JP2015084764A - Mouse whose seriousness of heart failure can be correctly quantified and evaluated in non-evasive manner over time - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、創薬研究等において使用する、心不全の重症度を経時的に正確に測定可能なモデル動物、並びにその心不全重症度の測定方法に関する。 The present invention relates to a model animal capable of accurately measuring the severity of heart failure over time and a method for measuring the severity of heart failure used in drug discovery research and the like.
高齢化が進む今日の社会では、心不全患者数は増加の一途をたどっているが、現状では有効な治療法は限られている。 In today's aging society, the number of patients with heart failure continues to increase, but at present there are limited effective treatments.
心不全とは、一般的に、心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、心筋症、高血圧症等の様々な原因により心臓の機能が低下した病態を指す。現在、このような心不全を診断するためのバイオマーカーとして、心房性利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性利尿ペプチド（ＢＮＰ）及びその前駆タンパク質ｐｒｏＢＮＰ等が知られており（非特許文献１）、これらのマーカーを測定することで、患者が心不全であるか否か、あるいはその重症度がどの程度かを知ることができる。
なお、ＡＮＰ及びＢＮＰは、心不全の際に心臓において強くその発現が誘導されるタンパク質であるが、どのような因子によって発現が誘導されるかについては、未だ解明されていない。
Heart failure generally refers to a pathological condition in which the function of the heart is reduced due to various causes such as ischemic heart disease such as myocardial infarction and angina, cardiomyopathy, and hypertension. At present, as a biomarker for diagnosing such heart failure, atrial diuretic peptide (ANP), brain diuretic peptide (BNP) and its precursor protein proBNP are known (Non-patent Document 1). Can be used to determine whether a patient has heart failure or how severe it is.
ANP and BNP are proteins whose expression is strongly induced in the heart during heart failure, but it has not been elucidated yet what kind of factor induces the expression.
薬剤の生体内スクリーニングに最も適している系はマウスである。しかしながら、マウスの心不全の程度を評価するために、ＢＮＰ及び／又はＡＮＰを測定しようとすると、ほぼ致死量の採血をしなければならない。したがって、測定の度にマウスを殺処分することとなり、経時的な測定は不可能である。 The most suitable system for in vivo screening for drugs is the mouse. However, when trying to measure BNP and / or ANP in order to assess the degree of heart failure in mice, a nearly lethal blood draw must be taken. Therefore, the mouse is killed for each measurement, and measurement over time is impossible.
マウスの心不全の状態を経時的に評価する方法としては、心エコー法による左心室壁運動評価及び心臓カテーテルによる左心室内圧測定が知られているが（非特許文献２及び３）前者にはマウスの心臓の小ささや心拍数の高さ等のために測定自体が難しいことから正確な評価が困難であるという問題、後者には手技自体が非常に難しいため実施者の技能によって結果が左右されるという問題がある。そのため、従来の方法では、マウスの心不全の程度を、低侵襲、経時的にかつ正確に評価することは実質的にできていなかった。 As a method for evaluating the state of heart failure of a mouse over time, left ventricular wall motion evaluation by echocardiography and left ventricular pressure measurement by a cardiac catheter are known (Non-patent Documents 2 and 3). The problem is that accurate evaluation is difficult because the measurement itself is difficult due to the smallness of the heart and the height of the heart rate, etc., and the procedure is very difficult for the latter, and the result depends on the skill of the practitioner. There is a problem. Therefore, in the conventional method, the degree of heart failure of a mouse could not be substantially evaluated with minimal invasiveness over time.
また、創薬においては、開発中の薬剤が臨床応用された段階で初めて、心不全を引き起こす等の心毒性を有していることが確認される場合もある（例えば、非特許文献４）。薬剤の心毒性を適確に評価できる技術が開発されれば、開発した薬剤による早期の心臓毒性予測が可能となりより安全性の高い創薬研究が可能となる。 In drug discovery, it may be confirmed that the drug under development has cardiotoxicity such as causing heart failure only when it is clinically applied (for example, Non-Patent Document 4). If a technology that can accurately evaluate the cardiotoxicity of a drug is developed, it will be possible to predict cardiotoxicity at an early stage using the developed drug, and drug discovery research with higher safety will be possible.
そのため、心不全をはじめとする循環器疾患の創薬研究の発展を期すために、マウス等の小動物において、低侵襲であり経時的かつ正確で簡便に病態評価が可能となる技術の開発が望まれていた。 Therefore, in order to develop drug discovery research for cardiovascular diseases such as heart failure, it is desirable to develop a technology that enables minimally invasive, timely, accurate and simple pathological evaluation in small animals such as mice. It was.
上記状況に鑑み本発明者らは、心不全の重症度を低侵襲に経時的かつ簡便に可視化又は定量化できるモデル動物を提供すること、並びに、モデル動物の心不全重症度を低侵襲に経時的、正確かつ簡便に評価する方法を提供することを課題とする。 In view of the above situation, the present inventors provide a model animal that can easily visualize or quantify the severity of heart failure over time in a minimally invasive manner, and over time, the heart failure severity of a model animal in a minimally invasive manner, It is an object to provide a method for accurate and simple evaluation.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、心不全の際に心臓において増加するＢＮＰに関して、ＢＮＰをコードする遺伝子発現の増大に関与する遺伝子領域（発現制御遺伝子領域）の配列の同定に成功した。そして、この発現制御遺伝子領域とレポーター遺伝子とを含有する塩基配列をマウスに導入することで、外部からの測定によって心不全の重症度を可視化、定量化ができることを見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a gene region (expression control gene region) involved in an increase in the expression of a gene encoding BNP is related to BNP that increases in the heart during heart failure. The sequence was successfully identified. Then, by introducing into the mouse a base sequence containing this expression control gene region and a reporter gene, it was found that the severity of heart failure can be visualized and quantified by measurement from the outside, and further investigations are made. It came to complete.
すなわち、本発明は以下に関する。
（１） 心不全で誘導されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている、非ヒトトランスジェニック動物。
（２） 前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である前記（１）に記載の動物。
（３） 前記発現制御遺伝子領域が、配列番号１の塩基配列である前記（１）又は（２）に記載の動物。
（４） ルシフェリンの発光により心不全重症度を可視化する前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の動物。
（５） 非ヒト動物が、げっ歯類である前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の動物。
（６） げっ歯類が、マウス又はラットである前記（５）に記載の動物。
（７） 前記（１）〜（６）のいずれかに記載の動物に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定することにより心不全重症度を評価する方法。
（８） 前記（１）〜（６）のいずれかに記載の動物に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定する工程を含む、循環器疾患薬のスクリーニング方法。
（９）配列番号１の塩基配列及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定する工程を含む、循環器疾患薬のスクリーニング方法。
That is, the present invention relates to the following.
(1) A non-human transgenic animal into which an expression control gene region of a gene encoding ANP and / or BNP induced by heart failure and a base sequence containing a reporter gene have been introduced.
(2) The animal according to (1), wherein the reporter gene is a luciferase gene.
(3) The animal according to (1) or (2), wherein the expression control gene region is the base sequence of SEQ ID NO: 1.
(4) The animal according to any one of (1) to (3), wherein the severity of heart failure is visualized by luminescence of luciferin.
(5) The animal according to any one of (1) to (4), wherein the non-human animal is a rodent.
(6) The animal according to (5), wherein the rodent is a mouse or a rat.
(7) A method for evaluating the severity of heart failure by administering luciferin to the animal according to any one of (1) to (6) and measuring the amount of luciferin luminescence.
(8) A screening method for a cardiovascular disease drug, comprising a step of administering luciferin to the animal according to any one of (1) to (6) and measuring the amount of luciferin luminescence.
(9) A screening method for a cardiovascular disease drug, comprising a step of administering luciferin to an in vitro cell into which a nucleotide sequence containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a luciferase gene has been introduced, and measuring the amount of luciferin luminescence.
