JP2015083994A - Cell analysis device and cell analysis method - Google Patents

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高広 塩山
Takahiro Shioyama
高広 塩山
あかね 鈴木
Akane Suzuki
あかね 鈴木
武田 朴
Sunao Takeda
朴 武田
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日本光電工業株式会社
Nippon Koden Corp
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To extremely easily and highly accurately analyze the malignancy of cancer.SOLUTION: A cell analysis device includes: a measuring part which measures nucleus-colored cells; a display part which displays a histogram of fluorescence intensity using a result of the measuring part; determination means which determines the total number of a strong area cell distributed in an area of stronger fluorescence intensity than normal cells from data of the histogram, determines the total number of a weak area cell distributed in an area of weaker fluorescence intensity than the normal cells, and determines the malignancy of cancer on the basis of at least either of the total number of the weak area cells and the total number of the strong area cells, and the number of all cells.

Description

この発明は、細胞解析装置及び細胞解析方法に関するものである。 The present invention relates to a cell analysis apparatus and a cell analysis method.

従来、病理標本作成の後に細胞検査士や病理医によって組織切片による病理診断が行われている。 Conventional, pathological diagnosis is being carried out by the tissue sections by cell examiners and pathologists after creating pathological specimens.

標本作成や細胞検査士や病理医による診断のためには熟練した技術が必要であり、更に、技術の差により診断結果に違いが生じる虞もある。 For diagnosis with specimens prepared and cells examiners and pathologist is needed skilled technique, further, there is a possibility that a difference in the diagnostic results generated by the difference in technology. また、組織摘出から診断を行うまでには、組織固定・切片作成・染色といった手技が必要であり、細胞検査士等を一定時間拘束する。 Further, from the tissue removal until the diagnosis is required procedure such tissue fixed and sectioned, stained for a certain period of time restrain the cells examiners like. このため、診断までの手技を自動化することが求められている。 Therefore, it is required to automate the procedure up diagnostics.

更に、手術中に摘出した組織が腫瘍か正常組織か判別することも腫瘍の部位や術式によって必要であり、細胞診断や凍結切片による迅速診断が行われているが、通常の病理診断と比較して、より高度な技術・診断精度が要求される。 Further comparison, the excised tissue during surgery to determine whether tumor or normal tissues are also required by the site and surgical technique of tumors, rapid diagnosis by cytology and frozen section is being performed, the normal pathological diagnosis and, more advanced technologies and diagnostic accuracy is required.

また、病理医にとっては術中一定時間拘束される摘出した固形組織のがん細胞迅速診断を、自動でより客観的に行う装置があれば、非常に有用であると考えられる。 Further, for the pathologist cancer cells rapid diagnosis of solid tissues excised bound intraoperative predetermined time, if there is more objectively perform device automatically considered to be very useful. 更に、腫瘍断端の組織の解析を行うことは、迅速病理診断では一断面でしか診断できなかったものが、組織中の細胞全体を解析出来ることにつながり、このような装置の開発及び提供が望まれている。 Furthermore, by performing an analysis of tissue tumor stump, that could not be diagnosed only one cross section in the rapid histological diagnosis leads to be able analyze whole cells in the tissue, the development and provision of such apparatus It is desired.

そこで、従来においては、フローサイトメトリー法を用いて、フローセルを流れる測定試料から蛍光を検出して、測定対象細胞の大きさを反映した値と、測定対象細胞の核の大きさを反映した値とに基づいて測定対象細胞の異常を判定するようにした細胞分析装置が知られている(特許文献1参照)。 Therefore, conventionally, using flow cytometry method, and detecting fluorescence from the measurement sample flowing in the flow cell, and the value reflecting the size of the measured cell, nucleus size value reflecting the measured cell preparative cell analysis apparatus adapted to determine an abnormality of the measurement target cells based on is known (see Patent Document 1).

特開2009−103687号公報 JP 2009-103687 JP

本発明は上記のような病理診断の分野における現状に鑑みてなされたもので、その目的は、フローサイトメータによる測定結果を応用して、極めて容易にしかも高精度でがんの悪性度解析を行うことが可能な細胞解析装置及び細胞解析方法を提供することである。 The present invention has been made in view of the current situation in the field of pathological diagnosis as described above, and its object is by applying the measurement result by the flow cytometer, the grade analysis of cancer in very easily and highly accurately it is to provide a method of cell analysis apparatus and a cell analysis can be performed.

本発明に係る細胞解析装置は、細胞核染色された細胞を計測する計測部と、前記計測部の結果を用いて蛍光強度のヒストグラムを表示する表示部と、前記ヒストグラムのデータから、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求め、前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ(前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く)基づいてがんの悪性度を判定する判定手段とを具備する。 Cell analysis apparatus according to the present invention includes a measuring unit for measuring the cell nuclei stained cells, and a display unit that displays a histogram of fluorescence intensity using the result of the measuring unit, from the data of the histogram, than normal cells It obtains the total number of weak regions cells distributed in the weak region of fluorescence intensity than normal cells with obtaining the total number of strong regions cells distributed in strong fluorescence intensity regions, the total number of the strong area cells, the total number of the weak area cells and All at least one cell number (the total number of the strong area cells except the ratio of the total cell number) and a determination means for determining malignancy of cancer based.

