての使用プライマーを混合し、1反応液中で表1の菌株を用いたマルチプレックスPCRを行った。反応試薬はMultiplex PCR Assay Kit（TaKaRa）を用いた。1反応当たりMultiplex PCR Mix 1を6.25 μL 、Multiplex PCR Mix 2を0.0625 μL、プライマーを表２の濃度となるよう添加し、テンプレートDNAを1.25 μL 加え、滅菌精製水で全量を12.5μLとした。PCR装置はPerkin Elmer cetus DNA Thermal Cycler 480を用いた。反応条件は検討の結果2ステップのシャトルPCRとした（図1）。増幅産物を3%アガロースゲル（TaKaRa）で100V、30分間電気泳動し、増幅産物の大きさにより判定を行った。C. jejuni及びC. coli、Shigella spp.、Salmonella spp.については全ての菌株が遺伝子を保有しているものとし、それ以外については市販プライマーまたは既に反応性が確立されているプライマー（既存プライマー）を用いて結果を比較することにより感度・特異度を算出した。
3. Examination of sensitivity and specificity of designed primers All the primers used were mixed, and multiplex PCR was performed using the strains shown in Table 1 in one reaction solution. The reaction reagent used was Multiplex PCR Assay Kit (TaKaRa). 6.25 μL of
４ 検出感度の測定
使用菌株のうち各々の遺伝子保有株の任意の菌株をBrain Heart Infusion（BHI:Oxoid）ブロスで3〜5時間培養し、希釈した菌液をTryptone Soya Agar（TSA:Oxoid）で一夜培養し、菌数を算出した。カンピロバクターについては7％馬血液含有BHIで一夜培養後、CCDA選択サプリメント不含CCDA培地で菌数を算出した。この菌液を用いて100、101、102、103 CFU/反応におけるmultiplex PCRを行い、検出感度を測定した。
4 Measurement of detection sensitivity Arbitrary strains of each gene-bearing strain among the strains used are cultured in Brain Heart Infusion (BHI: Oxoid) broth for 3-5 hours, and the diluted bacterial solution is tryptone Soya Agar (TSA: Oxoid) After overnight culture, the number of bacteria was calculated. Campylobacter was cultured overnight in BHI containing 7% horse blood, and then the number of bacteria was calculated on a CCDA-free CCDA medium. It performed 10 0, 10 1, 10 2 , 10 3 CFU / multiplex PCR in a reaction using this bacterial solution was measured detection sensitivity.
５ 消化器症状事例におけるマルチプレックスPCRのスクリーニング法としての感度・特異度の検討
山梨県内において2012年3月〜2013年6月までに消化器症状を呈した患者及び、調理従事者等の健常者の糞便72検体（9事例）を対象とし、培養結果と本発明の方法の比較を行った。糞便の培養は前述の培地で行った。糞便からのDNA抽出はアルカリ熱溶菌法により行った。即ち、約10倍乳剤の糞便を100μL採取し、10,000 rpmで5分間遠心後、上清を取り除き、50 mMのNaOH （Wako）85μLで懸濁した。100℃で10分間加熱し、1M Tris-HCl（pH 7.5 : Wako）15μLで中和後、10,000 rpmで5分間遠心し、上清をテンプレートDNAとした。
5. Examination of sensitivity and specificity as screening methods for multiplex PCR in cases of digestive symptoms Symptoms in Yamanashi Prefecture from March 2012 to June 2013 and healthy subjects such as cooking workers 72 samples of feces (9 cases) were compared, and the culture results were compared with the method of the present invention. Feces were cultured in the above medium. DNA extraction from stool was performed by alkaline hot lysis. That is, 100 μL of stool of about 10 times emulsion was collected, centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and suspended in 85 μL of 50 mM NaOH (Wako). The mixture was heated at 100 ° C. for 10 minutes, neutralized with 15 μL of 1M Tris-HCl (pH 7.5: Wako), centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was used as template DNA.