本発明のトランスジェニック動物を用いることで、低侵襲、経時的かつ簡便に心不全病態の重症度を定量化して評価できる。そのため、本発明によれば、循環器系創薬開発研究に重要な動物モデル、心不全の重症度の評価方法、及び循環器系創薬のスクリーニング方法を提供できる。 By using the transgenic animal of the present invention, it is possible to quantify and evaluate the severity of a heart failure condition with minimal invasiveness and time. Therefore, according to the present invention, an animal model important for cardiovascular drug development research, a method for evaluating the severity of heart failure, and a screening method for cardiovascular drug discovery can be provided.
以下、本発明について詳しく説明する。 The present invention will be described in detail below.
真核生物の遺伝子発現は正確にコントロールされており、ＤＮＡ複製のようにすべての細胞で全か無かの法則で調節されるのではなく非常に選択的である。遺伝子発現は、遺伝子が転写、翻訳されてタンパク質になるまでの数多くの過程で調節されうる。 Eukaryotic gene expression is precisely controlled and highly selective rather than regulated by all-or-nothing rules in all cells like DNA replication. Gene expression can be regulated in a number of processes from gene transcription to translation to protein.
遺伝子の転写は、ＲＮＡポリメラーゼが転写開始領域の遺伝子に結合することで開始される。しかし、真核生物のＲＮＡポリメラーゼだけでは転写開始領域の遺伝子に結合できず、転写因子と呼ばれる様々な調節タンパク質が組み立てられて初めて転写が開始される（Lee TI, et. al., “transcription of eukaryotic protein coding genes” Annu Rev Genet. 2000; 34: pp.77-137）。前記転写因子が結合する遺伝子領域は特定の配列を有しており、「発現制御遺伝子領域」とも呼ばれる。 Transcription of a gene is started when RNA polymerase binds to a gene in the transcription initiation region. However, eukaryotic RNA polymerase alone cannot bind to genes in the transcription initiation region, and transcription is initiated only when various regulatory proteins called transcription factors are assembled (Lee TI, et. Al., “Transcription of eukaryotic protein coding genes ”Annu Rev Genet. 2000; 34: pp.77-137). The gene region to which the transcription factor binds has a specific sequence and is also referred to as “expression control gene region”.
本発明において、「発現制御遺伝子領域」の「発現制御」とは、例えば、遺伝子発現の増幅又は増強に関与すること、遺伝子の転写開始に関与する又は遺伝子転写量の増大に関与することを意味する。また、「発現制御遺伝子領域」の「遺伝子領域」とは、塩基配列を意味する。 In the present invention, “expression control” of “expression control gene region” means, for example, involved in amplification or enhancement of gene expression, involved in initiation of gene transcription, or involved in increase in gene transcription amount. To do. The “gene region” of the “expression control gene region” means a base sequence.
本発明のひとつの態様は、心臓におけるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を可視化及び定量する方法に関する。本態様においては、心臓において産生されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子（以降、それぞれをＡＮＰ遺伝子、ＢＮＰ遺伝子ともいう。）の発現を制御する遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている、非ヒトトランスジェニック動物を用いる。なお、前記非ヒトトランスジェニック動物も、本発明のひとつの態様である。 One aspect of the present invention relates to a method for visualizing and quantifying the expression of ANP and / or BNP in the heart. In this embodiment, a gene region that controls expression of ANP and / or BNP-encoding genes (hereinafter also referred to as ANP gene and BNP gene) produced in the heart, and a base sequence containing a reporter gene A non-human transgenic animal into which is introduced. The non-human transgenic animal is also one aspect of the present invention.
前記ＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域は、ＡＮＰ遺伝子、ＢＮＰ遺伝子のいずれか一方、又は両方の発現を制御するものであってよい。本発明のひとつの好ましい態様において、前記発現制御遺伝子領域は、ＡＮＰ遺伝子及びＢＮＰ遺伝子の両方の発現を制御する。 The expression control gene region of the gene encoding ANP and / or BNP may control the expression of one or both of the ANP gene and the BNP gene. In one preferred embodiment of the present invention, the expression control gene region controls the expression of both the ANP gene and the BNP gene.
前記ＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域は、心臓におけるＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現を制御する遺伝子領域であれば特に限定されないが、配列番号１の塩基配列であるものが好ましい。配列番号１の塩基配列の発現制御遺伝子領域は、本発明において初めて同定されたものであり、心臓におけるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を誘導する。なお、Sonisha Aらが２０１１年に発見したＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域（Sonisha A, et. al., “Differential Role of Nkx2-5 in Activation of the Atrial Natriuretic Favtor Gene in the Developing versus Failing Heart” MOLECULER AND CELLULAR BIOLOGY, Nov. 2011,pp.4633-4645を参照。）は、受精卵の発生初期のＡＮＰ及びＢＮＰの発現には関与するが、成マウスの心不全となった心臓において上昇するＡＮＰ及びＢＮＰの発現には関与しない。 The expression control gene region of the gene encoding ANP and / or BNP is not particularly limited as long as it is a gene region that controls the expression of the ANP gene and / or BNP gene in the heart, but has the base sequence of SEQ ID NO: 1. Is preferred. The expression control gene region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was identified for the first time in the present invention, and induces the expression of ANP and / or BNP in the heart. In addition, Sonisha A, et al., “Differential Role of Nkx2-5 in Activation of the Atrial Natriuretic Favor Gene in The Developing versus Failing Heart ”(see MOLECULER AND CELLULAR BIOLOGY, Nov. 2011, pp.4633-4645) is involved in the expression of ANP and BNP in the early development of fertilized eggs, but became heart failure in adult mice. It is not involved in elevated ANP and BNP expression in the heart.
本発明において、前記「レポーター遺伝子」は、導入したＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域に転写因子が結合して転写が行われることで発現する遺伝子を包含する。導入された発現制御遺伝子領域に結合する転写因子は、好ましくは、心不全の状態において心臓でＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を誘導する因子である。あるいは、前記転写因子は、心不全の状態に応じて心臓で特異的に増加する因子である。したがって、本発明の好ましい態様においては、心臓で発現するＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現量と前記レポーター遺伝子の発現量は正の比例関係を示す。すなわち、本態様においては、レポーター遺伝子の発現量を測定することで、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現量を評価することができる。さらには、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現量から心不全の重症度を評価することができる。 In the present invention, the “reporter gene” includes a gene that is expressed when transcription is performed by binding a transcription factor to the expression control gene region of the introduced ANP gene and / or BNP gene. The transcription factor that binds to the introduced expression control gene region is preferably a factor that induces the expression of ANP and / or BNP in the heart in the state of heart failure. Alternatively, the transcription factor is a factor that specifically increases in the heart depending on the state of heart failure. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the expression level of ANP and / or BNP expressed in the heart and the expression level of the reporter gene show a positive proportional relationship. That is, in this embodiment, the expression level of ANP and / or BNP can be evaluated by measuring the expression level of the reporter gene. Furthermore, the severity of heart failure can be evaluated from the expression level of ANP and / or BNP.
レポーター遺伝子は、その発現が検出可能である限り、特に制限されない。レポーター遺伝子の発現は、転写物、翻訳産物、または翻訳産物の活性もしくは機能を検出することによって直接的または間接的に検出することができる。レポーター遺伝子としては、公知の任意のレポーター遺伝子を使用することができ、特に限定されないが、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、β-D-グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、β-D-ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子などが挙げられる。レポーター遺伝子は、単独で又は２種以上を組合せて用いてもよい。 The reporter gene is not particularly limited as long as its expression can be detected. Reporter gene expression can be detected directly or indirectly by detecting the transcript, translation product, or activity or function of the translation product. As the reporter gene, any known reporter gene can be used, and is not particularly limited. For example, the reporter gene includes, but is not limited to, chloramphenicol acetyltransferase gene (CAT), β-D-glucuronidase gene (GUS), β-D- Examples include galactosidase gene (LacZ), luciferase gene, aequorin gene, green fluorescent protein (GFP) gene and the like. You may use a reporter gene individually or in combination of 2 or more types.
