JP2015136293A - Peptides suitable for preventing or treating renal cell carcinoma, nucleic acid molecules, vectors and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、腎細胞癌の予防又は治療に好適なペプチド、核酸分子、及びベクター、並びに、腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物、腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法、腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の調製方法、及び抗原提示細胞調製剤に関する。 The present invention relates to peptides, nucleic acid molecules and vectors suitable for the prevention or treatment of renal cell carcinoma, pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of renal cell carcinoma, a method for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells, The present invention relates to a method for preparing an antigen-presenting cell that presents a complex of a renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer, an erythropoietin receptor-derived peptide, and an HLA-A24 molecule on the cell surface, and an antigen-presenting cell preparation.
腎細胞癌（Ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、以下、「ＲＣＣ」と称することがある）は、化学療法や放射線療法といった一般的な癌の治療方法では治療効果が得られず、また、インターフェロン類やインターロイキン−２などのサイトカインによる免疫療法でも限定的な治療効果しか得られないという問題がある。
そのような状況の中、これまでに、腎細胞癌に対するペプチドワクチンとして、Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒａｓｅ ９（以下、「ＣＡ９」と称することがある）抗原由来ペプチド、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（以下、「ＶＥＧＦＲ１」と称することがある）由来ペプチドが提案されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
Renal cell carcinoma (hereinafter sometimes referred to as “RCC”) does not have a therapeutic effect with general cancer treatment methods such as chemotherapy and radiotherapy, and interferons and interleukins There is a problem that only a therapeutic effect can be obtained even by immunotherapy with cytokines such as 2.
Under such circumstances, as a peptide vaccine against renal cell carcinoma, carbonic anhydride 9 (hereinafter sometimes referred to as “CA9”) antigen-derived peptide, vascular endothelial growth factor receptor 1 (hereinafter referred to as “VEGFR1”). Have been proposed (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
前記ペプチドワクチンによるワクチン療法の経験から、個々の患者の免疫状態の多様性と治療ターゲットである癌の多様性によって免疫応答（ＣＴＬ反応など）が多彩であること、一旦有効であった症例も免疫逃避あるいは寛容により無効となることが明らかとなった。このようなエビデンスを鑑みると、１つの決まった抗原をターゲットにするのではなく、腎癌の発生、分化、増殖に立脚した複数の分子をターゲットにし、それぞれ異なった性質の癌を担癌した宿主に合ったテーラーメイドワクチン療法が必要と思われる。 Based on the experience of vaccine therapy with the peptide vaccine, the immune response (CTL response, etc.) varies depending on the variety of individual patients' immune status and the target cancer. It became clear that it was invalidated by escape or tolerance. In view of such evidence, a host that targets multiple molecules based on the development, differentiation, and growth of renal cancer, and targets cancers with different properties, rather than targeting one specific antigen. It seems that tailor-made vaccine therapy suitable for is necessary.
したがって、腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチドの開発が強く求められているのが現状である。 Therefore, there is a strong demand for the development of peptides useful for cancer vaccine therapy for renal cell cancer patients.
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチド、該ペプチドをコードする核酸分子、及び該核酸分子を含むベクターを提供することを目的とする。
また、本発明は、特異的細胞性免疫を誘導することができ、腎細胞癌の予防又は治療に有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができる腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤及びそれを用いた腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法、エリスロポイエチンレセプター（以下、「ＥｐｏＲ」と称することがある）由来ペプチドと、ヒト白血球抗原−Ａ２４（以下、「ＨＬＡ−Ａ２４」と称することがある）分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製することができる抗原提示細胞調製剤及びそれを用いた抗原提示細胞の調製方法を提供することを目的とする。
An object of the present invention is to solve the above-described problems and achieve the following objects. That is, an object of the present invention is to provide a peptide useful for cancer vaccine therapy for renal cell cancer patients, a nucleic acid molecule encoding the peptide, and a vector containing the nucleic acid molecule.
Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition that can induce specific cellular immunity and is useful for the prevention or treatment of renal cell carcinoma.
The present invention also relates to a renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer capable of inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells, and renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells using the same. Induction method, erythropoietin receptor (hereinafter sometimes referred to as “EpoR”)-derived peptide and human leukocyte antigen-A24 (hereinafter sometimes referred to as “HLA-A24”) molecule complex It is an object of the present invention to provide an antigen-presenting cell preparation agent capable of preparing antigen-presenting cells to be presented in the above and a method for preparing antigen-presenting cells using the same.
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ヒト白血球抗原−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４）分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであって、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであることを特徴とするペプチドである。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸分子を含有することを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物である。
＜５＞ ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を前記＜１＞に記載のペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
＜６＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜７＞ エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の調製方法であって、
ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを導入する工程を含むことを特徴とする方法である。
＜８＞ エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、
前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗原提示細胞調製剤である。
Means for solving the problems are as follows. That is,
<1> A peptide capable of binding to human leukocyte antigen-A24 (HLA-A24) molecule and recognized by cellular immunity, which is any of the following (a) and (b) It is.
(A) A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
<2> A nucleic acid molecule comprising a base sequence encoding the peptide according to <1>.
<3> A vector comprising the nucleic acid molecule according to <2>.
<4> A pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma, comprising at least one of the peptide according to <1> and the vector according to <3>.
<5> a renal cell carcinoma reactive cytotoxicity T comprising a step of contacting peripheral blood mononuclear cells collected from a patient with HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma with the peptide according to <1>. This is a method for inducing cells.
<6> A renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer comprising the peptide according to <1>.
<7> A method for preparing an antigen-presenting cell, which presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface,
Including the step of introducing at least one of the peptide according to the above <1> and the vector according to the above <3> into a cell having an antigen presenting ability collected from an HLA-A24 molecule positive renal cell carcinoma patient. It is a characteristic method.
<8> An antigen-presenting cell preparation for preparing an antigen-presenting cell that presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface,
An agent for preparing an antigen-presenting cell, comprising at least one of the peptide according to <1> and the vector according to <3>.
本発明によると、従来における前記問題を解決することができ、腎細胞癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なペプチド、該ペプチドをコードする核酸分子、及び該核酸分子を含むベクターを提供することができる。
また、本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、特異的細胞性免疫を誘導することができ、腎細胞癌の予防又は治療に有用な医薬組成物を提供することができる。
また、本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができる腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤及びそれを用いた腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法、ＥｐｏＲ由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製することができる抗原提示細胞調製剤及びそれを用いた抗原提示細胞の調製方法を提供することができる。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the said problem in the past can be solved, and the peptide useful for cancer vaccine therapy with respect to a renal cell carcinoma patient, the nucleic acid molecule which codes this peptide, and the vector containing this nucleic acid molecule can be provided. .
In addition, according to the present invention, the above-described conventional problems can be solved, specific cellular immunity can be induced, and a pharmaceutical composition useful for the prevention or treatment of renal cell carcinoma can be provided. .
In addition, according to the present invention, the above-mentioned conventional problems can be solved, and a renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer capable of inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells, and Method for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell used, antigen-presenting cell preparation agent capable of preparing antigen-presenting cells that present a complex of EpoR-derived peptide and HLA-A24 molecule on the cell surface, and A method for preparing an antigen-presenting cell using the same can be provided.
（ペプチド）
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであって、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかである。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
(peptide)
The peptide of the present invention is a peptide that can bind to the HLA-A24 molecule and is recognized by cellular immunity, and is one of the following (a) and (b).
(A) A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
本発明において、「ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子に結合できる」とは、ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子と複合体を形成し細胞表面に提示され得ることをいう。
一般に、ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、ＨＬＡの型に依存する規則性あるアミノ酸配列を有することが知られており、前記規則性あるアミノ酸配列は、結合モチーフと呼ばれる。
前記ＨＬＡ−Ａ２４分子に対し、ペプチドが結合できるか否かは、例えば、ウェブサイト（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ、 Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＩＨ）などのコンピューター解析により予測することができる。
In the present invention, “the peptide can bind to the HLA-A24 molecule” means that the peptide can form a complex with the HLA-A24 molecule and be presented on the cell surface.
In general, it is known that a peptide that binds to an HLA molecule has a regular amino acid sequence that depends on the type of HLA, and the regular amino acid sequence is called a binding motif.
Whether or not a peptide can bind to the HLA-A24 molecule is determined by, for example, website (Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Computational Bioscience and Engineering Laboratory I, Computer of Computer Analysis, Division of Computer Analysis) be able to.