結果
１ 設計プライマーの感度・特異度
各菌株を用いたマルチプレックスPCRの結果、各遺伝子の増幅産物は明瞭に区別することができた（図２Ａ）。図２ＡおよびＢにおいて、各レーンは次のとおりである。1:cadF (jejuni)、2:cpe、3:ipaH、4:invA、5:eae、6:tdh、7:st1b、8:st1a、9:lt、10:stx2、11:stx1及び12:aggR。図２Ａはアニーリング・伸長ステップの温度を６４℃として本発明のマルチプレックスシャトルPCR法を行った結果であり、非特異的バンドが出現することなく、各菌株が特異的に識別できた。図２Ｂはアニーリング・伸長ステップの温度を６０℃としてシャトルPCRを行った比較例であり、レーン５、７、９、１２に非特異的バンドが見られた。他の条件は図２Ａの場合と同様であった。
カンピロバクター属のcadF遺伝子についてはさらに１５分の電気泳動を行ったところ、カンピロバクター・ジェジュニ(C. jejuni)とカンピロバクター・コリ(C. coli)を鑑別することができた（図３）。レーン1がC. jejuniでありレーン2がC. coliである。
When the cadF gene of Campylobacter was further subjected to electrophoresis for 15 minutes, Campylobacter jejuni and C. coli were discriminated (FIG. 3).
健常者由来のC. coli 1株と、2株のEHEC O111:HNMのeae遺伝子以外は全て検出または、既プライマーと同一の結果であり、感度は99.1 %であった。また、非特異反応は確認されなかったため、特異度は100%であった。1検体当たりの試薬にかかる費用は電気泳動まで含めて約130円であり、PCRは約75分で完了した。
The results were the same as those obtained with the existing primers except for
２ 検出感度の測定
12種の遺伝子の検出感度はipaHが1 CFU/反応と最も検出感度が高く、invA、eae、tdh、lt、st1a、st1b、stx1、stx2は10 CFU/反応であり、cadF、cpe、aggRは102 CFU/反応であった。
本発明の方法の既存プライマーと比較した感度及び特異度を表３に示す。
2 Measurement of detection sensitivity
The detection sensitivity of 12 genes is highest with 1 CFU / reaction for ipaH, 10 CFU / reaction for invA, eae, tdh, lt, st1a, st1b, stx1, stx2 and cadF, cpe,
Table 3 shows the sensitivity and specificity of the method of the present invention compared to the existing primers.
３ 消化器症状事例におけるマルチプレックスPCRのスクリーニング法としての感度・特異度の検討
消化器症状事例において糞便からテンプレートDNAを抽出し、マルチプレックスPCRを行い、培養結果との比較を行ったところ、感度は83.3%、特異度は96.4%であった（表４）。検出された遺伝子はcadF、cpe、eae、stx1、aggRの5種であった。カンピロバクターが培養陽性となった2検体でcadFが陰性となり、cadFが陽性となった2検体でカンピロバクターが培養陰性となった。また、EHEC O103が培養陽性となった検体でeaeを検出することができなかった（表５）。下記表４に消化器症状事例由来糞便を用いた培養と比較した本発明の方法の感度・特異度を示す。また表５に消化器症状事例由来糞便の培養及び本発明の方法の結果を示す。
3. Examination of sensitivity and specificity as a screening method for multiplex PCR in cases of digestive tract symptoms Template DNA was extracted from feces in cases of digestive tract symptoms, multiplex PCR was performed, and the results were compared with the culture results. Was 83.3% and the specificity was 96.4% (Table 4). The detected genes were cadF, cpe, eae, stx1, and aggR. Two specimens that were positive for Campylobacter were negative for cadF, and two specimens that were positive for cadF were negative for Campylobacter. In addition, eae could not be detected in specimens in which EHEC O103 was culture positive (Table 5). Table 4 below shows the sensitivity and specificity of the method of the present invention compared to culture using stool derived from digestive symptom cases. Table 5 shows the results of the culture of stool from cases of digestive system symptoms and the method of the present invention.
本発明の方法で検出対象とした11種の細菌は厚生労働省の統計によると、国内で過去10年間に発生した細菌性食中毒の原因の約90%を占めている。標的遺伝子は病原遺伝子とし、1菌種に複数存在する場合は保有率が高く、病原性に深く関わっているものを選択した。また、カンピロバクターについては増幅産物のサイズからC. jejuniとC. coliの鑑別ができるような遺伝子とした。 According to statistics from the Ministry of Health, Labor and Welfare, eleven species of bacteria detected by the method of the present invention account for about 90% of the causes of bacterial food poisoning that occurred in the past 10 years in Japan. The target gene was selected as a pathogenic gene. When multiple genes exist in one bacterial species, the gene possessing a high retention rate and deeply related to pathogenicity was selected. Campylobacter was a gene that could distinguish C. jejuni and C. coli from the size of the amplified product.