本発明のひとつの好ましい態様においては、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子を用いる。ルシフェラーゼ遺伝子を用いると、例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリンアッセイ法により、生細胞、組織、器官、さらには個体における遺伝子の発現を実時間で検出することができ、遺伝子発現量の定量もできることから好ましい（例えば、G. Zhang et. al., “Bioluminescent imaging of Cdk2 inhibition in vivo” NATURE MEDICINE Vol.10, No.6, June 2004: 643-648等を参照。）。本態様においては、レポーター遺伝子として、さらに、ルシフェラーゼ遺伝子以外のレポーター遺伝子を１以上用いてもよい。 In one preferred embodiment of the present invention, a luciferase gene is used as a reporter gene. Use of the luciferase gene is preferable because, for example, the expression of the gene in living cells, tissues, organs, and individuals can be detected in real time by the luciferase-luciferin assay, and the amount of gene expression can be quantified (for example, , G. Zhang et. Al., “Bioluminescent imaging of Cdk2 inhibition in vivo” NATURE MEDICINE Vol. 10, No. 6, June 2004: 643-648, etc.). In this embodiment, one or more reporter genes other than the luciferase gene may be used as the reporter gene.
本発明の別のひとつの態様は、心臓におけるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を可視化及び定量することによって、心不全の重症度を評価する方法に関する。ＡＮＰ及びＢＮＰは心不全の状態となった際に、心臓においてその発現が強く誘導される。前記非ヒトトランスジェニック動物を用いて、発現が誘導されたＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を可視化及び定量することによって、心不全の重症度を評価することができる。すなわち、好ましいひとつの態様において、ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物を用いて、心不全の際に心臓において発現されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰを測定することにより心不全の重症度を評価する。 Another aspect of the invention relates to a method for assessing the severity of heart failure by visualizing and quantifying the expression of ANP and / or BNP in the heart. When ANP and BNP are in a state of heart failure, their expression is strongly induced in the heart. The non-human transgenic animals can be used to assess the severity of heart failure by visualizing and quantifying expression induced ANP and / or BNP expression. That is, in one preferred embodiment, using a non-human transgenic animal into which an ANP gene and / or BNP gene expression control gene region and a base sequence containing a reporter gene have been introduced, in the heart during heart failure, The severity of heart failure is assessed by measuring the expressed ANP and / or BNP.
より好ましい態様において、配列番号１の塩基配列、及び、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物を用いて、心不全の重症度を評価する。レポーター遺伝子は、特に限定されず、例えば、上記したものを使用してもよい。 In a more preferred embodiment, the severity of heart failure is evaluated using a non-human transgenic animal into which the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence containing a reporter gene have been introduced. A reporter gene is not specifically limited, For example, you may use what was mentioned above.
さらにより好ましい態様において、配列番号１の塩基配列、並びに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、β-D-グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、β-D-ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子及び緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子からなる群から選択される１以上のレポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物を用いて、心不全の重症度を評価する。 In an even more preferred embodiment, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the chloramphenicol acetyltransferase gene (CAT), β-D-glucuronidase gene (GUS), β-D-galactosidase gene (lacZ), luciferase gene, aequorin The severity of heart failure is evaluated using a non-human transgenic animal into which a base sequence containing one or more reporter genes selected from the group consisting of a gene and a green fluorescent protein (GFP) gene is introduced.
本発明の特に好ましい態様においては、配列番号１の塩基配列及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する塩基配列が導入された非ヒトトランスジェニック動物を用いて、心不全の重症度を、ルシフェリン発光で可視化することによって評価する。 In a particularly preferred embodiment of the present invention, the severity of heart failure is evaluated by visualizing luciferin luminescence using a non-human transgenic animal into which the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence containing the luciferase gene have been introduced. To do.
次に、本発明において、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合における、心不全重症度の評価方法について具体的に説明する。 Next, in the present invention, a method for evaluating the severity of heart failure when a luciferase gene is used as a reporter gene will be specifically described.
本発明の非ヒトトランスジェニック動物において、心臓におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現は、好ましくは、ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現量に比例する。そのため、非ヒトトランスジェニック動物の心臓において発現するルシフェラーゼ遺伝子の発現量を定量することで、ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現量を評価することができる。ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定する方法は、特に限定されないが、この分野において通常用いられる公知の方法を用いることができる。例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリンアッセイ法等に基づいて測定することができる。具体的には、非ヒトトランスジェニック動物に、発光基質であるルシフェリンを腹腔内あるいは静脈内に投与して、ルシフェラーゼとルシフェリンの反応によって生じる発光を測定し、ルシフェリンの発光量を定量することで、ルシフェラーゼ遺伝子を定量してもよい（ルシフェラーゼアッセイのより詳しい操作手順等については、例えば、C.E.Burd, et. Al., “Monitoring Tumorigenesis and Senescence In Vivo with a p16INK4a-Luciferase Model” Cell 152, 340-351, Jan. 17, 2013を参照のこと。）。
ルシフェラーゼ遺伝子の発現量が高いほど、すなわち、ルシフェリンの発光量が多いほど、心不全の重症度が高いと評価できる。
In the non-human transgenic animal of the present invention, the expression of the luciferase gene in the heart is preferably proportional to the expression level of the ANP gene and / or BNP gene. Therefore, the expression level of the ANP gene and / or BNP gene can be evaluated by quantifying the expression level of the luciferase gene expressed in the heart of the non-human transgenic animal. The method for measuring the expression level of the luciferase gene is not particularly limited, and a known method usually used in this field can be used. For example, it can be measured based on a luciferase-luciferin assay or the like. Specifically, luciferin as a luminescent substrate is administered intraperitoneally or intravenously to a non-human transgenic animal, luminescence generated by the reaction of luciferase and luciferin is measured, and the amount of luciferin luminescence is quantified, The luciferase gene may be quantified (for more detailed procedure for luciferase assay, see, for example, CEBurd, et. Al., “Monitoring Tumorigenesis and Senescence In Vivo with a p16 INK4a- Luciferase Model” Cell 152, 340-351 , Jan. 17, 2013).
It can be evaluated that the higher the expression level of the luciferase gene, that is, the greater the amount of luciferin luminescence, the higher the severity of heart failure.
ルシフェリン発光量の測定は、具体的には、例えばインビボ（in vivo）イメージングシステム (IVIS Lumina II（登録商標）、Caliper Life Sciences)を使用して、撮影することで行ってもよい。また、ルシフェリン発光量の定量は、例えば、Living Image 4.0解析ソフトを使用して、測定場所をROIで囲み、発光量をrelative light units (RLU/min)で表示することで行うことができる。
より詳しくは、後記する実施例に記載の方法により測定してもよい。
Specifically, the amount of luciferin luminescence may be measured by taking an image using, for example, an in vivo imaging system (IVIS Lumina II (registered trademark), Caliper Life Sciences). The luciferin luminescence amount can be quantified, for example, by using Living Image 4.0 analysis software, surrounding the measurement location with ROI, and displaying the luminescence amount in relative light units (RLU / min).
More specifically, the measurement may be performed by the method described in Examples described later.
本発明の別のひとつの好ましい態様において、心臓部のルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、心臓部のルシフェリン発光量の測定値を、心臓部以外の部位におけるルシフェリン発光量の測定値によって補正することで評価してもよい。例えば、心臓以外の部位で特異的に発現する遺伝子の発現制御遺伝子の下流に、ルシフェラーゼ遺伝子が導入されていれば、心臓以外の部位においてルシフェラーゼが発現することが期待される。そのような心臓以外の部位におけるルシフェラーゼの発現量は、心不全によって発現が誘導されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現量には依存しないため、誤操作などによりルシフェリンの投与量に誤差が生じた場合であっても、補正をかけることによって、精度よく心臓部のルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することができる。 In another preferred embodiment of the present invention, the expression level of the luciferase gene in the heart is evaluated by correcting the measurement value of the luciferin luminescence amount in the heart part with the measurement value of the luciferin luminescence amount in a site other than the heart part. May be. For example, if a luciferase gene is introduced downstream of an expression control gene of a gene that is specifically expressed at a site other than the heart, luciferase is expected to be expressed at a site other than the heart. The expression level of luciferase in such a region other than the heart does not depend on the expression level of ANP and / or BNP that is induced by heart failure. However, by applying correction, the expression level of the luciferase gene in the heart can be accurately measured.