本発明において、「細胞性免疫に認識される」とは、ペプチドが特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「ＣＴＬ」と称することがある）に認識される、即ち、ペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができることをいう。
ペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチドで刺激した末梢血単核細胞（以下、「ＰＢＭＣ」と称することがある）が、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してインターフェロン（以下、「ＩＦＮ」と称することがある）−γなどのサイトカインを産生するか否かを測定することにより確認する方法などが挙げられる。
前記サイトカインを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡなどで測定することができる。
In the present invention, “recognized by cellular immunity” means that a peptide is recognized by a specific cytotoxic T cell (hereinafter sometimes referred to as “CTL”). It means that it can be induced.
The method for confirming whether or not peptide-specific CTL can be induced is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, peripheral blood mononuclear cells stimulated with a peptide (hereinafter referred to as “the peptide-specific CTL”) It is measured whether or not “PBMC” may produce cytokines such as interferon (hereinafter sometimes referred to as “IFN”)-γ in response to antigen-presenting cells pulsed with the peptide. The method of confirming by this is mentioned.
There is no restriction | limiting in particular as a method to measure the said cytokine, According to the objective, it can select suitably, For example, it can measure by ELISA etc.
また、誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５１Ｃｒ放出試験により確認する方法などが挙げられる。 As the method of confirming the cytotoxic activity of induced CTL, not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include method of confirming by a 51 Cr release test.
前記（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＥｐｏＲ由来ペプチドであり、前記ＥｐｏＲにおける５２番目から６０番目のアミノ酸配列に相当する（以下、「ＥｐｏＲ５２−６０ペプチド」と称することがある）。 The peptide consisting of the amino acid sequence represented by (a) SEQ ID NO: 2 is an EpoR-derived peptide and corresponds to the 52nd to 60th amino acid sequences in the EpoR (hereinafter referred to as “EpoR 52-60 peptide”). Sometimes called).
前記（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドとしては、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 (B) a peptide comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, can bind to the HLA-A24 molecule; The peptide is not particularly limited as long as it is a peptide recognized by cellular immunity, and can be appropriately selected according to the purpose.
前記欠失、置換、及び付加の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 There is no restriction | limiting in particular as a position of the said deletion, substitution, and addition, According to the objective, it can select suitably.
前記置換としては、ペプチドの性質を変化させない点で、同族アミノ酸の間で置換することが好ましい。前記同族アミノ酸は、例えば、極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸などの観点で選択することができる。 As said substitution, it is preferable to substitute between homologous amino acids at the point which does not change the property of a peptide. The homologous amino acid can be selected from the viewpoints of, for example, a polar amino acid, a nonpolar amino acid, a hydrophobic amino acid, a hydrophilic amino acid, a positively charged amino acid, a negatively charged amino acid, and an aromatic amino acid.
前記欠失、置換、及び付加は、ＨＬＡ−Ａ２４分子の結合モチーフである点で、ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン又はフェニルアラニンであり、Ｃ末端アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、又はフェニルアラニンとなるように行うことが好ましい。 The deletion, substitution, and addition are the binding motif of the HLA-A24 molecule, the second amino acid from the N-terminal of the peptide amino acid sequence is tyrosine or phenylalanine, and the C-terminal amino acid is isoleucine, leucine, Or it is preferable to carry out so that it may become phenylalanine.
前記ペプチドを構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよいし、アミノ酸アナログであってもよい。
前記アミノ酸アナログとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物などが挙げられる。
The amino acid constituting the peptide may be a natural amino acid or an amino acid analog.
The amino acid analog is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include N-acylated products, O-acylated products, esterified products, acid amidated products, and alkylated products of amino acids.
また、前記ペプチドは、本発明の効果を損なわない限り、その構成アミノ酸又はカルボキシル基などが修飾されていてもよい。
前記修飾としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等を結合するものや、Ｃ末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等を結合するものなどが挙げられる。
Moreover, as long as the effect of this invention is not impaired, the constituent amino acid or the carboxyl group of the said peptide may be modified.
There is no restriction | limiting in particular as said modification, According to the objective, it can select suitably, For example, the thing which couple | bonds a formyl group, an acetyl group, t-butoxycarbonyl group etc. to N terminal or a free amino group, C Examples thereof include those in which a methyl group, an ethyl group, a t-butyl group, a benzyl group or the like is bonded to a terminal or a free carboxyl group.
前記ペプチドは、細胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドは、免疫原性が高くＣＴＬ誘導能に優れると期待される点で、液性免疫にも認識されることが好ましい。
本発明において、「液性免疫に認識される」とは、ペプチドに特異的なＩｇＧが生体内に存在する、即ち、ペプチド特異的ＩｇＧが血漿から検出されることをいう。
血漿中の特異的ＩｇＧを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡなどで測定することができる。
The peptide is preferably recognized by humoral immunity in that a peptide recognized by both cellular immunity and humoral immunity is expected to have high immunogenicity and excellent CTL inducing ability.
In the present invention, “recognized by humoral immunity” means that peptide-specific IgG exists in vivo, that is, peptide-specific IgG is detected from plasma.
There is no restriction | limiting in particular as a method of measuring specific IgG in plasma, According to the objective, it can select suitably, For example, it can measure by ELISA etc.
前記ペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。 There is no restriction | limiting in particular as a manufacturing method of the said peptide, A well-known method can be selected suitably.
本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドが細胞内で断片化されることで生じるものであってもよい。前記ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 The peptide of the present invention may be produced by fragmenting a polypeptide containing the amino acid sequence in a cell. There is no restriction | limiting in particular as said polypeptide, According to the objective, it can select suitably.
前記ペプチドは、癌増殖に関与するとされるＥｐｏＲ由来ペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるので、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者の癌ワクチン療法に好適に用いることができる。 The peptide is an EpoR-derived peptide that is considered to be involved in cancer growth, can bind to the HLA-A24 molecule, and is recognized by cellular immunity. For example, cancer vaccine therapy for HLA-A24 molecule-positive renal cell cancer patients Can be suitably used.
（核酸分子）
本発明の核酸分子としては、前記ペプチドをコードする塩基配列からなるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記核酸分子の具体例としては、下記配列番号：７で表される塩基配列からなる核酸分子などが挙げられる。
ｔｇｃｔｔｃａｃｃｇａｇｃｇｇｔｔｇｇａｇｇａｃｔｔｇ（配列番号：７）
前記配列番号：７で表される塩基配列からなる核酸分子は、前記配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする。
(Nucleic acid molecule)
The nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it comprises a base sequence encoding the peptide, and can be appropriately selected according to the purpose.
Specific examples of the nucleic acid molecule include a nucleic acid molecule having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 below.
tgcttaccaccgagcgggtggaggactgt (SEQ ID NO: 7)
The nucleic acid molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 encodes a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
前記核酸分子は、例えば、後述するベクターに好適に利用可能である。 The nucleic acid molecule can be suitably used for, for example, a vector described later.
（ベクター）
本発明のベクターは、本発明の核酸分子を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。
(vector)
The vector of the present invention contains at least the nucleic acid molecule of the present invention, and further contains other elements as necessary.
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。
前記ウイルスベクターの具体例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられる。
There is no restriction | limiting in particular as said vector, According to the objective, it can select suitably, For example, a plasmid, a viral vector, etc. are mentioned.
Specific examples of the viral vector include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, vaccinia virus vectors, and the like.
前記ベクターの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して調製することができる。 There is no restriction | limiting in particular as the preparation method of the said vector, It can prepare by selecting a well-known method suitably.
前記ベクターは、抗原提示細胞に導入されると本発明のペプチドを発現する。そして、前記抗原提示細胞は、前記ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する。前記抗原提示細胞は、ペプチド特異的に腎細胞癌細胞を傷害するＣＴＬを効率的に増殖させることができる。 The vector expresses the peptide of the present invention when introduced into an antigen-presenting cell. The antigen-presenting cell presents a complex of the peptide and the HLA-A24 molecule on the cell surface. The antigen-presenting cells can efficiently proliferate CTL that damages renal cell carcinoma cells in a peptide-specific manner.
前記ベクターは、後述する腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物、抗原提示細胞調製剤に好適に利用可能である。 The vector can be suitably used for a pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma and an antigen-presenting cell preparation agent described later.
（腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物）
本発明の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
(Pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma)
The pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma of the present invention contains at least one of the peptide of the present invention and the vector of the present invention, and further contains other components as necessary.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物における前記ペプチド、及び前記ベクターの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかからなるものであってもよい。
前記ペプチド、及び前記ベクターは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、及び前記ベクターのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
The content of the peptide and the vector in the pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
The pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma may comprise at least one of the peptide and the vector.