使用プライマーは特異性の確保とシャトルPCRの導入を考え、3つの条件（1. Tm値が概ね60℃以上、2. 鎖長が25から30塩基程度、3. 増幅産物が区別可能な大きさ）を満たすものとした。プライマー対(d)と(i)を除き、全てのプライマー対は本発明において独自に設計したものである。12対のプライマーは少なくとも66℃まではアニーリング可能であったことから、反応時間の短縮と特異性の向上を目的にシャトルPCRとした（図1）。
表1の菌株を用いたマルチプレックスPCRの結果、感度・特異度ともに良好であった（表４）。
The primer used is designed to ensure specificity and introduce shuttle PCR. Three conditions (1. Tm value is approximately 60 ° C or higher, 2. Chain length is about 25 to 30 bases, 3. Amplification product is distinguishable in size. ). Except for the primer pairs (d) and (i), all the primer pairs are uniquely designed in the present invention. Since 12 pairs of primers could be annealed at least up to 66 ° C, shuttle PCR was used to shorten the reaction time and improve specificity (Figure 1).
As a result of multiplex PCR using the strains in Table 1, both sensitivity and specificity were good (Table 4).
本発明の方法の検出感度はアニーリング・伸長反応を64℃に下げて行うことにより、全ての遺伝子が102 CFU/反応以下となった。1反応チューブ当たりのテンプレートDNA添加量は1.25μLであるため、最も検出感度が低い遺伝子であっても8×104 CFU/mL以上のテンプレートDNAであれば検出が可能である。一般に急性期の患者糞便中には106 CFU/g以上の原因菌が排出されることが多いため（非特許文献１１）、最も検出感度が低い遺伝子であっても検出が可能であると考えられる。 The detection sensitivity of the method of the present invention was lowered to 10 2 CFU / reaction for all genes by performing the annealing / elongation reaction at 64 ° C. Since the amount of template DNA added per reaction tube is 1.25 μL, even a gene with the lowest detection sensitivity can be detected with a template DNA of 8 × 10 4 CFU / mL or more. In general, causative bacteria of 10 6 CFU / g or more are often excreted in the stool of patients in the acute phase (Non-patent Document 11), so that even the genes with the lowest detection sensitivity can be detected. It is done.
消化器症状事例における本発明の方法の有用性を糞便からDNAを抽出し確認したところ、菌株を用いた結果と比較し、若干の感度・特異度の低下が見られたものの、概ね同様の結果が得られた（表４）。感度低下の原因としては検体の不適切な保存が考えられる。培養からカンピロバクターが3検体陽性になった事例において、先に搬入のあった1検体はcadF陽性が確認されたが、その後搬入があり3日間、20℃程度の室温で保存していた2検体は陰性となった。この際、陽性となっていた1検体についても同条件下で保存していたが、再度確認したところ陰性となった。このことから、検体の保存温度は本発明の方法の結果に影響を与えることが考えられる。また、特異度が低下した原因として死菌由来遺伝子の検出が考えられる。カンピロバクターが原因となった食中毒事例の患者糞便1検体からcadFが検出されたが、培養結果は非病原菌を含む全ての細菌が陰性であった。この検体は抗菌薬を投与後採取されたものであったこと、既存プライマーにおいてもカンピロバクター由来の増幅産物が確認されていることから、死菌由来の遺伝子を検出したことが考えられた。同様の検体は他にも1検体確認されている（表５）。これらの結果は過去に感染があり、抗菌薬の投与により通常培養で分離できない検体であっても、PCRにより検出することができる一例である。多くの患者が抗菌薬服用後であり、患者検体が限られる事例などにおいては、このような結果は補助的な情報として有用であると考えられる。 The usefulness of the method of the present invention in digestive symptom cases was confirmed by extracting DNA from stool, compared with the results using strains, although a slight decrease in sensitivity and specificity was seen, but almost the same results Was obtained (Table 4). Inappropriate storage of the sample can be considered as a cause of the decrease in sensitivity. In the case where Campylobacter became 3 samples positive from culture, 1 sample that had been brought in first was confirmed to be cadF positive, but 2 samples that were brought in and then stored at room temperature of about 20 ° C for 3 days Negative. At this time, one specimen that was positive was also stored under the same conditions, but when confirmed again, it became negative. From this, it is considered that the storage temperature of the specimen affects the result of the method of the present invention. Moreover, the detection of a dead bacteria origin gene can be considered as a cause of the decrease in specificity. Although cadF was detected in one sample of feces from a food poisoning case caused by Campylobacter, the culture results were negative for all bacteria including non-pathogenic bacteria. This sample was collected after the administration of the antibacterial drug, and since the amplification product derived from Campylobacter was confirmed in the existing primer, it was considered that the gene derived from dead bacteria was detected. One other similar sample has been confirmed (Table 5). These results are an example that can be detected by PCR even for specimens that have been infected in the past and that cannot be separated by normal culture by administration of antibacterial drugs. In cases where many patients are taking antibacterial drugs and patient specimens are limited, such results may be useful as supplementary information.