また、本発明のひとつの態様は、非ヒトトランスジェニック動物に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定する工程を含む、創薬スクリーニング方法に関する。本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いることで、経時的に心不全重症度を評価することができるため、例えば、心不全の重症度に応じた治療薬、改善薬、予防薬等の開発が可能となる。本発明の前記創薬スクリーニング方法を用いることで、例えば、罹患人口の多い高血圧性心肥大（拡張不全）や軽度心不全にならば使用できるという薬剤のみをスクリーニングすることができる。
スクリーニングは、例えば、施術により大動脈縮窄又は心肥大の状態にした非ヒトトランスジェニック動物に対し、薬剤、好ましくは循環器疾患薬を投与し、薬剤の投与前後の心臓部のルシフェリン発光量を測定して、その発光量を比較することで行ってもよい。例えば、薬剤の投与後にルシフェリン発光量を減少させた薬剤は、ANP/BNPの発現を低下させる。つまり心不全を改善させる薬剤として効果を示すことが期待される。また、例えば、ルシフェリン発光量を増加させた薬剤は、ANP/BNPの産生誘導剤として効果を示すことが期待される薬剤のスクリーニングは、他の評価方法を併せて実施して総合的に評価することが好ましい。前記他の評価方法としては、例えば、心エコー法による左室壁運動評価、心臓カテーテルによる左心室内圧測定、病理組織学的検査、遺伝子発現検査等が挙げられる。
Moreover, one aspect of the present invention relates to a drug discovery screening method comprising a step of administering luciferin to a non-human transgenic animal and measuring the amount of luciferin luminescence. Since the severity of heart failure can be evaluated over time by using the non-human transgenic animal of the present invention, for example, it is possible to develop therapeutic agents, remedies, preventive agents, etc. according to the severity of heart failure Become. By using the drug discovery screening method of the present invention, for example, only drugs that can be used for hypertensive cardiac hypertrophy (diastolic dysfunction) or mild heart failure with a large affected population can be screened.
In screening, for example, a drug, preferably a cardiovascular disease drug, is administered to a non-human transgenic animal that has undergone aortic constriction or cardiac hypertrophy by treatment, and the amount of luciferin emitted from the heart before and after the drug is measured. And you may carry out by comparing the light-emission quantity. For example, a drug that has reduced the amount of luciferin luminescence after the administration of the drug decreases the expression of ANP / BNP. In other words, it is expected to be effective as a drug that improves heart failure. In addition, for example, drugs that have increased luciferin luminescence level are screened for drugs that are expected to be effective as ANP / BNP production inducers. It is preferable. Examples of the other evaluation methods include left ventricular wall motion evaluation by echocardiography, left ventricular pressure measurement using a cardiac catheter, histopathological examination, gene expression examination, and the like.
また、本発明のトランスジェニック動物を用いることで心機能を鋭敏に測定できることから、従来困難であった生体内での薬剤の心毒性効果についての評価にも、本発明のスクリーニング方法を適用することできる。心毒性効果の評価は、例えば、評価したい薬剤の投与前後の心臓部のルシフェリン発光量を測定して、その発光量を比較することで行ってもよい。例えば、薬剤の投与後にルシフェリン発光量を増加させた薬剤は、心毒性を有する可能性が高いと考えられる。薬剤が心毒性を有するか否かの評価は、他の評価方法を併せて実施して総合的に評価することが好ましい。前記他の評価方法としては、例えば、心エコー法による左室壁運動評価、心臓カテーテルによる左心室内圧測定、病理組織学的検査、遺伝子発現検査等が挙げられる。 In addition, since the cardiac function can be measured sharply by using the transgenic animal of the present invention, the screening method of the present invention can also be applied to the evaluation of the cardiotoxic effect of a drug in vivo, which has been difficult in the past. it can. Evaluation of the cardiotoxic effect may be performed, for example, by measuring the amount of luciferin luminescence in the heart before and after administration of the drug to be evaluated and comparing the amount of luminescence. For example, a drug that increases the amount of luciferin luminescence after drug administration is considered to have a high possibility of having cardiotoxicity. The evaluation of whether or not a drug has cardiotoxicity is preferably carried out comprehensively by carrying out other evaluation methods together. Examples of the other evaluation methods include left ventricular wall motion evaluation by echocardiography, left ventricular pressure measurement using a cardiac catheter, histopathological examination, gene expression examination, and the like.
本発明によれば、心不全の重症度又は病期別に試験動物を分類することができるため、心不全という非常に幅広い病態に対して、開発薬剤の投与時期を分別して投与試験を行うことができ、また、ヒト疾患への応用、前臨床を進めるに当り、どのような心不全群に対してどのような薬剤開発を行うことが有効か、事前に判断することができる。 According to the present invention, since test animals can be classified according to the severity or stage of heart failure, for a very wide range of pathological conditions of heart failure, administration tests can be conducted by separating the administration time of the developed drug, In advance of application to human diseases and preclinical treatment, it is possible to determine in advance what kind of drug development is effective for what kind of heart failure group.
続いて、本発明の非ヒトトランスジェニック動物の作成方法について、具体的に説明する。より詳細な方法については、後記の実施例に記載する。 Subsequently, the method for producing the non-human transgenic animal of the present invention will be specifically described. More detailed methods are described in the examples below.
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、従来公知の方法（例えば、（財）東京都臨床医学総合研究所 実験動物研究部門 編「マウスラボマニュアル」シュプリンガー・フェアラーク東京（株）, 1998年12月14日, pp.225-245、Animal Biotechnology, 1, 175−84, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980)）に基づいて作製することができる。具体的には、例えば、導入遺伝子を非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作成することができる。 The non-human transgenic animal of the present invention can be produced by a conventionally known method (for example, “Mouse Lab Manual” edited by Experimental Animal Research Division, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Springer Fairlark Tokyo, December 1998). 14 pp.225-245, Animal Biotechnology, 1, 175-84, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980)). Specifically, for example, by introducing a transgene into a totipotent cell of a non-human animal, generating this cell into an individual, and selecting the individual in which the transgene is integrated into the genome of the somatic cell. Transgenic animals can be created.
遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いてもよい。また、培養細胞への遺伝子導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等の公知方法を用いてもよい。 As a totipotent cell into which a gene is introduced, in the case of a mouse, a fertilized egg or an early embryo may be used. In addition, as a method for introducing a gene into cultured cells, for example, a known method such as a calcium phosphate method, an electric pulse method, a lipofection method, an aggregation method, a microinjection method, a particle gun method, or a DEAE-dextran method may be used.
例えば、マイクロインジェクション法を用いた場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶かしたベクターをマイクロピペットで受精卵に注入し、この卵をホルモン処理（ＰＧＦ２α、ｈＣＧ、エストラジオール、ＬＨ等）又は物理的刺激により擬妊娠状態にした宿主動物の子宮内に移植してもよい。この宿主動物を飼育して分娩させることによって遺伝子導入非ヒト動物が得られる。遺伝子導入非ヒト動物が得られたか否かは、体の一部（例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認することにより知ることができる。 For example, when the microinjection method is used, a vector dissolved in a HEPES buffer, phosphate buffer, physiological saline, or the like is injected into a fertilized egg with a micropipette, and the egg is treated with hormone (PGF2α, hCG, estradiol, LH Etc.) or may be transplanted into the uterus of a host animal made pseudo-pregnant by physical stimulation. A transgenic non-human animal can be obtained by breeding and delivering this host animal. Whether or not a transgenic non-human animal has been obtained can be determined by extracting DNA from a part of the body (for example, the tip of the tail) and confirming the presence of the transgene by Southern analysis or PCR.
本発明のトランスジェニック動物は、構築物（コンストラクト）が直接導入されている動物、並びに、その構築物を発現する能力を保持する当該動物の後代を含む。 The transgenic animals of the present invention include animals into which the construct (construct) has been directly introduced, as well as progeny of the animal that retain the ability to express the construct.