本発明に係る細胞解析装置では、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数の比に基づいてがんの悪性度を判定する。 In cell analysis apparatus according to the present invention determines the degree of malignancy of cancer based on the ratio of the total number of the weak area cells to the total number of the strong area cells.

本発明に係る細胞解析装置では、判定手段は、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数と全細胞数を組み合わせて差分により、全細胞数−(前記弱領域細胞の総数+前記強領域細胞の総数)を算出し、前記強領域細胞の総数と(式1)との比に基づいてがんの悪性度を判定する。 In cell analysis apparatus according to the present invention, the determination means, the difference in combination of total cell number and the total number of the total number and the weak region cells of the strong area cells, total cell number - (total number of the weak area cells + the strong calculating the area total number of cells), it determines the malignancy of cancer based on the ratio of the total number of the strong area cells and (equation 1).

本発明に係る細胞解析方法は、細胞核染色された細胞を計測して、蛍光強度のヒストグラムを得るステップと、前記ヒストグラムのデータから、正常細胞のピークを検出するステップと、前記ピークよりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求めるステップと、前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ(前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く)に基づいてがんの悪性度を判定する判定する判定ステップとを具備する。 Methods Cell analysis according to the present invention, by measuring the cell nuclei stained cells, obtaining a histogram of fluorescence intensity, from the data of the histogram, and detecting a peak of normal cells, the fluorescence intensity than the peak determining a total number of weak regions cells distributed in the weak region of fluorescence intensity than normal cells with obtaining the total number of strong regions cells distributed in a strong region, the total number of the strong area cells, the total number of the weak area cells and ; and a determination step of determining the malignancy of cancer based on at least one of the total cell number (except for the ratio of the total cell number and the total number of the strong area cells).

本発明に係る細胞解析方法では、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数の比に基づいてがんの悪性度を判定する。 The cell analysis method according to the present invention, determining the malignancy of cancer based on the ratio of the total number of the weak area cells to the total number of the strong area cells.

本発明に係る細胞解析方法では、判定ステップでは、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数と全細胞数を組み合わせて差分により、(式1)=全細胞数−(前記弱領域細胞の総数+前記強領域細胞の総数)を算出し、前記強領域細胞の総数と(式1)との比に基づいてがんの悪性度を判定する。 The cell analysis method according to the present invention, in the determination step, wherein the strong by the total number and differential combination total and the total number of cells in the weak area cell area cells, (Equation 1) = total cell number - (the weak area cells calculating the total number) of the total number + the strong area cell, determining the malignancy of cancer based on the ratio of the total number of the strong area cells and (equation 1).

本発明によれば、前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ(前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く)に基づいてがんの悪性度を判定するので、フローサイトメータにより得られた結果を用いて容易に、がんの悪性度を解析可能である。 According to the present invention, the total number of the strong area cell, the weak total and at least one of the total cell number of regions cells (the strong said an area Total number of cells except the ratio of the total cell number) in cancer based since determining the malignancy, easily by using the results obtained by the flow cytometer, it is possible to analyze the degree of malignancy of cancers.

本発明に係る方法により解析を行う診断システムの概略構成図。 Schematic diagram of a diagnostic system for analyzing by the method according to the present invention. 本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器を示す側面図。 Side view of the cell isolation apparatus for use in all stages of the analysis by the apparatus according to the present invention. 本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器の要部断面図。 Cross sectional view of the cell isolation apparatus for use in all stages of the analysis by the apparatus according to the present invention. 本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器を示す組立斜視図。 Assembled perspective view showing a cell isolation device for use in all stages of the analysis by the apparatus according to the present invention. 本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器の組織取り込みの過程を示す斜視図。 Perspective view showing a process of tissue uptake of cell isolation device for use in all stages of the analysis by the apparatus according to the present invention. 本発明に係る装置による解析の全段階に用いる細胞単離機器を用いた細胞浮遊液生成過程を示す工程図。 Process drawing showing the cell suspension formation process using the cell isolation apparatus for use in all stages of the analysis by the apparatus according to the present invention. フローサイトメータによる蛍光強度のヒストグラムの一例を示す図。 Diagram showing an example of a histogram of the fluorescence intensity by flow cytometer. 本発明に係る細胞解析装置の実施形態による動作を説明するためのフローチャート。 Flowchart for explaining the operation according to an exemplary embodiment of the cell analysis apparatus according to the present invention. 本発明に係る細胞解析装置の実施形態において用いたスレッショルドを示す図。 It shows a threshold used in the embodiment of a cell analysis apparatus according to the present invention. 病理診断によるがん悪性度解析結果をプロットした図。 We plotted the cancer grade analysis results by the pathological diagnosis. 図9について、平均値と標準偏差を求めて示した図。 For Figure 9, it shows in the average value and the standard deviation. 図10についてスレッショルドの境界線と共に示した図。 It shows with threshold boundary line for FIG. 病理診断の結果と、本発明に係る細胞解析装置の実施形態による解析結果の対比を示す図。 Shows results of pathological diagnosis, the comparison of the analysis results according to an embodiment of the cell analysis apparatus according to the present invention.