本発明の方法は迅速・安価・簡便なスクリーニング法として開発された。シャトルPCRを用いたため、検出所要時間は温度変化が遅い初期の機器を使用した場合で、電気泳動を含めても2時間以内に検出が可能であった。最新の機器を使用すればさらなる迅速性が期待される。1検体当たりの費用についても特殊で高価な試薬を必要としないため、前述のとおり試薬費が約130円/検体と安価である。また、リアルタイムPCRやLAMP法などと比べ高価な機器を導入する必要もない。1検体当たりに1反応液を使用するため、複雑な操作も必要としない。これらのことから本発明の方法は日常搬入される全ての検体から大規模な食中毒などが発生した際の大量の検体まで用いることができる迅速・安価・簡便な有用なスクリーニング法であると考えられる。本発明の検出方法は臨床検体の検査や、食中毒事例における食品中からの細菌検出に用いることができる。 The method of the present invention was developed as a quick, inexpensive and simple screening method. Since shuttle PCR was used, the time required for detection was the case of using an early instrument with a slow temperature change, and detection was possible within 2 hours even including electrophoresis. If the latest equipment is used, further rapidity is expected. The cost per sample does not require a special and expensive reagent, so the reagent cost is about 130 yen / sample as described above. Moreover, it is not necessary to introduce expensive equipment as compared with real-time PCR, LAMP method and the like. Since one reaction solution is used per sample, no complicated operation is required. From these facts, it is considered that the method of the present invention is a quick, inexpensive and simple useful screening method that can be used for all samples that are carried in on a daily basis to a large amount of samples when large-scale food poisoning occurs. . The detection method of the present invention can be used for examination of clinical specimens and detection of bacteria in foods in food poisoning cases.
本発明の食中毒原因菌の検出方法は、(I)大量の検体数に対応できる、(II)細菌性感染型食中毒の原因菌のほとんどを検出できる、(III)試料搬入当日に結果が判定できる、(IV)操作が簡便である、(V)１検体当たりのランニングコストが安いという５つの要件を同時に満たすために開発された。 The method for detecting food poisoning causal bacteria of the present invention is (I) capable of handling a large number of specimens, (II) capable of detecting most causative bacteria of bacterial infectious food poisoning, and (III) determining the result on the day of sample delivery. It was developed to simultaneously satisfy the five requirements of (IV) simple operation and (V) low running cost per specimen.