The said peptide and the said vector may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together. Moreover, about each of the said peptide and the said vector, you may use individually by 1 type and may use 2 or more types together.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬上許容され得る担体などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記担体の具体例としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンなどが挙げられる。
The other components in the pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose, for example, pharmaceutically acceptable And a carrier that can be used. The said other component may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
Specific examples of the carrier include cellulose, polymerized amino acid, albumin and the like.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 There is no restriction | limiting in particular as content of the said other component in the pharmaceutical composition for the said renal cell carcinoma prevention or treatment, According to the objective, it can select suitably.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せた態様で使用されてもよい。
また、前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
The pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma may be used in a mode combined with a pharmaceutical composition containing other ingredients as active ingredients.
Moreover, the pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma may be used in a state of being blended in a medicine containing other ingredients as active ingredients.
腎細胞癌患者のＣＴＬは、様々な癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合であるため、前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、例えば、ＣＡ９抗原由来ペプチド、ＶＥＧＦＲ１由来ペプチドと組み合わせて使用してもよい。 Since CTL of renal cell carcinoma patients is a collection of cells that recognize various cancer antigen peptides, the pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma is combined with, for example, a CA9 antigen-derived peptide or a VEGFR1-derived peptide. May be used.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、公知の剤形を適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。これらの剤形の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、常法に従い製造することができる。 There is no restriction | limiting in particular as a dosage form of the said pharmaceutical composition for the prevention or treatment of renal cell carcinoma, A well-known dosage form can be selected suitably, For example, a solid agent, a semi-solid agent, a liquid agent etc. are mentioned. The pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma in these dosage forms can be produced according to a conventional method.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、癌ワクチンとして使用することが好ましい。 The pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma is preferably used as a cancer vaccine.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物の投与方法、投与量、投与時期、投与間隔、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 The administration method, dose, administration timing, administration interval, and administration target of the pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することが好ましく、投与方法としては、例えば、皮内投与、皮下投与などが挙げられる。 The pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma is preferably administered together with an adjuvant that has been conventionally used for vaccine administration so that an immune response is effectively established. Examples thereof include intradermal administration and subcutaneous administration.
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象の個体の疾患の状態、年齢、体重、体質、他の成分を有効成分とする医薬組成物の投与の有無などを考慮して適宜選択することができる。
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物が前記ペプチドを含む場合の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド量として、０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇなどが挙げられる。
The dosage is not particularly limited and may be appropriately selected in consideration of the disease state, age, weight, constitution, presence / absence of administration of a pharmaceutical composition containing other ingredients as active ingredients, etc. Can do.
The dosage when the pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma contains the peptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the peptide amount is 0.0001 mg to 1,000 mg etc. are mentioned.
前記腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物が前記ベクター含む場合の投与量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ量として、０．１μｇ〜１００ｍｇなどが挙げられる。投与方法としては、静脈注射、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。 The dosage when the pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma contains the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the amount of DNA is 0.1 μg to 100 mg. Etc. Examples of the administration method include intravenous injection, subcutaneous administration, and intradermal administration.
前記投与時期、及び投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、数週から数ヶ月に１回、１年間〜３年間継続して投与するなどが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as said administration time and administration interval, According to the objective, it can select suitably, For example, once every several weeks to several months, it administers continuously for 1 year-3 years etc., etc. are mentioned. It is done.
前記投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as said administration object, According to the objective, it can select suitably, For example, a human is mentioned.
（腎細胞癌の予防又は治療方法）
前記ペプチド、及び前記ベクターは、個体に投与することにより、個体における腎細胞癌の発症を予防したり、腎細胞癌を患っている個体を治療したりすることができる。したがって、本発明は、腎細胞癌を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかを投与することを特徴とする、腎細胞癌の予防又は治療方法にも関する。
(Prevention or treatment method of renal cell carcinoma)
The peptide and the vector can be administered to an individual to prevent the onset of renal cell carcinoma in the individual or to treat an individual suffering from renal cell carcinoma. Therefore, the present invention provides a method for preventing or treating renal cell carcinoma, which comprises administering at least one of the peptide and the vector to an individual. Also related to the method.
また、前記腎細胞癌の予防又は治療方法は、後述する腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法により誘導した腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を個体に戻したり、後述する抗原提示細胞の調製方法により調製した抗原提示細胞を個体に戻したりすることにより行ってもよい。 In addition, the method for preventing or treating renal cell carcinoma includes returning renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells induced by the method for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells described later to an individual, or an antigen described later. Alternatively, antigen-presenting cells prepared by the method for preparing presenting cells may be returned to the individual.
（腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法）
本発明の腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法は、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
(Method for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells)
The method for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells of the present invention includes at least a contact step, and further includes other steps as necessary.
＜接触工程＞
前記接触工程は、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を本発明のペプチドと接触させる工程である。
前記接触工程により、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
<Contact process>
The contact step is a step of contacting peripheral blood mononuclear cells collected from an HLA-A24 molecule positive renal cell carcinoma patient with the peptide of the present invention.
By the contact step, cytotoxic T cells that damage HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma cells can be induced.
前記細胞傷害性Ｔ細胞が「腎細胞癌反応性」であるとは、前記細胞傷害性Ｔ細胞が、腎細胞癌細胞上の癌抗原ペプチドと、ＨＬＡ分子との複合体を認識し、その細胞を傷害する能力を有することをいう。 The cytotoxic T cell is “renal cell carcinoma responsive” means that the cytotoxic T cell recognizes a complex of a cancer antigen peptide on the renal cell carcinoma cell and an HLA molecule, and the cell. It has the ability to injure.
前記ペプチドは、前記ペプチドのみからなるものを使用してもよいし、後述する腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤を使用してもよい。 As the peptide, a peptide consisting only of the peptide may be used, or a renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer described later may be used.
前記接触の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記ペプチドの存在下で培養する方法などが挙げられる。 The contact method is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, the peripheral blood mononuclear cells collected from the HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma patient can be used in vitro. Examples thereof include a method of culturing in the presence of a peptide.
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<Other processes>
The other steps are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose.
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法で得られた腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻して腎細胞癌細胞を傷害する養子免疫療法に好適に用いることができる。 The renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells obtained by the method for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells are, for example, returned to the body of the individual from whom the peripheral blood mononuclear cells were collected. It can be suitably used for adoptive immunotherapy that damages the skin.
（腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤）
本発明の腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
(Renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer)
The renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer of the present invention contains at least the peptide of the present invention, and further contains other components as necessary.
前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記腎細胞癌反応性障害性Ｔ細胞誘導剤は、前記ペプチドのみからなるものであってもよい。
The said peptide may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
There is no restriction | limiting in particular as content of the said peptide in the said renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer, According to the objective, it can select suitably. The renal cell carcinoma responsive disorder T cell inducer may consist of only the peptide.
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述した腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
The other components in the renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose. The thing similar to what was described in the item of the other component of the pharmaceutical composition for prevention or treatment of a cell cancer is mentioned. The said other component may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
There is no restriction | limiting in particular as content of the said other component in the said renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer, According to the objective, it can select suitably.
前記腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤は、上述した腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に好適に用いることができる。 The renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer can be suitably used in the above-described method for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells.
（腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キット）
本発明の腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットは、本発明の腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。
(Kit for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells)
The kit for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells of the present invention contains at least the renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer of the present invention, and further contains other elements as necessary.
前記その他の要素としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の要素は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。 The other elements are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include a medium and a buffer solution. The said other elements may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
前記腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットは、上述した腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に好適に用いることができる。 The kit for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells can be suitably used for the above-described method for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells.
（抗原提示細胞の調製方法）
本発明の抗原提示細胞は、導入工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
(Method for preparing antigen-presenting cells)
The antigen-presenting cell of the present invention includes at least an introduction step, and further includes other steps as necessary.
前記導入工程は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性腎細胞癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを導入する工程である。
前記導入工程により、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製することができる。前記抗原提示細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る。
The introduction step is a step of introducing at least one of the peptide of the present invention and the vector of the present invention into cells having antigen-presenting ability collected from an HLA-A24 positive renal cell carcinoma patient.
Through the introduction step, antigen-presenting cells that present a complex of erythropoietin receptor-derived peptide and HLA-A24 molecule on the cell surface can be prepared. The antigen-presenting cells can induce cytotoxic T cells that damage HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma cells.