以下添付図面を参照して、本発明に係るがんの細胞解析装置及びその方法の実施例を説明する。 With reference to the accompanying drawings, an embodiment of a cell analysis apparatus and method for cancer according to the present invention. 各図において、同一の構成要素には同一の符号を付して重複する説明を省略する。 In each figure, the same components and duplicated description will be omitted by the same reference numerals. 細胞単離機器2と本発明の細胞解析装置の実施形態に係るがん悪性度解析装置4を用いて構成される診断システム1を図1に示す。 The diagnostic system 1 configured with cancer malignancy analyzing apparatus 4 according to an embodiment of the cell analysis apparatus of the present invention the cell isolation apparatus 2 shown in FIG. 悪性度解析装置4はフローサイトメータ6とコンピュータ7により構成される。 Grade analyzer 4 is constituted by a flow cytometer 6 and computer 7. 言うまでもなく、それぞれ別の装置とせずにフローサイトメータ6にコンピュータ7の機能を持たせてもよい。 Needless to say, may be a flow cytometer 6 without separate device have a function of the computer 7. 図2に示すように、細胞単離機器2は、試薬を入れるための容器20に挿入された状態で自動細胞前処理装置5にセットされる。 As shown in FIG. 2, cell isolation device 2 is set in the automatic cell pretreatment device 5 in a state of being inserted into the container 20 for containing a reagent.

図3に示すように、細胞単離機器2は、透明あるいは半透明であって試薬と反応しない樹脂性の筒体21と底蓋部31を備える。 As shown in FIG. 3, cell isolation device 2 includes a cylindrical body 21 and the bottom lid 31 of the resin may not react with transparent or semi-transparent even in the reagent. 筒体21は、上側部に厚肉帯部22を有し、厚肉帯部22における外径は、試薬が入れられる試験管などの容器20の内径とほぼ同一であり、容器20の口部内壁に接触した状態で挿入される。 Cylindrical body 21 has a thick band portion 22 in the upper portion, the outer diameter of the thick belt portion 22 is substantially the same as the inner diameter of the container 20, such as a test tube reagents are placed, the mouth of the container 20 It is inserted in contact with the inner wall.

図3、図4に示すように、筒体21の厚肉帯部22の外壁には、筒体21の直径を挟んで対称な位置に摘片23、24が設けられている。 As shown in FIGS. 3 and 4, the thickness outer wall of the walled strip portion 22 of the tubular body 21, 摘片 23 and 24 are provided at positions symmetrical across the diameter of the cylindrical body 21. 摘片23と厚肉帯部22との間には、容器20における開口部の端部20aが入り込み挟持される挟持溝23aが形成されている。 Between the 摘片 23 and the thick band portion 22, the holding grooves 23a of the end portion 20a of the opening is enters sandwiched are formed in the container 20. この挟持溝23aは、容器20と嵌合した細胞単離機器2の装着姿勢を確認するための嵌合部として機能する。 The holding grooves 23a functions as a fitting part for confirming a fitted mounting attitude of the cell isolation apparatus 2 and the container 20.

摘片24は摘片23とは異なる形状を有しており、容器20に挿入された状態の細胞単離機器2は、例えば摘片24が自動細胞前処理装置5の固定孔51に挿入されてセットされる。摘片 24 has a shape different from 摘片 23, cell isolation device 2 in a state of being inserted into the container 20, for example 摘片 24 is inserted into the fixing hole 51 of the automated cell pretreatment device 5 It is set Te. 固定孔51には、フォトインタラプタや近接スイッチなどのセンサが備えられている。 The fixing hole 51 is provided with a sensor such as a photo-interrupter and a proximity switch. センサは、摘片24が適切に挿入されたか否かを検出する信号を制御部へ送出し、制御部は不適切な場合にアラームを発生する。 Sensor sends a signal to detect whether 摘片 24 is properly inserted into the control unit, the control unit generates an alarm when incorrect. このため、摘片24と摘片23とによって、自動細胞前処理装置5に対する細胞単離機器2の誤セットを防止可能となっている。 Therefore, by the 摘片 24 and 摘片 23, and can prevent erroneous set cell isolation device 2 for automated cell pretreatment device 5.

筒体21の下端部はやや細径のスリーブ端部25となっており、傾斜面によって切り取られた形状を有している。 The lower end of the cylindrical body 21 is somewhat a sleeve end 25 of small diameter, and has a cut away by the inclined surface shape. この筒体21におけるスリーブ端部25の傾斜面には、網26が張設されている。 The inclined surface of the sleeve end 25 in the cylindrical body 21, a net 26 is stretched. この網26は、例えば樹脂あるいは金属性であり、例えば40μメッシュ径の粗さを有し、スリーブ端部25の傾斜面にウエルダーなどにより張設される。 The network 26 is, for example, a resin or metal, for example, a roughness of 40μ mesh size, is stretched due welder on the inclined surface of the sleeve end 25.