本発明の方法は従来法と比較して迅速・安価・簡便で大量の検体を同時に処理可能である。ここでは従来法の例として非特許文献１２、非特許文献４、非特許文献１３及び非特許文献５に記載の方法に言及し、本発明をこれらと比較して説明する。例えば(I)機器１台当たりの処理検体数（９６ウェルプレートの場合）に着目すると非特許文献１３に記載の方法は本発明と同様９４検体を処理可能であるが、非特許文献１３に記載の方法では検出遺伝子数は６と少なく、(II)発生する食中毒原因菌の約10%程度に対応するのみである。非特許文献１２、非特許文献４及び非特許文献５に記載の方法は機器１台当たりの処理検体数が、それぞれ７、１１及び３０である。(III)検出時間に着目すると非特許文献１２に記載の方法及び非特許文献４に記載の方法は２時間程度で結果がでるが、非特許文献１２に記載の方法も非特許文献４に記載の方法も(I)処理できる検体数が少なく、試薬費を市販試薬の価格や使用量から推定すると(V)１検体当たりのコストも本発明のそれより高い。非特許文献１３及び非特許文献５に記載の方法の検出時間はPCRのみでも、それぞれ4〜5時間及び3.5〜4.5時間を要する。これに対して本発明の方法はPCR反応に1〜1.25時間を要するのみである。(IV)１検体に必要な反応液については、本発明の方法は１反応液で１検体を検査できる。非特許文献１３に記載の方法も同様であるが、非特許文献１３に記載の方法は検出感度が107〜108cfu/反応と低い。一般に急性期の患者糞便中には106 CFU/g以上の原因菌が排出されるが、DNA抽出のための希釈等により、検査チューブには102〜103cfu程度の原因菌に相当するDNAが存在することとなる。そのため、非特許文献１３に記載の方法は感度が糞便からのDNA抽出サンプルの検査には不向きである。非特許文献１２、非特許文献４及び非特許文献５に記載の方法は、１検体に必要な反応液が、それぞれ、８、７、及び３反応液である。(IV)操作の簡便性については、本発明の方法はリアルタイムPCRを必要とせず、１検体に必要な反応液も少ない。非特許文献１２に記載の方法はリアルタイムPCRを必要とする。また非特許文献４及び非特許文献５に記載の方法は１検体に必要な反応液が、それぞれ７及び３である。(V)検体当たりのコストに着目すると、試薬費を市販試薬の価格や使用量から推定すると本発明の方法は従来法（例えば非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献４、非特許文献１３及び非特許文献５に記載の方法）より有意に低コストで検査が可能である。このように本発明の検出方法はこうした(I)〜(V)の望ましい性質を全て備えている。
Compared with the conventional method, the method of the present invention is quicker, cheaper and simpler and can simultaneously process a large amount of specimens. Here, the methods described in
本発明のプライマーによるマルチプレックスシャトルPCR法を用いることにより、食中毒原因菌を一括検出することができる。本発明の方法は迅速かつ簡便に、そして安価に、かつ高い特異性で多種の食中毒原因菌を一括検出できる。 By using the multiplex shuttle PCR method with the primer of the present invention, food poisoning causative bacteria can be detected at once. The method of the present invention can quickly and easily detect various food poisoning causative bacteria at a low cost and with high specificity.
配列番号１ cadF遺伝子用フォワードプライマーcadF-F
配列番号２ cadF遺伝子用リバースプライマーcadF-R
配列番号３ cpe遺伝子用フォワードプライマーcpe-F
配列番号４ cpe遺伝子用リバースプライマーcpe-R
配列番号５ ipaH遺伝子用フォワードプライマーipaH-F
配列番号６ ipaH遺伝子用リバースプライマーipaH-R
配列番号７ invA遺伝子用フォワードプライマーinvA-F
配列番号８ invA遺伝子用リバースプライマーinvA-R
配列番号９ eae遺伝子用フォワードプライマーeaeA-F
配列番号１０ eae遺伝子用リバースプライマーeaeA-R
配列番号１１ tdh遺伝子用フォワードプライマーtdh-F
配列番号１２ tdh遺伝子用リバースプライマーtdh-R
配列番号１３ st1b遺伝子用フォワードプライマーST1b-F
配列番号１４ st1b遺伝子用リバースプライマーST1b-R
配列番号１５ st1a遺伝子用フォワードプライマーST1a-F
配列番号１６ st1a遺伝子用リバースプライマーST1a-R
配列番号１７ lt遺伝子用フォワードプライマーLT-F
配列番号１８ lt遺伝子用リバースプライマーLT-R
配列番号１９ stx2(VT2)遺伝子用フォワードプライマーVT2-F
配列番号２０ stx2(VT2)遺伝子用リバースプライマーVT2-R
配列番号２１ stx1(VT1)遺伝子用フォワードプライマーVT1-F
配列番号２２ stx1(VT1)遺伝子用リバースプライマーVT1-R
配列番号２３ aggR遺伝子用フォワードプライマーaggR-F
配列番号２４ aggR遺伝子用リバースプライマーaggR-R
配列番号２５ Campylobacter coli JV20 contig00034 cadF
配列番号２６ Campylobacter jejuni subsp. jejuni CG8421 CPS cadF
配列番号２７ Clostridium perfringens SM101, complete genome cpe
配列番号２８ Shigella flexneri invasion plasmid antigen H (ipaH)
配列番号２９ Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium DT104 main chromosome, complete genome invA
配列番号３０ Escherichia coli O55:H7 eae