前記ペプチドは、前記ペプチドのみからなるものを使用してもよいし、後述する抗原提示細胞調製剤を使用してもよい。
前記ベクターは、前記ベクターのみからなるものを使用してもよいし、後述する抗原提示細胞調製剤を使用してもよい。
As the peptide, one consisting only of the peptide may be used, or an antigen-presenting cell preparation agent described later may be used.
As the vector, a vector consisting only of the vector may be used, or an antigen-presenting cell preparation agent described later may be used.
前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかを前記抗原提示能を有する細胞導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 The method for introducing the peptide and / or the vector into the cell having the antigen-presenting ability is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
前記抗原提示細胞は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者由来の抗原提示能を有する細胞を前記ペプチドと共に培養することにより得られる。また、例えば、前記ベクターをＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し、前記ペプチドを発現させることにより得られる。 The antigen-presenting cells can be obtained, for example, by culturing cells having antigen-presenting ability derived from HLA-A24 molecule positive renal cell carcinoma patients together with the peptide. In addition, for example, the vector can be obtained by introducing the vector into a cell having antigen-presenting ability derived from an HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma patient and expressing the peptide.
前記抗原提示能を有する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、樹状細胞などが挙げられる。
前記樹状細胞の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、患者より採取した末梢血単核細胞から培養プレートに接着する細胞を分離し、その細胞をＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で約１週間培養する方法などが挙げられる。
There is no restriction | limiting in particular as a cell which has the said antigen presentation ability, According to the objective, it can select suitably, For example, a dendritic cell etc. are mentioned.
The method for preparing the dendritic cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, cells that adhere to a culture plate are isolated from peripheral blood mononuclear cells collected from a patient, and the cells For example, in the presence of IL-4 and GM-CSF.
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<Other processes>
The other steps are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose.
前記抗原提示細胞の調製方法で得られた抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻し、体内での腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を促進するために好適に用いることができる。 The antigen-presenting cells obtained by the method for preparing antigen-presenting cells are returned to the body of the individual from which peripheral blood mononuclear cells were collected, for example, and the induction of renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells in the body is promoted. Therefore, it can be used suitably.
（抗原提示細胞調製剤）
本発明の抗原提示細胞調製剤は、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、本発明のペプチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
(Antigen-presenting cell preparation)
The antigen-presenting cell preparation agent of the present invention is an antigen-presenting cell preparation agent for preparing an antigen-presenting cell that presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface. It contains at least one of the peptide of the invention and the vector of the invention, and further contains other components as necessary.
前記ペプチド、及び前記ベクターは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、及び前記ベクターのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗原提示細胞調製剤における前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記抗原提示細胞調製剤は、前記ペプチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかのみからなるものであってもよい。
The said peptide and the said vector may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together. Moreover, about each of the said peptide and the said vector, you may use individually by 1 type and may use 2 or more types together.
The content of at least one of the peptide and the vector in the antigen-presenting cell preparation agent is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. The antigen-presenting cell preparation agent may consist of at least one of the peptide and the vector.
前記抗原提示細胞調製剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述した腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗原提示細胞調製剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
The other components in the antigen-presenting cell preparation are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, for the prevention or treatment of the above-described renal cell carcinoma The thing similar to what was described in the item of the other component of pharmaceutical composition is mentioned. The said other component may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
There is no restriction | limiting in particular as content of the said other component in the said antigen presentation cell preparation agent, According to the objective, it can select suitably.
前記抗原提示細胞調製剤は、上述した抗原提示細胞の調製方法に好適に用いることができる。 The antigen-presenting cell preparation can be suitably used for the above-described method for preparing antigen-presenting cells.
（抗原提示細胞調製用キット）
本発明の抗原提示細胞調製用キットは、エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製用キットであって、本発明の腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の要素を含む。
(Antigen-presenting cell preparation kit)
The kit for preparing an antigen-presenting cell of the present invention is a kit for preparing an antigen-presenting cell for preparing an antigen-presenting cell that presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface. And at least the renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer of the present invention, and further contains other elements as necessary.
前記その他の要素としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地、緩衝液などが挙げられる。前記その他の要素は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。 The other elements are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include a medium and a buffer solution. The said other elements may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
前記抗原提示細胞調製用キットは、上述した抗原提示細胞の調製方法に好適に用いることができる。 The kit for preparing antigen-presenting cells can be suitably used for the method for preparing antigen-presenting cells described above.
以下、本発明の試験例を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, although the test example of this invention is demonstrated, this invention is not limited to these test examples at all.
（試験例１：腎細胞癌細胞株におけるＥｐｏＲのｍＲＮＡの発現）
以下の５種類の腎細胞癌細胞株におけるエリスロポイエチンレセプターのｍＲＮＡの発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより調べた。
＜腎細胞癌株＞
（１）ＳＫＲＣ−１細胞（愛知医科大学の吉川先生より供与）
（２）ＳＫＲＣ−４４細胞（愛知医科大学の吉川先生より供与）
（３）ＳＫＲＣ−５２細胞（愛知医科大学の吉川先生より供与）
（４）ＫＰＫ−１３細胞（大分大学医学部の三股先生より供与）
（５）ＫＫ−ＲＣＣ６細胞（香川大学医学系研究科の筧先生より供与）
(Test Example 1: EpoR mRNA expression in renal cell carcinoma cell lines)
The expression of erythropoietin receptor mRNA in the following five types of renal cell carcinoma cell lines was examined by semi-quantitative RT-PCR.
<Renal cell carcinoma strain>
(1) SKRC-1 cells (provided by Prof. Yoshikawa of Aichi Medical University)
(2) SKRC-44 cells (provided by Prof. Yoshikawa of Aichi Medical University)
(3) SKRC-52 cells (provided by Prof. Yoshikawa of Aichi Medical University)
(4) KPK-13 cells (provided by Prof. Mimata of Oita University School of Medicine)
(5) KK-RCC6 cells (provided by Prof. Tsuji of Kagawa University Graduate School of Medicine)
＜半定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞
前記各細胞から、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。前記抽出したトータルＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。
前記ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＰＣＲの３０サイクル（（１）変性：９４℃、３０秒間、（２）アニール：５５℃、３０秒間、（３）伸長：７２℃、１分間／ｋｂ）を行った。
<Semi-quantitative RT-PCR>
Total RNA was extracted from each cell using PureLink RNA Mini Kit (manufactured by Invitrogen). The extracted total RNA was reverse-transcribed using PrimeScript RT Master Mix (manufactured by Takara Bio Inc.) to prepare cDNA.
30 cycles of PCR using the above-described cDNA as a template and Platinum Taq DNA polymerase (manufactured by Invitrogen) ((1) denaturation: 94 ° C., 30 seconds, (2) annealing: 55 ° C., 30 seconds, (3) extension: 72 ° C., 1 minute / kb).
前記ＰＣＲは、以下の３種のプライマーセットをそれぞれ用いて行った。
（１）ＥｐｏＲ−１
フォワード：５’−ｃｃｔｇｇｔｃｇｇａｇｃｃｔｇｔｇｔ−３’（配列番号：１１）
リバース：５’−ｃａｃｇａｃｇａｃｔｇｇｃａｃｇａｇ−３’（配列番号：１２）
１０４ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ＥｐｏＲの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインに対応する。
（２）ＥｐｏＲ−２
フォワード：５’−ｔｃｇｔｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇａ−３’（配列番号：１３）
リバース：５’−ａｃｃｔｔｃａｇｇａｇａｇｔｃｔｃｇｃｇａｃｇａ−３’（配列番号：１４）
２４０ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ＥｐｏＲの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに対応する。
（３）ＥｐｏＲ−３
フォワード：５’−ｃｃｃｇａｇｃｃｃａｇａｇａｇｃｇａｇｔｔ−３’（配列番号：１５）
リバース：５’−ｔａｇｇａｇｇａｃｇａｇｔａｇａｃｇａａａ−３’（配列番号：１６）
３７２ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。ＥｐｏＲの細胞質ドメインに対応する。
The PCR was performed using the following three types of primer sets, respectively.
(1) EpoR-1
Forward: 5′-cctgggtcggagccgtgtgt-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
Reverse: 5′-cacgacgactggcacgag-3 ′ (SEQ ID NO: 12)
A 104 bp PCR product is obtained. It corresponds to the extracellular domain and transmembrane domain of EpoR.
(2) EpoR-2
Forward: 5′-tcgtgggtcatcctgggtgctgctga-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
Reverse: 5'-acttcaggagagagtctcgcgaga-3 '(SEQ ID NO: 14)
A 240 bp PCR product is obtained. Corresponds to the transmembrane and cytoplasmic domains of EpoR.