本明細書において「動物」とは、ヒトを除く動物（すなわち、非ヒト動物）を意味し、例えば、ヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、イルカ、又はウマ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生類（例えば、カエル）、爬虫類、又は昆虫（例えば、ショウジョウバエ）などを挙げることができる。非ヒト動物としては、技術的にはすべての動物種を対象とすることが可能であるが、実験動物として使用する観点からげっ歯類が好ましく、特に、近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウス、又はラットが好ましい。 As used herein, “animal” means an animal other than a human (ie, a non-human animal), such as a mammal other than a human (eg, rat, mouse, hamster, guinea pig, dog, cat, monkey, pig). , Cattle, sheep, rabbits, goats, dolphins, or horses), birds (eg, chickens or quails), amphibians (eg, frogs), reptiles, or insects (eg, Drosophila). As non-human animals, it is technically possible to target all animal species, but rodents are preferred from the viewpoint of use as laboratory animals, and in particular, many inbred strains have been created, In addition, mice or rats that are well-equipped with techniques such as culturing fertilized eggs and in vitro fertilization are preferred.
本発明の別のひとつの態様は、ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞（以降、トランスジェニックin vitro細胞ともいう。）を用いる創薬スクリーニング方法に関する。本態様において、前記ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域は、上記した非ヒトトランスジェニック動物に導入したものと同じものを用いてよく、配列番号１の塩基配列であることが好ましく、前記レポーター遺伝子は、上記した非ヒトトランスジェニック動物に導入したものと同じものを用いてよく、ルシフェラーゼ遺伝子であることが好ましい。
なお、前記トランスジェニックin vitro細胞も本発明のひとつの態様である。
Another embodiment of the present invention is an in vitro cell into which an ANP gene and / or BNP gene expression control gene region and a base sequence containing a reporter gene have been introduced (hereinafter also referred to as a transgenic in vitro cell). The present invention relates to a drug discovery screening method using In this embodiment, the expression control gene region of the ANP gene and / or BNP gene may be the same as that introduced into the non-human transgenic animal, and is preferably the base sequence of SEQ ID NO: 1. The reporter gene may be the same as that introduced into the non-human transgenic animal described above, and is preferably a luciferase gene.
The transgenic in vitro cell is also an embodiment of the present invention.
本態様の好ましい形態は、配列番号１の塩基配列及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞に、ルシフェリンを投与する工程、ルシフェラーゼの発現量を測定する工程を含む、循環器疾患薬スクリーニング方法である。ルシフェラーゼの発現量は、ルシフェリン発光量を測定することで測定することが好ましい。より好ましくは、配列番号１の塩基配列及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリン発光量を測定する工程を含む、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導薬のスクリーニング方法である。
遺伝子を導入する細胞は、所望のあらゆる培養細胞を用いることができ、特に限定されないが、例えば、マウスやラットの心筋細胞であってもよい。
A preferred form of this embodiment includes a step of administering luciferin to an in vitro cell into which a base sequence containing SEQ ID NO: 1 and a luciferase gene is introduced, and a step of measuring the expression level of luciferase. Screening method. The expression level of luciferase is preferably measured by measuring the amount of luciferin luminescence. More preferably, screening for an ANP and / or BNP inducer, comprising the step of administering luciferin to an in vitro cell into which a nucleotide sequence containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the luciferase gene has been introduced, and measuring the amount of luciferin luminescence. Is the method.
Any desired cultured cell can be used as the cell into which the gene is introduced, and is not particularly limited. For example, mouse or rat cardiomyocytes may be used.
前記ＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導薬のスクリーニング方法は、例えば、遺伝子を導入したin vitro細胞に、評価したい薬剤を投与し、薬剤の投与前後のルシフェリン発光量を測定することで行ってもよい。ルシフェリンの発現量すなわちルシフェリン発光量は、細胞に導入したＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域が活性化されることで増加する。したがって、本態様のスクリーニング方法において、ルシフェリン発光量を増加させた薬剤は、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導薬として有効であると期待できる。 The ANP and / or BNP inducer screening method may be performed, for example, by administering a drug to be evaluated to in vitro cells into which a gene has been introduced, and measuring the amount of luciferin luminescence before and after the drug administration. The expression level of luciferin, that is, the luciferin luminescence level, is increased by activating the expression control gene region of the ANP gene and / or BNP gene introduced into the cell. Therefore, in the screening method of this embodiment, a drug that increases the amount of luciferin luminescence can be expected to be effective as an ANP and / or BNP inducer.
本発明のさらに別のひとつの態様は、前記トランスジェニックin vitro細胞を用いる薬剤の心毒性効果の評価方法に関する。心毒性を有する薬剤のひとつの特徴として、心臓におけるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの産生を減少させるという作用があることが知られている（Y.Aihara, et. al., “Doxorubicin Represses CARP Gene Transcription Through the Generation of Oxidative Stress in Neonatal Rat Cardiac Myocytes: Possible Role of Serine/Threonine Kinase-dependent Pathways” J Mol Cell Cardiol 32, 1401-1414 (2000)）。そのため、心毒性効果の評価方法は、例えば、前記トランスジェニックin vitro細胞に、評価したい薬剤を投与し、薬剤の投与前後のルシフェリン発光量を測定し比較することで行ってもよく、薬剤の投与後にルシフェリンの発光量を低下させた薬剤は、心毒性を有している可能性があると評価できる。また、該評価方法において、評価したい薬剤の投与前に、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導薬を細胞に投与する工程が含まれていてもよい。 Yet another embodiment of the present invention relates to a method for evaluating the cardiotoxic effect of a drug using the transgenic in vitro cells. One of the characteristics of drugs having cardiotoxicity is known to have an effect of decreasing the production of ANP and / or BNP in the heart (Y. Aihara, et. Al., “Doxorubicin Represses CARP Gene Transcription Through The Generation of Oxidative Stress in Neonatal Rat Cardiac Myocytes: Possible Role of Serine / Threonine Kinase-dependent Pathways ”J Mol Cell Cardiol 32, 1401-1414 (2000)). Therefore, the method for evaluating the cardiotoxic effect may be performed, for example, by administering a drug to be evaluated to the transgenic in vitro cells, and measuring and comparing the amount of luciferin luminescence before and after the drug administration. It can be evaluated that a drug that later reduced the luminescence amount of luciferin may have cardiotoxicity. In addition, the evaluation method may include a step of administering an ANP and / or BNP inducer to cells before administration of a drug to be evaluated.
前記ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞は、公知の方法（例えば、R.B.Sekar, et. al., “Lentiviral vector-mediated expression of GFP or Kir2.1 alters the
electrophysiology of neonatal rat ventricular myocytes without inducing cytotoxicity” Am J Physiol Heart Circ Physiol 293: H3757-H3770, 2007を参照。）を用いて作成することができる。具体的には、例えば、導入したい遺伝子を組み込んだベクターを培養細胞に感染させることで、目的の遺伝子を標的の細胞に組み込むことによって作成してもよい。より詳しくは、後記する実施例に記載の方法を用いてもよい。
In vitro cells into which the nucleotide sequence containing the expression control gene region of the ANP gene and / or BNP gene and the reporter gene has been introduced can be obtained by known methods (for example, RBSekar, et. Al., “Lentiviral vector-mediated expression”). of GFP or Kir2.1 alters the
electrophysiology of neonatal rat ventricular myocytes without inducing cytotoxicity ”(see Am J Physiol Heart Circ Physiol 293: H3757-H3770, 2007). Specifically, for example, a vector incorporating a gene to be introduced The target gene may be incorporated into a target cell by infecting the cultured cells with the cultured cells, and more specifically, the method described in the examples described later may be used.
前記トランスジェニックin vitro細胞を用いたスクリーニング方法又は心毒性効果の評価方法において、ルシフェリンの発光量測定方法は、後記する実施例に具体的に記載する。 In the screening method using the transgenic in vitro cells or the cardiotoxic effect evaluation method, the method for measuring the amount of luciferin luminescence is specifically described in Examples described later.
次に、実験例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。 Next, the present invention will be described more specifically with reference to experimental examples and examples. However, the present invention is not limited to these examples, and many modifications are within the technical idea of the present invention. This is possible by those with ordinary knowledge in the field.
本実施例におけるすべての動物実験は実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従い、大阪大学動物実験委員会の承認を得て行った。 All animal experiments in this example were conducted with the approval of the Osaka University Animal Experiment Committee in accordance with the Guidelines for the Management and Use of Laboratory Animals.