配列番号３１ Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin(tdh)
配列番号３２ Escherichia coli ETEC heat-stable enterotoxin (St1b)
配列番号３３ ETEC H10407 plasmid pEntH10407 (ST1a)
配列番号３４ heat-labile enterotoxin (LT)
配列番号３５ Escherichia coli O157:H7 str. Sakai VT2 subunit B
配列番号３６ Escherichia coli O157:H7 sakai VT1 subunitA precursor
配列番号３７ Escherichia coli 55989 aggR
SEQ ID NO: 1 cadF gene forward primer cadF-F
SEQ ID NO: 2 Reverse primer for cadF gene cadF-R
SEQ ID NO: 3 forward primer for cpe gene cpe-F
SEQ ID NO: 4 Reverse primer for cpe gene cpe-R
SEQ ID NO: 5 ipaH-F forward primer for ipaH gene
SEQ ID NO: 6 reverse primer for ipaH gene ipaH-R
SEQ ID NO: 8 reverse primer for invA gene invA-R
SEQ ID NO: 9 forward primer for eae gene eaeA-F
SEQ ID NO: 10 reverse primer for eae gene eaeA-R
SEQ ID NO: 11 tdh-F forward primer for tdh gene
SEQ ID NO: 12 tdh-R reverse primer for tdh gene
SEQ ID NO: 13 st1b gene forward primer ST1b-F
SEQ ID NO: 14 reverse primer ST1b-R for st1b gene
SEQ ID NO: 15 st1a gene forward primer ST1a-F
SEQ ID NO: 16 reverse primer for st1a gene ST1a-R
SEQ ID NO: 17 lt gene forward primer LT-F
SEQ ID NO: 18 Reverse primer LT-R for lt gene
SEQ ID NO: 19 stx2 (VT2) gene forward primer VT2-F
Sequence number 20 reverse primer VT2-R for stx2 (VT2) gene
SEQ ID NO: 21 stx1 (VT1) gene forward primer VT1-F
SEQ ID NO: 22 reverse primer for stx1 (VT1) gene VT1-R
SEQ ID NO: 23 forward primer aggR-F for aggR gene
SEQ ID NO: 24 reverse primer for aggR gene aggR-R
Sequence number 25 Campylobacter coli JV20 contig00034 cadF
SEQ ID NO: 26 Campylobacter jejuni subsp. Jejuni CG8421 CPS cadF
SEQ ID NO: 27 Clostridium perfringens SM101, complete genome cpe
SEQ ID NO: 28 Shigella flexneri invasion plasmid antigen H (ipaH)
SEQ ID NO: 29 Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium DT104 main chromosome, complete genome invA
SEQ ID NO: 30 Escherichia coli O55: H7 eae
SEQ ID NO: 31 Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin (tdh)
SEQ ID NO: 32 Escherichia coli ETEC heat-stable enterotoxin (St1b)
SEQ ID NO: 33 ETEC H10407 plasmid pEntH10407 (ST1a)
Sequence number 34 heat-labile enterotoxin (LT)
SEQ ID NO: 35 Escherichia coli O157: H7 str. Sakai VT2 subunit B
SEQ ID NO: 36 Escherichia coli O157: H7 sakai VT1 subunitA precursor
SEQ ID NO: 37 Escherichia coli 55989 aggR
Claims (23)
食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いて試料について核酸増幅反応を行う工程及び増幅産物を確認する工程を含む、試料中の食中毒原因菌を検出する方法。 A method for detecting a food poisoning germ in a sample,
The following primer pair consisting of two polynucleotides that can specifically bind to the genomic DNA of a food poisoning bacterium:
(A) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for amplifying the cadF gene;
A method for detecting food poisoning-causing bacteria in a sample, comprising a step of performing a nucleic acid amplification reaction on the sample using the method and a step of confirming the amplification product.