(3) EpoR-3
Forward: 5′-cccgagccccagagagcgagtt-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
Reverse: 5′-taggaggacgagtagagagaaaa-3 ′ (SEQ ID NO: 16)
A 372 bp PCR product is obtained. Corresponds to the cytoplasmic domain of EpoR.
前記ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色し、撮影した。結果を図１に示す。なお、図１中、ＧＡＰＤＨは内在性コントロールである。
図１の結果から、各腎細胞癌細胞株において、ＥｐｏＲのｍＲＮＡが発現していることが確認された。
The PCR products were separated on a 2% agarose gel, stained with ethidium bromide and photographed. The results are shown in FIG. In FIG. 1, GAPDH is an endogenous control.
From the results of FIG. 1, it was confirmed that EpoR mRNA was expressed in each renal cell carcinoma cell line.
（試験例２：ＨＬＡ−クラスＩの発現）
前記ＫＰＫ−１３細胞、及び前記ＫＫ−ＲＣＣ６細胞におけるＨＬＡ−クラスＩの発現を以下のようにして、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により調べた。
前記各細胞を抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（ハイブリドーマ：Ｗ６／３２）、又は抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ社製）で細胞を染色し、次いで、ＦＩＴＣ−コンジュゲート ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ社製）で染色した。前記染色した細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて分析した。結果を図２に示す。
(Test Example 2: Expression of HLA-class I)
Expression of HLA-class I in the KPK-13 cells and the KK-RCC6 cells was examined by flow cytometry (FACS) as follows.
The cells were stained with anti-HLA class I monoclonal antibody (hybridoma: W6 / 32) or anti-HLA-A24 monoclonal antibody (manufactured by One Lambda), and then FITC-conjugated goat anti-mouse IgG (H + L) Stained with an antibody (manufactured by KPL). The stained cells were analyzed using FACSCalibur (manufactured by BD Biosciences). The results are shown in FIG.
図２中、上段はＫＰＫ−１３細胞、下段はＫＫ−ＲＣＣ６細胞の結果を示し、それぞれ、左側が抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体で染色した場合（ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ Ｉ）、右側が抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体で染色した場合（ａｎｔｉ−ＨＬＡ−Ａ２４）の結果を示す。
図２の結果から、ＫＰＫ−１３細胞はＨＬＡ−Ａ２４分子陽性であり、ＫＫ−ＲＣＣ６細胞はＨＬＡ−Ａ２４分子陰性であることが確認された。
In FIG. 2, the upper row shows the results of KPK-13 cells and the lower row shows the results of KK-RCC6 cells. When the left side is stained with an anti-HLA class I monoclonal antibody (anti-HLA-class I), the right side is anti-HLA- The results when stained with an A24 monoclonal antibody (anti-HLA-A24) are shown.
From the results in FIG. 2, it was confirmed that KPK-13 cells were HLA-A24 molecule positive and KK-RCC6 cells were HLA-A24 molecule negative.
（試験例３：ペプチドの検討）
ＥｐｏＲ由来ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４アレル分子に対する結合モチーフに基づいて設計し、ＨＬＡ−クラスＩ分子からの解離予測半減期に基づき計算された結合スコアから下記の５種類のＥｐｏＲ由来ペプチドを候補とした。その結合スコアを表１に示す。
なお、前記ＨＬＡ−クラスＩ分子からの解離予測半減期に基づき計算された結合スコアは、ウェブサイト（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ、 Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＩＨ）から算出した。
(Test Example 3: Examination of peptides)
EpoR-derived peptides were designed based on the binding motif for the HLA-A24 allele molecule, and the following five types of EpoR-derived peptides were used as candidates from the binding score calculated based on the predicted half-life from dissociation from HLA-class I molecules. The binding score is shown in Table 1.
The binding score calculated based on the predicted half-life of dissociation from the HLA-class I molecule is shown on the websites (Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Computational Bioscience and Engineering Laboratory, Division of Computer).
(Research & Technology, NIH).
＜ＥｐｏＲ由来ペプチド＞
（１）ＥｐｏＲ３４−４２ ： ＫＦＥＳＫＡＡＬＬ（配列番号：１）
配列番号：１で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの３４番目から４２番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：１で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：６で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の２３５番目から２６１番目に対応する。
ａａｇｔｔｃｇａｇａｇｃａａａｇｃｇｇｃｃｔｔｇｃｔｇ（配列番号：６）
（２）ＥｐｏＲ５２−６０ ： ＣＦＴＥＲＬＥＤＬ（配列番号：２）
配列番号：２で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの５２番目から６０番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：２で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：７で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の２８９番目から３１５番目に対応する。
ｔｇｃｔｔｃａｃｃｇａｇｃｇｇｔｔｇｇａｇｇａｃｔｔｇ（配列番号：７）
（３）ＥｐｏＲ２１５−２２４ ： ＲＹＴＦＡＶＲＡＲＭ（配列番号：３）
配列番号：３で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの２１５番目から２２４番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：３で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：８で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の７７８番目から８０７番目に対応する。
ｃｇｃｔａｃａｃｃｔｔｃｇｃｃｇｔｃｃｇｃｇｃｇｃｇｔａｔｇ（配列番号：８）
（４）ＥｐｏＲ３６７−３７５ ： ＴＹＬＶＬＤＫＷＬ（配列番号：４）
配列番号：４で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの３６７番目から３７５番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：４で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：９で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の１，２３４番目から１，２６０番目に対応する。
ａｃｃｔａｔｃｔｇｇｔｇｃｔｇｇａｃａａａｔｇｇｔｔｇ（配列番号：９）
（５）ＥｐｏＲ４５５−４６４ ： ＬＹＬＶＶＳＤＳＧＩ（配列番号：５）
配列番号：４で表されるアミノ酸配列は、ＥｐｏＲの４５５番目から４６４番目のアミノ酸に対応する。なお、前記配列番号：５で表されるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、下記配列番号：１０で表され、ＥｐｏＲ遺伝子の１，４９８番目から１，５２７番目に対応する。
ｃｔｇｔａｃｃｔｔｇｔｇｇｔａｔｃｔｇａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃ（配列番号：１０）
<EpoR-derived peptide>
(1) EpoR 34-42 : KFESKALL (SEQ ID NO: 1)
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to the 34th to 42nd amino acids of EpoR. The base sequence of the DNA encoding the peptide represented by SEQ ID NO: 1 is represented by the following SEQ ID NO: 6 and corresponds to positions 235 to 261 of the EpoR gene.
aagttcgagagcaaagcggccttgctg (SEQ ID NO: 6)
(2) EpoR 52-60 : CFTERLEDL (SEQ ID NO: 2)
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to the 52nd to 60th amino acids of EpoR. The base sequence of the DNA encoding the peptide represented by SEQ ID NO: 2 is represented by the following SEQ ID NO: 7 and corresponds to the 289th to 315th positions of the EpoR gene.
tgcttaccaccgagcgggtggaggactgt (SEQ ID NO: 7)
(3) EpoR 215-224 : RYTFAVRARM (SEQ ID NO: 3)
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 corresponds to the 215th to 224th amino acids of EpoR. The base sequence of the DNA encoding the peptide represented by SEQ ID NO: 3 is represented by the following SEQ ID NO: 8, and corresponds to positions 778 to 807 of the EpoR gene.
cgctacactttcgccgtccgcgcgcgtatg (SEQ ID NO: 8)
(4) EpoR 367-375 : TYLVLDKWL (SEQ ID NO: 4)
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 corresponds to the 367th to 375th amino acids of EpoR. The base sequence of the DNA encoding the peptide represented by SEQ ID NO: 4 is represented by the following SEQ ID NO: 9, and corresponds to positions 1,234 to 1,260 of the EpoR gene.
acctatctgggtgctggacaaatgggtg (SEQ ID NO: 9)
(5) EpoR 455-464 : LYLVVSSDGI (SEQ ID NO: 5)
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 corresponds to the 455th to 464th amino acids of EpoR. The base sequence of the DNA encoding the peptide represented by SEQ ID NO: 5 is represented by the following SEQ ID NO: 10, and corresponds to the 1,498th to 1,527th positions of the EpoR gene.
ctgtaccttgtgggtattctactctggcatc (SEQ ID NO: 10)
（試験例４）
−末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）−
以下の試験で用いたＰＢＭＣは、以下のようにして調製した。
インフォームドコンセントのうえ、文書にて同意を得られた腎細胞癌（ＲＣＣ）患者、及び健康なドナーからＰＢＭＣを得た。前記提供者の中には、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性患者が含まれていた。なお、前記提供者の中には、ヒト免疫不全ウイルス（以下、「ＨＩＶ」と称することがある）に感染している者はいなかった。
前記ＰＢＭＣは、前記提供者から末梢血を３０ｍＬ採取し、フィコール・コンレイ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ）比重遠心法によって調製した。全ての試料は、使用するまで凍結保存した。
本試験は、近畿大学倫理委員会の承認を受けて行った。
(Test Example 4)
-Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)-
The PBMC used in the following tests was prepared as follows.