フェニレフリンはSigma-Aldrich社より購入した。ChIP-seqに使用したanti-RNA ポリメラーゼ II抗体、及びanti-H3K4me3抗体は木村博士（Dr. H. Kimura）より提供を受けた。 Phenylephrine was purchased from Sigma-Aldrich. The anti-RNA polymerase II antibody and the anti-H3K4me3 antibody used for ChIP-seq were provided by Dr. H. Kimura.
＜ラット心筋培養細胞の作成方法＞
｛１｝１日齢のラットから心臓を取り出し、４℃トリプシン溶液で一晩静置。
｛２｝心臓組織を37℃コラゲナーゼ溶液でインキュベートすると、細胞がばらばらになる。
｛３｝ばらばらになった細胞10%ウシ胎仔血清を含む培地で70分培養すると、線維芽細胞はプレートの底に接着し、心筋細胞は上清に残る。
｛４｝上清に残った心筋細胞を回収し、プレートにまく。
<Method for preparing rat myocardial cultured cells>
{1} The heart is removed from a 1-day-old rat and left overnight in a 4 ° C. trypsin solution.
{2} When the heart tissue is incubated with a 37 ° C. collagenase solution, the cells break apart.
{3} Dissociated cells When cultured in a medium containing 10% fetal calf serum for 70 minutes, fibroblasts adhere to the bottom of the plate and cardiomyocytes remain in the supernatant.
{4} Cardiomyocytes remaining in the supernatant are collected and plated.
＜ルシフェラーゼアッセイ法＞
（Ｉ）非ヒトトランスジェニック動物におけるルシフェリン発光測定：
ルシフェラーゼの発光は、下記の方法にて測定する。
イメージング装置：IVIS Lumina II（登録商標）
(Caliper Life Sciences)
解析ソフト：Living Image 4.0 (Caliper Life Sciences)
吸入麻酔：エスカイン吸入麻酔液（登録商標）(マイラン製薬)
発光基質：D-ルシフェリン (VivoGlo Luciferin In Vivo Grade（登録商標）, Promega)
（撮影）
マウスを吸入麻酔で鎮静し、頸部・前胸部・腹部の除毛を行う。ただし、白色の毛は発光検出に影響しないため、ICRなどの白色マウスは除毛不要。ルシフェリンを腹腔内(150 mg/kg)もしくは静脈内(75 mg/kg)に投与し、鎮静をかけたまま、イメージング装置内に仰向けに固定する。ルシフェリン腹腔内投与の場合は、投与５分後から５分間撮影する。静脈内投与の場合は投与１分後から１分間撮影する。
<Luciferase assay method>
(I) Luciferin luminescence measurement in non-human transgenic animals:
The luminescence of luciferase is measured by the following method.
Imaging device: IVIS Lumina II (registered trademark)
(Caliper Life Sciences)
Analysis software: Living Image 4.0 (Caliper Life Sciences)
Inhalation anesthesia: Escaine inhalation anesthetic solution (registered trademark) (Mylan Pharmaceutical)
Luminescent substrate: D-luciferin (VivoGlo Luciferin In Vivo Grade (registered trademark), Promega)
(photograph)
The mouse is sedated by inhalation anesthesia, and the hair is removed from the neck, front chest, and abdomen. However, since white hair does not affect the detection of luminescence, white mice such as ICR do not require hair removal. Luciferin is administered intraperitoneally (150 mg / kg) or intravenously (75 mg / kg) and sedated and fixed supine in the imaging device. In the case of intraperitoneal administration of luciferin, images are taken for 5 minutes from 5 minutes after administration. In the case of intravenous administration, images are taken for 1 minute from 1 minute after administration.
（ＩＩ）非ヒトトランスジェニック動物におけるルシフェリン発光測定：
ｉ）培養細胞に溶解液を加え、溶解させる。
ｉｉ）前記ｉ）の溶解液を、測定用の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移す。
ｉｉｉ）ルシフェリンを添加して、ルミノメーター（ベルトールド社製：CentroXS3 LB960（製品名））で発光を測定する。
(II) Luciferin luminescence measurement in non-human transgenic animals:
i) Add the lysate to the cultured cells and dissolve them.
ii) Transfer the lysate from i) to a 96-well plate for measurement.
iii) Add luciferin, and measure luminescence with a luminometer (Berthold: CentroXS3 LB960 (product name)).
（ＩＩＩ）ルシフェリン発光量の解析
解析ソフトLiving Image 4.0を使用し、発光をROIで囲み、発光量(Relative light unit: RLU)を測定する。
(III) Analysis of luciferin luminescence amount Using analysis software Living Image 4.0, luminescence is surrounded by ROI, and the luminescence amount (Relative light unit: RLU) is measured.
＜統計学的分析＞
データはmean ± SEMを使用し、2群間の比較には2-tailed Student’s t-testを使用し、P < 0.05を有意とした。
<Statistical analysis>
Data used mean ± SEM, 2-tailed Student's t-test was used for comparison between the two groups, and P <0.05 was considered significant.
＜実施例１＞トランスジェニックマウスの作成
（１）ベクターの作成
ＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域として、配列番号１の塩基配列を用いた。本実施例において、配列番号１の塩基配列を、以降「ＣＲ９」と呼ぶ。
（１−１）レポーターベクターへのＣＲ９のサブクローニング
レポーターベクターは、minimal ＣＭＶプロモーターにＬａｃＺレポーターとルシフェラーゼレポーターがついたベクターを使用した（図１）。ＣＲ９領域を含むマウスゲノムＢＡＣ (clone RP23-128E8, BACPAC Resources Center)をテンプレートにして、配列番号２及び配列番号３のプライマーでＰＣＲを行い、レポーターベクターのminimal ＣＭＶプロモーターの上流にある制限酵素サイト(EcoRI, SpeI)にサブクローニングを行った(完成ベクターは図２)。
（１−２）ＣＲ９トランスジェニックマウスの作成
上記（１−１）で作成したベクターを制限酵素(EcoR1, Sfi1)で切断し、ＣＲ９を含む約７ ｋｂの直鎖ＤＮＡを精製した(遺伝子情報：表１、配列番号４及び図３)。この直鎖DNAをマウス受精卵 (Jcl:BDF（登録商標）1凍結受精卵、日本クレア) にインジェクションすることにより、トランスジェニックマウスを作成した。ジェノタイピングは、LacZレポーターを増幅させる配列番号５及び配列番号６のプライマーを用いて行った。
<Example 1> Preparation of transgenic mouse (1) Preparation of vector The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was used as an expression control gene region of a gene encoding ANP and / or BNP. In this example, the base sequence of SEQ ID NO: 1 is hereinafter referred to as “CR9”.
(1-1) Subcloning of CR9 into Reporter Vector The reporter vector used was a minimal CMV promoter with a LacZ reporter and a luciferase reporter (FIG. 1). Using the mouse genome BAC containing CR9 region (clone RP23-128E8, BACPAC Resources Center) as a template, PCR is performed with the primers of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, and the restriction enzyme site upstream of the minimal CMV promoter of the reporter vector ( EcoRI, SpeI) was subcloned (completed vector is Fig. 2).
(1-2) Preparation of CR9 transgenic mouse The vector prepared in (1-1) above was cleaved with restriction enzymes (EcoR1, Sfi1), and approximately 7 kb linear DNA containing CR9 was purified (gene information: Table 1, SEQ ID NO: 4 and FIG. 3). A transgenic mouse was prepared by injecting this linear DNA into a mouse fertilized egg (Jcl: BDF (registered trademark) 1 frozen fertilized egg, CLEA Japan). Genotyping was performed using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 that amplify the LacZ reporter.
（１−３）導入遺伝子の存在確認
ＣＲ９トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子の存在は、ルシフェラーゼの発現を確認することで行うことができるが、併せて次の方法によっても確認した。
マウス組織から抽出したゲノムを用いて、（i）ジェノタイピングＰＣＲと、(ii)サザンブロットで確認。なお、（i）で使用したプライマー配列を配列番号７及び配列番号８に示した。（ii）で使用したＤＮＡプローブ作成用のプライマー配列を配列番号９及び配列番号１０に示した。
(1-3) Confirmation of Transgene Presence The presence of the transgene in CR9 transgenic mice can be confirmed by confirming the expression of luciferase, but it was also confirmed by the following method.