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる請求項１に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(B) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for amplifying the cpe gene;
The method according to claim 1, wherein
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、請求項１または２に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(C) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for amplifying the ipaH gene;
The method according to claim 1 or 2, wherein
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(E) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for amplifying the eae gene;
The method of any one of Claims 1-3 using this.
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(F) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for amplifying the tdh gene;
The method according to any one of claims 1 to 4, wherein
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(G) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 for amplifying the st1b gene;
The method according to any one of claims 1 to 5, wherein
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(H) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for amplifying the st1a gene;
The method according to any one of claims 1 to 6, wherein
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(J) a primer comprising the sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for amplifying the stx2 gene;
The method according to any one of claims 1 to 7, wherein
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(K) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for amplifying the stx1 gene;
The method according to any one of claims 1 to 8, wherein
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
を用いる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(L) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 for amplifying the aggR gene;
10. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein
（ｄ）invA遺伝子を増幅するための配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対、及び／又は
（ｉ）lt遺伝子を増幅するための配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー、
を用いる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 In the nucleic acid amplification reaction,
(D) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for amplifying the invA gene, and / or (i) a sequence of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for amplifying the lt gene A primer consisting of,
The method according to claim 1, wherein:
食中毒原因菌のゲノムDNAに特異的に結合可能な２つのポリヌクレオチドからなる以下のプライマー対、すなわち、
（ａ）cadF遺伝子を増幅するための配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、食中毒原因菌検出用キット。 A kit for detecting food poisoning causative bacteria,
The following primer pair consisting of two polynucleotides that can specifically bind to the genomic DNA of a food poisoning bacterium:
(A) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for amplifying the cadF gene;
A kit for detecting bacteria causing food poisoning.
（ｂ）cpe遺伝子を増幅するための配列番号３及び配列番号４に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、請求項１３に記載のキット。 further,
(B) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for amplifying the cpe gene;
The kit according to claim 13, comprising:
（ｃ）ipaH遺伝子を増幅するための配列番号５及び配列番号６に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、請求項１３または１４に記載のキット。 further,
(C) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for amplifying the ipaH gene;
The kit according to claim 13 or 14, comprising:
（ｅ）eae遺伝子を増幅するための配列番号９及び配列番号１０に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキット。 further,
(E) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for amplifying the eae gene;
The kit according to any one of claims 13 to 15, comprising:
（ｆ）tdh遺伝子を増幅するための配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のキット。 further,
(F) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 for amplifying the tdh gene;
The kit of any one of Claims 13-16 containing this.
（ｇ）st1b遺伝子を増幅するための配列番号１３及び配列番号１４に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のキット。 further,
(G) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 for amplifying the st1b gene;
The kit of any one of Claims 13-17 containing this.
（ｈ）st1a遺伝子を増幅するための配列番号１５及び配列番号１６に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のキット。 further,
(H) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for amplifying the st1a gene;
The kit of any one of Claims 13-18 containing this.
（ｊ）stx2遺伝子を増幅するための配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列からなるプライマー、
を含む、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のキット。 further,
(J) a primer comprising the sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 for amplifying the stx2 gene;
The kit according to any one of claims 13 to 19, comprising:
（ｋ）stx1遺伝子を増幅するための配列番号２１及び配列番号２２に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載のキット。 further,
(K) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for amplifying the stx1 gene;
The kit according to any one of claims 13 to 20, comprising:
（ｌ）aggR遺伝子を増幅するための配列番号２３及び配列番号２４に記載の配列からなるプライマー対、
を含む、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載のキット。 further,
(L) a primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 for amplifying the aggR gene;
The kit according to any one of claims 13 to 21, comprising:
（ｄ）invA遺伝子を増幅するための配列番号７及び配列番号８に記載の配列からなるプライマー対、及び／又は
（ｉ）lt遺伝子を増幅するための配列番号１７及び配列番号１８に記載の配列からなるプライマー、
を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の食中毒原因菌検出用キット。 Furthermore, (d) a primer pair consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for amplifying the invA gene, and / or (i) a sequence described in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 for amplifying the lt gene A primer consisting of a sequence,
The kit for detecting a food poisoning causal organism according to any one of claims 13 to 22.
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