摘片24が自動細胞前処理装置5の固定孔51にセットされたとき、網26の最低部分が手前側に位置し、図1に示される自動細胞前処理装置5のノズル54が下降した状態では、ノズル54の先端が網26の最低部分に近接することになる。 When 摘片 24 is set into the fixing hole 51 of the automated cell pretreatment unit 5, the state in which the lowest part of the network 26 is positioned on the front side, the nozzle 54 of the automated cell pretreatment apparatus 5 shown in FIG. 1 has been lowered in, so that the tip of the nozzle 54 is close to the lowest part of the network 26. ノズル54には、その先端から長手方向(図1の縦方向)にスリット54aが形成されており、後に説明するピッペッティングのときに、微細化された組織がノズル54に詰まってピッペッティングが妨げられる不具合を防止するようにノズルの先端に切込みが入った形で構成されている。 The nozzle 54 longitudinally from its distal end which is in the slit 54a is formed (the vertical direction in FIG. 1), when pipetting to be described later, pipetting is disturbed is miniaturized tissue clogged nozzles 54 It is constructed in the form containing the cut to the tip of the nozzle so as to prevent a problem to be.

スリーブ端部25の最下端部には組織取得手段であるスプーン27が突出して形成されている。 The lowermost end of the sleeve end 25 spoon 27 is formed to protrude a tissue acquisition means. スプーン27は、スリーブ端部25から真直ぐに下方へ延びる柄部27aと、柄部27aの先端からほぼ直角に筒体21における内径側へ折れ曲がった掻取部27bとを有し、掻取部27bの中央部27bbは凹状容器形状に形成され、組織を掻き取ると共に掻き取った組織を保持する場合に作業が容易な形状となっている。 Spoon 27 has a shank 27a extending straight downward from the sleeve end 25, and a cleaning unit 27b which is bent to the inner diameter side of the cylindrical body 21 at approximately a right angle from the distal end of the handle portion 27a, the cleaning unit 27b central portion 27bb of a concave shape container shape, working with the case of holding the tissue was scraped with a scraping tissue has become an easy shape. 組織取得手段は、このような要件が満たされるものであれば、スプーン形状に限定されない。 Tissue acquisition unit, as long as these requirements are met, but are not limited to spoon shape.

筒体21の厚肉帯部22における直下の外壁には、空気抜用の孔28が形成されており、液が底側から貯液されてゆく場合に、筒体21と容器20との間隙29に存在する空気が上記孔28を介して筒体21の上側開口部から抜ける。 The outer wall immediately below the thick belt portion 22 of the tubular body 21, the gap A hole 28 of the air 抜用 is formed, if the liquid Yuku been reservoir from the bottom side, a tubular member 21 and the container 20 air present in 29 escapes from the upper opening of the cylinder body 21 through the hole 28. このため、適切なピペッティングの処理が確保される。 Therefore, the processing of suitable pipetting is ensured.

底蓋部31は、筒状の本体部32と半球形殻体33とにより構成された有底管である。 Bottom lid portion 31 is a bottomed tube, which is constituted by a cylindrical main body portion 32 and the hemispherical shell 33. 本体部32の開口端部34は、筒体21におけるスリーブ端部25の傾斜面に一致させた傾斜面となっている。 Open end of the body portion 32 34 is an inclined surface which is aligned with the inclined surface of the sleeve end 25 in the cylindrical body 21. 開口端部34の内壁部35は、上記筒体21におけるスリーブ端部25が挿入される薄肉の内壁となっている。 Inner wall 35 of the opening end portion 34 has a thin inner wall sleeve end 25 in the cylinder 21 is inserted.

本体部32の上部側と下部側には、それぞれ内外を繋ぐ孔36、37が形成されている。 The upper side and lower side of the main body portion 32, holes 36, 37 connecting the inner and outer, respectively, are formed. 孔36、37は、筒体21におけるスリーブ端部25が底蓋部31へ挿入された状態においても内外を繋ぎ、本体部32へ流入した液を筒体21と容器20との間隙29に流出させ、また、ピッペティングによる細胞浮遊液の吸引の場合には、筒体21と容器20との間隙29から液を呼び戻すように働くものである。 Holes 36 and 37, also connect the inside and outside in a state in which the sleeve end 25 in the cylindrical body 21 is inserted into the bottom cover portion 31, discharging the liquid that has flowed into the main body 32 in the gap 29 between the cylindrical body 21 and the container 20 is, also in case of aspiration of the cell suspension by Pippetingu are those acting from the gap 29 between the cylindrical body 21 and the container 20 so as to recall the liquid.