PBMCs were obtained from renal cell carcinoma (RCC) patients with informed consent and written consent and healthy donors. Among the donors were HLA-A24 molecule positive patients. None of the providers was infected with human immunodeficiency virus (hereinafter sometimes referred to as “HIV”).
The PBMC was prepared by collecting 30 mL of peripheral blood from the donor and using a Ficoll-Conlay specific gravity centrifugation method. All samples were stored frozen until use.
This test was conducted with the approval of the Kinki University Ethics Committee.
−細胞株−
以下の試験で用いた細胞株は、以下のとおりである。全ての細胞株は、ＦＣＳを１０％含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で維持した。
・ Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＊：０２遺伝子を安定的に発現するＣ１Ｒリンパ腫の亜細胞株、久留米大学医学部の伊東先生より供与より供与）
・ ＫＰＫ−１３細胞（ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞株、大分大学医学部の三股先生より供与）
・ ＫＫ−ＲＣＣ６細胞（ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性腎細胞癌細胞株、香川大学医学系研究科の筧先生より供与）
・ ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ（ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性幼弱化Ｔ細胞、近畿大学医学部 泌尿器科学教室にて調製）
-Cell line-
The cell lines used in the following tests are as follows. All cell lines were maintained in RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 10% FCS.
C1R-A24 cells (HLA-A24 * : a sub-cell line of C1R lymphoma that stably expresses the 02 gene, provided by Dr. Ito of Kurume University School of Medicine)
・ KPK-13 cells (HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma cell line, donated by Prof. Mimata of Oita University School of Medicine)
・ KK-RCC6 cells (HLA-A24 molecule-negative renal cell carcinoma cell line, donated by Prof. Tsuji, Graduate School of Medicine, Kagawa University)
・ PHA-blast (HLA-A24 molecule positive weakened T cells, prepared at Department of Urology, Kinki University School of Medicine)
−ペプチド−
以下の試験で用いたペプチドは、以下のとおりである。全てのペプチドは、ＯＰＥＲＯＮ社から購入した。前記ペプチドは、１０ｍｇ／ｍＬの用量でＤＭＳＯ中に溶解させた。
−ＥｐｏＲ由来ペプチド−
・ ＥｐｏＲ３４−４２ ： ＫＦＥＳＫＡＡＬＬ（配列番号：１）
・ ＥｐｏＲ５２−６０ ： ＣＦＴＥＲＬＥＤＬ（配列番号：２）
・ ＥｐｏＲ２１５−２２４ ： ＲＹＴＦＡＶＲＡＲＭ（配列番号：３）
・ ＥｐｏＲ３６７−３７５ ： ＴＹＬＶＬＤＫＷＬ（配列番号：４）
・ ＥｐｏＲ４５５−４６４ ： ＬＹＬＶＶＳＤＳＧＩ（配列番号：５）
−コントロール（ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するコントロール）−
・ エプスタイン・バーウイルス（以下、「ＥＢＶ」と称することがある）由来ペプチド ： ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ（配列番号：１７）
・ ＨＩＶ由来ペプチド ： ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ（配列番号：１８）
-Peptide-
The peptides used in the following tests are as follows. All peptides were purchased from OPERON. The peptide was dissolved in DMSO at a dose of 10 mg / mL.
-EpoR-derived peptide-
EpoR 34-42 : KFESKALL (SEQ ID NO: 1)
EpoR 52-60 : CFTERLEDL (SEQ ID NO: 2)
EpoR 215-224 : RYTFAVRARM (SEQ ID NO: 3)
EpoR 367-375 : TYLVLDKWL (SEQ ID NO: 4)
EpoR 455-464 : LYLVVSSDGI (SEQ ID NO: 5)
-Control (Control binding to HLA-A24 molecule)-
Epstein-Barr virus (hereinafter sometimes referred to as “EBV”) peptide: TYGPVFMSL (SEQ ID NO: 17)
-HIV-derived peptide: RYLRDQQLL (SEQ ID NO: 18)
−統計−
以下の試験のデータの統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定し、Ｐ値が０．０５未満である場合を統計学的に有意であるとした。
-Statistics-
The statistical significance of the data in the following tests was determined using a two-sided student t test, and a case where the P value was less than 0.05 was considered statistically significant.
＜試験例４−１：ＰＢＭＣからのペプチド特異的ＣＴＬの誘導＞
前記ＥｐｏＲ由来ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導できるかについて、従来報告されている方法にいくつかの変更を加えて調べた。具体的な方法は、以下のとおりである。なお、ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者（１０名）から調製したものをそれぞれ用いた。
<Test Example 4-1: Induction of peptide-specific CTL from PBMC>
Whether the EpoR-derived peptide can induce peptide-specific CTLs from PBMCs of HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma patients was examined with some modifications to previously reported methods. The specific method is as follows. PBMCs prepared from HLA-A24 molecule positive renal cell carcinoma patients (10 patients) were used.
Ｕ底型９６ウェルマイクロ培養プレート（Ｎｕｎｃ社製）において、ＰＢＭＣ（５×１０４細胞／ウェル）を、ペプチド（前記各ＥｐｏＲ由来ペプチド、又は前記ＥＢＶ由来ペプチド））を１０μｇ／ｍＬで含む培養培地１００μＬ中で培養した。前記培養培地は、４５％ ＲＰＭＩ １６４０培地、４５％ ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）、１０％ ＦＣＳ、及びＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００倍希釈、Ｇｉｂｃｏ社製）からなる。
培養開始の翌日に、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む前記培養培地を１００μＬ添加した。培養８日目に、１００μＬの前記培養培地を除去し、同じペプチド（１０μｇ／ｍＬ）を含む新しい培養培地を補充した。培養９日目に、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む前記培養培地を１００μＬ添加した。
培養１７日目に、１つのウェルで培養された細胞を４つのウェルに分けた。その後、２つのウェルは、対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養し、残りの２つのウェルは、前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した。１８時間培養した後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮ−γの産生を測定した。
Culture medium containing PBMC (5 × 10 4 cells / well) and peptide (each EpoR-derived peptide or EBV-derived peptide) at 10 μg / mL in a U-bottom 96-well microculture plate (manufactured by Nunc) Cultured in 100 μL. The culture medium consists of 45% RPMI 1640 medium, 45% AIM-V medium (Gibco), 10% FCS, and MEM non-essential amino acid solution (100-fold dilution, Gibco).
On the next day after the start of culture, 100 μL of the culture medium containing 50 U / mL of IL-2 was added. On day 8 of culture, 100 μL of the culture medium was removed and replenished with fresh culture medium containing the same peptide (10 μg / mL). On the 9th day of culture, 100 μL of the culture medium containing 50 U / mL of IL-2 was added.
On the 17th day of culture, cells cultured in one well were divided into 4 wells. Thereafter, the two wells were cultured with C1R-A24 cells pulsed with the corresponding peptide, and the remaining two wells were cultured with C1R-A24 cells pulsed with the HIV-derived peptide. After culturing for 18 hours, the supernatant was collected and IFN-γ production was measured by ELISA.
ペプチド特異的ＣＴＬの誘導は、前記対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値と、前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値との差が５０ｐｇ／ｍＬ以上であり、かつ、前記対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値と、前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値との比（前記対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値／前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞と培養した２つのウェルにおけるＩＦＮ−γの産生量の平均値）が、１．２以上であるときは陽性と判定した。 Induction of peptide-specific CTLs was carried out with the average value of IFN-γ production in two wells cultured with C1R-A24 cells pulsed with the corresponding peptide, and with C1R-A24 cells pulsed with the HIV-derived peptide. The difference between the average production amount of IFN-γ in the two wells was 50 pg / mL or more, and the production of IFN-γ in the two wells cultured with the C1R-A24 cells pulsed with the corresponding peptide The ratio between the average value of the amount and the average value of the production amount of IFN-γ in the two wells cultured with the C1R-A24 cells pulsed with the HIV-derived peptide (cultured with the C1R-A24 cells pulsed with the corresponding peptide) Mean value of IFN-γ production in the two wells / C1R-A24 pulsed with the HIV-derived peptide A positive value was determined when the average production amount of IFN-γ in two wells cultured with cells was 1.2 or more.
