JP2015116174A - 細胞培養足場基材、マイクロ流体デバイス及びそれを用いたハイスループットナノファイバースクリーニング方法 - Google Patents
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- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
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Abstract
Description
項1. ナノファイバーからなる複数の人工細胞外マトリクス部を基板上に所定の間隔で配置してなる細胞培養足場基材。
項2. ナノファイバーを金属コート上に形成してなる、項1に記載の細胞培養足場基材。
項3. 金属コートが白金コートである、項2に記載の細胞培養足場基材。
項4. ナノファイバーからなる複数の人工細胞外マトリクス部を基板上に所定の間隔で配置してなる項1〜3のいずれかに記載の細胞培養足場基材と、各人工細胞外マトリクス部の対応する位置にマイクロ流体チャネルを形成するようにマイクロ流路構造体とを密着させ、前記マイクロ流体チャネルで細胞培養と培養液交換を可能にしてなるマイクロ流体デバイス。
項5. 項4に記載のマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルで細胞を培養し、培養細胞の状態を評価することで、当該培養細胞に好適なナノファイバーを決定することを特徴とする、ナノファイバーのハイスループットスクリーニング方法。
多種類のナノファイバーを単一基板上に作製する方法として、発明者はエレクトロスピニング法を基にした方法を開発した。エレクトロスピニング法はゼラチン・コラーゲン・セルロースなど様々な生体材料やポリスチレン、ポリ乳酸などのポリマー材料を原料としてナノファイバーを簡便に作製できる方法である。しかし、従来のエレクトロスピニング法では、一つの基板上に対して一種類のナノファイバーを作製するだけであった。
μFDは細胞生物学において様々な利点を持つ反面、作製過程において、鋳型準備に時間がかかることが問題点であった。また、単一基板上に複数の高さ、またはなだらかな勾配を持つ鋳型を作製するためには、複数のマスク、リソグラフィープロセスを繰り返す必要があり、効率的な新規作製法の開発が必要であった。
最適なナノファイバーを効率よく同定するために、本発明では、マイクロ流体デバイスと組み合わせたハイスループットスクリーニングシステムを開発した。マイクロ流体デバイスは、実験条件を厳密に制御できるため再現性が良くなり、かつ実験のハイスループット化を可能にするため、ナノファイバー・スクリーニングにおいても非常に効果的に応用することが可能である。しかし、これまではマイクロ流体デバイス中にナノファイバーを作製する技術はなかった。本発明では、まず始めにナノファイバーを基板とマイクロ流体デバイスでサンドイッチのように挟むことによって、それを可能にした。
実施例1:ナノファイバーのパターニング作製方法
(1)材料
Gelatin Solution
・ Gelatin (SIGMA G2625 MW: 30kDa)
・ Acetic acid glacial (AA; SIGMA P-338826)
・ Ethyl acetate anhydrous (EA; SIGMA P270989)
Polystyrene Solution
・Polystyrene (PS; SIGMA 182435 Fluka, Mw: 290,000, Mn: 130,000)
・Tetrahydrofuran (THF; Wako, 206-05106)
・N,N-Dimethylformamide (DMF; Wako, 047-29191)
Polydimethylglutarimide SF 11 (PMGI; MicroChem, 02464)
Crosslink buffer
・ Water-soluble carbodiimide (WSC; DOJINDO Catalog344-03633)
・ N-Hydroxysuccinimide (NHS; SIGMA Catalog56480)
・ 99.5% ethanol (Wako)
Nuncオムニトレイ(Thermo scientific)
Gauze BEMCOTTM S-2 Asahi Kasei
High voltage supply (TECHDEMPAZ Japan)
真空ポンプ(Vacuum Pump)
ニプロブランド針 23Gx1 1/4” 刃先なし
10%w/v gelatin solution (AA:EA = 3:2) 1 mL調製
1.2 mLチューブに gelatin 0.1 g(最終濃度 10%w/v)、DDW 0.2 mLを入れる。
2.次にドラフト内で Acetic acid glacial 0.42 mL(最終濃度 42%w/v)、Ethyl acetate anhydrous 0.31 mL(最終濃度 28%w/v)を加える。