更に、ピッペティングによって発生した気泡により組織の撹拌が妨げられることがある。 Furthermore, there is the stirring of the tissue by bubbles generated by Pippetingu is prevented. その場合、孔36、37があることによって、気泡を孔36から抜くとともに孔37から液を呼び込むことができる。 In that case, by the presence of holes 36 and 37, it is possible to attract the liquid from the hole 37 together remove bubbles from the hole 36. さらには網26が傾斜していることにより、孔36からの脱気が効率よく行うことができる。 Furthermore by the network 26 is inclined, degassed from the hole 36 can be performed efficiently.

半球形殻体33の外壁には、容器20の壁に当接して姿勢を安定させる脚部38が設けられている。 The outer wall of the hemispherical shell 33, the leg portion 38 to stabilize the posture in contact with the wall of the container 20 is provided. 脚部38は、概ね三角形形状であり、容器20の底壁や内側壁に当接して、厚肉帯部22と協働し、容器20内において細胞単離機器2を揺動させることなく、安定した状態で保持する。 Leg 38 is generally a triangular shape, in contact with the bottom wall and the inner wall of the container 20, in cooperation with the thick zone 22 without swinging the cell isolation apparatus 2 in the container 20, It is held in a stable state. 脚部の形状は、三角形形状に限られることはなく、細胞単離機器2を安定した状態で保持可能であればどのような形状でも良い。 The shape of the legs is not limited to the triangular shape, holding possible may be any shape in a state of stable cell isolation device 2.

以上の通りに構成された細胞単離機器2を用いて細胞浮遊液を得る場合には、容器20に細胞処理薬30を入れたものを用いる。 Or cell isolation device 2 configured as described with reference to the case of obtaining a cell suspension, use one to the container 20 contains a cell processing agent 30. この細胞処理薬30としては、例えば、10%Triton X-100/RO水、1%ヨウ素化プロピジウム/RO水、1%RNase/RO水を、1対10対2(体積)の割合で混合した溶液を、65μLずつ試験管に分注し、凍結乾燥機(KYOWA VAC RLE−52ES:共和真空技術製)を用い凍結乾燥させた試薬を用いることができる。 As the cell treatment agent 30, e.g., 10% Triton X-100 / RO water, 1% iodinated propidium / RO water, the 1% RNase / RO water were mixed in a ratio of 1: 10: 2 (by volume) the solution was dispensed into test tubes 65μL min, freeze dryer: it is possible to use a reagent obtained by freeze-drying with a (KYOWA VAC RLE-52ES Kyowa steel vacuum technique). この試薬については、本願の発明者らが既に出願済みの特願2009−244702号に詳細を譲る。 This reagent, the inventors of the present application has already cede detail in Patent Application already No. 2009-244702. 勿論、試薬は凍結乾燥したものに限られるものではなく、また、液体の試薬の場合には、自動細胞前処理装置5から供給するようにしても良い。 Of course, the reagent is not limited to that lyophilized, and when the reagent liquid may be supplied from the automatic cell pretreatment apparatus 5. 更に試薬にデキストリンを添加してもよい。 Further dextrin may be added to the reagent.

解析対象である組織61を図5に示すようにシャーレ62に入れて、適量を筒体21のスプーン27によって掻き取り、スプーン27に載せた状態において底蓋部31を筒体21に結合する。 Tissue 61 to be analyzed is put in a petri dish 62 as shown in FIG. 5, scraped appropriate amount by spoon 27 of the cylindrical body 21, to couple the bottom cover portion 31 to the cylindrical body 21 in a state placed on the spoon 27. 次に、上記細胞処理薬30が入っている容器20に細胞単離機器2を挿入して嵌合する。 Next, fitted by inserting the cell isolation device 2 in the container 20 to the cell treatment agent 30 is on. このように、細胞単離機器2によって、ピンセットなど他の器具を用いずに、容易に組織を掻き取り、測定キットにセットすることができる。 Thus, the cell isolation device 2, without the use of other instruments such as forceps, scraped easily tissue, it can be set to measure kit.

次に、図1に示した自動細胞前処理装置5の例えば上下にスライドする蓋52を開けて、固定孔51に細胞単離機器2の摘片24を挿入すると共に、容器20の底部を位置決孔53に挿入して、容器20が適切に支持されるようにセットする。 Next, by opening the lid 52 to slide example above and below the automated cell pretreatment apparatus 5 shown in FIG. 1, the position is inserted a 摘片 24 cell isolation device 2, the bottom of the vessel 20 into the fixing hole 51 insert the Ke'ana 53 is set so that the container 20 is properly supported.

この後、自動細胞前処理装置5の蓋52を閉めると、自動細胞前処理装置5は前処理の動作を図6に示すように行う。 Thereafter, when closing the lid 52 of the automated cell pretreatment device 5, the automatic cell pretreatment device 5 performs the operation of pre-processing, as shown in FIG. まず、自動細胞前処理装置5はノズル54を降下させて2mlの希釈液であるリン酸緩衝液を吐出する(S11)。 First, automated cell pretreatment unit 5 ejects phosphate buffer is a dilution of 2ml by lowering the nozzle 54 (S11). 次に、ノズル54を上昇させてノズル54から自動細胞前処理装置5の吸引吐出機構部に空気層を生成する(S12)。 Next, the nozzle 54 is raised to produce an air layer suction and discharge mechanism portion of the automatic cell pretreatment device 5 from the nozzle 54 (S12).