前記判定の結果、陽性と判定されたものについての結果を表２に示す。
表２の結果から、前記ＥｐｏＲ由来ペプチドの中でも、ＥｐｏＲ５２−６０ペプチド（配列番号：２）が、１０人のＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者のうち６人のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができ、特に好ましいペプチドであることがわかった。また、ＨＬＡ−クラスＩ分子からの解離予測半減期に基づき計算された結合スコアが高いものが、活性が高いというわけではないこともわかった。 From the results shown in Table 2, among the EpoR-derived peptides, EpoR 52-60 peptide (SEQ ID NO: 2) obtained peptide-specific CTL from 6 PBMCs out of 10 HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma patients. It can be induced and proved to be a particularly preferred peptide. It was also found that those with high binding scores calculated based on predicted half-lives from dissociation from HLA-Class I molecules are not highly active.
＜試験例４−２：ペプチド特異的ＣＴＬの腎細胞癌細胞株に対する細胞傷害活性＞
ペプチド特異的ＣＴＬの腎細胞癌細胞株に対する細胞障害活性を、標準的な６時間５１Ｃｒ放出アッセイにより、以下のようにして試験した。
<Test Example 4-2: Cytotoxic activity of peptide-specific CTL against renal cell carcinoma cell line>
The cytotoxic activity of peptide-specific CTLs against renal cell carcinoma cell lines was tested by a standard 6 hour 51 Cr release assay as follows.
−ＣＤ８陽性Ｔ細胞−
以下の試験に用いるＣＤ８陽性Ｔ細胞は、以下のようにして、ペプチド刺激されたＰＢＭＣから調製した。
前記試験例４−１と同様の方法により、前記ＥｐｏＲ５２−６０ペプチド（配列番号：２）で刺激されたＰＢＭＣ（ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者 ６名からそれぞれ調製（Ｐｔ ＃６９、Ｐｔ ＃４２、Ｐｔ ＃４６、Ｐｔ ＃５７、Ｐｔ ＃５０、及びＰｔ ＃５２の６サンプル。前記Ｐｔ ＃４２、及びＰｔ ＃４６は、それぞれ、前記試験例４−１の患者７、及び９に該当）。）のそれぞれについて、抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（ｍＩｇＧ１：ＤＩＡＣＬＯＮＥ、Ｂｅｓａｎｃｏｖ Ｃｅｄｅｘ社製）で染色し、次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ 抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ 抗ＣＤ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、及び抗ＣＤ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で処理した。前記Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合した細胞は、磁化し、取り除いた。前記処理により、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞が取除かれ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合は、およそ８０％〜８５％であった（データは示さず）。
なお、陰性対照細胞としては、フィトヘマグルチニンで活性化されたＴ細胞を用意した。
-CD8 positive T cells-
CD8 positive T cells used in the following tests were prepared from peptide-stimulated PBMC as follows.
In the same manner as in Test Example 4-1, PBMC stimulated with the EpoR 52-60 peptide (SEQ ID NO: 2) was prepared from 6 patients with HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma (Pt # 69, Pt # 42, Pt # 46, Pt # 57, Pt # 50, and Pt # 52, the Pt # 42 and Pt # 46 are the patient 7 of the test example 4-1, and 9))), and stained with anti-CD56 monoclonal antibody (mIgG1: DIACLONE, manufactured by Besankov Cedex), then Dynabeads anti-mouse IgG (manufactured by Invitrogen), Dynabeads anti-CD19 (manufactured by Invitrogen), and Treated with anti-CD4 (Invitrogen). Cells bound to the Dynabeads were magnetized and removed. The treatment removed CD4 positive T cells, B cells, and NK cells, and the proportion of CD8 positive T cells was approximately 80% to 85% (data not shown).
In addition, T cells activated with phytohemagglutinin were prepared as negative control cells.
＜＜試験例４−２−１＞＞
ターゲット細胞として、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞株であるＫＰＫ−１３細胞、ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性腎細胞癌細胞株であるＫＫ−ＲＣＣ６細胞、及びＨＬＡ−Ａ２４分子陽性幼弱化Ｔ細胞であるＰＨＡ−ｂｌａｓｔを用い、これらに対する前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞（以下、「エフェクター細胞」と称することがある）の細胞傷害活性を以下のようにして、試験した。
<< Test Example 4-2-1 >>
Target cells are KPK-13 cells, which are HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma cell lines, KK-RCC6 cells, which are HLA-A24 molecule-negative renal cell carcinoma cell lines, and HLA-A24 molecule-positive, weakened T cells. Using PHA-blast, the cytotoxic activity of the CD8 positive T cells (hereinafter sometimes referred to as “effector cells”) against them was tested as follows.
丸底の９６ウェルプレートにおいて、５１Ｃｒ標識したターゲット細胞（２，０００個／ウェル）と、エフェクター細胞とを所定のエフェクター細胞／ターゲット細胞比で培養した。
特異的な５１Ｃｒ放出は、以下の式から計算した。
特異的溶解（％）＝（試験サンプルにおける放出−自然放出）×１００／（最大放出−自然放出）
前記「自然放出」は、エフェクター細胞なしで５１Ｃｒ標識したターゲット細胞をインキュベートした場合の上清から決定し、前記「最大放出」は、エフェクター細胞なしで、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（和光純薬工業株式会社製）と５１Ｃｒ標識したターゲット細胞とをインキュベートした場合の上清から決定した。
結果を図３に示す。図３の縦軸は、「特異的溶解（％）」（％ ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸は、エフェクター細胞と、ターゲット細胞との比（Ｅ／Ｔ：エフェクター細胞／ターゲット細胞）を示す。
In a round bottom 96-well plate, 51 Cr-labeled target cells (2,000 cells / well) and effector cells were cultured at a predetermined effector cell / target cell ratio.
Specific 51 Cr release was calculated from the following equation:
Specific lysis (%) = (release in test sample-spontaneous release) x 100 / (maximum release-spontaneous release)
The “spontaneous release” is determined from the supernatant when 51 Cr-labeled target cells are incubated without effector cells, and the “maximum release” is 1% Triton X (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) without effector cells. (Supplied by the company) and 51 Cr-labeled target cells.
The results are shown in FIG. The vertical axis in FIG. 3 represents “specific lysis (%)” (% lysis), and the horizontal axis represents the ratio of effector cells to target cells (E / T: effector cells / target cells).
図３に示されるように、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥｐｏＲ５２−６０ペプチドにて刺激したＨＬＡ−Ａ２４分子陽性患者由来の各ＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４分子陰性腎細胞癌株（ＫＫ−ＲＣＣ６）及びＨＬＡ−Ａ２４分子陽性幼弱化Ｔ細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）に対してよりもＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌株（ＫＰＫ１３）に対して高いレベルの細胞障害活性を示した。この結果は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドにて刺激されたＰＢＭＣは、腎細胞癌に対してＨＬＡ−Ａ２４分子拘束性に細胞障害活性を発揮することを示す。 As shown in FIG. 3, each PBMC derived from an HLA-A24 molecule positive patient stimulated with EpoR 52-60 peptide in vitro is HLA-A24 molecule negative renal cell carcinoma line (KK-RCC6) and HLA-A24. It showed a higher level of cytotoxic activity against the HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma line (KPK13) than against the molecule-positive juvenile T cells (PHA-blast). This result shows that in vitro, PBMC stimulated with EpoR 52-60 peptide exert cytotoxic activity against renal cell carcinoma in a HLA-A24 molecule-restricted manner.
＜＜試験例４−２−２＞＞
ペプチド刺激ＣＴＬの細胞傷害活性に関与する細胞のタイプをコールド阻害試験により調べた。コールド阻害試験は以下のようにして行った。
<< Test Example 4-2-2 >>
Cell types involved in the cytotoxic activity of peptide-stimulated CTLs were examined by cold inhibition test. The cold inhibition test was performed as follows.