3.チューブをボルテックスしよく攪拌する。
4.Gelatinが十分に溶けたらチューブをローターにセットし、一昼夜転倒混和。(室温度:20℃以上)
1. 2 mLチューブに polystyrene 0.085 g(最終濃度 8.5%w/v)を入れる。
2. 次にドラフト内で Tetrahydrofuran 0.4575 mL、N,N-Dimethylformamide 0.4575 mLを加える。
3. チューブをボルテックスしよく攪拌する。
4. PSが十分に溶けたらチューブをローターにセットし、一昼夜転倒混和。(室温度:20.C以上)
1. 3次元画像描画ソフトウェア( 3D-CAD)により、ナノファイバー・アレイのデザインを有するマスクを作製する(本実験では各々 3箇所のホールを有する 8種類のマスクを作製)。
2. マスクデザインを stfファイルに変換する。
3. Stfファイルを 3Dプリンタに転送し、印刷する。
1. Nuncオムニトレイの蓋をマグネトロンスパッタリング( 100 mA、12 sec x 2(両側))により白金コーティングする(白金プレート)。
2. Nanofiber solutionを 23Gのブラント針(ニプロ)を付けたシリンジに入れ、気泡を抜く。
3. マイクロシリンジポンプの流速をセットする(gelatin: 0.2 mL/h, PS: 0.16 mL/h, PMGI: 0.6 mL/h)。
4. 白金プレートを万力で垂直に固定し、マイクロシリンジポンプにセットするシリンジの針から 10 cmほどの距離に置く。
5. ブラント針に+電極(赤線)、シリコンウェハーに−電極(緑線)を取り付ける。
6. 白金プレートにマスクを装着し、クリップで固定する。
7. マイクロシリンジポンプのスイッチを入れ、電圧(gelatin: 11kV, PS: 13kV, PMGI: 8kV)をかけ、白金プレートにファイバーを噴出する。
8. ファイバー噴出後、白金プレート上のマスクを静かに外す。
9. 6-8のステップを繰り返し、ナノファイバー・アレイを作製する。
10. プレートをデシケーターに入れ、真空ポンプをかけながら一昼夜乾燥させる。
(1)材料
SYLGARDR 184 Silicone Elastomer kit (base, curing agent)(Dow corning)
Nuncオムニトレイ( Thermo scientific 165218)
3Dプリンタ AGILISTA(Keyence)
デシケーター
コロナフィット CFG-500(信光電気計装株式会社)
3D-CAD(AutoCAD、Blender等)
鋳型の作製
4. 3次元画像描画ソフトウェア(3D-CAD)により、マイクロ流路構造の型となる鋳型デザインを有するマスクを作製する。
5. 鋳型デザインをstfファイルに変換する。
6. Stfファイルを 3Dプリンタに転送し、印刷する。
1. Silicone Elastomer Baseと Curing agentを 10:1の重量比で撹拌ミキサーを用いて混合する(PDMS混合液)。
2. PDMS混合液を、3Dプリンタにより印刷された鋳型に流し込む。
3. デシケーターで30分間脱気を行う。
4. 65℃のオーブンで加熱、オーバーナイト。
5. 鋳型からPDMSを回収する。
1. オムニトレイまたはナノファイバーがアレイ状に作製されたオムニトレイの表面をコロナ処理する(コロナフィット CFG-500等を用いる)。
2. PDMSの表面をコロナ処理する。
3. オムニトレイとPDMSを貼り合わせる。
4. 65℃のオーブンで加熱、オーバーナイト。
5. 使用するまでデシケーター内で保存する。
(1)材料
Crosslink buffer
・Water-soluble carbodiimide (WSC; DOJINDO Catalog344-03633)
・N-Hydroxysuccinimide (NHS; SIGMA Catalog56480)
・99.5% ethanol (Wako)
TeSR .E8 STEM CELL ペリタス ST-05940
Y−27632 Wako 257-00511(1 mg)253-00513(5 mg)
Cell Dissociation Buffer enzyme-free, Hanks’-based GIBCO 13150-016
TrypLE Express GIBCO 12605-010
NFの前準備
1. HTNS-μFDのナノファイバーを架橋処理する必要がある場合はここで行う。(ゼラチンナノファイバーの架橋処理)
1-1.デシケーターで乾燥させた gelatin nanofiberを表面が浸る程度の量の Crosslink bufferに浸ける。 (4時間)
1-2. Crosslink bufferに浸けていた nanofiberを取り出し 99.5% ethanolに 5〜10分浸けて洗浄する。 (2回繰り返す)