再び、ノズル54を下降させて試薬30とリン酸緩衝液と組織61が混合された細胞浮遊液55を出し入れするピペッティングを所要時間行う(S13)。 Again, performing the nozzle 54 is lowered reagent 30 and phosphate buffer and the tissue 61 is required pipetting in and out the cell suspension 55 that is mixing times (S13). この所要時間は、脳腫瘍組織の測定においては5分程度で十分な結果が得られた。 The required time is, satisfactory results in about 5 minutes in the measurement of brain tumor tissue was obtained. 次に、ノズル54を下降させた状態において試料としての細胞浮遊液55を吸引してフローサイトメータ6による測定をスタートさせる(S14)。 Then, to start the measurement by the flow cytometer 6 by sucking the cell suspension 55 as a sample in a state of being lowered nozzle 54 (S14). 吸引される細胞浮遊液は、網26を介してろ過されたものを得ることができる。 Cell suspension is aspirated, it is possible to obtain what is filtered through a network 26.

自動細胞前処理装置5は、測定が終了すると、例えば警報音等により終了を報知するので、操作者は、自動細胞前処理装置5の蓋52を開けて細胞単離機器2がセットされた状態の容器20を取り出し、全てを医療廃棄物のダストボックス56へ廃棄する(S15)。 State automated cell preprocessing device 5, the measurement is completed, for example because the notification of completion by the warning sound or the like, the operator, which opens the lid 52 of the automated cell pretreatment device 5 cell isolation device 2 is set removed of vessel 20, discarding all the dust box 56 of medical waste (S15).

自動細胞前処理装置5により吸引された細胞浮遊液は、悪性度解析装置4を構成するフローサイトメータ6に送られる。 Cell suspension is aspirated by automated cell pretreatment device 5 is sent to the flow cytometer 6 constituting the grade analyzer 4. フローサイトメータ6は細胞浮遊液を用いて、単離・細胞核染色された細胞を計測して、イベント毎の蛍光信号のピーク値と積分値により図示しないスキャッタグラムを得る。 Flow cytometer 6 using a cell suspension, isolation and cell nuclei stained cells was measured to obtain the scattergram not shown by the integral value and the peak value of the fluorescence signal for each event. このスキャッタグラムに適切なゲート処理を行い、シングル細胞と思われるイベントから蛍光強度積分値のヒストグラムを得る。 This scattergram take appropriate gating to obtain a histogram of fluorescence intensity integral value from an event you think that the single cells. このヒストグラムは、図示しないLCDなどの表示器に表示される。 This histogram is displayed on the display such as an LCD (not shown). このように、フローサイトメータ6は、細胞核染色された細胞を計測する計測部及び上記計測部の結果を用いて蛍光強度のヒストグラムを表示する表示部として機能する。 Thus, the flow cytometer 6 functions as a display unit for displaying a histogram of fluorescence intensity using the result of the measuring part and the measuring unit measures a cell nucleus stained cells.

このヒストグラムは、図7に示すようである。 The histogram is as shown in FIG. P1は、G0/G1期細胞群によるピークであり、P2はDNA量が正常とは異なる腫瘍細胞を指すDNA Aneuploidyの細胞群によるピークであり、P3はG2/M期細胞群によるピークである。 P1 is the peak due to G0 / G1 phase cells group, P2 is a peak due to cell population DNA aneuploidy pointing to different tumor cells and normal DNA content, P3 is the peak due to the G2 / M phase cell populations. フローサイトメータ6により得られた蛍光強度のヒストグラムに係るデータはコンピュータ7へ送られる。 Data according to the histogram of the fluorescence intensity obtained by the flow cytometer 6 is sent to the computer 7.

コンピュータ7には、判定手段が備えられている。 The computer 7, the determination means are provided. 判定手段は、ヒストグラムのデータから、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞数を求め、この強領域細胞数と前記ヒストグラムに基づいてがんの悪性度を判定する。 Determination means, from the histogram of the data, determine the strong area number of cells distributed in a strong region fluorescence intensity than normal cells, determining the malignancy of cancer based on the strong area cell number and the histogram.

フローサイトメータ6とコンピュータ7の判定手段によって構成される悪性度解析装置4による動作は、図8に示されるフローチャートによる示すことができる。 Operation by grade analyzer 4 constituted by the determination means of a flow cytometer 6 and computer 7 can be shown by the flow chart shown in FIG. 蛍光強度のヒストグラムを作成する(S21)は、フローサイトメータ6によって行われる。 Creating a histogram of fluorescence intensity (S21) is performed by flow cytometer 6.