Confirmed by (i) genotyping PCR and (ii) Southern blot using genome extracted from mouse tissue. The primer sequences used in (i) are shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. The primer sequences for DNA probe preparation used in (ii) are shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
＜＜試験例１＞＞
大動脈縮窄術（ＴＡＣ）マウスの作成と心不全重症度の評価
<< Test Example 1 >>
Creation of aortic constriction (TAC) mice and assessment of severity of heart failure
＜実施例２＞
実施例１で得たマウスの中から、８週齢・体重20-25gのトランスジェニックマウスを使用した。胸骨左縁第二肋間から胸腔内に入り、大動脈弓部を露出後、無名動脈と左内頚動脈の間で、27ゲージ針とともに大動脈弓部を7-0縫合糸で縛った。その後、27ゲージ針を慎重に除去し、結果として大動脈の60-80%狭窄を作成した。
＜比較例１＞
実施例１で得たマウスの中から、８週齢・体重20-25gのトランスジェニックマウスを使用し、シャム手術を施した。
<Example 2>
Among the mice obtained in Example 1, 8 weeks old and transgenic mice weighing 20-25 g were used. After entering the thoracic cavity from the second intercostal space between the left sternum and exposing the aortic arch, the aortic arch was tied together with a 27 gauge needle with a 7-0 suture between the anonymous artery and the left internal carotid artery. The 27 gauge needle was then carefully removed, resulting in a 60-80% stenosis of the aorta.
<Comparative Example 1>
From the mice obtained in Example 1, 8 weeks old, 20-25 g transgenic mice were used, and sham surgery was performed.
実施例２及び比較例１で得られたマウスの心不全重症度を評価するため、ルシフェラーゼアッセイを上記の方法を用いた実施した。結果を図４に示す。
心臓におけるルシフェリン発光量は、比較例１のシャム（Sham）マウスと比較し、実施例２のＴＡＣマウスの値は有意に増加した。
In order to evaluate the heart failure severity of the mice obtained in Example 2 and Comparative Example 1, a luciferase assay was performed using the method described above. The results are shown in FIG.
The amount of luciferin luminescence in the heart was significantly higher than that of the TAC mouse of Example 2 as compared to the Sham mouse of Comparative Example 1.
＜＜試験例２＞＞
フェニレフリン誘導心臓負荷マウスの作成と心不全重症度の評価
<< Test Example 2 >>
Preparation of phenylephrine-induced cardiac strain mice and evaluation of heart failure severity
＜実施例３＞
実施例１で得たマウスの中から、８週齢・体重20-25gのトランスジェニックマウスを使用し、フェニレフリン(75 mg/kg/day)を注入した浸透性ポンプを皮下挿入することにより、心臓負荷モデルを作成した。フェニレフリンの投与は、２８日間の連続投与の後、１４日間の休薬、その後にフェニレフリンを再投与連続３日間で行った。
<Example 3>
From the mice obtained in Example 1, 8 weeks old, 20-25 g transgenic mice were used, and a osmotic pump into which phenylephrine (75 mg / kg / day) was injected was inserted subcutaneously. A load model was created. The administration of phenylephrine was carried out for 28 consecutive days followed by 14 days of withdrawal, followed by phenylephrine re-administration for 3 consecutive days.
得られたマウスの心不全重症度を評価するため、ルシフェラーゼアッセイを上記の方法を用いた実施した。結果を図５に示す。
フェニレフリンの投与中は心臓の発光が強くなり、フェニレフリンの休薬中は発光が低下するという心臓負荷の状態を精度良く反映した結果となった。
In order to assess the severity of heart failure in the resulting mice, a luciferase assay was performed using the method described above. The results are shown in FIG.
This result accurately reflected the state of heart load, in which heart luminescence became stronger during phenylephrine administration and luminescence decreased during phenylephrine withdrawal.
＜実施例４＞ＣＲ９及びルシフェラーゼ遺伝子を導入したin vitro培養細胞の作成
（１）pMD2.G （図６、配列番号１１）
（２）pMDLg/pRRE （図７、配列番号１２）
（３）pRSV-Rev （図８、配列番号１３）
配列番号４の塩基配列が導入されているレンチベクター（図２）を、上記の３つのベクター（１）〜（３）とともに２９３Ｔ細胞に遺伝子導入すると、レンチウイルス粒子を形成し、２９３Ｔ細胞の培養上清に分離される。この培養上清を心筋培養細胞にふりかけることで、培養細胞にレンチウイルス粒子が感染し、ベクターが細胞内に導入される。
（導入遺伝子の存在確認）
心筋培養細胞における導入遺伝子の存在は、ルシフェラーゼの発現を確認することにより確認することができる。
<Example 4> Preparation of in vitro cultured cells introduced with CR9 and luciferase genes (1) pMD2.G (Fig. 6, SEQ ID NO: 11)
(2) pMDLg / pRRE (Fig. 7, SEQ ID NO: 12)
(3) pRSV-Rev (FIG. 8, SEQ ID NO: 13)
When a lenti vector (FIG. 2) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 introduced therein is introduced into 293T cells together with the above three vectors (1) to (3), lentiviral particles are formed, and 293T cells are cultured. Separated into supernatant. By sprinkling the culture supernatant on the cultured cardiac muscle cells, the cultured cells are infected with lentiviral particles, and the vector is introduced into the cells.
(Confirmation of the presence of the transgene)
The presence of the transgene in cultured myocardial cells can be confirmed by confirming the expression of luciferase.
＜＜試験例３＞＞ＣＲ９及びルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞を用いた、薬剤のＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導効果の評価
＜実施例５＞
実施例３に記載の方法により、ラット心筋培養細胞にレンチベクターを感染させ、培養液にフェニレフリンを加え、４８時間後にルシフェリン発光量を測定した。
＜比較例２＞
ＣＲ９とは別のＤＮＡ領域をｍＣＭＶプロモーターに繋げる以外は、実施例２に記載の方法と同様の方法でベクターを導入した心筋培養細胞を作成した。得られた培養液にフェニレフリンを加え、４８時間後にルシフェリン発光量を測定した。
<< Test Example 3 >> Evaluation of ANP and / or BNP-inducing effect of drug using cells into which CR9 and luciferase genes have been introduced <Example 5>
By the method described in Example 3, rat myocardial cultured cells were infected with a lentivector, phenylephrine was added to the culture solution, and luciferin luminescence was measured 48 hours later.
<Comparative Example 2>
A cardiomyocyte culture cell into which a vector was introduced was prepared in the same manner as described in Example 2 except that a DNA region different from CR9 was linked to the mCMV promoter. Phenylephrine was added to the obtained culture broth, and luciferin luminescence was measured 48 hours later.
試験例３の結果を図９に示した。実施例４のＣＲ９−ｍＣＭＶ−ルシフェラーゼベクターを導入した心筋培養細胞に、フェニレフリンを加えると、ルシフェラーゼ発現が５倍程度に増加した。一方、比較例２のＣＲ９とは別のＤＮＡ領域をｍＣＭＶプロモーターにつなげたベクターを導入した心筋培養細胞では、フェニレフリンを加えても、ルシフェラーゼ発現は変化しなかった。 The results of Test Example 3 are shown in FIG. When phenylephrine was added to the cultured myocardial cells into which the CR9-mCMV-luciferase vector of Example 4 was introduced, luciferase expression increased about 5-fold. On the other hand, in cultured myocardial cells into which a vector in which a DNA region different from CR9 of Comparative Example 2 was linked to the mCMV promoter was introduced, luciferase expression did not change even when phenylephrine was added.