1-3.洗浄後キムワイプを敷いたシャーレの上で風乾する。
1-4.風乾後デシケーターに入れ一昼夜乾燥させる。
2. 99.5%エタノールで 3回洗浄 1 mLx3 (滅菌処理)
3. 3回目は丁寧に吸引しクリーンベンチ内で乾燥
4. HTNS-μFDの流路を TeSR-E8培地で満たし、 37℃でインキュベートしておくTeSR-E8 2〜7 μL/channel in HTNS-μFD
1. Y-27632(最終濃度 10 μM)入り TeSR-E8を用意
2. PBSで 2回細胞をリンス
3. TrypLE Express 2mlを加えたらそのままインキュベート
4. 2分くらいでdishをゆすって顕微鏡下でチェック (チェックポイント:コロニーが丸くなっている(MEF上の細胞を用いる場合は MEFが剥がれてくる))
5. TrypLE Expressを吸引除去秘密資料 11
6. 必要な時はTeSR-E8 1〜2 mlでリンス
7. TeSR-E8(+Y27632)4 mlで回収して、10回ぐらいピペッティングし、シングルセルにする
8. 細胞数をカウントする
9. 1000 rpm 3分間遠心し上清吸引除去し、TeSR-E8(+Y-27632)で必要な細胞濃度に再懸濁
10. 細胞懸濁液を播種する
2〜7 μL TeSR-E8培地
細胞の濃度は 0.5〜2 X 105cells/cm2
翌日以降の培地 TeSR-E8(+Y-27632)を毎日2回交換する
(1)材料
・4% formaldehyde PBS solution
・PBS
・PBS-0.5% Triton X-100
・ブロッキング液(5% normal goat serum, 5% normal donkey serum, 3% BSA ,0.1% Tween20 in PBS(add 0.1% of n-dodecyl-beta-D-maltoside (DDM) in blocking solution for prevent nonspecific binding onto PDMS))
・3% BSA in PBS
・PBS-T
・300 nM DAPI in PBS
・蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse Ti)
・Cell profiler(http://www.cellprofiler.org/)
固定処理・透過処理・ブロッキング
1. 培地を除去し、1X Wash bufferで 1回細胞を洗浄する。
2. 1X Wash bufferを除去し、4% formaldehyde PBS solutionを用いて、遮光、室温下で 15分間細胞の固定処理を行う。
3. 4% formaldehyde PBS solutionを除去し、PBSで 2回洗浄し、PBSを完全に除去する。
4. PBS-0.5% Triton X-100で 30分間、透過処理を行う(室温)(OCT3/4, Nanog, Sox2等の染色では4℃でオーバーナイト)。
5. PBS-0.5% Triton X-100を除去し、細胞をブロッキング液に漬ける(4℃、オーバーナイト)。
6. 3% BSA in PBSで2回洗浄。
7. 1次抗体液に細胞を漬けて、 4℃、オーバーナイト。
8. PBS-Tで 2回洗浄。
9. 2次抗体液に細胞を漬けて、遮光下、室温、1時間インキュベート。
10. PBS-Tで 2回洗浄。
11. 300 nM DAPI in PBSで核染色(室温、30分間インキュベーション)。
12. PBSで 1回洗浄後、観察まで新鮮な PBSを保ちながら遮光下、4℃保存。
13.蛍光顕微鏡を用いて、各流路において画像を取得。
14.取得した画像を Cell profilerを用いて解析。
Claims (5)
- ナノファイバーからなる複数の人工細胞外マトリクス部を基板上に所定の間隔で配置してなる細胞培養足場基材。
- ナノファイバーを金属コート上に形成してなる、請求項1に記載の細胞培養足場基材。
- 金属コートが白金コートである、請求項2に記載の細胞培養足場基材。
- ナノファイバーからなる複数の人工細胞外マトリクス部を基板上に所定の間隔で配置してなる請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養足場基材と、各人工細胞外マトリクス部の対応する位置にマイクロ流体チャネルを形成するようにマイクロ流路構造体とを密着させ、前記マイクロ流体チャネルで細胞培養と培養液交換を可能にしてなるマイクロ流体デバイス。
- 請求項4に記載のマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルで細胞を培養し、培養細胞の状態を評価することで、当該培養細胞に好適なナノファイバーを決定することを特徴とする、ナノファイバーのハイスループットスクリーニング方法。
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