次に、判定手段により、ヒストグラムのデータから正常細胞のピーク検出が行われる(S22)。 Next, the determination unit, peak detection of normal cells is carried out from the histogram of the data (S22). 即ち、図7に示したG0/G1期細胞群によるピークP1を求め、その終了点PFを確定する。 That is, determine the peak P1 by G0 / G1 phase cells group shown in FIG. 7, to determine the end point PF. 具体的には、細胞数が所定数(例えば10)以下となるポイントをサーチする。 Specifically, search for points where the cell number is a predetermined number (e.g. 10) or less.

次に、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞数Sを求める(S23)。 Next, determine the strong area number of cells S distributed in areas stronger fluorescence intensity than normal cells (S23). 図7においては、PFよりも右側に示されている領域Rに分布する細胞数を求める。 7, we obtain the number of cells distributed in a region R shown on the right side of the PF. 更に、蛍光強度のヒストグラムにおける全細胞数Aを求め(S24)、ここでは強領域細胞数Sと全細胞数Aの比(S/A)をスレッショルドTHと比較し、悪性度を得てコンピュータ7の表示器や図示しないプリンタから出力する(S25)。 Moreover, obtain the total cell number A in the histogram of fluorescence intensity (S24), wherein the strength ratio of the area number of cells S and the total number of cells A and (S / A) as compared to the threshold TH, to give a malignancy computer 7 outputted from the display or a printer (not shown) (S25).

スレッショルドTHを図9に示す。 The threshold TH shown in FIG. 9. これは、次のようにして得たものである。 This is obtained as follows. 実際に病理診断を行い、正常とグレード(grade)2〜4に分けて強領域細胞数Sの比(S/A)をプロットすると図10のように分布が得られた。 Actually performed pathological diagnosis, when plotting the ratio (S / A) normal and grade (grade) 2 to 4 to divide by strong area cell counts S distribution as shown in FIG. 10 were obtained. この結果について、正常とグレード(grade)2〜4とのそれぞれの平均値と標準偏差を求めると図11のように求まる。 This result, found as in Figure 11 when obtaining the respective mean value and the standard deviation of the normal and the grade (grade) 2 to 4. 求められたそれぞれの平均値と標準偏差を用いて計算を行い、上記図9のスレッショルドTHを得たものである。 Perform the calculation using the respective mean and standard deviation obtained, in which to obtain a threshold TH of FIG 9.

図10に示されている病理診断の結果による分布に対し、スレッショルドTHの境界値K1(6.1%)、K2(20.6%)、K3(40%)を図示すると図12のようになる。 To results of the distribution of the pathological diagnosis shown in Figure 10, the boundary value K1 (6.1%) of the threshold TH, K2 (20.6%), as shown in FIG. 12 To illustrate the K3 (40%) Become. 病理診断の結果としてえられた正常(0)及びグレード(grade)2〜4について、本実施形態に係る細胞解析方法を実施して得られた結果を図の横方向に分解して示した表が図13(a)である。 Table showing, in exploded for as a result the obtained normal (0) and grade (grade) 2 to 4, the results obtained by carrying out the cell analysis method according to the present embodiment in the lateral direction in FIG pathological diagnosis There is a drawing 13 (a). つまり、病理診断の結果が正常(0)である46ケースを、本実施形態では、正常(0)が36ケースとグレード2が10ケースであるとの解析結果になったことを示す。 That shows that the 46 cases are normal results of the pathological diagnosis (0), in the present embodiment, the normal (0) 36 cases and grade 2 becomes the analysis result with a 10 case. これにより、図13(b)の「True negative」に示すように、本実施形態では78%の確率で正常と判断し、図13(b)の「False positive」に示すように、22%の確率で悪性度ありと判定することが確かめられた。 Thus, FIG. 13 (b) as shown in "True negatives", is determined to be normal in 78% of the time in the present embodiment, as shown in "False positives" in FIG. 13 (b), 22% It is possible to determine that there is a malignancy was confirmed in probability.

また、病理診断でグレード2〜4の109ケースについて、本実施形態では図13(b)の「False negative」に示すように、5%の確率で正常と判定し、図13(b)の「True positive」に示すようにグレード2〜4であると判定することが確かめられた。 Also, the 109 cases grade 2-4 in pathological diagnosis, in the present embodiment, as shown in "False negatives" in FIG. 13 (b), is determined to be normal in a probability of 5%, 13 (b), " it was confirmed that determined to be grade 2-4 as shown in True positives ".

尚、上記の実施形態で用いたスレッショルドTHは、対象とする組織等により適宜変更し得るものである。 Incidentally, the threshold TH used in the above embodiment, it is capable of appropriately changed by tissue or the like in question. また、上記では強領域細胞数Sと全細胞数Aの比(S/A)を用いて判定を行ったが、正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞数Wを求め、弱領域細胞数Wと強領域細胞数Sとの比に基づき重み付けをして判定を行うようにしても良い。 Although was determined using the ratio of the strong area cell number S and the total cell number A in the above (S / A), determine the weak area cell numbers W distributed in areas of weak fluorescence intensity than normal cells, by weighting based on the ratio between the weak region cell number W and intensity region number of cells S may perform determination. この処理は、別言すれば判定手段の判定を弱領域細胞数により補正することを意味する。 This process is meant to correct the weak area cell number determined in decision means other words. その他、全細胞数A、強領域細胞数S、弱領域細胞数Wを組み合わせて差分を得て、これを用いて悪性度を判定する等の様々の手法を採用することができる。 Other, total cell number A, strong area cell number S, to give a difference in a combination of weak regions cell numbers W, thereby adopting various methods such as determining the malignancy using the same.