丸底９６ウェルプレートにおいて、５１Ｃｒ標識したターゲット細胞（ＫＰＫ−１３細胞；２，０００個／ウェル）と、上述したエフェクター細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）とを、下記のいずれかの５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞（４×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）と共に培養し、前記試験例４−２−１と同様にして、特異的溶解（％）を求めた。なお、コントロールとして、前記５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞を用いなかった場合についても同様にして、特異的溶解（％）を求めた。結果を図４に示す。
−５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞−
（１） 前記ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞
（２） 前記ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞
なお、本試験では、ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者 ３名からそれぞれ調製したＰＢＭＣ（Ｐｔ ＃６９、Ｐｔ ＃４２、及びＰｔ ＃５７の３サンプル。前記Ｐｔ ＃４２は、前記試験例４−１の患者７に該当）を用いて得られたエフェクター細胞について調べた。
In a round bottom 96-well plate, 51 Cr-labeled target cells (KPK-13 cells; 2,000 cells / well) and the above-described effector cells (2 × 10 4 cells / well) were either 51 The cells were cultured with cold target cells (4 × 10 4 cells / well) not labeled with Cr, and specific lysis (%) was determined in the same manner as in Test Example 4-2-1. As a control, specific lysis (%) was determined in the same manner even when the cold target cells not labeled with 51 Cr were not used. The results are shown in FIG.
- 51 Cr unlabeled Cold Target cells -
(1) C1R-A24 cells pulsed with the HIV-derived peptide (2) C1R-A24 cells pulsed with the EpoR 52-60 peptide In this study, each was prepared from 3 patients with HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma The effector cells obtained using the obtained PBMC (Pt # 69, 3 samples of Pt # 42, and Pt # 57. The Pt # 42 corresponds to the patient 7 of Test Example 4-1) were examined.
図４の横軸は、「特異的溶解（％）」（％ ｌｙｓｉｓ）を示し、縦軸は、上から順に、「コントロール」（ｎｏｎｅ）、５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞として「ＨＩＶ由来ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞」を用いた場合（Ｃ１Ｒ−Ａ２４／ＨＩＶ）、５１Ｃｒ標識していないコールドターゲット細胞として「ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞」を用いた場合（Ｃ１Ｒ−Ａ２４／ＥｐｏＲ ５２）の結果を示す。
図４に示されるように、ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドにて刺激したＨＬＡ−Ａ２４分子陽性患者由来のＰＢＭＣのＫＰＫ１３細胞に対する細胞障害活性は、ＥｐｏＲ５２−６０ペプチドをパルスした非標識のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞の添加によって有意に抑制されたが、ＨＩＶ由来ペプチドをパルスした非標識のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞によっては抑制されなかった。このコールド阻害試験の結果は、ペプチド刺激ＰＢＭＣのＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌細胞株に対する細胞障害活性が、ペプチド特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞による可能性が高いことを示す。
The horizontal axis of FIG. 4 indicates “specific lysis (%)” (% lysis), and the vertical axis indicates, in order from the top, “control” (none), as a cold target cell not labeled with 51 Cr, “HIV-derived When “C1R-A24 cells pulsed with peptide” are used (C1R-A24 / HIV), “C1R-A24 cells pulsed with EpoR 52-60 peptide” are used as cold target cells not labeled with 51 Cr ( The result of C1R-A24 / EpoR 52) is shown.
As shown in FIG. 4, the cytotoxic activity against KPK13 cells of PBMC derived from HLA-A24 molecule-positive patients stimulated with EpoR 52-60 peptide is shown in unlabeled C1R-A24 cells pulsed with EpoR 52-60 peptide. Was not significantly suppressed by unlabeled C1R-A24 cells pulsed with HIV-derived peptides. The results of this cold inhibition test indicate that the peptide-stimulated PBMC has a high cytotoxicity against the HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma cell line due to peptide-specific CD8-positive T cells.
以上の結果は、本発明のＥｐｏＲ由来ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌において腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞を誘導でき、特異的免疫療法、特に癌ワクチン療法に有用であることを示す。本発明のＥｐｏＲ由来ペプチドにより、ペプチドワクチン療法の選択肢を増やすことが可能となると考えられる。 The above results show that the EpoR-derived peptide of the present invention can induce renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells in HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma and is useful for specific immunotherapy, particularly cancer vaccine therapy. Show. It is believed that the EpoR-derived peptide of the present invention can increase the options for peptide vaccine therapy.
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ヒト白血球抗原−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４）分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドであって、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかであることを特徴とするペプチドである。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸分子を含有することを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物である。
＜５＞ 癌ワクチンである前記＜４＞に記載の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物である。
＜６＞ 腎細胞癌を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載の腎細胞癌の予防又は治療用医薬組成物を投与することを特徴とする方法である。
＜７＞ ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された末梢血単核細胞を前記＜１＞に記載のペプチドと接触させる工程を含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
＜８＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜９＞ 前記＜８＞に記載の腎細胞癌反応性細胞障害性Ｔ細胞誘導剤を含むことを特徴とする腎細胞癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞誘導用キットである。
＜１０＞ エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の調製方法であって、
ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを導入する工程を含むことを特徴とする方法である。
＜１１＞ エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製剤であって、
前記＜１＞に記載のペプチド、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗原提示細胞調製剤である。
＜１２＞ エリスロポイエチンレセプター由来ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製するための抗原提示細胞調製用キットであって、
前記＜１１＞に記載の抗原提示細胞調製剤を含むことを特徴とする抗原提示細胞調製用キットである。
Examples of the aspect of the present invention include the following.
<1> A peptide capable of binding to human leukocyte antigen-A24 (HLA-A24) molecule and recognized by cellular immunity, which is any of the following (a) and (b) It is.
(A) A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
<2> A nucleic acid molecule comprising a base sequence encoding the peptide according to <1>.
<3> A vector comprising the nucleic acid molecule according to <2>.
<4> A pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma, comprising at least one of the peptide according to <1> and the vector according to <3>.
<5> The pharmaceutical composition for prevention or treatment of renal cell carcinoma according to <4>, which is a cancer vaccine.
<6> A method for preventing or treating renal cell carcinoma, comprising administering to the individual the pharmaceutical composition for preventing or treating renal cell carcinoma according to any one of <4> to <5> above It is the method characterized by this.
<7> Renal cell carcinoma reactive cytotoxicity T, comprising a step of contacting peripheral blood mononuclear cells collected from a patient with HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma with the peptide according to <1>. This is a method for inducing cells.
<8> A renal cell carcinoma reactive cytotoxic T-cell inducer comprising the peptide according to <1>.
<9> A kit for inducing renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cells, comprising the renal cell carcinoma reactive cytotoxic T cell inducer according to <8>.
<10> A method for preparing an antigen-presenting cell, which presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface,
Including the step of introducing at least one of the peptide according to the above <1> and the vector according to the above <3> into a cell having an antigen presenting ability collected from an HLA-A24 molecule positive renal cell carcinoma patient. It is a characteristic method.
<11> An antigen-presenting cell preparation for preparing an antigen-presenting cell that presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface,
An agent for preparing an antigen-presenting cell, comprising at least one of the peptide according to <1> and the vector according to <3>.
<12> A kit for preparing an antigen-presenting cell for preparing an antigen-presenting cell that presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface,
An antigen-presenting cell preparation kit comprising the antigen-presenting cell preparation agent according to <11>.
Claims (9)
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１個若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。 A peptide capable of binding to a human leukocyte antigen-A24 (HLA-A24) molecule and recognized by cellular immunity, which is one of the following (a) and (b).
(A) A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
ＨＬＡ−Ａ２４分子陽性腎細胞癌患者より採取された抗原提示能を有する細胞に請求項１に記載のペプチド、及び請求項３に記載のベクターの少なくともいずれかを導入する工程を含むことを特徴とする方法。 A method for preparing an antigen-presenting cell, which presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface,
Including a step of introducing at least one of the peptide according to claim 1 and the vector according to claim 3 into a cell having antigen-presenting ability collected from an HLA-A24 molecule-positive renal cell carcinoma patient. how to.
請求項１に記載のペプチド、及び請求項３に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗原提示細胞調製剤。 An antigen-presenting cell preparation for preparing an antigen-presenting cell that presents a complex of an erythropoietin receptor-derived peptide and an HLA-A24 molecule on the cell surface,
An agent for preparing an antigen-presenting cell, comprising at least one of the peptide according to claim 1 and the vector according to claim 3.
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|---|---|---|---|---|
| JP2018070469A (en) * | 2016-10-26 | 2018-05-10 | 学校法人近畿大学 | HIF-1α-DERIVED PEPTIDE CAPABLE OF BINDING TO HLA-A24 MOLECULE AND RECOGNIZED BY CELL-MEDIATED IMMUNITY AND RENAL CELL CARCINOMA VACCINE CONTAINING SAME |
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2014
- 2014-01-20 JP JP2014007671A patent/JP2015136293A/en active Pending
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| 植村 天受, 科学研究費補助金研究成果報告書 研究課題番号：19390419 腎癌に対するペプチドを用いたテーラ, JPN6017035506 * |
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