＜参考例＞ <Reference example>
１．＜比較ゲノム解析＞
UCSC Genome Browserを使用して、マウスと7種の脊椎動物間で、ANP、BNP遺伝子を含むゲノム領域のアライメントを行った。7種の脊椎動物とは、ラット、ヒト、オラウータン、イヌ、ウマ、カモノハシ、ニワトリである。アライメントによって、これらの脊椎動物間のシンテニーマップを作成し、保存性の高い領域を評価した。この保存領域の中から偽陽性を除外するために、既知の遺伝子領域、EST、mRNAは除外し、またシンテニーマップの視覚的評価からも他の偽陽性も除外した。これらの除外を経て、最終的に、少なくともマウスとヒトの間で、保存されている領域を進化的保存領域と定義した。
1. <Comparative genome analysis>
The UCSC Genome Browser was used to align genomic regions including ANP and BNP genes between mice and seven vertebrates. The seven species of vertebrates are rats, humans, orangutans, dogs, horses, platypuses and chickens. By alignment, synteny maps between these vertebrates were created, and highly conserved regions were evaluated. In order to exclude false positives from this conserved region, known gene regions, ESTs, and mRNAs were excluded, and other false positives were also excluded from the visual evaluation of the synteny map. After these exclusions, finally, a region conserved at least between mice and humans was defined as an evolutionary conserved region.
２．＜マウス心筋細胞からのChIPのシーケンス処理＞
８週齢のC57BL6マウスから心臓を摘出し、冷PBSで素早く洗浄後、液体窒素で凍結させ、組織を粉砕・ホモジナイズし、0.3%パラホルムアルデヒドでクロスリンクした。クロマチンを抽出し、ソニケーションを行い、anti-RNA polymerase II抗体とanti-H3K4me3抗体で免疫沈降した。免疫沈降したDNAとインプットをソニケーションにより分断した後、シーケンスアダプターにライゲーションさせ、増幅させ、免疫沈降DNAライブラリーを作成した。このDNAライブラリーは、Illumina Genome Analyzer IIで配列解析を行った。得られた配列をマウスゲノムにアライメントし、MACSで解析することで、RNA polymerase IIとH3K4me3が豊富な領域を同定した。
結果を図１０に示した。
2. <Sequence processing of ChIP from mouse cardiomyocytes>
Hearts were removed from 8-week-old C57BL6 mice, quickly washed with cold PBS, frozen in liquid nitrogen, and the tissues were crushed and homogenized, and cross-linked with 0.3% paraformaldehyde. Chromatin was extracted, sonicated, and immunoprecipitated with anti-RNA polymerase II antibody and anti-H3K4me3 antibody. The immunoprecipitated DNA and input were separated by sonication, and then ligated to a sequence adapter and amplified to prepare an immunoprecipitated DNA library. This DNA library was subjected to sequence analysis with Illumina Genome Analyzer II. The resulting sequence was aligned with the mouse genome and analyzed by MACS to identify a region rich in RNA polymerase II and H3K4me3.
The results are shown in FIG.
３．＜レンチウイルスを用いた発現制御遺伝子領域の同定試験＞
11箇所の保存領域はANP、BNP遺伝子を含むマウスBACクローンをテンプレートにして、PCRで増幅させた。このPCR産物をpCR-Blunt II-TOPOにサブクローニングし、その後ホタルルシフェラーゼレポーターを含むレンチベクターに組み込んだ。このレンチベクターと３つのレンチベクターパッケージングプラスミドをLipofectamine 2000を用いて、293T細胞に同時にトランスフェクションさせることにより、レンチウイルス粒子を産生させた。産生されたレンチウイルス粒子は48時間後に回収し、0.45 μmセルロースフィルターで精製後に、沈殿濃縮させた。
ラット心筋培養細胞を96wellプレートにまき、翌日にレンチウイルスを含む無血清培地に交換し、12時間インキュベートし、感染させた。その後、48時間100mMフェニレフリンで刺激を行い、ルシフェラーゼアッセイを行った。
3. <Identification test of expression control gene region using lentivirus>
Eleven conserved regions were amplified by PCR using mouse BAC clones containing ANP and BNP genes as templates. This PCR product was subcloned into pCR-Blunt II-TOPO and then incorporated into a lentivector containing a firefly luciferase reporter. This lenti vector and three lenti vector packaging plasmids were simultaneously transfected into 293T cells using Lipofectamine 2000 to produce lentiviral particles. The produced lentiviral particles were recovered after 48 hours, purified with a 0.45 μm cellulose filter, and concentrated by precipitation.
Rat myocardial cultured cells were seeded in a 96-well plate, replaced with a serum-free medium containing lentivirus the next day, and incubated for 12 hours for infection. Thereafter, stimulation was performed with 100 mM phenylephrine for 48 hours, and a luciferase assay was performed.
４．＜ＲＮＡの抽出と定量ＲＴ−ＰＣＲ＞
ラット心筋培養細胞、ラット心臓線維芽細胞、マウス心臓組織、マウス脳組織から、RNA-Bee RNA isolation reagentも用いてTotal RNAを抽出し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いてcDNAを作成した。定量PCRは、TaqMan technologyとStepOnePlus Real-Time PCR Systemを用いて行い、内因性コントロールとして、GAPDH遺伝子を使用した。
4). <RNA extraction and quantitative RT-PCR>
Total RNA was extracted from rat myocardial cultured cells, rat heart fibroblasts, mouse heart tissue, and mouse brain tissue using RNA-Bee RNA isolation reagent, and cDNA was prepared using High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. Quantitative PCR was performed using TaqMan technology and StepOnePlus Real-Time PCR System, and GAPDH gene was used as an endogenous control.
５．＜３Ｃアッセイ＞
マウスから心臓を摘出し、冷PBSで素早く洗浄後、液体窒素で凍結させ、組織を粉砕・ホモジナイズし、1%パラホルムアルデヒドでクロスリンクした。3Cアッセイをするために、クロスリンクDNAをBamHI制限酵素で切断した。また、コントロールとして、ANP, BNPを含むBACクローンを使用した。制限酵素近辺のプローベとプライマーを用いて、TaqMan（登録商標）定量PCRで解析を行った。
３Ｃアッセイの結果、ＣＲ９がＡＮＰ遺伝子（Ｎｐｐａ）及びＢＮＰ遺伝子（Ｎｐｐｂ）のいずれも制御していることが示された。分析結果を図１１に示す。
5. <3C assay>
The heart was removed from the mouse, quickly washed with cold PBS, frozen with liquid nitrogen, the tissue was crushed and homogenized, and cross-linked with 1% paraformaldehyde. To perform the 3C assay, the cross-linked DNA was cleaved with BamHI restriction enzyme. As a control, a BAC clone containing ANP and BNP was used. Analysis was performed by TaqMan (registered trademark) quantitative PCR using a probe and primers near the restriction enzyme.
As a result of 3C assay, it was shown that CR9 controls both ANP gene (Nppa) and BNP gene (Nppb). The analysis results are shown in FIG.
本発明によれば、心不全をはじめとする循環器疾患の創薬研究において、有用な非ヒトトランスジェニック動物及びトランスジェニックin vitro細胞を提供することができる。本発明の非ヒトトランスジェニック動物、トランスジェニックin vitro細胞を用いることで、安全性及び質が高く、より効率の良い創薬研究が可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide useful non-human transgenic animals and transgenic in vitro cells in drug discovery research for cardiovascular diseases including heart failure. By using the non-human transgenic animal and transgenic in vitro cells of the present invention, it is possible to conduct drug discovery research with higher safety and quality and more efficient.
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|---|---|---|---|---|
| WO2021095809A1 (en) | 2019-11-15 | 2021-05-20 | 国立大学法人大阪大学 | Enhancer polynucleotide responding to heart failure and expression vector including said enhancer polynucleotide |
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2013
- 2013-11-01 JP JP2013228824A patent/JP2015084764A/en active Pending
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| WO2021095809A1 (en) | 2019-11-15 | 2021-05-20 | 国立大学法人大阪大学 | Enhancer polynucleotide responding to heart failure and expression vector including said enhancer polynucleotide |
| EP4059523A4 (en) * | 2019-11-15 | 2024-01-03 | Osaka University | Enhancer polynucleotide responding to heart failure and expression vector including said enhancer polynucleotide |
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