ここでは、がんの悪性度の判定は、正常及びグレードの判定を説明したが、単にがん細胞の有無の判定に用いることができることは言うまでもない。 Here, the determination of the malignancy of cancer, has been described determination of normal and grade, it is needless to say that simply can be used for the determination of the presence or absence of the cancer cells.

2 細胞単離機器4 悪性度解析装置5 自動細胞前処理装置6 フローサイトメータ7 コンピュータ20 容器21 筒体26 網27 スプーン38 脚部 2 cell isolation device 4 grade analyzer 5 automated cell pretreatment device 6 flow cytometer 7 computer 20 container 21 the tubular body 26 network 27 the spoon 38 leg



Claims (6)

  1. 細胞核染色された細胞を計測する計測部と、 A measuring unit for measuring the cell nuclei stained cells,
    前記計測部の結果を用いて蛍光強度のヒストグラムを表示する表示部と、 A display unit for displaying a histogram of fluorescence intensity using the result of the measuring unit,
    前記ヒストグラムのデータから、正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求め、前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ(前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く)に基づいてがんの悪性度を判定する判定手段と を具備する細胞解析装置。 From the data of the histogram to obtain the total number of weak regions cells distributed in the weak region of fluorescence intensity than normal cells with obtaining the total number of strong regions cells distributed in the region stronger fluorescence intensity than the normal cells, the strong area cells It provided the total number, and a determination means for determining malignancy of cancer based on at least one total number and total number of cells of the weak area cells (except for the total number and the ratio of the total number of cells in the strong area cells) cell analysis device that.
  2. 判定手段は、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数の比に基づいてがんの悪性度を判定する請求項1に記載の細胞解析装置。 Determining means, cell analysis apparatus according to claim 1 determines the strong region total number and the weak region malignancy of cancer based on the ratio of the total number of cells in the cell.
  3. 判定手段は、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数と全細胞数を組み合わせて差分により、 Determining means, the difference in combination of total cell number and the total number of the total number and the weak region cells of the strong area cells,
    (式1)=全細胞数−(前記弱領域細胞の総数+前記強領域細胞の総数) (Equation 1) = total cell number - (total number of the total number + the strong area cells of the weak area cells)
    を算出し、 Is calculated,
    前記強領域細胞の総数と(式1)との比に基づいてがんの悪性度を判定する請求項1に記載の細胞解析装置。 Cell analysis apparatus according to claim 1 determining the malignancy of cancer based on the ratio of the total number of the strong area cells and (Equation 1).
  4. 細胞核染色された細胞を計測して、蛍光強度のヒストグラムを得るステップと、 Cell nuclei stained cells were measured, and obtaining a histogram of fluorescence intensity,
    前記ヒストグラムのデータから、正常細胞のピークを検出するステップと、 From the data of the histogram, and detecting a peak of a normal cell,
    前記ピークよりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞の総数を求めると共に正常細胞よりも蛍光強度の弱い領域に分布する弱領域細胞の総数を求めるステップと、 Determining a total number of weak regions cells distributed in the weak region of fluorescence intensity than normal cells with obtaining the total number of strong regions cells distributed in strong fluorescence intensity region than the peak,
    前記強領域細胞の総数、前記弱領域細胞の総数及び全細胞数の少なくとも一つ(前記強領域細胞の総数と前記全細胞数の比を除く)に基づいてがんの悪性度を判定する判定する判定ステップと を具備する細胞解析方法。 The total number of the strong area cell, determining determines the total number and degree of malignancy of cancer based on at least one of the total cell number (excluding the total number and the ratio of the total number of cells in the strong area cells) of the weak area cells cell analysis method of and a determination step of.
  5. 判定ステップでは、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数の比に基づいてがんの悪性度を判定する請求項4に記載の細胞解析方法。 In the determination step, the method of cell analysis wherein the malignancy of cancer is determined Claim 4 based on the ratio of the total number of the weak area cells to the total number of the strong area cells.
  6. 判定ステップでは、前記強領域細胞の総数と前記弱領域細胞の総数と全細胞数を組み合わせて差分により、 In the determination step, the difference in combination of total cell number and the total number of the total number and the weak region cells of the strong area cells,
    (式1)=全細胞数−(前記弱領域細胞の総数+前記強領域細胞の総数) (Equation 1) = total cell number - (total number of the total number + the strong area cells of the weak area cells)
    を算出し、 Is calculated,
    前記強領域細胞の総数と(式1)との比に基づいてがんの悪性度を判定する請求項4に記載の細胞解析方法。 The total number and method of cellular analysis described malignancy of cancer is determined Claim 4 on the basis of the ratio of the (Formula 1) of the strong area cells.

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